專利名稱：：Ev71病毒廣譜性單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的病毒免疫學(xué)檢測(cè)及
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種可中和EV71病毒A、B、C三種基因型病毒的廣譜性單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的細(xì)胞林、制備方法及該單克隆抗體的用途。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，手足口病已經(jīng)成為越來(lái)越威脅國(guó)內(nèi)兒童健康的廣泛流行性疾病之一。手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報(bào)道。該病于1957年在新西蘭首次報(bào)道。1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出手足口病名稱。手足口病的早期病原體主要為CoxA16型，而1969年美國(guó)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出腸道病毒71(亦稱為"EV71病毒，，)，并被首次確認(rèn)。此后EV71感染與CoxA16感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要臨床特征的EV71流行，1975年保加利亞才艮告病例750例，其中149人致癱，44人死亡。1994年在英國(guó)暴發(fā)了CoxA16引起的手足口病，患者大多為l-4歲嬰幼兒。根據(jù)英國(guó)1963年以來(lái)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，手足口病流行的間隔期為2-3年。20世紀(jì)90年代后期，EV71引起的手足口病開(kāi)始在東南亞地區(qū)流行，EV71感染常引起患者發(fā)生嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，死亡率較高。1997年馬來(lái)西亞發(fā)生了主要由EV71引起的手足口病，其中，4-8月間共有2628人發(fā)病，4-6月間共有29例病人死亡。除此之外，1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007年該病在中國(guó)的流行等均引起了大規(guī)模的疾病暴發(fā)。近年，EV71在亞太地區(qū)的流行呈逐年上升趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)1981年上海首次才艮道本?。淮撕?，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等十幾個(gè)省市均有報(bào)道。1983年天津暴發(fā)了CoxA16引起的手足口病，5-10月間發(fā)生了7，OOO余病例。經(jīng)過(guò)2年低水平散發(fā)后，1986年再次暴發(fā)。1995年武漢病毒研究所從手足口病人中分離出EV71，1998年深圳市衛(wèi)生防疫站從患者標(biāo)本中分離出EV71。1998年臺(tái)灣暴發(fā)了大規(guī)模的EV71疫情，估計(jì)發(fā)病人數(shù)達(dá)150萬(wàn)，其中重癥405例，死亡78例，大多為5歲以下的幼兒。2000年80，677人發(fā)病，291例重癥感染者，41人死亡；2001年389例重癥感染者，55人死亡。2007年山東臨圻、青島和濟(jì)南等地發(fā)生主要由EV71引起的手足口病流行，其中報(bào)告病例近4萬(wàn)，報(bào)告死亡病例14例。EV71可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。隨著EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì)，不斷引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀導(dǎo)致兒童死亡。我國(guó)尤其是南方地區(qū)一直存在EV71病毒的活動(dòng)，人群尤其5歲以下人群EV71抗體陽(yáng)性率普遍較低，與其他國(guó)家和地區(qū)(臺(tái)灣)的研究結(jié)果類似，提示EV71病毒對(duì)人群尤其是幼兒的危害依然存在，一旦條件具備，將有可能發(fā)生暴發(fā)和流行。由于無(wú)疫苗、藥物等特異性的防控手段，該病存在隱性感染和輕癥病例多，傳染源難以發(fā)現(xiàn)和控制，兒童普遍易感，傳播途徑多，難以有效阻斷等原因，預(yù)防控制EV71帶來(lái)的手足口病難度較大。由于EV71引起的手足口病影響范圍的廣泛性、危害的嚴(yán)重性，該病在我國(guó)已納入丙類傳染病管理。因此，EV71病毒疫苗的抗原含量檢測(cè)，保護(hù)性表位研究，治療性單克隆抗體的制備，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會(huì)需求。EV71屬于樣i小核糖核酸病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員。EV71病毒的基因組為7408核苷酸的單股正鏈RNA。該基因組僅含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(編碼含有約2194個(gè)氨基酸的多聚蛋白)，其后為85個(gè)堿基的3'非編碼區(qū)。