專利名稱：一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種自植物中制備天然化學品的方法，具體的說是一種自南蛇藤根皮中提取 雷公藤紅素的方法。
二背景技術：
雷公藤紅素(tripterine)分子式為C29H380又 名南蛇藤素(Celastrol)，是一種存在于衛(wèi)矛科植 物雷公藤、南蛇藤等植物中的五環(huán)三萜類物質， 其結構式如圖。
以往研究表明，雷公藤紅素能抑制多種癌細 胞的增值，包括白血病、神經(jīng)膠質瘤、前列腺 癌等。此外，有證據(jù)顯示，雷公藤紅素能參與 促炎癥細胞因子、誘導性一氧化氮合酶、黏附 分子、蛋白酶體活性、拓撲異構酶、鉀通道以
及熱休克應答等調(diào)控。在體內(nèi)研究方面，雷公藤紅素能顯著的抑制前列腺癌以及胰腺癌細胞 小鼠腫瘤抑制模型中癌細胞的增值，并且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘、類風濕性關節(jié)炎以及膠 原誘導的關節(jié)炎等動物模型中顯示有效的抗炎癥作用。因此，無論在科研還是藥物研發(fā)中雷 公藤紅素的需求越來越大。雷公藤紅素在已報道的植物中含量極低，目前多采用常壓反復硅 膠柱層析進行分離，得率低，毒性大，而且有毒溶劑消耗也大。
中國專利20071002543.3公開了南蛇藤莖總萜提取物及其制備方法及用途。特點是從南 蛇藤屬植物南蛇藤莖中提取分離而得到含有南蛇藤莖總二、三萜的提取物。工藝采用95% 乙醇提取，乙酸乙酯萃取后即得南蛇藤莖總二、三萜，優(yōu)點在于原料提取率高，成本低，操 作簡便，但是未提及雷公藤紅素的單體制備。
中國專利200710041518.X公開了南蛇藤素的堿金屬鹽化合物及其制備方法。其特點是 一種水溶性南蛇藤素堿金屬鹽化合物及其制備方法，可制成藥學上的各種劑型，包括注射劑， 特別是用于制造注射劑用粉針劑。
中國專利200710039694.X公開了南蛇藤葡甲胺炎及其制備方法。其特點是采用選擇性 的只有南蛇藤分子中羧基參與成鹽的南蛇藤葡甲胺鹽，可制成藥學上的各種劑型。
中國專利200510121360.8公開了一種南蛇藤中成藥及其在抗類風濕關節(jié)炎中的應用。其特點是從衛(wèi)茅科南蛇藤屬植物南蛇藤中提取分離而得到含有南蛇藤總萜類的提取物，經(jīng)藥 效學及毒理學實驗證明，該提取物對類風濕關節(jié)炎具有較好的治療作用。
美國專利號US4328309公開了用植物細胞培養(yǎng)方法來制備雷公藤甲素、雷公藤紅素等 活性成分。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供高純度的雷公藤紅素，所要解決的技術問題是遴選雷公藤紅素含量豐富 的植物源及其提取方法。
研究表明，在植物源南蛇藤中，雷公藤紅素含量最為豐富，且多集中在其根皮部位。所 以本發(fā)明的技術方案是以南蛇藤根皮粉為原料，包括提取、分離、純化、重結晶，所述的提 取包括動態(tài)回流提取和靜態(tài)醇沉萃取，動態(tài)回流提取是南蛇藤根皮粉按1 : 3 20的質量比 加入低級氯代垸烴加熱回流提取不少于2小時，冷卻、分離、提取液脫溶得到暗紅色浸膏狀 初提物；靜態(tài)醇沉萃取是向上述初提物中加入濃度50 70vty。(體積百分比，下同)的甲醇或 乙醇溶液，充分攪拌后靜置萃取，待白色析出物沉淀完全后分離，萃取液脫溶得到紅色稠膏 狀粗提物所述的純化是將粗提物溶于甲醇中用固定相為正相硅膠或者反相ds或Cs硅膠的 柱色譜分離純化，等度洗脫，收集洗脫液，脫溶、干燥后得到紅色粉末狀精提物，精提物經(jīng) 重結晶得到純度》98%紅色結晶狀雷公藤紅素。
所述的低級氯代烷烴選自三氯甲烷(氯仿)或1， 2-二氯乙垸(均二氯乙烷)或1， 1， 1-三氯乙烷(偏三氯乙院)等a
所述的正相硅膠柱色譜固定相為200 300目正相硅膠，洗脫液(流動相)為氯仿-甲醇 (體積比70 : 30 50 : 50)混合液。
所述的反相ds或C8硅膠柱色譜固定相相為U或C8反相硅膠，洗脫液(流動相)為pH值 3 4的75 87vt。/。乙醇或甲醇溶液。
重結晶所用溶劑為乙醇一水(體積比90: 10 70: 30)混合溶劑。
具體操作如下
1、 回流提取選取南蛇藤根皮部粉末，按質量比加入3 20倍量的1， 2-二氯乙烷，加 熱回流提取2-6小時，然后冷卻靜置、分離、過濾，濾液減壓濃縮回收溶劑得初提物，呈暗 紅色浸膏狀。
