專利名稱：一種具殺菌活性的櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，涉及櫛孔扇貝肽聚糖IH別蛋白(Cf-PGRP)基因編碼 區(qū)的體外重組表達技術，活性重組蛋白的分離純化，以及重組蛋白對枯草芽孢桿菌、藤黃微 球菌、大腸桿菌的殺菌抑菌作用研究；還涉及到該重組蛋白作為一種新型抗菌藥物及免疫增 強劑，飼料添加劑生產(chǎn)中的應用價值。
背景技術：
非己識別是固有免疫的起始歩驟，也是免疫學研究的根本問題。無脊椎動物缺少獲得性 免疫，因此，固有免疫的非己識別對無脊椎動物具有至關重要的意義。同時，由于微生物種 類繁多，并經(jīng)常發(fā)生變異，也增加了非己識別的復雜性。固有免疫非己識別的研究主要是從 Janeway和Medzhitov在1998年提出的病原體相關分子模式和模式識別受體這兩個概念的 基礎上發(fā)展起來的。
病原體相關分子模式(PAMPs)是一類或幾類病原體所共有、對其生存絕對必要且宿主機 體沒有的保守成分。它包括G'菌的脂多糖(LPS)、類脂A， G+菌的肽聚糖(PGN)、脂磷壁 酸(LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM),分枝桿菌和疏密螺旋體的脂蛋白與脂肽，酵母菌 和支原體的某些成分等。
PAMP是固有免疫識別的理想靶標，而且數(shù)量并不多，因此宿主通過有限數(shù)量的胚系編 碼基因就能夠識別很多類的微生物。這類由胚系基因編碼的，在機體內不斷進化識別PAMP 的受體，即被稱為模式識別受體(PRRs)。模式識別受體和病原體相關分子模式這兩個概念的 提出及后續(xù)的研究實例，揭示了固有免疫識別分子的作用本質就是通過識別病原體所特有保 守性分子模式而區(qū)別對宿主機體有害或無害物質，并選擇合適方式清除有害物質，因而具有 重要的免疫生物學意義。
肽聚糖識別蛋白家族(PGRPs)是重要的模式識別受體，從昆蟲到人類均高度保守，根 據(jù)結構的差異，肽聚糖識別蛋白可以分為三個亞家族長型亞家族(L)、中間型亞家族(I) 和短型亞家族(S)。短型PGRP基因屬于分泌型胞外蛋白，具有典型的信號肽，分子量在20kDa 左右，PGRP結構域緊接在信號肽之后，成熟蛋白只具有1個PGRP結構域。
第一個PGRP蛋白是在家蠶的血淋巴中發(fā)現(xiàn)的，它能與肽聚糖結合并能激活酚氧化酶級聯(lián) 反應。在對哺乳動物和昆蟲PGRP的研究發(fā)現(xiàn)，PGRP對肽聚糖有很強的親和力，起著胞內或胞外識別分子的功能，它能激活Toll、 Imd、酚氧化酶的激活途徑，從而引起黑化反應、抗菌 肽的活化及促進細胞吞噬等功能。
PGRP蛋白的殺菌機制有兩種 一種是由于PGRP與肽聚糖不可逆的結合，從而干擾細菌 細胞壁的合成；另一種是一些PGRP具有酰胺酶活性，可以降解肽聚糖，從而破壞細胞壁使菌 體破裂，這種殺菌作用類似丁-青霉素。人的PGRP-S、 PGRP-Ia和PGRP-ip有抗菌作用，其他 哺乳動物PGRPs也被報道有殺菌或抑菌活性。DziarskiR等發(fā)現(xiàn)大鼠的PGRP-S具有抑制革蘭氏 陽性菌生長的作用，PGRP-S基因敲除后的大鼠對革蘭氏陽性歯的易感性增加。在人的PGRPs 4個成員中，人們只發(fā)現(xiàn)PGRP-L具有酰胺酶活性，人PGRP-LCys的一個突變體能夠使PGRP-L 喪失酰胺酶活性。GeliusE等發(fā)現(xiàn)大鼠的PGRP-L也具有酰胺酶活性。SashchenkoLP等發(fā)現(xiàn)大 鼠PGRP-S與體液或淋巴細胞內的Hsp70能形成一個穩(wěn)定的細胞毒素復合體，在極低的濃度下 就能導致機體死亡。KappelerSR等發(fā)現(xiàn)駱駝的PGRP識別乳酸菌，在鏈球菌感染時能夠上調 其表達，但在乳腺發(fā)炎的情況下卻不出現(xiàn)此現(xiàn)象，這似乎說明了在駱駝奶中這種蛋ft的主要 作用是抑制乳酸菌的生長。
本發(fā)明中的怖孔扇貝Cf-PGRP為短型肽聚糖識別蛋tl,其重組產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌具有 很強的抗菌功能。目前，肽聚糖識別蛋白的結構和功能在昆蟲和哺乳動物中己得到一定程度 的研究，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的研究還很少。PGRPs在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的研究，有利于更好 的揭示固有免疫作用的途徑及其工作機制，廣譜抗菌藥物和免疫增強劑的篩選提供指導。

發(fā)明內容