所編碼的多聚蛋白可進(jìn)一步水解成Pl，P2和P3三個(gè)前體蛋白，Pl前體蛋白被進(jìn)一步活化為1A(多肽VP1)、1B(多肽VP2)、1C(多肽VP3)和1D(多肽VP4)四個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白；四種結(jié)構(gòu)蛋白拼接成五聚體結(jié)構(gòu)；五聚體形成亞單位結(jié)構(gòu)，60個(gè)亞單位構(gòu)成病毒粒子。P1和PS前體蛋白主要編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，編碼蛋白水解酶及RNA聚合酶，P3區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。VP1作為主要的衣殼蛋白，具有最多的型特異性中和位點(diǎn)，其基因序列與病毒血清型具有較高的相關(guān)性。VP1蛋白是主要的病毒中和決定因子，負(fù)責(zé)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合，它直接決定病毒的抗原性。VP1基因具有與病毒血清型完全對(duì)應(yīng)的遺傳多樣性，以及由于其變異快速的特點(diǎn)，vpl基因成了基因分型的重要的對(duì)象。VPl起始于2438bp-3328bp(BrCr)，由891個(gè)核苷酸組成。1999年，Brown等根據(jù)19701998年分離于美國(guó)和其它5個(gè)國(guó)家的113抹EV71的VP1全基因序列，將EV71分為A型、B型和C型3個(gè)基因型，其中A型僅有原型林，B型和C型又分為B1-B5以及C1-C5亞型。對(duì)于核苷酸序列，型內(nèi)差異<12%，型間差異為16.5%~19.7%。鑒于EV71的危害性以及其多基因型或血清型的特點(diǎn)，有必要開(kāi)發(fā)針對(duì)EV71病毒的具有廣諳性中和活性的單克隆抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人采用EV71全病毒顆粒作為抗原利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，然后通過(guò)EV71病毒A、B、C三基因型的間接ELISA法篩選并進(jìn)行中和試驗(yàn)，獲得了能分泌中和EV71三種基因型病毒并能特異性結(jié)合EV71病毒的細(xì)胞系及由所屬細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。因此，本發(fā)明一方面提供了一種對(duì)EV71病毒各種基因型均有高中和效價(jià)的雜交瘤細(xì)胞株。對(duì)于本發(fā)明的上述雜交瘤細(xì)胞抹，申請(qǐng)人于2009年3月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)對(duì)其進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo，2937(所對(duì)應(yīng)的本發(fā)明的編號(hào)為HD6)。本發(fā)明的另一方面提供了由上述的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體，或其活性片段或其保守性突變體。進(jìn)一步地，本發(fā)明的抗體可根據(jù)其抗原結(jié)合區(qū)域(例如重鏈和輕鏈可變區(qū))發(fā)展出的各種衍生抗體，可以用于被動(dòng)免疫治療或者預(yù)防EV71病毒感染，如人源化抗體。由于本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)于EV71病毒A、B、C三種基因型均有高水平的中和效果，所以本發(fā)明提供了本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合在制備用于檢測(cè)EV71病毒A、B、C三基因型的抗原的試劑、藥劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一方面提供了試劑、藥劑或試劑盒，其包括本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合。所述試劑、藥劑或試劑盒可用于檢測(cè)EV71病毒抗原，從而可進(jìn)一步用于診斷EV71病毒感染。在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的試劑、藥劑或試劑盒優(yōu)選包括標(biāo)記的本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。本發(fā)明的再一方面涉及一種用于治療或預(yù)防EV71病毒感染的藥物，所述藥物包含本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。優(yōu)選地，所述藥物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的又一方面涉及一種用于治療和/或預(yù)防EV71病毒感染的方法，其中包括將本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體施用于患者。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)EV71病毒抗原的方法，其中使用了本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體，或標(biāo)記的本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。優(yōu)選的，采用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)EV71病毒抗原。對(duì)于本發(fā)明所述的標(biāo)記，其是指生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。