專利名稱：一種直接富集尿蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種直接在小便池或便斗中用吸附劑吸附尿液中的尿蛋白，并將吸附 尿蛋白的吸附劑運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理的尿蛋白富集方法。
背景技術(shù)：
尿胰蛋白酶抑制劑，又名人尿胰蛋白酶抑制劑(Human Urinary Trypsin Inhibitor)。尿胰蛋白酶抑制劑是由143個(gè)氨基酸組成的一種糖蛋白，分子量經(jīng)HPLC法測(cè) 定為60 70KD，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定為40 50KD，等電點(diǎn)為2. 6，是一種對(duì)熱穩(wěn)定的酸性蛋 白。該蛋白目前主要用于胰腺炎、休克等疾病的治療。
尿激酶(Urokinase，簡寫為UK)，是由人腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到尿中的一 種堿性蛋白酶，等電點(diǎn)值在PH8 9之間，人尿中平均含量為5 7iu/ml。在尿激酶的天然 來源中，主要有兩種形式的尿激酶分子，即高分子量尿激酶(54000道爾頓)和低分子量尿 激酶(33000道爾頓)。人尿激肽原酶(英文名Urinary Kallidinogenase)是從人尿中分離提取的一種 由238個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，等電點(diǎn)在4左右。目前，已經(jīng)被開發(fā)成用于治療急性腦梗死 的藥物。這些蛋白具有重要的治療價(jià)值，在疾病的治療中發(fā)揮了重要的作用。目前，均主要 來自人尿。生產(chǎn)方式基本上都是先收集尿液，再將尿液運(yùn)至相應(yīng)場(chǎng)所進(jìn)行集中處理，尿激酶 主要利用硅膠進(jìn)行吸附，尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶主要利用殼聚糖進(jìn)行吸附，再通 過氨水或高鹽等解吸條件，將蛋白從吸附劑上解吸，通過硫酸銨沉淀等方法得到含有相應(yīng) 蛋白的粗品。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平日益改善，社會(huì)對(duì)環(huán)境重視程度不斷提高，尿蛋白 的收集越來越困難。按照目前男性尿蛋白制備通行的工藝先收集尿液，再集中到加工點(diǎn)進(jìn) 行尿蛋白吸附和后續(xù)處理。該法收集男性尿液，氣味較大，不符合城市衛(wèi)生要求，生產(chǎn)尿蛋 白粗品所需尿液，已從大中城市已經(jīng)全面退出，目前，收集的尿液主要來自小城鎮(zhèn)、鄉(xiāng)村，收 集的成本越來越高，而且收集時(shí)間間隔也越來越長，尿蛋白的降解、變性較為嚴(yán)重，給后續(xù) 的純化也帶來更多的困難。本發(fā)明的目的就是在符合城市衛(wèi)生化要求的基礎(chǔ)上，利用離子 交換吸附劑，對(duì)尿液或稀釋尿液中尿激酶、尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等尿蛋白進(jìn) 行現(xiàn)場(chǎng)吸附，解決了上述難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次利用樹脂，通過處理后，直接在便池或便斗中吸附尿液或稀釋尿液中 的蛋白；以前的尿蛋白吸附方法，必需收集尿液，然后將尿液運(yùn)至加工點(diǎn)，統(tǒng)一處理。本專 利方法的創(chuàng)新性在于不用收集尿液，可直接吸附流經(jīng)樹脂的尿液的尿蛋白。本發(fā)明的方法 對(duì)廁所的衛(wèi)生狀況無明顯影響，大幅度降低了尿液運(yùn)輸、加工成本以及帶來的一系列環(huán)境問題。本發(fā)明的目的是提供一種直接在小便池或便斗中用吸附劑吸附尿液或者稀釋尿液中的尿蛋白，并將吸附尿蛋白的吸附劑運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理的尿蛋白富集方法。