專利名稱：：受體、其應(yīng)用以及小鼠抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在快速增殖的細(xì)胞表面，特別是胃癌細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的受體，其應(yīng)用，以及特異性結(jié)合在其上的小鼠抗體的結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
：采用從雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體用于臨床和科學(xué)試驗(yàn)已廣為人知。將由B細(xì)胞雜種細(xì)胞產(chǎn)生的人單克隆抗體用于治療腫瘤、病毒和微生物感染、抗體生成減少的B細(xì)胞免疫缺乏癥和其它免疫系統(tǒng)機(jī)能障礙大有前途。胃癌是全世界最頻繁發(fā)生的癌癥類型之一。根據(jù)Lauren的文章“Thetwohistologicallymaintypesofgastriccarcinoma，，，ActaPath.Microbiol.Scand.64331-49，胃癌細(xì)胞在組織學(xué)上分為彌散型腺癌細(xì)胞和腸腺癌細(xì)胞。腸胃癌常伴有慢性B型胃炎，特別是伴有腸化生，其被認(rèn)為是發(fā)育不良病變和胃癌的前兆。這兩種類型的區(qū)別也表顯為患有彌散型癌癥的病人通常為A型血，從這一點(diǎn)可以看出遺傳因素對發(fā)癌率的影響，而環(huán)境因素如幽門螺桿菌感染對于腸型癌癥的發(fā)生的影響也可能很顯著。在西方，胃腺癌的發(fā)病人數(shù)已在不斷減少，但在東方發(fā)病人數(shù)卻在日益增多。胃癌的發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素的過程(Correa，1992，CancerRes.526735-6740)。盡管對其分子作用機(jī)制所知甚少，但已經(jīng)過明確證實(shí)如高鹽攝入量、酒精、亞硝胺、以及幽門螺桿菌(H.pylori)感染等因素與引發(fā)胃癌有關(guān)。由于幽門螺桿菌感染與胃炎，發(fā)育不良以及胃癌的發(fā)展有很大聯(lián)系，這種細(xì)菌已被WHO歸類為第1類致癌物質(zhì)。幽門螺桿菌在粘膜環(huán)境下直接導(dǎo)致嚴(yán)重的癌癥前期細(xì)胞病變，還是造成自身抗體增加的原因，在胃炎和胃癌患者體內(nèi)經(jīng)?？捎^測到這種自身抗體增加(Negrini等，1996，Gastroenterol.Ill:655_665)。這些抗體可導(dǎo)致胃損傷和胃上皮細(xì)胞凋亡(Steiniger等，1998，VirchowsArch.43313-18)?？乖牟糠中再|(zhì)至今仍是未知的。在胃粘膜或胃癌瘤中經(jīng)常可發(fā)現(xiàn)胃H+/K(+)-ATP酶抗體(Claeys等，1998，Gastroenterology115340-347)，白介素-8(Crabtree等，1993，Scand.J.Immunol.37:65_70；Ma等，1994Scand.J.Gastroenterol.29:961_965)以及路易斯血型抗原(Appelmelk等，1997，Trends.Microbiol.5:70_73)。直到現(xiàn)在，治療方法還僅限于胃切除術(shù)和淋巴結(jié)切除術(shù)；不過，由于預(yù)后能力還很差，就需要有新的伴隨療法。免疫研究表明，即使在免疫系統(tǒng)不能有效抗擊惡性細(xì)胞的情況下，仍可測量到細(xì)胞和體液的活性，但其活性不足以破壞腫瘤細(xì)胞。目前有效的方法是分離出由患者的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體，以適當(dāng)?shù)姆椒◤?fù)制該抗體，并用于治療。這樣，例如從患有肺癌、食道癌、和結(jié)腸癌的病人中產(chǎn)生的抗體被分離出來，并可從這些抗體衍生出人的單克隆抗體，它們可以，例如，直接影響腫瘤細(xì)胞的分化和生長。細(xì)胞凋亡是漸進(jìn)的細(xì)胞死亡，是細(xì)胞的自毀，通過DNA破碎，細(xì)胞萎縮和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，隨之是細(xì)胞破碎和形成膜結(jié)合囊泡或凋亡體而完成。凋亡，細(xì)胞死亡的生理形式，保證了快速干凈地清除不需要的細(xì)胞，而不會引發(fā)炎癥過程或組織創(chuàng)傷，如在壞死的情況下發(fā)生的。在病理?xiàng)l件下，細(xì)胞凋亡還可用于除去惡性細(xì)胞，如癌癥前體細(xì)胞。它可通過各種不同的刺激引發(fā)，如通過細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞或細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子、糖皮質(zhì)激素類以及抗體。凋亡是真核細(xì)胞死亡的最經(jīng)常原因，且在胚胎形成、變態(tài)和組織萎縮時(shí)發(fā)生。細(xì)胞表面的凋亡受體，如NGF/TNF族受體，主要在淋巴細(xì)胞上表達(dá)，但也可在各種其它細(xì)胞類型中找到，因此它們不適于治療癌癥。特別是，這些受體的配體和抗體在體內(nèi)試驗(yàn)中可導(dǎo)致肝損傷。因此，具有凋亡功能的特定腫瘤受體尤其重要。
發(fā)明內(nèi)容在最近的出版物中，我們描述了人抗體103/51，該抗體是從患有彌散型腺癌的胃癌病人中分離得到的，其與幽門螺桿菌和胃癌細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)(Vollmers等，1994，Cancer74=1525-1532)0在所有的測試中，都用到了已知的胃腺癌細(xì)胞系23132，該細(xì)胞系保存在DSMZ-德國微生物保藏及細(xì)胞培養(yǎng)股份有限公司(DSMZ-GermanCollectionofMicroorganismsandCellCulturesGmbH),MascheronderWeglb,38124Braunschweig,保藏號為ACC201。在低劑量時(shí)，該抗體通過結(jié)合在一個(gè)130kD的膜受體上對胃癌細(xì)胞在體外有有絲分裂作用(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)。對該抗體基因區(qū)域的測序識別出抗體103/51是自體抗體。免疫組織化學(xué)研究表明該抗體與胃癌細(xì)胞和腺胃細(xì)胞反應(yīng)劇烈。單克隆抗體103/51的細(xì)胞受體以前是未知的。在產(chǎn)生本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)過程中，我們可以識別出這種細(xì)胞受體。不過，這個(gè)識別過程很困難。一方面，在蛋白質(zhì)印記分析中單克隆抗體103/51僅在非常特別的嚴(yán)格條件下才與其受體反應(yīng)。另一方面，可發(fā)現(xiàn)通過人工變性作用其與一系列其它蛋白發(fā)生非特異性反應(yīng)。序列分析表明該受體相應(yīng)于CFR-I蛋白，但又不與該蛋白相同。此外，本申請要求保護(hù)具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)于已知的CFR-I的決定簇(配體)的糖蛋白類化合物。特別是，要求在本申請中定義為對應(yīng)性的同源性在一級氨基酸序列中至少為80%。因此，該受體與CFR-I是同種型。另外，要求特異性結(jié)合在人抗體103/51和/或鼠類抗體58/47-69上。如果在糖蛋白上的特異性結(jié)合位點(diǎn)是碳水化合物殘基，即糖殘基，則其尤其令人感興趣。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，CFR-I蛋白具有附件S細(xì)胞系23132的氨基酸序列為其決定簇?？贵w103/51的細(xì)胞受體是CFR-I蛋白的同種型，對腫瘤細(xì)胞，特別是胃癌細(xì)胞有特異性，而不會對正常組織作用。該同種型的特異性受體的性質(zhì)是基于經(jīng)N-聯(lián)接連接在蛋白質(zhì)骨架上的特殊糖結(jié)構(gòu)。腫瘤特異性受體可用于識別特異性結(jié)合的配偶體的方法中。按照本發(fā)明，受體的特異性結(jié)合配偶體是選擇性地結(jié)合在CFR-I的腫瘤特異性糖結(jié)構(gòu)上的化合物，且優(yōu)選具有誘導(dǎo)凋亡的能力。這些特異性結(jié)合配偶體可用于生產(chǎn)治療腫瘤的藥物以及生產(chǎn)診斷劑。所述蛋白化合物通過純化、測序和轉(zhuǎn)染確定為CFR-I的同種型。對抗原103/51的特異性通過從具有識別反應(yīng)和功能的純化分子生產(chǎn)鼠抗體、經(jīng)免疫組織化學(xué)染色、以及對兩個(gè)CFR-I陰性細(xì)胞系的MTT測試而確定。通過人和鼠的抗體而確定的CFR-I分子的同種型定位于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜且具有不同于以前所述CFR-I的表達(dá)方式(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.12:5600_5609)。CFR-1，從雞成纖維細(xì)胞分離出來的高親和力FGF-結(jié)合蛋白(FGF=成纖維細(xì)胞生長因子)(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.125600-5609)，結(jié)合在許多FGFs上且據(jù)稱在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖方面起作用。