例如酶標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的(例如熒光素標(biāo)記)。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記為辣根過(guò)氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標(biāo)記。對(duì)于本發(fā)明的用于預(yù)防或治療目的的單克隆抗體，其優(yōu)選是被人源化的。本發(fā)明還提供了如下用途，即，本發(fā)明的單克隆抗體在制備用于預(yù)防或治療EV71感染的人源化抗體中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明所述B型EV71病毒選自Bl、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及優(yōu)選地，C型EV71病毒選自Cl、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。本發(fā)明還提供了EV71相關(guān)抗原、抗體的檢測(cè)方法，其包括1、用于樣本中針對(duì)EV71的IgG抗體的檢測(cè)方法將純化病毒液吸附于固相載體上，再加入置于緩沖系統(tǒng)中的待檢標(biāo)本，再加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物的識(shí)別所檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源物種的IgG抗體的第二抗體，再通過(guò)檢測(cè)所攜帶的標(biāo)記物的存在推測(cè)標(biāo)本中抗EV71抗體的存在或者多少。優(yōu)選的所述可檢測(cè)標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶或熒光素標(biāo)記。2、用于樣本中針對(duì)EV71的IgM抗體的檢測(cè)方法將純化病毒液吸附于固相載體上，再加入置于緩沖系統(tǒng)中的待檢標(biāo)本，再加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物的識(shí)別所檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源物種的IgM抗體的第二抗體，再通過(guò)檢測(cè)所攜帶的標(biāo)記物的存在推測(cè)標(biāo)本中抗EV71抗體的存在或者多少。優(yōu)選的所述可檢測(cè)標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶或熒光標(biāo)記物。3、用于樣本中針對(duì)EV71的IgM抗體的檢測(cè)方法將抗待檢物種的IgM的抗體(抗抗體，抗IgM的抗體)吸附于固相載體上，再加入置于緩沖系統(tǒng)中的待檢標(biāo)本，再加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物的識(shí)別所檢測(cè)標(biāo)本的酶標(biāo)記抗原，再通過(guò)檢測(cè)所攜帶的標(biāo)記物的存在推測(cè)標(biāo)本中抗EV71IgM抗體的存在或者多少。優(yōu)選的所述可檢測(cè)標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶或熒光素標(biāo)記物。圖1為本發(fā)明的單克隆抗體的針對(duì)A基因型的免疫電鏡實(shí)驗(yàn)，其中圖1A表示直接電鏡結(jié)果；圖1B表示免疫電鏡結(jié)果(均按1:100，000放大)。圖2為本發(fā)明的單克隆抗體的針對(duì)B基因型的免疫電鏡實(shí)驗(yàn)，其中圖2A表示直接電鏡結(jié)果；圖2B表示免疫電鏡結(jié)果(均按1:100，000放大)。圖3為本發(fā)明的單克隆抗體的針對(duì)C基因型的免疫電鏡實(shí)驗(yàn)，其中圖3A表示直接電鏡結(jié)果；圖3B表示免疫電鏡結(jié)果(均按1:100，000放大)。為更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對(duì)本申請(qǐng)的限制。實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞系的獲得、單克隆抗體的篩選及制備1、單克隆抗體的制備1.1、免疫原的制備免疫原為EV71病毒，分別為1969年美國(guó)株(A基因型)與2007年山東林(C4基因型)。將病毒接種vero細(xì)胞，培養(yǎng)、收毒、滅活后采用50KD的超濾膜超濾濃縮，然后進(jìn)行純化、除菌過(guò)濾以制備純化病毒液。1.2、動(dòng)物免疫采用EV71病毒A型純化病毒液進(jìn)行BALB/c小鼠初次免疫，采用C基因型純化病毒液加強(qiáng)免疫。免疫程序首次免疫取EV71病毒A基因型原液與弗氏完全佐劑混合乳化，免疫BALB/c小鼠，150pg/只，皮下多點(diǎn)注射；間隔10天后進(jìn)行第二次免疫取EV71病毒C基因型純化病毒液與弗氏不完全佐劑混合乳化，然后加強(qiáng)免疫上述小鼠，劑量同第一次；7天后采血，采用間接ELISA法測(cè)定抗體的抗EV71活性。對(duì)檢測(cè)抗體效價(jià)最高的小鼠不加佐劑，用EV71病毒C基因型純化病毒液進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫。1.3、細(xì)胞融合取免疫鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤按比例融合，鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，第七天采用間接ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清以篩選陽(yáng)性細(xì)胞。