本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)將吸附劑再生處理，水沖至中性；(2)將處理好的吸附劑裝在透過性較好的濾布袋中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或 者便池中；(3)尿液流經(jīng)吸附劑，尿蛋白被吸附；(4)收集吸附尿蛋白的吸附劑，運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理。所述的吸附劑再生處理，可采用常規(guī)的吸附劑再生處理方法，包括酸或/和堿再 生、水沖至中性。本發(fā)明所述的吸附劑包括樹脂，凝膠等。其中所述樹脂包括普通樹脂和大孔型樹脂，優(yōu)選為大孔型樹脂，可包括陰離子交 換樹脂，陽離子交換樹脂，陰陽離子混合樹脂或者兩性樹脂；其中兩性樹脂是指樹脂同時(shí)具 有陽離子交換基團(tuán)和陰離子交換基團(tuán)。所述的尿液可以是原尿液，也可以是經(jīng)過稀釋后的尿液。裝有吸附劑的濾布袋可在衛(wèi)生間便斗或便池中放置一段時(shí)間，放置一定時(shí)間可以 根據(jù)情況而定，如果放置時(shí)間短，吸附的蛋白量較小，如果放置時(shí)間較長，蛋白可能變性、降 解等，一般可為24小時(shí)左右。所述透氣性較好的濾布是指該濾布既能保證尿液能透過，但又不致使吸附劑外 漏。優(yōu)選50目孔徑的濾布。所述的尿蛋白包括等電點(diǎn)低于5的蛋白，也包括等電點(diǎn)高于8的尿蛋白，或者同時(shí) 包括等電點(diǎn)低于5和高于8的尿蛋白；其中，等電點(diǎn)低于5的尿蛋白包括尿胰蛋白酶抑制 齊U、人尿激肽原酶等，等電點(diǎn)高于8的尿蛋白包括尿激酶等。本發(fā)明所述的后處理包括解吸，過濾、超濾濃縮、鹽析等步驟得到含有尿蛋白的蛋 白質(zhì)粗制品以及進(jìn)一步純化得到高純度的尿蛋白的過程。優(yōu)選的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下(1)將樹脂再生處理，水沖至中性；(2)將陰離子交換樹脂裝在透過性較好的濾布袋中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或 者便池中，吸附等電點(diǎn)低于5的尿蛋白，和/或?qū)㈥栯x子交換樹脂裝在透過性較好的濾布袋 中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便池中，吸附等電點(diǎn)高于8的尿蛋白，和/或?qū)㈥庩栯x子 混合樹脂或兩性樹脂裝在透過性較好的濾布袋中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便池中， 吸附等電點(diǎn)低于5和/或高于8的尿蛋白；(3)放置一定時(shí)間后，尿液流經(jīng)樹脂，尿蛋白被吸附；(4)收集吸附尿蛋白的樹脂，運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理。其中所述樹脂包括普通樹脂和大孔型樹脂，優(yōu)選為大孔型樹脂，可包括陰離子交 換樹脂，陽離子交換樹脂，陰陽離子混合樹脂或者兩性樹脂；樹脂骨架包括聚苯乙烯、丙烯 酸、酚醛樹脂、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、纖維素等任意一種或幾種；配基為磺酸基、羧酸基、 磷酸基等陽離子交換基團(tuán)和伯胺、仲胺、叔胺和季胺基等陰離子基團(tuán)。經(jīng)過對(duì)大量各種類 型吸附劑的篩選，基于對(duì)尿液和稀釋尿液中目標(biāo)蛋白吸附能力的比較，獲得了對(duì)尿激酶、尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等尿蛋白有高吸附量的吸附劑，陽離子樹脂優(yōu)選配基 為-S03_的大孔型聚丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂，陰離子交換樹脂優(yōu)選配基為-N+(CH3)3的 大孔型聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸樹脂，兩性樹脂優(yōu)選聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸樹脂，配基 為(-N+(CH3)3)和C00—。應(yīng)用這些樹脂蛋白交換量大，流速高(吸附力強(qiáng))。