專利名稱：黑乳海參中新的抗腫瘤化合物黑乳海參皂苷丁的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種從海洋動(dòng)物黑乳海參中分離到的新的抗腫瘤 化合物黑乳海參皂苷丁。
技術(shù)背景黑乳海參(//o/wAn》"o&fc <S.)，又名"鳳梨參"，屬海洋棘皮動(dòng)物門海參綱 刺參科。其體形很大，長(zhǎng)一般為700mm，寬約lOOmm，高約80mm，廣泛分布于 我國(guó)西沙群島和臺(tái)灣南端。其體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、皂苷類物 質(zhì)，具有補(bǔ)肝腎，益精，養(yǎng)血的功效。有關(guān)其所含的皂苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗 腫瘤活性迄今尚未見有過報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是從生長(zhǎng)于中國(guó)福建海域的黑乳海參中提取分離一種新的皂苷類化合物，命名為黑乳海參皂苷丁，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下黑乳海參皂苷丁為無(wú)色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)212.4-214.4^ (MeOH-H20)， [a〗D22.3°(c=0.3，MeOH)， Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。電噴霧陽(yáng) 正離子質(zhì)譜信號(hào)m/z 891 [M+Na]+和電噴霧-負(fù)離子質(zhì)譜信號(hào)m/z 845 [M-Na].。紅 外光譜max-3418，強(qiáng)寬峰(羥基)，1762 (羰基)，1637 (雙鍵)，1253， 1069
(m，磺酸基)。iH-和"C核磁共振數(shù)據(jù)見表l。
表1黑乳海參皂苷丁的的&和13C核磁共振數(shù)據(jù)_
position dH(J) _dM(J)___
1
2
3
4
8
9
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26
27
30
31
32
1.38(1H,m,a),
1.86(lH，m^)
1.76(1H，m，a)，
2.02(1H,m力)
3.14(1H,ddA2，12.0，a)
1.00(1H，d，10.2，a) 2.02 (2H，nO
1.49(1H,m,"), 1.74(lH,m^) 3.36(1H，t，9劾
5.62(1H，dA2》) 4.99(lH，dd,5.4，12.0^)
1.82(1H，m，")， 1.40(1H,m》) 2.41(1H，ddd,a)， 2.97(1H那.0,14頭
1.40(3H,s)
1.76(3H，s) 4.32(1H，m,fl) L45(2H,m) 1.64(2H,m)
1.20(3H，s) U9(3H，s) U3(3H，s) 1.28(3H，s) 1.65(3H，s)
Xyi:木糖，J值偶合常數(shù)
36.4 Xyl
27.414.71(1H,d,7.2)105.3
88.824.04(1H，m)83.4
40.134.28(1H，m)75.4
52.845.10(1H,m)76.0
28.43.73(1H拜)，64.2
4.75(1H,dd,4.8,11.4》)
21.2Xyl
41.014.83(1H，d,7.2)105.9
153.924.02(1H,m)76.8
39.834.22(1H，m)77.7
115.643.68(1H，m)69.9
71.653-74(lH^， a)，65.2
4.55(1H,dd，4.2,10.8》)
58.9 46.0 36.9
35.6
89.8 174.6
22.7 86.7
9
18 2,3822122本發(fā)明還提供了從黑乳海參提取分離黑乳海參皂苷丁的方法，其歩驟如下
(1) 提取將黑乳海參洗凈，切碎，用5倍量(重量)95%乙醇浸泡7天， 濾出提取液，再用85%乙醇浸泡提取2次，每次7天，合并3次提取液，減壓回 收乙醇，得流浸膏。將流浸膏溶于水中，通過大孔樹脂柱，依次用水和50%乙醇 洗脫。收集50%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得總皂苷提取物。
(2) 分離將上述總皂苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以二氯甲垸甲醇水 為8~5 :1~4 : l混合溶劑和正丁醇甲醇為20 : i兩相溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，
收集含黑乳海參皂苷丁的流份，再經(jīng)ZorbaxSBC18高效液相柱層析，以甲醇 水為50 : 50為流動(dòng)相洗脫，得黑乳海參皂苷丁純品。
本發(fā)明對(duì)黑乳海參皂苷黑乳海參皂苷丁進(jìn)行了體外抗腫瘤試驗(yàn)，表明其具有
明顯的抑制腫瘤的效果。試驗(yàn)所用細(xì)胞株為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株，艮卩A-549 (肺癌)和IA-9 (卵巢癌)腫瘤細(xì)胞株。
試驗(yàn)方法為國(guó)際通用的SRB法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 腫瘤細(xì)胞以9(HU/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)再加藥10nl/孔。每個(gè) 濃度設(shè)三復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對(duì)照及無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在 37'C、 5WC02條件下培養(yǎng)72小時(shí)，然后傾去培養(yǎng)液，用10%冷TCA固定細(xì)胞， 4'C放置1小時(shí)后用蒸餾水洗滌5次，空氣干燥。最后加入15(^l/孔的Tris溶液， 酶標(biāo)儀520nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。試驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2黑乳海參皂苷丁對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用
.. , ■ ■,■ ■ .. . ■.