櫛孔扇貝作為軟體動物的代表，在進化上比較原始，研究其模式識別作用具有重要的意 義。本發(fā)明對櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白(Cf-PGRP)基因編碼區(qū)進行原核重組，旨在確認其 蛋白功能，以深入研究Cf-PGRP受體蛋白的殺菌抑菌活性及其廣譜性，為抗菌藥物和免疫增 強劑的篩選提供指導。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是在Cf-PGRP基因編碼區(qū)的兩端分別設計含 有限制性酶切位點的引物，通過PCR技術，擴增編碼區(qū)基因并將其克隆到pET-32a表達載體中， 隨后轉入宿主細胞BL21 (DE3) plysS中實現(xiàn)原核體外重組表達。重組產(chǎn)物經(jīng)His-tog融合蛋白 純化試劑盒純化和透析復性后，表現(xiàn)出以下活性
1、生長抑制實驗中，為了更好觀察菌量生長變化，加菌量為10^iL對數(shù)生長期菌懸液。 實驗中
1)低濃度的Cf-PGRP蛋白對革蘭氏陽性菌的繁^^在抑制作用，高濃度則具有殺滅作 用。當培養(yǎng)基中含有50ng/mL的重組蛋白時，藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌的生長明顯受到了抑制；當培養(yǎng)基中含有80ng/mL的重組蛋白時，藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌幾乎無法生長， 菌液澄清，6小時抑菌率高達訴.58。/。和98.69%。
2)該Cf-PGRP蛋白對一些革蘭氏陰性菌也有一定抗菌作用。當培養(yǎng)基中含有50ng/mL的 重組蛋白時，大腸桿菌的生長影響不大當培養(yǎng)基中含有80嗎/mL的重組蛋白時，大腸桿菌 的生長受到明顯抑制，6小時抑菌率為75.47%。
2、在另一個實驗中，對數(shù)生長期菌稀釋l X 104倍，測得重組蛋白對藤黃微球菌、枯草芽 孢桿菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為2ng/mL 、 2jig/mL、 4pg/mL。


圖l:櫛孔扇貝重組Cf-PGRP對藤黃菌生長的影響
圖2:櫛孔扇貝重組Cf-PGRP對枯草芽胞桿菌生長的影響
圖3:櫛孔扇貝重組Cf，PGRP對大腸桿菌生長的影響
具體實施例方式
下面的實驗例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。 實驗例l:
本發(fā)明的櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP基因編碼區(qū)體外原核重組表達，包括下列步 驟
1、 重組載體的構建
本發(fā)明中釆用的重組載體為Novagen公司的pET原核表達系統(tǒng)。
通過PCR技術，使用5'末端分別添加了及z加H I和M>f I特定酶切位點的基因特異性引物 Pl(5'"GGATCCATTACAGCTGATTACCTGATAAC-3,)、 P2 (S'-GCGGCCGCTTAAGGGCATCCCGGAC-S" 擴增櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP的編碼區(qū)片段。反應條件為:首先94C預變性5分鐘, 然后進入下列循環(huán)94"變性30秒，60r退火30秒，72"延伸30秒，共進行30個循環(huán)， 最后72"延伸10分鐘。將擴增片段純化回收，與pMD18-T simple載體連接，構建亞克隆。 轉化后篩選陽性克隆，提取質粒；使用BomHI-iVirfI雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化i5^PJ 盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收；回收目的片段與經(jīng)同樣雙 酶切的表達載體pET-32a連接，完成載體的構建。上述實驗操作的具體方法請參照《分子克 隆第三版》。
2、 重組蛋白的表達
本研究中使用的重組表達菌株為BL21(DE3)-plysS。使用構建好的重組載體轉化表達宿主 菌，并篩選陽性克隆，測序確認表達框的正確性。挑取單克隆，接種于200mlSOB培養(yǎng)基中 220rpm， 37"C培養(yǎng)至OD600=0.5-0.7。加入IPTG,使終濃度達到lmmol/mL,繼續(xù)培養(yǎng)5h。4t:， 5000rpm,離心10min,收集菌體，于-20'C凍存?zhèn)溆?。取lml菌液離心，棄去上清后， 加入80jiL水和20pL 5x蛋白上樣緩沖液，100匸煮沸2分鐘，稍離心，SDS-PAGE檢測表達 產(chǎn)物。
3、重組蛋白的純化與復性
本發(fā)明中重組蛋白的純化采用TOYOBO公司MagExtractor His-Tag試劑盒。變性狀態(tài)下 的具體操作步驟如下