所述的兩性樹脂是指樹脂同時(shí)具有陽離子交換基團(tuán)和陰離子交換基團(tuán)。所述的尿蛋白包括等電點(diǎn)低于5的蛋白，也包括等電點(diǎn)高于8的尿蛋白，或者同時(shí) 包括等電點(diǎn)低于5和高于8的尿蛋白；其中，等電點(diǎn)低于5的尿蛋白包括尿胰蛋白酶抑制 齊U、人尿激肽原酶等，等電點(diǎn)高于8的尿蛋白包括尿激酶等。本發(fā)明所述的后處理包括解吸，過濾、超濾濃縮、鹽析等步驟得到含有尿蛋白的蛋 白質(zhì)粗制品以及進(jìn)一步純化得到高純度的尿蛋白的過程。在本發(fā)明尿蛋白粗品原料富集方法中，原尿直接流經(jīng)樹脂，能有效的吸附尿蛋白 中尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶、尿激酶等；經(jīng)測(cè)定，其理化性質(zhì)和生理活性不會(huì)發(fā)生 改變。
本發(fā)明的方法，能有效吸附稀釋尿液中的目標(biāo)蛋白，研究者進(jìn)行了各種吸附劑對(duì) 尿液從原液至稀釋100倍的吸附研究，在此范圍內(nèi)，本發(fā)明優(yōu)選的吸附劑對(duì)目標(biāo)蛋白均可 以進(jìn)行有效吸附。最佳的尿蛋白吸附范圍是從尿原液到稀釋10倍。本發(fā)明利用樹脂的離子交換性質(zhì)，利用尿激酶、尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原 酶等尿蛋白等電點(diǎn)的區(qū)別，將有效成分吸附上樹脂，從而達(dá)到有效吸附的目的。利用本發(fā)明方法所述的陰離子交換樹脂得到的尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原 酶具有以下特性尿胰蛋白酶抑制劑活性大于5萬單位/kg樹脂，人尿激肽原酶活性大于 0. 001PNA單位/kg樹脂，所制備的粗制品尿胰蛋白酶抑制劑活性大于1萬單位/g粗制品， 比活(單位/E2J應(yīng)彡30單位/E28tl,人尿激肽原酶活性大于0. OlPNA單位/g粗制品，比活 (單位 /E280)應(yīng)彡 0. IPNA 單位 /E280。利用本發(fā)明方法所述的陽離子交換樹脂得到的尿激酶具有以下特性尿激酶活性 大于1000單位/kg樹脂，所制備的粗制品尿激酶活性大于1萬單位/g粗制品，比活(單位
/E280)應(yīng)彡 30 單位 /E2800利用本發(fā)明方法所述的兩性離子交換樹脂得到的尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原 酶和尿激酶具有以下特性尿胰蛋白酶抑制劑活性大于3萬單位/kg樹脂，人尿激肽原酶活 性大于0. 001PNA單位/kg樹脂，尿激酶活性大于500單位/kg樹脂。本方法利用特定尿蛋白的等電點(diǎn)性質(zhì)，通過使用包括離子交換樹脂等特定吸附 齊U，對(duì)流經(jīng)吸附劑的包括尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接進(jìn)行有效 吸附，避免了尿液的收集步驟。該方法對(duì)廁所的衛(wèi)生狀況無明顯影響，并大幅度降低了尿液 運(yùn)輸?shù)某杀疽约皫淼囊幌盗协h(huán)境問題。
具體實(shí)施例方式以下用實(shí)例說明本發(fā)明的方法，但本發(fā)明并不限于以下應(yīng)用。實(shí)施例1 大孔陰離子交換樹脂10公斤(聚苯乙烯樹脂，配基為〔-N+(CH3)3〕)，經(jīng)過3%鹽 酸、3% NaOH再生處理，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在衛(wèi)生間的便斗或便池中(每天可流過80L尿液的便池放1公斤樹脂)，尿液或被水稀 釋后的尿液流過樹脂；24小時(shí)后，將吸附尿蛋白的樹脂集中到加工點(diǎn)，用10%硫酸銨溶液 進(jìn)行洗脫；將洗脫液加硫酸銨粉末至飽和，靜置2小時(shí)，硅藻土過濾收集沉淀部分，沉淀吹 干，得到尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶粗制品120克。每克粗制品含尿胰蛋白酶抑制 劑31000U，含人尿激肽原酶0. 3PNA。