間接法采用A、B、C三種基因型病毒純化液分別單獨(dú)包被，篩選同時(shí)呈陽(yáng)性的細(xì)胞孔。間接ELISA法如下將A、B、C三基因型EV71病毒純化液包被酶標(biāo)板，加入陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，37'C反應(yīng)后洗滌酶標(biāo)板，加入羊抗小鼠IgG-HRP;反應(yīng)后洗滌酶標(biāo)板，加入TMB顯色液37。C顯色10分鐘，用2MH2S04終止反應(yīng)，儀器上讀取OD450的吸光度。結(jié)果，陽(yáng)性血清對(duì)照的0D值為2.496，陰性血清對(duì)照的OD值為0.116，空白孔0D值為0.001。經(jīng)過(guò)篩選，所獲得的目的細(xì)胞抹所對(duì)應(yīng)的0D值如表1所示。表l單克隆抗體細(xì)胞抹篩選細(xì)胞上清0D值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由此篩選出5個(gè)與EV71病毒A、B、C三基因型均有反應(yīng)且OD值大于0.4的陽(yáng)性孔。1.4、克隆采用有限稀釋法對(duì)上述5細(xì)胞孔進(jìn)行克隆。1.5、檢測(cè)七天之后采用EV71病毒A、B、C三基因型病毒純化液包被酶標(biāo)板，檢測(cè)克隆板內(nèi)的細(xì)胞上清，發(fā)現(xiàn)僅3F12克隆板對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型均仍為陽(yáng)性，其余四抹細(xì)胞轉(zhuǎn)為陰性。1.6、從3F12克隆板中挑選兩個(gè)陽(yáng)性孔B4，F(xiàn)ll進(jìn)行二次克隆化。1.7、二次克隆化后的檢測(cè)同上述檢測(cè)方法一樣，采用間接ELISA法將第二次克隆的細(xì)胞上清進(jìn)行針對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型的陽(yáng)性檢測(cè)，選擇單細(xì)胞陽(yáng)性孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。其中陽(yáng)性細(xì)胞孔編號(hào)為HN1、HN2、HN3、HC1、HD6，共5林。將上述單克隆抗體細(xì)胞抹擴(kuò)大培養(yǎng)，腹腔注射小鼠制備腹水。其中，腹水制備流程如下培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，收集后腹腔注射石蠟致敏的BALB/c小鼠，7-14天左右收集腹水，1200轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去沉淀，收集上層單克隆抗體腹水。2、單克隆抗體初步篩選采用EV71病毒A、B、C基因型純化病毒液1:100稀釋后分別包凈皮酶標(biāo)板，100ul/孔，包凈皮過(guò)夜；用0.01MPBST-20(Tween200.5/1,000(V/V)終濃度)的洗液洗板3遍，加入10%小牛血清、0.01MPBST-20(Tween200.5/1,000(V/V)終濃度)溶液，200ul/孔，37。C封閉，棄去板中溶液。加入系列稀釋的上述獲得的上層單克隆抗體腹水，100ul/孔，其中，小鼠陰性血清為陰性對(duì)照；37。C孵育l小時(shí)，用上述洗液洗板，加入l:10000稀釋于10%小牛血清、0.01MPBST-20(Tween200.5/1,000(V/V)終濃度)的羊抗小鼠IgG-HRP，100ul/孔，37X:孵育1小時(shí)，洗板，加入100ul的TMB顯色液，采用2MH2SO,終止反應(yīng)，450認(rèn)處讀數(shù)，篩選對(duì)于EV71病毒A、B、C三基因型均反應(yīng)的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果如下表2五林單克隆抗體對(duì)EV71病毒A基因型抗原間接法效價(jià)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3五林單克隆抗體對(duì)EV71病毒B基因型抗原間接法效價(jià)結(jié)果樣品稀釋倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>EV71病毒A、B、C三基因型依次為1969年美國(guó)抹A基因型、澳大利亞B3株、2008年安徽抹C4基因型。結(jié)果顯示僅HN2、HN3、HC1、HD6四抹單克隆抗體與上述三種抗原反應(yīng)性均>105。篩選出上述4林單克隆抗體，該4林單克隆抗體對(duì)于EV71病毒A、B、C基因型均有較強(qiáng)的間接法活性。對(duì)上述篩選的4抹單克隆抗體細(xì)胞抹建林，液氮保存。本實(shí)驗(yàn)采用EV71病毒A、B、C三基因型包凈皮的間接ELISA初篩方法，節(jié)省了大量的工作量，減少了試劑消耗，節(jié)省了時(shí)間，免卻了更多的生命體用于后期腹水制備試驗(yàn)。實(shí)施例2:單克隆抗體中和效價(jià)檢測(cè)與廣譜中和抗體篩選培養(yǎng)vero細(xì)胞；將實(shí)施例1中所獲得的上層腹水由1:8起始進(jìn)行2倍系列稀釋，每份樣品平行稀釋2孔。將稀釋腹水分別與100CCID50/0.05ml病毒液(HOl、H05、,、H07或H08病毒)混勻，置36"C下C02培養(yǎng)箱中孵育后，每孔加入細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度控制在1.5-2.0xi()5個(gè)/ml)100ul，置36。C下C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞病變觀察。