在吸附液中加入尿素，使尿素濃度達到8M,并調節(jié)pH到8.0。菌體加入吸附液后，加 入5MNaCl，使終濃度達到3M;于冰浴中超聲波破碎至菌液澄清，12000 rpm離心lmin，回 收上清。上清中加入磁珠，室溫下劇烈震蕩lCK30min,離心分離磁珠，棄去上清。加入洗凈 液，使用震蕩器攪拌10sec，稍離心分離磁珠。加入溶出液，室溫下劇烈震蕩1 10min,瞬間 高速分離，回收上清，得到純化蛋白。
變性純化產(chǎn)物經(jīng)2mM的還原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽，lmM EDTA、 50mM Tris-HCl、 50mM NaCl、 10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析復性，尿素濃度從起始 的6M逐漸替換到4M、 3M、 2M、 0M，最后一次透析至無尿素的透析液時不加甘油。用BCA 法測得透析后重組蛋白的濃度為lmg/mL。
實施實例2:
低濃度的Cf-PGRP蛋白對革蘭氏陽性菌的繁殖存在抑制作用，高濃度則具有殺滅作用。 此蛋白對一些革蘭氏陰性菌也有一定的抗菌作用。在開發(fā)廣"l普抗菌類藥物、免疫增強劑和詞 料添加劑等方面具有潛在應用。
對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的生長抑制實驗取無菌試管36支，排成三排， 每管加入lmLSOB液體培養(yǎng)基和10nL對數(shù)生長期菌懸液，再向試管中加入終濃度為50ng/mL 和80ng/mL的重組蛋白、Tris—HC1對照溶液，37"220卬m培養(yǎng)，觀察Oh、 3h、 6h、 9h、 22hODfi00 值的變化，每個樣品設三個重復，根據(jù)3次測得結果取平均值作圖。實驗表明，低濃度的 Cf-PGRP蛋白對革蘭氏陽性菌的繁殖存在抑制作用，高濃度則具有殺滅作用，此蛋白對一些 革蘭氏陰性菌也具有一定的抗菌作用。6小時測得80pg/mL的重組蛋白對藤黃微球菌、枯草芽 孢桿菌、大腸桿菌的抑菌率分別為訴.58%、 98.69%、 75.47%。
實施實例3:藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌最小抑菌濃度的測定。
細菌371C培養(yǎng)節(jié)OD600-0.5,稀釋l X 10 咅與終濃度范闈在0ng/mL、 lng/mL、 2jig/mL、 4jig/mL、 8ng/mL、 16ng/mL 、 32pg/mL、 64pg/mL的重組蛋白、Tris—HCl對照溶液共孵育30min， 倒入SOB平板培養(yǎng)，平板室溫下培養(yǎng)18h后，不允許任何肉眼可見菌落生長的最小蛋白濃度即 最小抑菌濃度(MIC),每個樣品設三個重復。結果重組蛋白對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為2pg/mL、 2ng/mL、 4pg/mL。

圖示為重組肽聚糖識別蛋白在50pg/mL和80pg/mL兩種濃度對藤黃微球菌、 枯草芽孢桿菌、大腸桿菌生長的抑制作用。
SEQIDNo.l的信息 序列特征
長度252個氨基酸 類型氨基酸 鏈型單鏈 拓撲結構線形
特性分子量為27.88 kDa,等電點為8.69，其中編碼序列的1-21位為信號肽序列，成熟
肽分子量為25.60kDa，等電點為8.77，具有一個保守的PGRP結構域和位于羧基末端的三
個鋅離子結合位點。
來源櫛孔扇貝(CWflW^/flWf)
序列描述
GHRDVRDTDCPGNALYKNMSSWTHFHIHGPGCP序列表
<110>中國科學院海洋研究所
<120〉 一種具有殺菌活性的櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白的制備及應用 <140>
<141〉 2008-10-23
<160> 1
<170> Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 252
<212> PRT
<213> 梓孔扇貝(Chlamys farreri) <220><221> BINDING <222> (83) . (225)
<400〉 1
Met Glu Lys Ser Leu Trp Thr Scr Cys Lou Val Va] Leu Leu l,cu Scr
15 10 15
Pro Thr Cys Leu Ser lie Thr Ala Asp Tyr Leu I]e Thr GJy Pro Arg
20 25 30
Asp Asp Lys Cys Ala Ala Leu Gly Gly lie Cys Gin Asn Asp Asn Gin
