專利名稱：傳染性法氏囊病病毒變異株vp2基因病毒樣顆粒重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳染性法氏囊病病毒(IBDV)變異株(AH1) VP2基因病毒樣顆粒 重組蛋白的表達(dá)與應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是引起我國及世界養(yǎng)禽業(yè)嚴(yán)重 經(jīng)濟(jì)損失的主要傳染病之一，是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害雛雞 淋巴組織，特別是中樞免疫器官一法氏囊為主要特征的傳染病。該病的危害包括兩個(gè) 方面 一是引起3~8周齡的雞發(fā)病和死亡，尤其是近年來超強(qiáng)毒株(wIBDV)的出 現(xiàn)使雛雞死亡率大大增加；二是雛雞早期感染本病，則引起免疫抑制，導(dǎo)致雞群對其 它疫病的易感性增高和對疫苗的免疫應(yīng)答能力降低或失敗，造成巨大的間接經(jīng)濟(jì)損 失。
疫苗接種是預(yù)防該病最有效的方法，在上世紀(jì)80年代的中后期，在世界范圍內(nèi) 爆發(fā)了在抗原性和致病性等方面與經(jīng)典毒株有很大差異的IBDV變異毒株，使養(yǎng)雞業(yè) 遭受重創(chuàng)。變異株和超強(qiáng)毒株(wIBDV)的出現(xiàn)使該病的防控難度加大，IBD免疫 預(yù)防失敗已成為禽病防控中的重要問題[王永山等.近期引起免疫失敗的傳染性法氏 囊病病毒VP2基因的分子特征.中國獸醫(yī)科學(xué)，2008,38(12): 1013-1019]。目前，使 用的常規(guī)弱毒疫苗和滅活疫苗，其安全性和制造工藝仍存在不足為預(yù)防變異毒株而 采用中強(qiáng)毒力活疫苗存在著較大的生物安全問題，因?yàn)樵诓煌琁BDV毒株之間潛在著 基因重配的可能，給該病的防控帶來隱患，滅活疫苗存在著抗原制備的困難。因此， 在當(dāng)前IBD防控實(shí)際工作中，亟需免疫效力強(qiáng)、生物安全性高、并且針對當(dāng)前流行毒 株的新型IBD基因工程疫苗的問世。
IBDV屬雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，基因組包括大(A)小(B)兩個(gè)片段， 有五種病毒蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4和VP5。 VP2占病毒蛋白的51°/。，既是IBDV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是病毒的主要保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力 的變異以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)。VP2的高變區(qū)是病毒中和性單抗的結(jié)合必需區(qū)， 該區(qū)的點(diǎn)突變是IBDV抗原漂移、毒力變異并進(jìn)而造成經(jīng)典疫苗株免疫失敗的主要原 因。迄今，IBD基因工程疫苗研究均以VP2為耙基因，采用的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿 菌、酵母、雞痘病毒載體、桿狀病毒表達(dá)載體、核酸疫苗以及近期報(bào)道的多表位疫苗 等。目前IBD基因工程疫苗研究中的主要問題或者是重組IBDV蛋白的表達(dá)量不夠 高，或者是重組IBDV蛋白復(fù)性難度大，或者是源于一種毒株的重組蛋白不適用于其 它變異毒株。因此，在VP2基因選擇、表達(dá)系統(tǒng)以及表達(dá)策略方面進(jìn)一步探索新的 技術(shù)路線是十分必要的。
三、 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題
本發(fā)明針對IBD流行現(xiàn)狀和基因工程疫苗研究中存在的主要問題，采用新的技 術(shù)路線，在目的基因選擇上，采用近期引起免疫失敗的IBDV變異株(AH1)，該變 異株具有完全的IBDV強(qiáng)毒分子特征的VP2基因，該VP2基因與當(dāng)前預(yù)防使用的疫 苗毒株(B87株)的VP2基因序列有較大差異，在表達(dá)系統(tǒng)上，利用桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)具有與高等細(xì)胞類似的翻譯后修飾系統(tǒng)，可使外源基因表達(dá)產(chǎn)物具有天然的活性形 式以及表達(dá)產(chǎn)物可自組裝成病毒樣顆粒(VLP)的優(yōu)點(diǎn)，制備病毒樣顆粒重組VP2 蛋白，研制針對當(dāng)前IBDV流行毒株的新型高效IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙绾蜋z測 試劑。
技術(shù)方案
傳染性法氏囊病病毒變異株(AH1) VP2基因病毒樣顆粒重組蛋白，是通過構(gòu)建 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2，用pBac-VP2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞獲得的重組桿狀病 毒vBac-VP2表達(dá)獲得的。