在中國倉鼠卵細(xì)胞(CHO)中，在高爾基體中發(fā)現(xiàn)CFR-I(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.12:5600_5609)，不過它也可以變異的形式被分泌出來(Zuber等，1997，J.Cell.Physiol.170:217-227)。取決于器官，CFR-I的兩種檢測到的變體，ESL-1(E-選擇蛋白-配體1)和MG-160(膜唾液酸糖蛋白160)具有80%-95%的序列同源性(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.12:5600_5609；Stieber等，1995，Exp.Cell.Res.219562-570；Steegmaier等，1995，Nature373:615_620；Mourelatos等，1996，DNACellBiol.151121-1128)而且似乎與其它已知的蛋白質(zhì)不具有任何序列同源性。CFR-I及其同源物的功能和細(xì)胞分布相對是未知而且矛盾的。已有報(bào)道說MG-160，一種從大鼠大腦中純化而得的中間高爾基唾液酸糖蛋白，在細(xì)胞內(nèi)FGF運(yùn)輸中起作用(Zuber等，1997，J.Cell.Physiol.170217~227)。近來的發(fā)現(xiàn)表明所述蛋白的定位并不限于高爾基體。如果截短C-末端，該蛋白也可定位于質(zhì)膜和絲足(Gonatas等，1998，J.Cell.Sci.Ill:249_260)。這與下列發(fā)現(xiàn)相一致，所述發(fā)現(xiàn)是從小鼠嗜中性粒母細(xì)胞(32Dcl3)分離出來的第三種同源體ESL-1，其既定位于高爾基體也定位于微絨毛細(xì)胞的表面(Steegmaier等，1997，J.Cell.Sci.110687-694，Gonatas等，1998，J.Cell.Sci.Ill249-260)。ESL-I被識別為嗜中性粒細(xì)胞中E-選擇蛋白的配體，其大約分子量為150kD。與抗ESL-I抗體的免疫沉淀反應(yīng)表明該蛋白未經(jīng)定義的同種型可從各種細(xì)胞中沉淀出來，包括一些癌細(xì)胞系(Steegmaier等，1995，Nature373:615_620)。由于CFR-I主要在癌細(xì)胞膜上分布，我們認(rèn)為所描述的受體是CFR-I的同種型。CFR-I及其同源物的可變的細(xì)胞分布可能與所述及的結(jié)果有關(guān)并且對其它蛋白來說是一種已知的現(xiàn)象(Smalheiser,1996,Mol.Biol.Cell7:1003-1014)?？勺兊姆植伎赡苁菒盒约?xì)胞中不同的糖基化模式引起的，其可導(dǎo)致向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。組織分布表明CFR-I分子與通過用抗體Ki67著色證明的細(xì)胞活化和增殖相關(guān)(Ramires等，1997，J.Pathol.18262~67)。正常的胃粘膜不會以可測量的量表達(dá)該受體，但幽門螺桿菌浸潤的上皮細(xì)胞和發(fā)育不良的上皮細(xì)胞具有該抗原。兩種組織都增殖且可能是胃癌的前體。為了理解高效性，要提到的重要一點(diǎn)是與在健康細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的CFR-I的結(jié)構(gòu)相比，所表征的同種型并未在健康細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而是全部在快速繁殖的細(xì)胞，即快速分化的細(xì)胞如在腫瘤生長及其相應(yīng)前體階段發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。受體的功能基本上以其被用作細(xì)胞攝入養(yǎng)分的能量受體且其尤其在頻繁分化的細(xì)胞，如癌細(xì)胞中具有高含量。特別要提到的是該受體不僅可在胃癌中應(yīng)用，而且也可應(yīng)用于所有具有基本相同的反應(yīng)機(jī)制的上皮腫瘤中。除了胃腫瘤，已證明這些受體還存在于下列腫瘤的癌變組織中食道、胃、腸、直腸、肝臟、膽囊、胰腺、肺、支氣管、乳房、宮頸、前列腺、胃賁門、Barrett's、卵巢和/或子宮。連接在本發(fā)明的受體上的對腫瘤有效的抗體，因此具有在癌細(xì)胞(非正常細(xì)胞)上的定靶活性。受體結(jié)構(gòu)的糖蛋白可經(jīng)其大約130kD的分子量進(jìn)行識別，該分子量可采用已知的方法，如用凝膠電泳來測定。術(shù)語“大約”基于以下本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)可的事實(shí)，即這些測定大小的類型無論如何都不精確，測定分子大小的方法的變化或差別會導(dǎo)致測量值的差別。應(yīng)用該受體的最重要的領(lǐng)域是診斷和治療。在預(yù)防性應(yīng)用中，將受體以藥用劑量給病人用藥，目的是刺激抗體，以便借助于受體達(dá)到接種疫苗的目的?？贵w負(fù)責(zé)除去任何產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞。不過，即使已經(jīng)存在腫瘤細(xì)胞，施用受體也是一種可能的治療方法。施用受體促進(jìn)并增強(qiáng)了抗體的形成，因此增加了腫瘤細(xì)胞的凋亡或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。由于受體的阻斷作用導(dǎo)致生長停止，細(xì)胞“餓死”。到目前為止的分析表明該受體經(jīng)證實(shí)尤其適合于治療腫瘤前體。對于胃的疾病，該受體適于治療胃粘膜發(fā)育異常和/或胃的腸上皮化生，和/或治療與幽門螺桿菌有關(guān)的胃粘膜炎，以及治療胃管狀和管狀絨毛(tubulovillfiser)腺瘤。該受體也可用于下列結(jié)腸疾病，特別是如結(jié)腸管狀腺瘤、結(jié)腸絨毛腺瘤、以及潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)育異常。該受體還適用于食道Barrett's發(fā)育異常和Barrett‘s化生。該受體還適用于治療下列宮頸疾病宮頊上皮內(nèi)瘤樣病變I、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變II和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變III。最后，上述受體還適用于支氣管鱗片狀上皮化生和鱗片狀上皮發(fā)育異常。由于上文所述的作用機(jī)制，該受體原則上適用于治療食道、胃、腸、直腸、肝臟、膽囊、胰腺、肺、支氣管、乳房、宮頸、前列腺、胃賁門、Barrett's、卵巢、和/或子宮的腫瘤。將該受體用于診斷目的時(shí)利用了由于特異性抗原/抗體相互作用，抗體結(jié)合在受體上的能力。以這種方式，相應(yīng)抗體的存在、定位和/或數(shù)量可從其結(jié)合受體的能力得到。以同樣的反應(yīng)機(jī)制，該結(jié)合能力可用于檢測受體。特別地，如果抗體是腫瘤抗體，其可用于檢測是否存在腫瘤。尤其該受體可能被用作腫瘤標(biāo)記物。以精制物的形式，該受體可用于生產(chǎn)抗腫瘤藥物，其中測定有潛在抗腫瘤活性的化合物特異性結(jié)合在該受體上的能力，如果得到陽性結(jié)果，即發(fā)生了結(jié)合，則將該化合物用于藥品應(yīng)用。當(dāng)然，如通常一樣，對于生產(chǎn)市集藥物，必需合適的制劑和加入常用的輔料。特別要提到的是不僅考慮到將人抗體借助于上文所述的受體用于生產(chǎn)抗癌藥物，還考慮到了用小鼠抗體和/或任何隨意種類的人化的抗體。還考慮到了用抗體片段如Fab和F(ab)2*/或Fab’片段，如通過抗體的蛋白水解裂解得到的。還包括單株抗體和/或四聚的和/或二聚的抗體形式和/或雙特異性抗體。另外，已知在小鼠中產(chǎn)生免疫性的人腫瘤抗原被用于生產(chǎn)單克隆小鼠抗體而且其能夠特異性識別人抗原，并因此適合用于治療人的疾病。本發(fā)明的目的是確定該受體的結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。然而，重復(fù)向人體注入“外來的”抗體和/或小鼠抗體很成問題，因?yàn)檫@會導(dǎo)致不利的過敏性反應(yīng)和循環(huán)抗體的清除率升高，結(jié)果抗體不能達(dá)到其靶位。由于這些原因，需要重新檢驗(yàn)小鼠抗體的治療適用性。雖然如此，與診斷方法有關(guān)的適用性并未加以限制。也存在研制人化的小鼠抗體并將之用于治療疾病的可能。重要的是不僅已經(jīng)存在的腫瘤，而且癌前結(jié)構(gòu)都可借助于這些診斷方法進(jìn)行確定。除了上文所述的受體，也要求保護(hù)特異性結(jié)合在所述受體上小鼠抗體，其結(jié)構(gòu)由附件A和B定義。沒有復(fù)制所有抗體都相同的區(qū)域；對每一單個(gè)抗體的特征區(qū)域要求保護(hù)并顯示其結(jié)構(gòu)。結(jié)果是，對受體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述，其被指定為CFR-I的同種型，該受體使得不僅可對腫瘤而且可對癌前結(jié)構(gòu)進(jìn)行治療和診斷。另外，還描述了特異性結(jié)合在該受體上的小鼠抗體的結(jié)構(gòu)。