實(shí)施例2: 將配基為-N+(CH3)3的聚苯乙烯樹脂、丙烯酸樹脂、酚醛樹脂、葡聚糖、殼聚糖、纖維 素吸附劑各1公斤，分別再生、平衡處理后，按實(shí)施例1的方法進(jìn)行尿蛋白吸附和洗脫，結(jié) 果配基為-N+(CH3)3的聚苯乙烯樹脂、丙烯酸樹脂分別得到10克、9. 5克粗制品，尿胰蛋白 酶抑制劑總活性分別為325000U和287000U，含人尿激肽原酶3. 2PNA, 2. 6PNA，其它吸附劑 尿胰蛋白酶抑制劑總活性均低于200000U，人尿激肽原酶低于2PNA。實(shí)施例3 大孔陽離子交換樹脂20公斤(丙烯酸樹脂，配基為-S03_)，經(jīng)過3%鹽酸、3% NaOH 再生處理，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在衛(wèi)生間 的便斗或便池中(每天可流過30L尿液的便池放1公斤樹脂)，尿液或被水稀釋后的尿液流 過樹脂；24小時(shí)后，將吸附尿蛋白的樹脂集中到加工點(diǎn)，用10%硫酸銨溶液進(jìn)行洗脫；將洗 脫液加硫酸銨粉末至飽和，靜置2小時(shí)，硅藻土過濾收集沉淀部分，沉淀吹干，得到尿激酶 粗制品50克。每克粗制品含尿激酶36000U。實(shí)施例4 將配基為磷酸根、-C00_、_S03_的聚苯乙烯樹脂、丙烯酸樹脂、酚醛樹脂、葡聚糖、殼 聚糖、纖維素吸附劑各1公斤，分別再生、平衡處理后，按實(shí)施例3的方法進(jìn)行尿蛋白吸附和 洗脫，結(jié)果配基為-SO3-的聚苯乙烯樹脂、丙烯酸樹脂得到6. 2克、5. 1克粗制品，尿激酶活 性為210000U和185000U，其它吸附劑制備的尿激酶粗制品活性均低于150000U。實(shí)施例5 兩性樹脂5公斤(聚苯乙烯樹脂，配基為〔-N+ (CH3) 3〕和C00_)，經(jīng)過3 % NaOH再生 處理，水沖至中性，裝入孔徑為60目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在衛(wèi)生間的便 斗或便池中(每天可流過100L尿液的便池放1公斤樹脂)，尿液或被水稀釋后的尿液流過 樹脂；24小時(shí)后，將吸附尿蛋白的樹脂集中到加工點(diǎn)，用10%硫酸銨溶液進(jìn)行洗脫；將洗脫 液加硫酸銨粉末至飽和，靜置2小時(shí)，硅藻土過濾收集沉淀部分，沉淀吹干，得到尿胰蛋白 酶抑制劑、人尿激肽原酶、尿激酶粗制品52克。每克粗制品含尿胰蛋白酶抑制劑27000U，含 人尿激肽原酶0. 15PNA，含尿激酶31000U。尿胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定方法見國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH09342008。尿激酶活性測(cè)定方法見《中華人民共和國藥典》。人尿激肽原酶活性測(cè)定方法見國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH30442005。
權(quán)利要求
一種直接在小便池或便斗中用吸附劑吸附尿液或者稀釋尿液中中的尿蛋白，并將吸附尿蛋白的吸附劑運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理的尿蛋白富集方法，包括如下步驟(1)將吸附劑再生處理，水沖至中性；(2)將處理好的吸附劑裝在濾布袋中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便池中；(3)尿液流經(jīng)吸附劑，尿蛋白被吸附；(4)收集吸附尿蛋白的吸附劑，運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿蛋白富集方法，其特征在于吸附劑包括樹脂、凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的尿蛋白富集方法，其特征在于樹脂為大孔型樹脂，包括陰離 子交換樹脂，陽離子交換樹脂，陰陽離子混合樹脂或者兩性樹脂；樹脂骨架材料包括聚苯乙 烯、丙烯酸、酚醛樹脂、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、纖維素中任意一種或幾種；配基為包括磺酸 基、羧酸基、磷酸基的陽離子交換基團(tuán)或?yàn)榘ú?