35 40 45
Tyr Cys Thr G]y Ser Tyr Phe Scr Asn Lys Cys A La Gly l)ro Val Thr
50 55 60
Thr Arg Cys Cys Thr Lys Asn lie Thr lie Arg Asp Thr Lys Glu Cys 65 70 75 80
Lys Asn Val Met lie lie Ser Arg Asp Ser Trp G]y Ala Arg Arg Pro
85 90 95
Val Lys Va] Leu Pro Leu Lys Thi" Pro Val Gly Asp Phe Phe Leu His 100 105 U0His Thr Asp Thr Lys Asn Cys Thr Thr Ala Lys Asn Cys [le Ser I]e
115 120 125
Val Lys Ser lie Gin Gin Tyr His Met Asn Asp Lys Asn Trp Trp Asp
130 135 140
lie Ala Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Asp Gly出s V"l Tyr' Glu Gly 145 150 155 160
Arg Gly Trp Lys Thr Val Gly Ser His Thr Arg Gly Cys Asn Asp Lys
165 170 175
Ser Leu Ala Ala Ser Met lie Gly Asn Phe Asn Asp Val Leu Pro Asn
180 185 190
Ala Ala Ala I,cu Ser Scr Val Lys Arg Leu Tlr Scr 「ys Gly Val Glu
195 200 205
lie Gly Arg Leu Ser Pro Asn Tyr Ser Leu Phe Gly His Arg Asp Val
210 215 220
Arg Asp Thr Asp Cys Pro Gly Asn Ala Leu Tyr Lys Asn Met Ser Ser 225 230 235 240
Trp Thr His Phe His lie His Gly Pro Gly Cys Pro 245 250
權利要求
1、一種櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP基因編碼蛋白，其特征在于含有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列。
2、 一種根據(jù)權利要求1所述的櫛孔扇貝重組肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP的制備方法，其特征在 于(1)利用帶有限制性酶切位點的引物Pl和P2擴增櫛孔扇貝Cf-PGRP基因編碼區(qū)片斷(2)將pET32a載體與PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)fe/zH I和AbH雙酶切，連接后轉化表達菌株BL21 (DE3) plysS; (3)測序鑒定重組子并進行誘導培養(yǎng)，超聲波破碎處理菌體收獲重組蛋白， 經(jīng)純化、復性后得到具有活性的肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP。
3、 一種權利要求l所述的櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP的應用。其特征在于櫛孔扇貝 肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP可作為廣譜抗菌類藥物治療細菌感染，或用于免疫增強劑、保健品、 飼料添加劑的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白(Cf-PGRP)基因的體外重組表達技術及其功能鑒定。櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白具有序列SEQ ID NO.1中氨基酸序列。本發(fā)明利用體外重組表達技術獲得了櫛孔扇貝肽聚糖識別蛋白Cf-PGRP，該重組蛋白具有廣譜性的殺菌效果，對革蘭氏陽性菌的殺滅作用顯著，對革蘭氏陰性菌也有一定的抗菌作用，在開發(fā)廣譜抗菌類藥物、免疫增強劑和飼料添加劑等方面具有潛在應用價值。
文檔編號C07K14/705GK101619102SQ200910130448
公開日2010年1月6日 申請日期2009年4月7日 優(yōu)先權日2008年12月16日
發(fā)明者姚雪梅, 宋林生, 婉 王, 王玲玲, 蓋云超, 蘇建國, 趙建民, 邱麗梅 申請人:中國科學院海洋研究所