其重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2和重組桿狀病毒vBac-VP2，其構(gòu)建方法為 根據(jù)VP2基因序列和供體質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)VP2基因擴(kuò)增引物 正向VP2F(36): 5'-CAGATCTGAATTCATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC隱3， 反向VP2R(34): 5，-CTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTCTTTG-3， 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物M13F(17): 上游序列5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3， 下游序列5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，
將克隆質(zhì)粒pUC-VP2 (AH1)和含有6個(gè)組氨酸His的供體質(zhì)粒pFastBacHTA分 別用EcoR I和Hind m雙酶切，將IBDV變異株AH1的VP2基因，定向克隆入桿狀 病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2， 轉(zhuǎn)化含有Bacmid和Helper plasmid的五.co/!' DH10Bac感受態(tài)，用VP2基因正向擴(kuò)增 引物VP2F(36)和M13 R(17)引物下游序列PCR鑒定Bacmid DNA，可得一條大小為 2100bp的條帶，獲得含VP2基因的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2，用pBac-VP2 轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒vBac-VP2。
所述重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2和重組桿狀病毒vBac-VP2，均含有6個(gè)組 氨酸His標(biāo)簽和煙草蝕紋病毒TEV蛋白酶識別位點(diǎn)，便于重組VP2蛋白的純化。
上述傳染性法氏囊病病毒變異株(AH1) VP2基因病毒樣顆粒重組蛋白可以在 IBDV檢測方法和制備免疫制劑中得到應(yīng)用。其純化方法為用第3代重組桿狀 病毒vBac-VP2感染Sf9昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變之后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，3000rpm 離心30min收集細(xì)胞，用HisTrap HP結(jié)合緩沖液重懸，并加入2(^1100mmol/L PMSF， 置于0'C冰水浴，超聲功率500~600W、每次超聲時(shí)間10min、重復(fù)2~4次超聲，至 細(xì)胞懸液清亮，4'C， 10000rpm離心30min,去除細(xì)胞碎片，取上清用0.45nm孔徑 濾膜過濾，然后按照說明書用HisTrap HP層析柱純化重組VP2蛋白。
其IBDV血清抗體ELISA檢測方法為用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋純化的重組
5VP2蛋白至5嗎/ml，包被ELISA板，100nl/孔，4'C過夜；用PBST洗滌3次，每次 2分鐘，拍干；每孔加入含體積比10%FBS的PBST封閉液30(^1， 37°C， 2h;用PBST 洗滌3次，每次2分鐘，拍干；加入待檢血清樣品，37°C， lh;用PBST洗滌3次， 每次2分鐘，拍干；加入HRP-標(biāo)記的1:2000兔抗雞IgG100pl， 37°C， lh;用PBST 洗滌4次，每次2分鐘，拍干；加入顯色劑A液(四甲基聯(lián)苯胺溶液)、B液(過氧
化氫脲溶液)各一滴，暗盒顯色；2MH2S04終止，測J450值。
其病毒樣顆?；蚬こ桃呙绲闹苽浞椒槿≈亟M桿狀病毒vBac-VP2感染的Sf9 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融三次，用IBDV抗體夾心ELISA檢測，ELISA效價(jià)^1600， 加等體積的白油免疫佐劑，混合乳化，即為IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙纭?br> 其病毒樣顆?；蚬こ桃呙绲膽?yīng)用方法為經(jīng)胸部肌肉注射，0.4ml/只/次，第1次 免疫14 d后進(jìn)行第2次免疫。
有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下