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和抗體純化所有的試驗(yàn)都采用已知的胃腺癌細(xì)胞系23132(HenSel等，1999，Int.J.Cancer81:229-235)。在補(bǔ)充了10%FCS和青霉素/鏈霉素(均為)的RPMI-1640(PAA，Vienna,Australia)中培養(yǎng)細(xì)胞至80%融合。對于所述試驗(yàn)，將細(xì)胞用胰島素/EDTA分離并在應(yīng)用前用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次。人雜腫瘤細(xì)胞系103/51是按Vollmers等，1994，Cancer74:1525_1532所述方法進(jìn)行生產(chǎn)和培養(yǎng)的。IgM抗體的純化如別處所述的方法進(jìn)行(Vollmers等，1998，Oncol.Rep.5:549_552)。膜萃取物的制備如Hensel等描述的方法(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)，用細(xì)胞系23132從腫瘤細(xì)胞分離出膜蛋白。簡言之，將融合的腫瘤細(xì)胞用PBS洗兩次，用刮細(xì)胞器收集并離心分離，再重新懸浮于低滲緩沖液中(20mMHEPES,3mMKCl,3mMMgCl2)。在冰上培養(yǎng)1511^11后，隨之超聲處理51^11，在10，00(^離心分離lOmin，以使胞核以離心餅形式沉出。在外開式轉(zhuǎn)子中在100，OOOg將上清液離心分離30min以使膜以離心餅形式沉出。在用低滲液洗滌離心餅，將其重新懸浮于膜溶解緩沖液中(50mMHEPESpH7.4,0.lmMEDTA,10%甘油，和TritonX-100)。向所有溶液中加入蛋白酶抑制劑(Boehringer,Mannheim，德國)。蛋白質(zhì)印跡法在其他地方所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下通過10%的SDS-PAGE凝膠分離和進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法試驗(yàn)(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)。簡言之，用含有2%低脂奶粉的PBS阻斷有印記的硝化纖維膜，隨后用10μg/ml純化的抗體103/51培養(yǎng)1小時(shí)。在用PBS+0.05%吐溫-20洗滌三次后，培養(yǎng)次級抗體(過氧化物酶偶合兔抗人IgM抗體(Dianova，Hamburg，德國))。借助于來自Pierce(KMF，St.Augustin，德國)的超信號化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測該反應(yīng)?？乖?03/51的純化該抗原的純化通過應(yīng)用Pharmazia(Freiburg，德國)FPLC單元經(jīng)柱色譜而完成。對于尺寸排除色譜，將5mg膜制品裝載到PharmaziaSuperdex200柱(XK16/60)上并用緩沖液A(100mMTris/Cl,pH7.5,2mMEDTA,40mMNaCl,1%TritonX-100)洗脫。然后將洗脫液分級，并用蛋白質(zhì)印跡分析檢測其與抗體103/51的反應(yīng)。用緩沖液A把陽性組分裝載IlJMonoQ(5/5)柱上。用緩沖液B(100mMTris/Cl,pH7.5,IMNaCl,2mMEDTA，IMNaCl,1%TritonX-100)線性梯度洗脫結(jié)合蛋白，分級并用Coomassie染色的SDS-PAGE和用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測。從凝膠上挖出陽性帶，進(jìn)行測序或用于使小鼠免疫。MALDI肽定位圖將感興趣的帶切下來并將之割成大約ImmXImm的小塊。洗滌凝膠塊，用DTT還原，用碘乙酰胺進(jìn)行S-烷基化，用胰蛋白酶(未修飾的，測序級，Boehringer)如其他地方所述的方法(Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68850-858)將凝膠內(nèi)物質(zhì)消化。在37°C消化3小時(shí)后，除去0.3μ1的消化液，并在配有延遲萃取器(Bruker-Franzen，Bremen,德國)的BrukerReflexMALDI-TOF上進(jìn)行MALDL肽質(zhì)譜測定。采用薄膜技術(shù)進(jìn)行樣品制備(Jensen等，1996，Rapid.Commun.Mass.Spectrom.10:1371_1378)。對此應(yīng)用胰蛋白酶肽質(zhì)量以通過發(fā)明人開發(fā)的PeptideSearch的軟件程序研究探索的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫。CFR-I克降反義載體和轉(zhuǎn)染如文獻(xiàn)所述分離RNA，合成cDNA，和進(jìn)行PCR(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81229-235)。簡言之，為進(jìn)行第802-1699堿基對的897bp片段的PCR擴(kuò)增，采用了下列引物CFR-5，GCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAA3，，CFR-Rev5，TGGCACTTGCGGTACAGGACAG3，。采用下列循環(huán)分布進(jìn)行擴(kuò)增95°C，2分鐘，隨之是94°C，30秒；60°C，30秒；72°C，60秒；以及72°C，4分鐘的35次循環(huán)?？寺∪隤CR-ScriptAmpSK(+)載體以及DNA測序如前述文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)。插入物被亞克隆到pHook-2載體(Invitrogen,Leek,Netherlands)中，而克隆再通過測序進(jìn)行檢測。用pHook-抗CFR-I轉(zhuǎn)染細(xì)胞系23132用Primefaktor試劑(PQLab，ErIangen，德國)按照供應(yīng)者的使用手冊完成。簡言之，將質(zhì)粒DNA稀釋至10yg/ml，以110的比例將激發(fā)因子試劑加入無血清培養(yǎng)基中。將稀釋的質(zhì)粒DNA(450μ1)，稀釋的Primefector試劑(90μ1)，和無血清培養(yǎng)基(460μ1)混合并在室溫(RT)下培養(yǎng)。60毫升的細(xì)胞培養(yǎng)皿(70%融合)用無血清基洗兩次，然后逐滴加入Primefector/DNA混合物。將細(xì)胞在37°C和7%的CO2中培養(yǎng)18小時(shí)，然后用含有10%FCS的生長培養(yǎng)基替代無血清培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，然后研究CFR-I表達(dá)。流式細(xì)胞測量轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)皿中分離出細(xì)胞系23132，洗滌并隨后在冰上與抗體103/51或與人同型對照抗體(Chromopure人IgM)—起培養(yǎng)15分鐘，然后與FITC標(biāo)記的兔抗人IgM抗體(Dianova)—起在冰上培養(yǎng)15分鐘?？贵w最優(yōu)選在含有0.01%疊氮化鈉的PBS中稀釋。通過流式細(xì)胞計(jì)(FACScan；BectonDickinson,USA)對細(xì)胞進(jìn)行分析。糖苷酶分析將分離下來并洗過的細(xì)胞重新懸浮于含有10%FCS的RPMI-1640中，在冰上培養(yǎng)1小時(shí)，然后計(jì)數(shù)，制備Cytospins。空氣干燥后，將Cytospins制品用丙酮固定(10分鐘)，洗滌，與20μυ/πι10-糖苷酶或5mU/mlN-糖苷酶(Boehringer)在37°C培養(yǎng)4小時(shí)。然后洗滌載玻片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。為了膜蛋白的脫糖基化，將膜萃取物與在脫糖基化緩沖液(50mMP00-緩沖液，pH7.4)中稀釋的lmU/mlN-糖苷酶一起在37°C培養(yǎng)16小時(shí)。作為對照，將萃取物單獨(dú)與脫糖基化緩沖液一起培養(yǎng)。然后用前文所述的方法通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分離萃取物。鼠單克降抗體的制備17天內(nèi)用5iig純化的抗體103/51的抗原對BALB/c小鼠免疫兩次，在第二次免疫后4天殺死。將其脾臟機(jī)械破碎并與前文述及的1X107個(gè)NS0細(xì)胞(Vollmers等，1985，Cell40:547-557)融合。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法和蛋白質(zhì)印跡分析中的反應(yīng)測定產(chǎn)生抗體的雜交瘤。具有陽性反應(yīng)活性的克隆58/47-69用作進(jìn)一步試驗(yàn)。石蠟切片的免疫組織化學(xué)染代把嵌入石蠟的具有腫瘤細(xì)胞的人胃粘膜切片(5iig)除去石蠟，并用在PBS中稀釋的BSA(15mg/ml)阻斷30分鐘。將該切片用被BSA/PBS(Dako，Hamburg，德國)按115稀釋的雜種細(xì)胞103/51，或58/47-69，Ki67(Loxo，Dossenhein，德國)或小鼠抗細(xì)胞角蛋白8抗體的上清液在加濕的孵化器中培養(yǎng)2小時(shí)。