腫瘤細(xì)胞株A-549IA-9
IC50 (ng/ml)1.20.6
iCso:表示本發(fā)明化合物的半數(shù)有效抑制濃度
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑乳海參皂苷丁對(duì)以上2種腫瘤細(xì)胞株均顯示明顯的抑
制作用。
5本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)利用中國(guó)的海 洋藥用生物資源具有重要意義。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述黑乳海參皂苷丁的分離制備。
將黑乳海參1000克洗凈，切碎，分別用5倍量(重量)的95%、 85%、 85% 乙醇依次浸泡，每次浸泡7天，合并乙醇浸出液，減壓回收乙醇，得流浸膏。將 流浸膏溶于3倍量水中，過濾，濾液通過DA201-B大孔樹脂柱，依次用水和50% 乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至干，得總皂苷5.6克。將總皂
苷進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲垸甲醇水為7.6 : 2.4 : i和正丁醇甲醇為20 :
l的兩相混合溶劑洗脫，收集含黑乳海參皂苷丁的流份。再經(jīng)ZorbaxSBC18高效
液相柱層析，以甲醇水為50 : 50為流動(dòng)相洗脫，得黑乳海參皂苷丁純品12毫克。
權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤的化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2. 權(quán)利要求l所述抑制腫瘤的化合物的制備方法，其具體步驟如下(1) 提取將原料黃疣海參洗凈，切碎，用95%乙醇浸泡7天，濾出提取 液，再用85%乙醇浸泡2次，每次7天；合并3次提取液，減壓回收乙醇，得流 浸膏；將流浸膏溶于水中，通過大孔樹脂柱，依次用水和50%乙醇洗脫；收集 50%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得總皂苷提取物；(2) 分離將上述總皂苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以二氯甲烷甲醇水為8~5 :1~4 : i混合溶劑和正丁醇甲醇為20 : i兩相溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含權(quán)利要求1所述化合物的流份，再經(jīng)Zorbax SBC18高效液相柱層析，以甲醇水為45:55為流動(dòng)相洗脫，得權(quán)利要求i所述化合物純品。
3. 權(quán)利要求1所述抑制腫瘤的化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種從黑乳海參中分離的抗癌化合物黑乳海參皂苷丁，分子式C₄₀H₆₁O₁₇SNa。經(jīng)多種現(xiàn)代光譜分析，特別是應(yīng)用先進(jìn)的二維核磁共振譜和高分辨質(zhì)譜的綜合解析，確定了該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型。體外抗腫瘤試驗(yàn)表明，該化合物對(duì)A-549肺癌和IA-9卵巢癌2種腫瘤細(xì)胞株有明顯的抑制作用。本發(fā)明可為研制新的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)利用中國(guó)的海洋藥用生物資源具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)C07J71/00GK101654472SQ20091015271
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者丁萍月, 軍 傅, 軍 巫, 張佳佳, 朱可奇, 王忠華 申請(qǐng)人:軍 傅