IBDV屬雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，基因組包括大(A)小(B) 兩個(gè)片段，有五種病毒蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4和VP5。 VP2占病毒蛋 白的51%，既是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是病毒的主要保護(hù)性抗原，與病 毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)。VP2的 高變區(qū)是病毒中和性單抗的結(jié)合必需區(qū)，該區(qū)的點(diǎn)突變是IBDV抗原漂移、 毒力變異并進(jìn)而造成經(jīng)典疫苗株免疫失敗的主要原因。迄今，IBD基因工程 疫苗研究均以VP2為靶基因，目前IBD基因工程疫苗研究中的主要問題或 者是重組IBDV蛋白的表達(dá)量不夠高，或者是重組IBDV蛋白復(fù)性難度大， 或者是源于一種毒株的重組蛋白不適用于其它變異毒株。因此，在VP2基因 選擇、表達(dá)系統(tǒng)以及表達(dá)策略方面進(jìn)一步探索新的技術(shù)路線是十分必要的。
病毒樣顆粒疫苗作為預(yù)防性疫苗具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(1)不含病 毒DNA，無感染性；(2)免疫原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì) 胞免疫；(3)穩(wěn)定性好，不易失活。顆粒疫苗作為一種新型的疫苗，不僅克 服了傳統(tǒng)的弱毒疫苗和滅活疫苗的缺點(diǎn)，也彌補(bǔ)了基因疫苗的不足。
本發(fā)明針對IBD流行現(xiàn)狀和基因工程疫苗研究中存在的主要問題，采用 新的技術(shù)路線，在目的基因選擇上，采用近期引起免疫失敗的IBDV變異株 (AH1)，該變異株具有完全的IBDV強(qiáng)毒分子特征的VP2基因，該VP2基 因與當(dāng)前預(yù)防使用的疫苗毒株(B87株)的VP2基因序列有較大差異，因此 對當(dāng)前IBDV的免疫預(yù)防更具有針對性；在表達(dá)系統(tǒng)上，利用桿狀病毒表達(dá) 系統(tǒng)具有與高等細(xì)胞類似的翻譯后修飾系統(tǒng)，可使外源基因表達(dá)產(chǎn)物具有天 然的活性形式以及表達(dá)產(chǎn)物可自組裝成病毒樣顆粒(VLP)的優(yōu)點(diǎn)，將IBDV 變異株(AH1) VP2基因在昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)；對VP2基因重組桿 狀病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，用夾心EUSA方法檢測，重組VP2蛋白的效價(jià)在 1.6xl03以上，重組VP2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒，并首次在感染的昆蟲細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了"包涵體樣"結(jié)構(gòu)。此外，在VP2基因之前增加了6個(gè)組氨酸(His) 標(biāo)簽和煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識別位點(diǎn)，便于重組VP2蛋白的純化。用純化 的重組VP2蛋白作為包被抗原建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法具有良 好的特異性與敏感性，用重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞裂解物免疫雞，可 有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性抗體，抵抗IBDV強(qiáng)毒攻擊。
本發(fā)明制備的重組VP2蛋白對當(dāng)前IBDV流行毒株的免疫預(yù)防針對性更 高，具有良好的實(shí)用價(jià)值和推廣前景。
四

圖1含有VP2基因的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2的結(jié)構(gòu)
圖2感染vBac-VP2的Sf9細(xì)胞SDS-PAGE和Western-blotting分析結(jié)果
圖3感染vBac-VP2的Sf9細(xì)胞電鏡檢査結(jié)果
五具體實(shí)施例方式
IBDV變異株(AH1) VP2基因系用RT-PCR方法從2007年12月在安徽引起免 疫失敗的IBDV變異株(AH1)中克隆，該變異株具有IBDV強(qiáng)毒株全部的標(biāo)志性氨 基酸殘基，VP2基因七肽基序?yàn)镾WSASGS，在222、 253、 256、 279、 284、 294和 299位上的氨基酸殘基分別是A、 Q、 I、 D、 A、 I和S，與現(xiàn)行商品疫苗毒株B87的 VP2基因序列有較大差異[王永山等.近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2 基因的分子特征.中國獸醫(yī)科學(xué)，2008,38(12): 1013-1019]。因此，對當(dāng)前IBDV的防 控更具有針對性和實(shí)際意義。
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1質(zhì)粒、菌種與細(xì)胞