然后用Tris/NaCl洗滌三次，隨之與按150在含有兔血清(對于抗體103/51)的PBS或含有人AB血漿(對于抗體58/47-69和抗細(xì)胞角蛋白)的PBS中稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人或兔抗小鼠結(jié)合物(DakO)—起培養(yǎng)。在用Tris/NaCl洗滌三次和在PBS中培養(yǎng)10分鐘后，在室溫下用二氨基聯(lián)苯胺(0.05%)-過氧化氫(0.02%)染色10分鐘。在流動的自來水中停止反應(yīng)，用蘇木紫對切片進(jìn)行復(fù)染色。活細(xì)胞和丙酮固定的細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染餼為對活細(xì)胞進(jìn)行染色，將細(xì)胞分離出來，洗滌并稀釋至1X106個(gè)細(xì)胞/ml。在1500g將1ml細(xì)胞懸浮液離心分離5分鐘。加入完全用RPMI稀釋至40ug/ml的抗體至最終體積為1ml并在冰上培養(yǎng)90分鐘。然后在1500g5分鐘使細(xì)胞離析成餅然后重新懸浮于500iURPMI中。用200iU細(xì)胞懸浮液，制得cytopsin制品并空氣干燥30分鐘。將細(xì)胞在丙酮中固定30分鐘并用Tris/NaCl洗滌三次。將HRP偶合的兔抗人IgM(DAKO)用PBS/BSA(0.1%)按150稀釋并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。三次洗滌后，按上文所述進(jìn)行染色。為對丙酮固定的細(xì)胞進(jìn)行染色，制備了Cytospins，按上文所述的方法在室溫下空氣干燥并在丙酮中固定。然后，將Cytospins用PBS/BSA(0.1%)阻斷15分鐘并與10yg/ml初級抗體培養(yǎng)30分鐘，隨后洗滌三次。按上文所述的方法與次級抗體一起培養(yǎng)和進(jìn)行染色。MTT-增殖試驗(yàn)按照已有描述的方法(Vollmers等，1994，Cancer741525-1532)對已知的細(xì)胞系23132進(jìn)行MTT試驗(yàn)。簡言之，將受胰蛋白酶作用的細(xì)胞生長培養(yǎng)基中稀釋至1X106個(gè)細(xì)胞/ml，然后向96孔板的每一孔中加人50yl細(xì)胞懸浮液。然后將用生長培養(yǎng)基稀釋至指定濃度的50yl抗體加入孔中，將該板在增濕的孵化器中于37°C培養(yǎng)一或兩天。為了測量，向每一孔中加入50illMTT(3(4，5二甲基噻唑)-2，5二苯基四唑溴化物)溶液(5mg/ml))，將所述96孔板培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，在800g將培養(yǎng)板離心分離5分鐘，除去MTT溶液，將染色的細(xì)胞餅溶于150ill二甲基亞砜中，測定其在波長540nm和690nm的吸光度。測定CFR-1序列的方法借助于來自Quiagen的RNeasy試劑盒制備用于cDNA合成的RNA。制備時(shí)，用冰冷的PBS將1X106個(gè)細(xì)胞洗滌兩次，并在1000Xg離心5分鐘得到細(xì)胞餅，按照制造商的說明書制得RNA。將5iig1^八(1-5111溶液)禾口1111寡-(11\5(1118/111)以及2ill任意引物(40uM)混合并用H20添至總體積為8ill。將RNA在65°C變性10分鐘，隨后將樣品在冰上冷卻。然后向其中逐滴加入17iUMastermix，其由5.2ylDEPC-H20,5u15X逆轉(zhuǎn)9CN101812133A說明書8/28頁錄酶緩沖液，2.5u1dNTPs(各10mM),2.5u1DTT(250mM),0.8u1RNasin(400U)，禾口1ii1M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U)組成。cDNA的合成在37°C進(jìn)行了70分鐘，隨后通過加熱至95°C5分鐘終止反應(yīng)。將1-5u1cDNA與PCRMastermix混合并添加水直至總體積為25yl。PCRMastermix包括2.5ii110XTaq-聚合酶緩沖液，0.5ii110mM的NTPs，1.5-2ii125mM的MgCl2，各0.5iU20pM的3’和5’引物，以及0.2illTaq聚合酶(1U)。各種PCR產(chǎn)物的放大條件列于下表中。用于放大各種cDNAs應(yīng)用的PCR程序列表產(chǎn)物退火溫度MgCl2延伸時(shí)間循環(huán)數(shù)產(chǎn)品大小[°C][mM][sec][bp]片段1551，754540691片段2601,54540898CFR片段3552，04540739片段4552，04540941片段5552，04540750引物序列用于PCR的;寡核苷酸的序列CFRCFR-Forl5‘0GCAGCTTCAGGAGCAACAGCA3'CFR-Revl5‘CAGCTCAGCCACCCGGAGAATG3'CFR-For25‘GCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAA3'CFR-Rev25‘TGGCACTTGCGGTACAGGACAG3'CFR-For35‘GAACACCGTCTCTTAGAGCTGC3'CFR-Rev35‘GCTTCCTGCAGAGTGTCATTGC3'CFR-For45‘GGAGGACGTGTTGAAGCTTTGC3'CFR-Rev45‘CCAGGGCACAAGCAGTATGAAG3'CFR-For55‘CAACAGCAGACAGGTCAGGTGG3'CFR-Rev55‘CCGGAAGTTCTGTTGGTATGAG3'用AppliedBiosystems公司的自動化序列分析儀進(jìn)行測序。下列寡肽用于對克隆的PCR產(chǎn)品進(jìn)行測序T35'ATT‘TAACCCTCACTAAAGGG3/T75'GTA,TACGACTCACTATAGGGC3/將如2、4、15所述分離的3iil質(zhì)粒DNA和ly.1引物(3.2pM)、lliil7jC禾口5iilAbiprismSequencingKit的反應(yīng)混合物混和，并采用下列參數(shù)在溫度循環(huán)器中循環(huán)25次變性退火延長_95°C，30秒52°C，15秒60°C，4分鐘為了除去低寡和dNTPs，把反應(yīng)混合物用S印hadexG_50柱進(jìn)行純化。為了達(dá)到純化的目的，用柱填充材料填充一個(gè)100u1的移液管頭直至其上沿并在2000xg離心3分鐘，隨后將樣品上到小柱加載再把該柱進(jìn)行離心。然后把DNA用2iU的醋酸鈉(pH5.2)和50iU100%的乙醇沉淀出來并在13，000xg離心15分鐘得到離析餅。經(jīng)干燥，將DNA加到3iU甲酰胺/25mMEDTA(51)中的，在自動化測序器中進(jìn)行了測序。序列測定分析在所有克隆中至少對5個(gè)克隆進(jìn)行了序列測定。為了排除在用Taq-聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增和/或序列測定時(shí)產(chǎn)生的錯(cuò)誤，借助于Windows軟件DNAsis將克隆的PCR片段的序列相互之間進(jìn)行比較，從兩個(gè)讀序方向建立了所有克隆的共同序列。通過將DNA序列重新寫入氨基酸序列，就可以確定沉默突變和氨基酸置換突變的數(shù)量。由NCBI數(shù)據(jù)庫繪出了MG160和CFR的序列并用Windows軟件DNAsis與PCR產(chǎn)物的排序進(jìn)行了比較。圖1識別抗體103/51的抗原a)從胃癌細(xì)胞系23132的膜萃取物中得到的抗原的蛋白純化。將膜組分進(jìn)行色譜法純化，而對整個(gè)膜組分(泳道2)或純化蛋白(泳道3)用Coomassie(泳道1:10kDa序列梯)進(jìn)行染色。用抗體103/51在細(xì)胞系23132的膜組分上進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡法分析表明與分子量為大約130kD的蛋白(泳道4)反應(yīng)。所純化的膜萃取物的特異性用103/51(泳道5)通過蛋白質(zhì)印跡法控制。從制備用凝膠上切下由箭頭指示的蛋白質(zhì)帶并將之用于MALDI質(zhì)以及小鼠免疫。b)用高分辨MALDI肽質(zhì)來識別130kDa的凝膠分離蛋白。標(biāo)記有‘*，的峰以高于50ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確度符合U28811人富含半胱氨酸的成纖維細(xì)胞生長因子受體(CFR-1)的胰蛋白酶的肽的計(jì)算質(zhì)量。標(biāo)記有‘T’的峰相應(yīng)于胰蛋白酶自溶產(chǎn)物。插塊表示在m/z1707.818時(shí)峰的高分辨質(zhì)量(m/Am=9000)。圖2:CFR-1反義轉(zhuǎn)染對抗體103/51染色和活細(xì)胞染色(放大倍數(shù)200x)的作用a)用對照載體對細(xì)胞系23132瞬間轉(zhuǎn)染并且丙酮固定化表現(xiàn)出與抗體103/51增強(qiáng)的染色。b)在用CFR-1反義載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可看到染色減弱。c)為了減弱免疫組織化學(xué)染色的背景染色，對細(xì)胞系23132的活細(xì)胞進(jìn)行染色?？梢姷角逦哪と旧?。d)用于對照的細(xì)胞系23132的活細(xì)胞染色(僅為次級抗體)。e)用抗體103/51在細(xì)胞系Colo-699上的陰性活細(xì)胞染色表明該細(xì)胞系對CFR-1的表達(dá)是陰性的。f)在細(xì)胞系Colo-699上進(jìn)行對照活細(xì)胞染色(僅為次級抗體)。g)具有Chromopure人IgM(灰色)抗體和抗體103/51的細(xì)胞系23132的流式細(xì)胞測量。