同時(shí)設(shè)立陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照、空白樣品對(duì)照及正常細(xì)胞對(duì)照。根據(jù)病變觀察結(jié)果確定待測(cè)單克隆抗體樣品的中和抗體滴度。篩選對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型均高效中和的單克隆抗體腹水及其對(duì)應(yīng)細(xì)胞抹。EV71單克隆抗體中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如下表5單克隆抗體腹水對(duì)A、B、C基因型EV71病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果毒種編號(hào)H01H05H06H07H08毒種信息山東2007年美國(guó)1969年安徽2008年安徽2008年澳大利亞基因型C4AC4C4B3隨<1:8<1:8<1:8<1:8鵬<1:8<1:8<1:8<1:8HC11:7681:10241:20481:40961:768HD61:20481:3841:40961:20481:768陰性對(duì)照<1:8<1:8<1:81:8<1:8病毒回滴751781337575結(jié)果1、EV71病毒A、B、C三基因型的病毒回滴結(jié)果依次為75、l78、133、75、75，滿足中和試驗(yàn)病毒回滴32-320的要求，試驗(yàn)成立。2、HN2、HN3對(duì)于A、B、C三基因型，無(wú)中和活性；而HC1、HD6腹水對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型，中國(guó)山東、安徽兩個(gè)地區(qū)，2007年、2008年兩年度病毒均有中和效果，說(shuō)明其具有廣譜性中和活性。3、HC1、HD6單克隆抗體對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型的中和效價(jià)>768，大于公認(rèn)的1:8作為判斷血清是否具有中和保護(hù)效果的標(biāo)準(zhǔn)，HC1、HD6單克隆抗體對(duì)于EV71病毒具有高效中和效果。由于單克隆抗體所識(shí)別的完整病毒顆粒的表位能夠與其結(jié)合，失去對(duì)細(xì)胞的感染能力，說(shuō)明病毒所對(duì)應(yīng)的表位位于EV71病毒的表面。實(shí)施例3:HC1、HD6單克隆抗體與CoxA16病毒的交叉保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)vero細(xì)胞；將單克隆抗體腹水由1:8起始進(jìn)行2倍系列稀釋，每份樣品平行稀釋2孔。將稀釋血清分別與100CCID50/0.05mlCoxA16病毒液等體積混勻，置36°CC02培養(yǎng)箱中醉育后，每孔加入細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度控制在1.5-2x105個(gè)/ml)100ul，然后置于36。C下C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞病變觀察。根據(jù)病變，見(jiàn)察結(jié)果確定待測(cè)單克隆抗體對(duì)應(yīng)該病毒的中和抗體滴度。表7單克隆抗體腹水對(duì)CA16交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果單克隆抗中和效價(jià)HC1<1:8HD6<1:8陰性對(duì)照<1:8從上表可以看出，HC1、HD6腹水對(duì)CA16病毒無(wú)中和活性。實(shí)施例4:HD6單克隆抗體免疫電鏡試驗(yàn)將實(shí)施例1獲得的HD6的上層腹水與A、B、C基因型EV71純化病毒液共同孵育后制備銅網(wǎng)，觀察添加單克隆抗體前后EVn病毒分布狀態(tài)的變化，用可視的方法證實(shí)抗體的病毒結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)流程將EV71純化病毒液與HD6單克隆抗體10:1混合，室溫放置2分鐘，制備銅網(wǎng)，采用醋酸鈾染色，放大IOO，000倍進(jìn)行直接電鏡觀察。同時(shí)將未中和的EV71純化病毒液直接制備銅網(wǎng)并經(jīng)醋酸鈾染色，同上進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如下圖所示。EV71純化病毒液A、B、C基因型的直接電鏡結(jié)果顯示EV71病毒直徑為27nm左右，以較分散的狀態(tài)存在，無(wú)聚集趨勢(shì)如圖1A、2A、3A所示；HD6單克隆抗體與A、B、C基因型EV71純化病毒液反應(yīng)后進(jìn)行電鏡觀察顯示，EV71病毒均被單克隆抗體所包圍，或者EV71病毒之間通過(guò)抗體橋連接到一起，如圖1B、2B、3B所示。由此說(shuō)明，抗EV71病毒HD6單克隆抗體具有與各型別EV71病毒結(jié)合的能力。根據(jù)以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得出本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)或可應(yīng)用的方面。1、本發(fā)明的HD6單克隆抗體對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型均具有較高的中和效價(jià)。2、本發(fā)明的HD6單克隆抗體對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型均具有較高的中和效價(jià)，說(shuō)明EV71病毒A、B、C三基因型具有相同的表位。