含有VP2基因的克隆質(zhì)粒pUC-VP2 (AH1)[公知公用，王永山等.近期引起免 疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征.中國獸醫(yī)科學(xué)，2008， 38(12): 1013-1019]，系用RT-PCR方法從2007年12月在安徽境內(nèi)發(fā)生的IBD免疫預(yù)防失敗 的病雞法氏囊組織中擴(kuò)增的VP2基因構(gòu)建而成。IBD弱毒疫苗(B87株，購自南京天 邦生物科技有限公司)。含有6xHis標(biāo)簽的供體質(zhì)粒pFastBacHTA、含有Bacmid和 Helper plasmid的￡.co/!' DH10Bac、 Sf9昆蟲細(xì)胞、五.co// TOP10均購自Invitrogen公 司。
1.2主要試劑
雞抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗(B87)免疫SPF雞(5次)獲得，用 DEAE纖維素(DE32)純化(劉玉斌，茍仕金主編.動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).長春吉 林科學(xué)技術(shù)出版社，1989， 8-15);
兔抗雞IgG抗體和HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體參照文獻(xiàn)制備(劉玉斌，茍仕金主 編.動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).長春吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1989， 150-151;王永山，郝 崇，侯世寬，劉子，馬從林，殷震.抗雞IgG單克隆抗體的研究.獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989,9(2):109-114)o
MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、 DPTG均購自TaKaRa 公司；BAC/PAC DNA Isolation kit購自O(shè)MEGA公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購 自Invitrogen公司；胎牛血清、Grace's昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自GIBCO公司。FITC標(biāo)記 的羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)VP2基因序列和供體質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)VP2基因擴(kuò)增引物 正向VP2F(36): 5，-CAGATCTGAATTCATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC-3， 反向VP2R(34): 5，-CTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTCTTTG-3， 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物M13F(17): 上游序列5，-GTTTTCCCAGTCACGAC-3， 下游序列5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3， 以上引物由Invi加gen公司合成。
2.2 VP2基因重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建
將克隆質(zhì)粒pUC-VP2(AHl )和供體質(zhì)粒f)FastBacHTA(其中含有6個(gè)組氨酸(His) 標(biāo)簽和煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識別位點(diǎn))分別用EcoRl和HindIE雙酶切，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收VP2和載體DNA片段，DNA膠回收試劑盒純化，T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化￡.co// TOP10感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的1.5 %瓊脂平 皿上(含氨芐青霉素100 pg/ml)， 37。C培養(yǎng)14 h。挑單菌落接種入LB (含氨芐青霉 素100 ng/ml)，振搖培養(yǎng)12 h，用MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，EcoR I和 Hind HI雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見兩條帶，分別約為1.4Kb與5.0Kb，獲 得含VP2基因的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2 (圖1 )。