2、 醇沉萃取將1步驟所得的雷公藤紅素初提物溶于50%—70討％的甲醇或乙醇溶液， 靜置取上清液或過濾取濾液濃縮得到粗提物，呈紅色稠膏狀。。
3、 將2步驟得到的粗提物溶于甲醇中進行固定相為正相硅膠的柱色譜分離，洗脫方式為氯仿與甲醇混合體系(70: 30-50: 50)等度洗脫，TLC跟蹤監(jiān)測雷公藤紅素餾分，收集
餾分濃縮。
4、 將2步驟得到的粗提物溶于甲醇中進行固定相為反相ds或C8硅膠的柱色譜分離， 流動相為加酸調(diào)整pH值為3 4的濃度75 87vt。/。的乙醇或者甲醇溶液等度洗脫，HPLC-UV 監(jiān)測收集洗脫液。
5、 柱色譜分離后的餾分或洗脫液濃縮，干燥后得到紅色粉末，采用兩相溶劑結晶法進 一步純化得到純度達98%的紅色結晶產(chǎn)品，所用溶劑為75 90vt。/。乙醇溶液。
雷公藤紅素的測定方法為
1、 高效液相制備色譜法(HPLC—UV)，色譜固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，檢測波長 425nm，流動相為甲醇-1%醋酸(體積比87: 13)，流速為lml/min，柱溫27。C，進樣量 10u 1。
2、 200-300目G硅膠鋪板，展開劑l:氯仿-甲醇(體積比65: 35)， pH調(diào)至3-4;展開劑2:
環(huán)己垸一丙酮(體積比1: 3);
顯色方式碘顯色或者香草醛硫酸乙醇溶解，105。C加熱顯色
本申請利用雷公藤紅素既溶于氯代烷烴又溶于50 70vt。/。甲醇或乙醇溶液的物理性質以 及氯代烷烴與醇溶液極性差異的特點，首先使用氯代烷烴提取，將僅溶于醇溶液而不溶于氯 代垸烴的非目標產(chǎn)物分離，然后用醇溶液萃取，將在醇溶液中有較小溶解度的另一些非目標 產(chǎn)物沉淀分離，這時醇溶液中所含非目標產(chǎn)物大大減少，使粗提物中雷公藤紅素含量較初提 物大幅度提高，從而簡化以后的分離純化過程。
四

圖1為2步驟制備的粗提物HPLC檢測圖譜
圖2為4步驟制備的精提物的HPLC檢測圖譜
圖3、圖4為4步驟制備的精提物的"C麗R1， H畫R檢測圖譜
圖5為4步驟制備的精提物的EI-MS檢測圖譜
五具體實施方式
實施例一
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按1: 5的質量比加入1， 2-二氯乙烷， 加熱回流提取4小時，回流提取兩次。過濾，合并濾液減壓濃縮回收l， 2-二氯乙烷后，得 暗紅色浸膏0. 39g(初提物)，紅素含量9. 2%。加50vt。/。甲醇溶液溶解，溶液中析出白色沉淀， 靜置，取上清液濃縮后重復處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公藤紅素含量51.3%。
5將粗提物甲醇溶解進行固定相為反相Ci8制備色譜上進行分離，洗脫劑為83vt^甲醇水溶液， 醋酸調(diào)pH至3，根據(jù)制備色譜圖收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸干后得雷公藤紅素粉末(精提 物)，采用乙醇/水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素產(chǎn)品。 實施例二
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: 7的質量比加入偏三氯乙烷，加熱 回流提取5小時，回流提取兩次。過濾，合并濾液減壓濃縮回收偏三氯乙烷后，得暗紅色浸 膏0.41g(初提物)，雷公藤紅素含量10.3%。加入60vtX乙醇溶液充分溶解，溶液中析出 白色沉淀，過濾后取濾液，濃縮后再次重復同樣處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公 藤紅素含量48.2%。將粗提物甲醇溶解進行固定相為反相d8制備色譜上進行分離，洗脫劑 為85"%甲醇溶液，醋酸調(diào)pH至3，根據(jù)制備色譜圖收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸干后得 雷公藤紅素粉末(精提物)，釆用乙醇/水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素