3、本發(fā)明的HD6單克隆抗體對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型均有較中和效價(jià)，提示該單克隆抗體可用于廣譜EV71病毒檢測(cè)與疫苗生產(chǎn)的抗原檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)的是病毒的抗原決定簇，能更加有效的反映疫苗的有效組分。4、該HD6單克隆抗體對(duì)應(yīng)的是EV71病毒中和表位，可用于EV71IgG抗體竟?fàn)幏z測(cè)，用于疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，更加有效的評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。5、本發(fā)明的HD6單克隆抗體對(duì)EV71病毒A、B、C三基因型均有較強(qiáng)的中和效果，提示該單克隆抗體可改造成EV71病毒A、B、C三基因型廣譜治療性單克隆抗體。6、本發(fā)明的HD6單克隆抗體對(duì)于與EV71病毒高度同源的CoxA16無(wú)交叉保護(hù)性，HD6單抗是針對(duì)EV71的特異性單抗。權(quán)利要求1、一種EV71病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2937。2、一種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。3、一種用于檢測(cè)EV71抗原或EV71的IgG或IgM的試劑盒、試劑或藥劑，其包含權(quán)利要求2所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段。4、根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒、試劑或藥劑，其中所述的EV71病毒選自A、B、C三種基因型的EV71病毒，優(yōu)選的，所述B型EV71病毒選自Bl、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒選自Cl、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒、試劑或藥劑，其所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段是生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的(例:i口酵才示T己的或熒光才示"i己的)。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒、試劑或藥劑，其中所述的標(biāo)記是辣根過(guò)氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標(biāo)記或是熒光素標(biāo)記的。7、權(quán)利要求2的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段的在制備用于檢測(cè)EV71抗原或EV71的IgG或IgM的試劑盒、藥劑或試劑或在制備用于預(yù)防或治療EV71感染的人源化抗體中的用途。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的EV71病毒選自A、B、C三種基因型的EV71病毒，優(yōu)選的，所述B型EV71病毒選自Bl、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒選自Cl、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用途，其所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段是生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的(例如酶標(biāo)記(例如辣根過(guò)氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或熒光標(biāo)記的，例如熒光素標(biāo)記的)。10、檢測(cè)EV71病毒抗原的方法，其中使用了權(quán)利要求2所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體或標(biāo)記的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體(例如酶標(biāo)記(例如辣根過(guò)氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或熒光標(biāo)記的，例如熒光素標(biāo)記的)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了EV71病毒廣譜性單克隆抗體及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明公開(kāi)了一株具有廣譜、高效、特異中和EV71病毒的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備篩選方法、細(xì)胞株以及所述單克隆抗體的用途。該中和單克隆抗體具有與EV71病毒A、B、C三種基因型病毒廣泛中和的效果。文檔編號(hào)C07K16/08GK101544962SQ200910131558公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年4月3日優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日發(fā)明者尹衛(wèi)東,張小梅,李雅靜,芳蔡,強(qiáng)高申請(qǐng)人:唐山怡安生物工程有限公司