h)在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)對用對照載體pHOOK-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行分析。i)用CFR-1反義載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出結(jié)合抗體103/51的能力明顯降低。圖3用抗體103/51染色的去糖基化作用a)用去糖基化緩沖液培養(yǎng)細(xì)胞(23132)并用丙酮固定表現(xiàn)出用抗體103/51增強(qiáng)的染色。b)用N-糖基化酶處理隨后用丙酮固定的細(xì)胞(23132)表現(xiàn)出染色顯著減弱。c)去糖基化對細(xì)胞系23132的膜萃取物在蛋白質(zhì)印跡分析中與抗體103/51的反應(yīng)的影響。用去糖基化緩沖液(Buffer)培養(yǎng)16小時(shí)的萃取物在染色時(shí)與未經(jīng)處理的萃取物(對照)相比沒有表現(xiàn)出明顯差異。用N-糖基化酶培養(yǎng)時(shí)則使得在染色時(shí)染色明顯減弱(N-glyco)。圖4用鼠抗體58/47-69和103/51在胃腺癌細(xì)胞上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色為了表現(xiàn)抗體103/51和鼠抗體58/47-69相同的特異性，將彌散型胃腺癌細(xì)胞用蘇木精-曙紅(a)，抗體103/51(b)和58/47-69(c)進(jìn)行染色，以及抗細(xì)胞角蛋白18為陽性對照。(c)和(d)的相同染色表明了它們相同的特異性(箭頭=腫瘤細(xì)胞)。圖5抗體103/51在各種胃組織的免疫組織化學(xué)染色用HE，抗體Ki67(為了表示增生細(xì)胞)和抗體103/51對胃組織的冷凍切片進(jìn)行染色(放大倍數(shù)X100)a)有炎癥的胃組織b)幽門螺桿菌誘發(fā)的胃炎(插圖給出了標(biāo)記的腺體放大圖)c)發(fā)育異常d)胃腺癌圖6用抗體103/51在各種癌變組織和正常組織的免疫組織化學(xué)染色給出了抗體103/51在下列組織的染色結(jié)果Vater壺腹部癌變(a)，乳腺癌侵襲性小葉(b)，腸腺瘤和腸的未經(jīng)染色的正常杯狀細(xì)胞細(xì)胞(c)，肝細(xì)胞癌(d)，腎上腺小球帶和束狀帶(e)，高爾基體的腎專一性染色的收集管(箭頭)(f)。a_d的箭頭表示腫瘤細(xì)胞，(c)中的紅色箭頭=杯狀細(xì)胞，(f)中的箭頭表示高爾基體(放大倍數(shù)400x，(g)例外為200x)。圖7由比色MTT-法測定的抗體103/51和58/47-69對細(xì)胞系的刺激作用a)用純化的抗體103/51滴定表現(xiàn)出高達(dá)4yg/ml的刺激值增加。更高的濃度不會導(dǎo)致更高的刺激(c=對照，未加入抗體)。b)用相同濃度(4ug/ml)的純化抗體103/51和58/47-69進(jìn)行MTT-試驗(yàn)表明在一或兩天的培養(yǎng)后二者表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞23132的類似的刺激作用。(對照1=Chromopur人IgM，對照2=不相關(guān)的小鼠IgM)。c)細(xì)胞系23132用對照載體pH00K_2或CFR-1反義載體瞬間轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行MTT-試驗(yàn)測定用4yg/ml的純化抗體103/51在加入24小時(shí)后對該細(xì)胞系的刺激作用。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也進(jìn)行培養(yǎng)作為對照(對照=不相關(guān)的人IgM)。d)MTT-試驗(yàn)，用相同濃度(4iig/ml)的抗體103/51作用于不同的上皮腫瘤細(xì)胞系，表明在加入抗體24小時(shí)后僅對CFR-1陽性細(xì)胞系23132表現(xiàn)出刺激作用。CFR-1陰性細(xì)胞系Colo-699和EPLC-272H沒有對抗體103/51作用而表現(xiàn)出任何刺激作用。表1抗體103/51與不同組織的反應(yīng)模式抗體染色的計(jì)分方式如下_=無染色，+=中等程度染色，++=強(qiáng)染色。HCC-肝細(xì)胞癌，1增殖區(qū)，腺體小凹，2腎小球，束狀帶(膜的染色)，3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)集合管。附件A附件B附件S由細(xì)胞系23132得到的CFR-1的氨基酸序列和已經(jīng)公布的CFR-1和MG160的序列的比較這些實(shí)驗(yàn)上的比較主要表明從細(xì)胞系23132得到的CFR-1蛋白不同于以前已知的CFR-1序列，而是它的一個(gè)同種型。除了與以前已知并已公布的CFR-1和MG160的不同外，該氨基酸序列被看作是一般要求保護(hù)的受體的一個(gè)特別的實(shí)施方案，其獨(dú)特的特征在于第一和特別標(biāo)明的位點(diǎn)。具體實(shí)施例方式抗原103/51的純化和鑒定用白質(zhì)印跡法表明抗體103/51結(jié)合在胃癌細(xì)胞的大約130kD的膜蛋白上。我們用序列尺寸排除法和離子交換色譜法預(yù)先對該蛋白進(jìn)行了純化(圖la)。從Coomassie-染色的制備用SDS-PAGE上割下該蛋白，一部分用于制備小鼠單克隆抗體(詳見下文)，另一部分用于通過由Shevchenko等概括的方法(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9314440-14445)來識別蛋白。用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化3小時(shí)后，取出了大約總消化體積并進(jìn)行高準(zhǔn)確度MALDI肽質(zhì)譜(保留剩余的消化物用于納米電噴霧分析，以防MALDIMASS不能產(chǎn)生確定的識別結(jié)果)。盡管MALDI分析僅用了毫微微摩爾量的蛋白消化物，數(shù)據(jù)庫檢索搜索到35個(gè)肽與CFR-1序列吻合，質(zhì)量準(zhǔn)確度在50ppm之內(nèi)。這些肽包括了CFR-1序列的29%，因此確定可以識別計(jì)算分子量為大約134kD的蛋白(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.125600-5609)(圖lb)。用CFR反義載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系23132對抗體103/51染餼和活細(xì)胞染餼的影我們用免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞測量術(shù)研究了胃癌細(xì)胞系23132的反義轉(zhuǎn)染效果。為此將堿基對802和1699間區(qū)域的CFR的897bpPCR片段按與CMV啟動子的反義方向用PH00K載體克隆。洗過的細(xì)胞用pH00K-CFR反義載體，pHOOK-lacZ和pHOOK載體在中間步驟轉(zhuǎn)染。用0-半乳糖苷酶測定法控制轉(zhuǎn)染(數(shù)據(jù)未給出)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，制備了cytospin制劑并用抗體103/51和抗體細(xì)胞角蛋白18染色作為對照(數(shù)據(jù)未給出)。免疫組織化學(xué)法顯示，與對照細(xì)胞比較，用pHOOK-CFR反義載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的染色明顯減弱(圖2a-b)。這確證了抗體103/51結(jié)合在CFR-1上。在兩種染色中均可見的輕微細(xì)胞質(zhì)染色可能是由于非特異性結(jié)合，這種非特異性結(jié)合經(jīng)常在用人IgM抗體在丙酮固定的細(xì)胞上染色時(shí)觀察到。還用流式細(xì)胞法測定了細(xì)胞表達(dá)和轉(zhuǎn)染的效果(圖2g-i)。數(shù)據(jù)表明在用CFR-1反義載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與抗體103/51的結(jié)合能力下降。不過，未經(jīng)處理的細(xì)胞或用對照載體PH00K-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)為明顯結(jié)合在細(xì)胞系23132上，說明了CFR-1在細(xì)胞膜上的表達(dá)。為了研究CFR-1同型物的特異性膜分布，我們用細(xì)胞系23132和一些非胃癌細(xì)胞系進(jìn)行活細(xì)胞染色。在細(xì)胞系23132上我們發(fā)現(xiàn)了清晰的染色(圖2c，d)而人肺腺瘤細(xì)胞系Colo-699(圖2e，f)和EPLC_272H(數(shù)據(jù)未給出)則顯然呈負(fù)結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明所述CFR-1同型物并未在所有的癌細(xì)胞系中存在，而唯一的23132細(xì)胞的膜染色說明CFR-1同型物具有不同于目前已有描述的CFR-1的分布的分布。糖苷酶測定CFR-1是具有5個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)的唾液酸糖蛋白，通過用糖苷酶F處理已表明該分子在這些位點(diǎn)進(jìn)行糖基化(Steegmaier等，1995，Nature373:615-620)。