實施例三
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: IO的質量比加入氯仿，加熱回流 提取5小時，回流提取兩次。過濾，合并濾液減壓濃縮回收氯仿后，得暗紅色浸膏0.47g(初 提物)，雷公藤紅素含量10. 1%。加入60vt^甲醇溶液，溶液混濁，靜置，過濾取濾液濃縮 后再次重復同樣處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公藤紅素含量53. 1% 。將粗提物 甲醇溶解硅膠拌樣進行固定相為正相硅膠常壓柱分離，洗脫劑為氯仿/甲醇(60: 40)等度洗 脫，TLC跟蹤監(jiān)測，收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸干后得到雷公藤紅素產(chǎn)精提物，采用乙醇 /水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素產(chǎn)品。 實施例四
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: 15的質量比加入氯仿，加熱回流 提取5小時，回流提取兩次。過濾，合并濾液減壓濃縮回收氯仿后，得暗紅色浸膏0.41g(初 提物)，雷公藤紅素含量9.2%。加入50vtX乙醇溶液，溶液混濁，靜置，過濾取濾液濃縮 后再次重復同樣處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公藤紅素含量50. 1% 。將粗提物 甲醇溶解硅膠拌樣進行固定相為正相硅膠常壓柱分離，洗脫劑為氯仿/甲醇(70:30)等度洗 脫，TLC跟蹤監(jiān)測，收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸干后得到雷公藤紅素精提物，采用乙醇/ 水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素產(chǎn)品。
權利要求
1、一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法，以南蛇藤根皮粉為原料，包括提取、分離、純化和重結晶，其特征在于所述的提取首先以低級氯代烷烴為溶劑，加熱回流提取，根皮粉與溶劑的質量比1∶3～20，時間不少于2小時，提取液脫溶后得到浸膏狀初提物，然后向初提物中加入50～70vt％甲醇或乙醇溶液，充分攪拌、靜置萃取，萃取液脫溶后得到稠膏狀粗提物；所述的純化是粗提物用甲醇溶解后用固定相為正相硅膠或反相硅膠的柱色譜分離純化，收集洗脫液，脫溶干燥后得到粉末狀精提物，最后用乙醇-水混合溶劑重結晶。
2、 根據(jù)要得要求1所述的方法，其特征在于所述的低級氯化垸烴選自氯仿或均二氯 乙烷或偏三氯乙烷。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于正相硅膠柱色譜固定相為200 300 目正相硅膠，洗脫液為氯仿-甲醇混合溶劑，體積比70 : 30 50 : 50。
4、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于反相硅膠柱色譜固定相為C,8或Cs 反相硅膠；洗脫液為pH3 4的75 87"%甲醇或乙醇溶液。
全文摘要
一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法，以南蛇藤根皮粉為原料，包括提取、分離、純化和重結晶，所述的提取首先以低級氯代烷烴為溶劑，加熱回流提取，根皮粉與溶劑的質量比1∶3～20，時間不少于2小時，提取液脫溶后得到浸膏狀初提物，然后向初提物中加入50～70vt％甲醇或乙醇溶液，充分攪拌、靜置萃取，萃取液脫溶后得到稠膏狀粗提物；所述的純化是粗提物用甲醇溶解后用固定相為正相硅膠或反相硅膠的柱色譜分離純化，收集洗脫液，脫溶干燥后得到粉末狀精提物，最后用乙醇-水混合溶劑重結晶。本方法分離、純化工藝簡單，得到純度達98％的雷公藤紅素。
文檔編號C07J63/00GK101638425SQ200910144620
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權日2009年8月24日
發(fā)明者楊 呂, 許舒雯, 蘭 陳, 陳龍勝 申請人:安徽省科學技術研究院