2.3 VP2基因重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
用重組供體質(zhì)粒pFas但acHTA-VP2轉(zhuǎn)化Eco/z' DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞(含Bacmid DNA和Helper plasmid),在LB培養(yǎng)基中37'C， 220rpm， 4 h，用LB做一系列稀釋
(10—1， l(T2， 10—3)，涂布于LB配制的1.5%瓊脂平皿上(含有5(Hig/ml卡那霉素、7ng/ml 慶大霉素、10pg/ml四環(huán)素以及100pg/ml X-gal和40pg/ml IPTG)， 37'C培養(yǎng)16 h，挑 白色單菌落，接種于含有三種抗生素(50pg/ml卡那霉素、7ng/ml慶大霉素、10pg/ml 四環(huán)素)的LB中，37。C振搖培養(yǎng)16 h，用BAC/PAC DNA Isolation kit提取重組Bacmid DNA，用VP2基因正向擴(kuò)增引物VP2F(36)和M13R(17)引物下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增
(93°C 3min, 94。C 45s， 55。C 45 s， 72°C 5min, 30個(gè)循環(huán)，最后72。C 7min)，用 1%瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約為2100bp的條帶，與理論值2092bp相符，說明 VP2基因已成功轉(zhuǎn)座入Bacmid DNA中，獲得含VP2基因的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒 pBac-VP2 (并且其中含有6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽和煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識 別位點(diǎn))。
2.4 VP2基因重組桿狀病毒的獲得在轉(zhuǎn)染前一天，用對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制備單層細(xì)胞。 將鑒定好的pBac-VP2按Lipofectamine2000使用說明書轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)，棄去 舊培養(yǎng)基，并用無血清無抗生素的Grace's液洗滌細(xì)胞，然后用孵育好的 pBac-VP2-Lipofectamine2000混合物平鋪S 細(xì)胞單層，27'C ， 5h ，棄去 pBac-VP2-Lipofectamine2000混合物，每孔加入含10%血清及抗生素的Grace's完全培 養(yǎng)液，置27。C繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察病變，5天后，轉(zhuǎn)染孔可見部分細(xì)胞變圓變大，第 6天細(xì)胞病變達(dá)90%以上，收集病變細(xì)胞及上清，1500rpm離心10min，上清液即為 含VP2基因的重組桿狀病毒vBac-VP2原液(Pl代)，繼續(xù)傳代2次，獲得P3代重 組桿狀病毒。實(shí)驗(yàn)同步設(shè)立用未插入外源基因片段的Bacmid質(zhì)粒和單用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn) 染Sf9細(xì)胞為對照。
2.5 VP2基因重組桿狀病毒的鑒定
2.5.1 PCR鑒定
取含有VP2基因的重組桿狀病毒vBac-VP2感染的Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物500W，凍 融3次，加入5ul蛋白酶K (20mg/ml)和100ul 10%SDS， 42'C水浴1 h，加入等體 積的酚氯仿抽提l次，4'C, 12000rpm離心5 min，取上清液，在上清液中加入1/10 體積的3mol/L NaAc和2.5倍體積的無水乙醇，置-20。C、 6 h， 4°C、 12000ipm離心 10 min，棄上清液，用70%乙醇洗沉淀1次，千燥，用30ul pH8.0 TE溶解，用VP2 基因正向擴(kuò)增引物VP2F(36)和M13R(17)引物下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(93°C 3min， 94'C 45s， 55°C 45 s， 72°C 5min， 30個(gè)循環(huán)，最后72°C 7min)，用1%瓊脂糖凝膠 電泳可見一條大小約為2100bp的條帶，表明重組桿狀病毒vBac-VP2中含有VP2基 因。
2.5.2間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測