、仲胺、叔胺、季胺基的陰離子基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的尿蛋白富集方法，所述的陽離子樹脂為配基為-S03_的大孔 型聚丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂，陰離子交換樹脂為配基為-N+(CH3)3的大孔型聚苯乙烯樹 脂和聚丙烯酸樹脂，兩性樹脂為聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸樹脂，配基為〔-n+(ch3)3〕和C00—。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的尿蛋白富集方法，其特征在于包括等電 點(diǎn)低于5的尿蛋白和/或等電點(diǎn)高于8的尿蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的尿蛋白富集方法，其特征在于等電點(diǎn)低于5的尿蛋白包括 尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶；等電點(diǎn)高于8的尿蛋白包括尿激酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的尿蛋白富集方法，其特征在于包括但不限于如下步驟(1)將樹脂再生處理，水沖至中性；(2)將陰離子交換樹脂裝在透過性較好的濾布袋中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便 池中，吸附等電點(diǎn)低于5的尿蛋白，和/或?qū)㈥栯x子交換樹脂裝在透過性較好的濾布袋中， 直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便池中，吸附等電點(diǎn)高于8的尿蛋白，和/或?qū)㈥庩栯x子混合 樹脂或兩性樹脂裝在透過性較好的濾布袋中，直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便池中，吸附 等電點(diǎn)低于5和/或高于8的尿蛋白；(3)尿液流經(jīng)樹脂，尿蛋白被吸附；(4)收集吸附尿蛋白的樹脂，運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的尿蛋白富集方法，其特征在于離子交換樹脂或兩性樹脂的骨 架材料包括聚苯乙烯、丙烯酸、酚醛樹脂、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、纖維素等任意一種或幾 種；配基為包括磺酸基、羧酸基、磷酸基的陽離子交換基團(tuán)或?yàn)榘ú?、仲胺、叔胺、季?基的陰離子基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的尿蛋白富集方法，其中所述的兩性樹脂是指同時(shí)具有陽 離子交換基團(tuán)和陰離子交換基團(tuán)的樹脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的尿蛋白富集方法，其特征在于等電點(diǎn)低于5的尿蛋白 包括尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶；等電點(diǎn)高于8的尿蛋白包括尿激酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種直接在小便池或便斗中用吸附劑吸附尿液中的尿蛋白，并將吸附尿蛋白的吸附劑運(yùn)至加工點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)處理的尿蛋白富集方法。本方法利用特定尿蛋白的等電點(diǎn)性質(zhì)，通過使用包括離子交換樹脂等特定吸附劑，對(duì)尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步驟。該方法對(duì)廁所的衛(wèi)生狀況無明顯影響，并大幅度降低了尿液運(yùn)輸?shù)某杀疽约皫淼囊幌盗协h(huán)境問題。
文檔編號(hào)C07K1/22GK101863974SQ200910157899
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者傅和亮, 王曉巖, 田友軍, 苗丕渠, 許文勤, 鄭少亮 申請(qǐng)人:廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司;廣州市博普生物技術(shù)有限公司