由于腫瘤反應(yīng)性抗體通常與碳水化合物殘基反應(yīng)，我們研究了是否抗體103/51也是如此。將細(xì)胞系23132的Cytopsin制劑用0-和N-糖苷酶培養(yǎng)4小時(shí)，然后用抗體103/51進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用N-糖苷酶處理的細(xì)胞在103/51染色中表現(xiàn)出驚人的減弱(圖3b)，而用脫磷酸緩沖液(圖3a)或用0-糖苷酶處理(數(shù)據(jù)未給出)則對抗體103/51與細(xì)胞的結(jié)合沒有影響。這表明抗體103/51結(jié)合的特異性必須定位于糖端殘基，而不能在初級蛋白序列中。為了進(jìn)一步核實(shí)這種作用，將細(xì)胞系23132的膜萃取物脫糖基化16小時(shí)，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)并用抗體103/51染色。我們發(fā)現(xiàn)與對照裂解產(chǎn)物相比，在用N-糖苷酶培養(yǎng)的裂解產(chǎn)物上反應(yīng)減少(圖3c)。#^鼠類秘禾_胃醜艦t刀片_龍械由于抗CFR-1的抗體不是可商供的，我們用從Coomassie-染色的SDS-凝膠沖洗下來的純化蛋白對小鼠免疫用以生產(chǎn)單克隆抗體并增強(qiáng)其特異性，而且也進(jìn)一步表征了CFR-1的表達(dá)。通過與heteromyelomaNS0融合使脾細(xì)胞永生。用免疫組織化學(xué)染色測試了150個(gè)克隆。對陽性克隆再進(jìn)行克隆，克隆58/47-49(IgM)用于進(jìn)一步表征。為了研究人抗體103/51和鼠類抗體58/47-69的結(jié)合性質(zhì)，我們對15個(gè)不同的胃腺癌細(xì)胞和一個(gè)腺細(xì)胞的石蠟切片進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)正常上皮組織的腺細(xì)胞具有同樣的染色而癌細(xì)胞的染色很強(qiáng)(圖4)。簡言之，早期癌(n=2)可被兩種抗體染色。對于腸癌細(xì)胞，兩種抗體都對5例中的4例進(jìn)行了染色，對于彌散型癌組織所有的切片(n=4)都被染了色，而中間型的癌用兩種抗體染色的陽性率都是50%(n=4)。這些結(jié)果表明CFR-1在大多數(shù)胃癌中的高表達(dá)。所研究的腺瘤組織表明只是在從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)變中具有陽性細(xì)胞的明確染色模式。用抗體103/51對胃粘膜進(jìn)行免疫組織化學(xué)染餼為了更詳細(xì)研究抗體103/51在胃粘膜上的反應(yīng)性，我們在沒有炎癥、與幽門螺桿菌有關(guān)的慢性活動性胃炎、重度發(fā)育不良以及胃腺癌的胃組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。在沒有炎癥的胃組織上沒有看到任何反應(yīng)(圖5)。不過，在患有幽門螺桿菌胃炎的病人的胃粘膜上我們發(fā)現(xiàn)主要在小凹細(xì)胞的基礎(chǔ)地帶發(fā)生染色?？贵w103/51的染色模式表現(xiàn)出如由Ki67染色表現(xiàn)的活動模式的很強(qiáng)的相關(guān)性(Ramires等，1997，J.Pathol.182:62_67)。在胃發(fā)育不良部位的增殖區(qū)可看到抗體103/51的更強(qiáng)染色，這也與用Ki67染色相吻合。最強(qiáng)的染色可在胃腺癌增殖區(qū)看到。抗體103/51和58/47-69在不同組織上的免疫組織化學(xué)染餼我們通過用抗體103/51和58/47-69對石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色研究了CFR-1在其它癌組織和正常組織中的表達(dá)。在15種癌組織中(不同于胃癌)，抗體103/51對其中13種表現(xiàn)出染色作用(圖6，表la)。在肺退行性發(fā)育的細(xì)胞上觀察到負(fù)的染色作用，印證了用細(xì)胞系Colo-699和EPLC-272H進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色和MTT-試驗(yàn)結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明了CFR-1的過度表達(dá)及其在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞膜上的分布。經(jīng)過對28種正常14組織的試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)僅在三種腸器官上的限制表達(dá)(表lb)。在胃的腺體小凹和腎上腺小球帶和束狀帶可觀察到膜染色，而在腎臟集合管可看到對高爾基體的染色(圖5)。這進(jìn)一步確證了抗原CFR-I的特征，所述特征以前由Burrus等描述過(1992，Mol.CellBiol.125600-5609)。用人和鼠類單克降抗體講行刺激如以前的出版物中所述的(Vollmers等，1994，Cancer74:1525_1532；Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)，抗體103/51在體外可導(dǎo)致細(xì)胞系23132的刺激。我們用線粒體羥化酶測定法(MTT)測定了抗體103/51的刺激，MTT法是測定增殖的標(biāo)準(zhǔn)方法(Carmichael等，1987，CancerRes.47:936_942)。為了進(jìn)一步研究抗體103/51的刺激性質(zhì)，我們用不同濃度的純化抗體培養(yǎng)細(xì)胞系23132。發(fā)現(xiàn)濃度依賴性刺激在4μg/ml時(shí)有最高活性(圖7a)。更高的濃度使得刺激有輕微降低。為了試驗(yàn)是否鼠類抗體58/47-69對細(xì)胞生長有同樣的作用，我們用等量的純化抗體進(jìn)行MTT-刺激試驗(yàn)。由圖7b可看到，兩種抗體都在體外引起對細(xì)胞系23132的刺激。這進(jìn)一步確證了兩種抗體相同的特異性。為了確證抗體103/51和鼠類抗體58/47-69的刺激作用是通過結(jié)合CFR-I而介導(dǎo)的，我們用對照載體pHOOK-2和CFR-I反義載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用MTT試驗(yàn)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。作為轉(zhuǎn)染的陽性對照，細(xì)胞也用pHOOK-2-lacZ載體轉(zhuǎn)染并隨之用β_半乳糖苷酶染色(數(shù)據(jù)未給出)。由于在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和用對照載體pHOOK-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到的刺激程度相當(dāng)，可排除兩種抗體會受轉(zhuǎn)染方法影響而減弱刺激作用。相反，用CFR-I反義載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯表現(xiàn)出刺激減弱(圖7c)。最后，為了表明由抗體103/51作用的刺激不會被CFR-I之外的其他受體所調(diào)節(jié)，我們用細(xì)胞系23132進(jìn)行了MTT-刺激試驗(yàn)并將之與CFR-I-負(fù)性肺癌細(xì)胞系Colo-699和EPLC-272H進(jìn)行比較。雖然細(xì)胞系23132如上文所述受到刺激，但這兩種肺癌細(xì)胞系沒有表現(xiàn)出任何受抗體103/51的刺激作用(圖7d)，印證了在免疫組織化學(xué)中觀察到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><213>小鼠<220>抗體NM58-49/69的重鏈可變區(qū)(VH)的序列<221>V區(qū)<222>(1)...(288)<400>tcctgcaaggettctggctacaccttcactgactactatataaactgggtgaagcagagg60SerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyrTyrlieAsnTrpValLysGlnArg15101520actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtaatacttactac120ThrGlyGlnGlyLeuGluTrplieGlyGlulieTyrProGlySerGlyAsnThrTyrTyr25303540aatgagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccageacagcctac180AsnGluLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr45505560atgcagctcageagectgacatctgaggactctgcagtctatttctgtgcaagatcggga240MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCysAlaArgSerGly50556065ttacgaccctatgetatggactactggggtcaaggaaccteagtcacc288LeuArgProTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerValThr707580附件B<110>Prof.Dr.MulIer-Hermelink,HansKonradProf.Dr.VolImers,HeinzDr.Hensel,Frank<112>受體、其應(yīng)用及小鼠抗體<141)03/09/02<211>315bp<212>DNA<213>小鼠<220>抗體N158-49/69的輕鏈可變區(qū)(VL)的序列<221>V區(qū)<222>(1)...(315)<400>ccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatetcttgcagatctagtcag60ProLeuSerLeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerlieSerCysArgSerSerGln15101520ageattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccag120SerlieValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnLysProGlyGln25303540tctccaaagctcctgatetacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttc180SerProLysLeuLeulieTyrLysValSerAsnArgPheSerGlyValProAspArgPhe45505560agtggcagtggateagggacagatttcacactcaagateageagagtggaggetgaggat240SerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslieSerArgValGluAlaGluAsp65707580ctgggagtttattactgctttcaaggtteacatgttccgtacacgttcggaggggggacc300LeuGlyValTyrTyrCysPheGlnGlySerHisValProTyrThrPheGlyGlyGlyThr859095100aagctggaaataaaa315LysLeuGlulieLys105附件S<110>Prof.Dr.MulIer-Hermelink,HansKonradProf.Dr.Vollmers，HeinzDr.Hensel,Frank<112>受體、其應(yīng)用及小鼠抗體<141)03/09/02<211>3114<212>DNA<213>人<220>胃癌細(xì)胞系23132的富含胱氨酸的FGF受體<221>CDS<222>(450)—(3563)<400>450GATGTGAGGGAGCCTGAAAATGAAATTTCTTCAGACTGCAATCATTTGTTGTGGAATTATAspValArgGluProGluAsnGlulieSerSerAspCysAsnHisLeuLeuTrpAsnTyr143145150155160AAGCTGAACCTAACTACAGATCCCAAATTTGAATCTGTGGCCAGAGAGGTTTGCAAATCTLysLeuAsnLeuThrThrAspProLysPheGluSerValAlaArgGluValCysLysSer165170175180ACTATAACAGAGATTGAAGAATGTGCTGATGAACCGGTTGGAAAAGGTTACATGGTTTCCThrlieThrGlulieGluGluCysAlaAspGluProValGlyLysGlyTyrMetValSer185190195200TGCTTGGTGGATCACCGAGGCAACATCACTGAGTATCAGTGTCACCAGTACATTACCAAGCysLeuValAspHisArgGlyAsnlieThrGluTyrGlnCysHisGlnTyrlieThrLys205210215220ATGACGGCCATCATTTTTAGTGATTACCGTTTAATCTGTGGCTTCATGGATGACTGCAAAMetThrAlalieliePheSerAspTyrArgLeulieCysGlyPheMetAspAspCysLys225230235240AATGACATCAACATTCTGAAATGTGGCAGTATTCGGCTTGGAGAAAAGGATGCACATTCAAsnAsplieAsnlieLeuLysCysGlySerlieArgLeuGlyGluLysAspAlaHisSer245250255260CAAGGTGAGGTGGTATCATGCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAAAGAAGCAGAAGAAAGAGAAGlnGlyGluValValSerCysLeuGluLysGlyLeuValLysGluAlaGluGluArgGlu265270275280CCCAAGATTCAAGTTTCTGAACTCTGCAAGAAAGCCATTCTCCGGGTGGCTGAGCTGTCAProLyslieGlnValSerGluLeuCysLysLysAlalieLeuArgValAlaGluLeuSer285290295300TCGGATGACTTTCACTTAGACCGGCATTTATATTTTGCTTGCCGAGATGATCGGGAGCGTSerAspAspPheHisLeuAspArgHisLeuTyrPheAlaCysArgAspAspArgGluArg305310315320TTTTGTGAAAATACACAAGCTGGTGAGGGCAGAGTGTATAAGTGCCTCTTTAACCATAAAPheCysGluAsnThrGlnAlaGlyGluGlyArgValTyrLysCysLeuPheAsnHisLys325330335340TTTGAAGAATCCATGAGTGAAAAGTGTCGAGAAGCACTTACAACCCGCCAAAAGCTGATTPheGluGluSerMetSerGluLysCysArgGluAlaLeuThrThrArgGlnLysLeulie345350355360GCCCAGGATTATAAAGTCAGTTATTCATTGGCCAAATCCTGTAAAAGTGACTTGAAGAAAAlaGlnAspTyrLysValSerTyrSerLeuAlaLysSerCysLysSerAspLeuLysLys365370375380TACCGGTGCAATGTGGAAAACCTTCCGCGATCGCGTGAAGCCAGGCTCTCCTACTTGTTATyrArgCysAsnValGluAsnLeuProArgSerArgGluAlaArgLeuSerTyrLeuLeu385390395400ATGTGCCTGGAGTCAGCTGTACACAGAGGGCGACAAGTCAGCAGTGAGTGCCAGGGGGAGMetCysLeuGluSerAlaValHisArgGlyArgGlnValSerSerGluCysGlnGlyGlu405410415420ATGCTGGATTACCGACGCATGTTGATGGAAGACTTTTCTCTGAGCCCTGAGATCATCCTAMetLeuAspTyrArgArgMetLeuMetGluAspPheSerLeuSerProGlulielieLeu425430435440AGCTGTCGGGGGGAGATTGAACACCATTGTTCCGGATTACATCGAAAAGGGCGGACCCTASerCysArgGlyGlulieGluHisHisCysSerGlyLeuHisArgLysGlyArgThrLeu445450455460CACTGTCTGATGAAAGTAGTTCGAGGGGAGAAGGGGAACCTTGGAATGAACTGCCAGCAGHisCysLeuMetLysValValArgGlyGluLysGlyAsnLeuGlyMetAsnCysGlnGln465470475480GCGCTTCAAACACTGATTCAGGAGACTGACCCTGGTGCAGATTACCGCATTGATCGAGCTAlaLeuGlnThrLeulieGlnGluThrAspProGlyAlaAspTyrArglieAspArgAla485490495500TTGAATGAAGCTTGTGAATCTGTAATCCAGACAGCCTGCAAACATATAAGATCTGGAGACLeuAsnGluAlaCysGluSerVallieGlnThrAlaCysLysHislieArgSerGlyAsp505510515520CCAATGATCTTGTCGTGCCTGATGGAACATTTATACACAGAGAAGATGGTAGAAGACTGTProMetlieLeuSerCysLeuMetGluHisLeuTyrThrGluLysMetValGluAspCys525530535540GAACACCGTCTCTTAGAGCTGCAGTATTTCATCTCCCGGGATTGGAAGCTGGACCCTGTCGluHisArgLeuLeuGluLeuGlnTyrPhelieSerArgAspTrpLysLeuAspProVal545550555560CTGTACCGCAAGTGCCAGGGAGACGCTTCTCGTCTTTGCCACACCCACGGTTGGAATGAGLeuTyrArgLysCysGlnGlyAspAlaSerArgLeuCysHisThrHisGlyTrpAsnGlu565570575580ACCAGCGAATTTATGCCTCAGGGAGCTGTGTTCTCTTGTTTATACAGACACGCCTACCGCThrSerGluPheMetProGlnGlyAlaValPheSerCysLeuTyrArgHisAlaTyrArg585590595600ACTGAGGAACAGGGAAGGAGGCTCTCACGGGAGTGCCGAGCTGAAGTCCAAAGGATCCTAThrGluGluGlnGlyArgArgLeuSerArgGluCysArgAlaGluValGlnArglieLeu605610615620CACCAGCGTGCCATGGATGTCAAGCTGGATCCTGCCCTCCAGGATAAGTGCCTGATTGATHisGlnArgAlaMetAspValLysLeuAspProAlaLeuGlnAspLysCysLeulieAsp625630635640CTGGGAAAATGGTGCAGTGAGAAAACAGAGACTGGACAGAAGCTGGAGTGCCTTCAGGACLeuGlyLysTrpCysSerGluLysThrGluThrGlyGlnLysLeuGluCysLeuGlnAsp645650655660CATCTGGATGACTTAGTGGTGGAGTGTAGAGATATAGTTGGCAACCTCACTGAGTTAGAAHisLeuAspAspLeuValValGluCysArgAsplieValGlyAsnLeuThrGluLeuGlu665670675680TCAGAGGATATTCAAATAGAAGCCTTGCTGATGAGAGCCTGTGAGCCCATAATTCAGAACSerGluAsplieGlnlieGluAlaLeuLeuMetArgAlaCysGluProlielieGlnAsn685690695700TTCTGCCACGATGTGGCAGATAACCAGATAGACTCCGGGGACCTGATGGAGTGTCTGATAPheCysHisAspValAlaAspAsnGlnlieAspSerGlyAspLeuMetGluCysLeulie705710715720CAGAACAAACACCAGAAGGACATGAACGAGAAGTGTGCCATCGGAGTTACCCACTTCCAGGlnAsnLysHisGlnLysAspMetAsnGluLysCysAlalieGlyValThrHisPheGln725730735740CTGGTGCAGATGAAGGATTTTCGGTTTTCTTACAAGTTTAAAATGGCCTGCAAGGAGGACLeuValGlnMetLysAspPheArgPheSerTyrLysPheLysMetAlaCysLysGluAsp745750755760GTGTTGAAGCTTTGCCCAAACATAAAAAAGAAGGTGGACGTGGTGATCTGCCTGAGCACGValLeuLysLeuCysProAsnlieLysLysLysValAspValVallieCysLeuSerThr765770775780ACCGTGCGCAATGACACTCTGCAGGAAGCCAAGGAGCACAGGGTGTCCCTGAAGTGCCGCThrValArgAsnAspThrLeuGlnGluAlaLysGluHisArgValSerLeuLysCysArg785790795800AGGCAGCTCCGTGTGGAGGAGCTGGAGATGACGGAGGACATCCGCTTGGAGCCAGATCTAArgGlnLeuArgValGluGluLeuGluMetThrGluAsplieArgLeuGluProAspLeu805810815820TACGAAGCCTGCAAGAGTGACATCAAAAACTTCTGTTCCGCTGTGCAATATGGCAACGCTTyrGluAlaCysLysSerAsplieLysAsnPheCysSerAlaValGlnTyrGlyAsnAla825830835840CAGATTATCGAATGTCTGAAAGAAAACAAGAAGCAGCTAAGCACCCGCTGCCACCAAAAAGlnlielieGluCysLeuLysGluAsnLysLysGlnLeuSerThrArgCysHisGlnLys845850855860GTATTTAAGCTGCAGGAGACAGAGATGATGGACCCAGAGCTAGACTACACCCTCATGAGGValPheLysLeuGlnGluThrGluMetMetAspProGluLeuAspTyrThrLeuMetArg865870875880GTCTGCAAGCAGATGATAAAGAAGTTCTGTCCGGAAGCAGATTCTAAAACCATGTTGCAGValCysLysGlnMetlieLysLysPheCysProGluAlaAspSerLysThrMetLeuGln885890895900TGCTTGAAGCAAAATAAAAACAGTGAATTGATGGATCCCAAATGCAAACAGATGATAACCCysLeuLysGlnAsnLysAsnSerGluLeuMetAspProLysCysLysGlnMetlieThr905910915920AAGCGCCAGATCACCCAGAACACAGATTACCGCTTAAACCCCATGTTAAGAAAAGCCTGTLysArgGlnlieThrGlnAsnThrAspTyrArgLeuAsnProMetLeuArgLysAlaCys925930935940AAAGCTGACATTCCTAAATTCTGTCACGGTATCCTGACTAAGGCCAAGGATGATTCAGAA2909LysAlaAsplieProLysPheCysHisGlylieLeuThrLysAlaLysAspAspSerGlu945950955960TTAGAAGGACAAGTCATCTCTTGCCTGAAGCTGAGATATGCTGACCAGCGCCTGTCTTCA2969LeuGluGlyGlnVallieSerCysLeuLysLeuArgTyrAlaAspGlnArgLeuSerSer965970975980GACTGTGAAGACCAGATCCGAATCATTATCCAGGAGTCCGCCCTGGACTACCGCCTGGAT3029AspCysGluAspGlnlieArglielielieGlnGluSerAlaLeuAspTyrArgLeuAgp9859909951000CCTCAGCTCCAGCTGCACTGCTCAGACGAGATCTCCAGTCTATGTGCTGAAGAAGCAGCA3089ProGlnLeuGlnLeuHisCysSerAspGlulieSerSerLeuCysAlaGluGluAlaAla1005101010151020GCCCAAGAGCAGACAGGTCAGGTGGAGGAGTGCCTCAAGGTCAACCTGCTCAAGATCAAA3149AlaGlnGluGlnThrGlyGlnValGluGluCysLeuLysValAsnLeuLeuLyslieLys1025103010351040ACAGAATTGTGTAAAAAGGAAGTGCTAAACATGCTGAAGGAAAGCAAAGCAGACATCTTT3209ThrGluLeuCysLysLysGluValLeuAsnMetLeuLysGluSerLysAlaAspliePhe1045105010551060GTTGACCCGGTACTTCATACTGCTTGTGCCCTGGACATTAAACACCACTGCGCAGCCATC3269ValAspProValLeuHisThrAlaCysAlaLeuAsplieLysHisHisCysAlaAlalie1065107010751080ACCCCTGGCCGCGGGCGTCAAATGTCCTGTCTCATGGAAGCACTGGAGGATAAGCGGGTG3329ThrProGlyArgGlyArgGlnMetSerCysLeuMetGluAlaLeuGluAspLysArgVal1085109010951100AGGTTACAGCCCGAGTGCAAAAAGCGCCTCAATGACCGGATTGAGATGTGGAGTTACGCA3389ArgLeuGlnProGluCysLysLysArgLeuAsnAspArglieGluMetTrpSerTyrAla1105111011151120GCAAAGGTGGCCCCAGCAGATGGCTTCTCTGATCTTGCCATGCAAGTA.ATGACGTCTCCA3449AlaLysValAlaProAlaAspGlyPheSerAspLeuAlaMetGlnValMetThrSerPro1125113011351140TCTAAGAACTACATTCTCTCTGTGATCAGTGGGAGCATCTGTATATTGTTCCTGATTGGC3509SerLysAsnTyrlieLeuSerVallieSerGlySerlieCyslieLeuPheLeulieGly1145115011551160CTGATGTGTGGACGGATCACCAAGCGAGTGACACGAGAGCTCAAGGACAGGTAG3563LeuMetCysGlyArglieThrLysArgValThrArgGluLeuLysAAspArg***1165117011751179.權(quán)利要求包含SEQIDNO2序列的純化多肽或其片段，其中所述多肽特異性地結(jié)合人腺癌細(xì)胞系23132的細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的純化多肽，其中所述多肽還包含SEQIDNO:4序列或其片段。3.包含SEQIDNO1序列的分離的核酸序列。4.包含SEQIDNO:3序列的分離的核酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及快速增殖的細(xì)胞的膜表面，特別是胃癌細(xì)胞膜表面的受體，該受體由糖蛋白組成，糖蛋白的至少一個(gè)決定簇相應(yīng)于CFR-1蛋白的一個(gè)決定簇；并且人抗體103/51和/或鼠類抗體58/47-69(IgM)特異性結(jié)合在該糖蛋白上。文檔編號C07H21/04GK101812133SQ20091016119公開日2010年8月25日申請日期2002年7月23日優(yōu)先權(quán)日2001年7月24日發(fā)明者弗蘭克·亨瑟爾,漢斯·康拉德·穆勒-赫梅寧克,海因茨·沃爾默斯申請人:德拜奧維森公司