實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將重組桿狀病毒(P3代)接種到Sf9細(xì)胞，培 養(yǎng)72h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)液洗2次，然后向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入-20 。C預(yù)冷的無水乙醇1 ml/孔，4。C固定30min，用PBS洗3次，拍干；加入40倍稀釋 的雞抗IBDV高免血清，200nl/孔，37。C孵育2小時(shí)，PBS洗滌5次，拍干；加入兔 抗雞IgG抗體，200 pl/孔，37'C孵育1 h, PBS洗滌5次，拍干；加入50倍稀釋的 FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液，200^1/孔，37。C孵育lh， PBS洗滌5次，置于 熒光顯微鏡下觀察。同步設(shè)立無VP2基因的桿狀病毒(Baculovirus)感染Sf9細(xì)胞和 正常Sf9細(xì)胞為對照。在熒光顯微鏡下，可以看見感染P3代vBac-VP2病毒的Sf9昆 蟲細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而感染野生型桿狀病毒的細(xì)胞與正常的細(xì)胞則無熒光。表明 VP2基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。
2.5.3夾心ELISA檢測
用包被液稀釋抗IBDV雞IgG至5pg/ml，然后包被酶標(biāo)板，100^1/孔，4'C過夜， PBST洗滌5次，每次5min，拍干；用含體積比10%FBS的PBST封閉液滿孔封閉， 37°C， 2h，PBST洗滌5次，每次5min，拍干；加入超聲破碎好的P4代細(xì)胞，lOOjil/ 孔，37'C, 2h， PBST洗滌5次，每次5min，拍干；加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的
9抗IBDV雞IgG， 100nl/孔，37°C， lh， PBST洗滌5次，每次5min，拍干；顯色。 實(shí)驗(yàn)同步設(shè)立陰性(正常Sf9細(xì)胞)和空白(PBST)對照。P4代vBac-VP2病毒細(xì)胞 超聲裂解物，抗原效價(jià)1.6xl()S以上，表明VP2基因在昆蟲細(xì)胞中得到了高效表達(dá)。 正常Sf9細(xì)胞和PBST對照孔則均為陰性。 2.5.4免疫印跡分析(Western blotting)
將P3代vBac-VP2感染的Sf9細(xì)胞、Bacmid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的野生桿狀病毒感染的Sf9 細(xì)胞和正常的Sf9細(xì)胞用0.01mol/LpH7.2 PBS離心洗漆兩次后，按原體積P/。加入PBS 重懸，三次凍融后，加入5xSDS-Loading Buffer,按常規(guī)方法進(jìn)12%分離膠和5%濃 縮膠的SDS-PAGE電泳分析，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印完畢后，將硝酸纖維素膜 用5。/。脫脂奶粉4'C封閉過夜，然后用一抗(雞的IBDV高免血清)，二抗(HRP標(biāo)記 的兔抗雞IgG抗體)分別與之作用，DAB底物顯色，觀察特異蛋白條帶。P3代vBac-VP2 病毒細(xì)胞培養(yǎng)物在53kDa附近可見一條特異蛋白帶(圖2中3、 4、 6泳道)。
2.5.5電鏡觀察
用P3代vBac-VP2感染Sf9昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變之后，收集細(xì)胞，凍融三 次，3000rpm,離心30min，取上清用電鏡負(fù)染技術(shù)制片觀察。用同樣方法收集病變 細(xì)胞，不凍融，3000rpm離心30min沉淀細(xì)胞，2%戊二醛固定液固定，超薄切片，電 鏡觀察，同時(shí)設(shè)立正常Sf9昆蟲細(xì)胞做空白對照。在P3代vBac-VP2病毒感染的昆蟲 細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒，直徑約60nm (圖3a);用vBac-VP2病毒感染的病變細(xì)胞 制備超薄切片，可發(fā)現(xiàn)由病毒樣顆粒在細(xì)胞中形成的"包涵體樣"結(jié)構(gòu)(圖3b)。
2.6重組VP2蛋白的純化
取300ml vBac-VP2感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集細(xì)胞，用12ml結(jié)合緩沖液重懸， 并加入2(^110Ommol/LPMSF，冰浴條件下超聲破碎至細(xì)胞懸液清亮，4'C， 10000rpm 離心30min，去除細(xì)胞碎片，取上清用0.45nm孔徑濾膜過濾，然后按照HisTrap HP 說明書純化重組VP2蛋白。純化的重組VP2蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，用凝膠圖像分析 軟件BandScan5.0分析，重組VP2蛋白的純度達(dá)卯％以上(圖2中4泳道)。
2.7重組VP2蛋白的應(yīng)用
2.7.1 IBDV抗體間接ELISA檢測方法的建立
用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋純化的重組VP2蛋白至5pg/ml，包被ELISA板， lOO^il/孔，4"過夜；用PBST洗滌3次，每次2分鐘，拍千；每孔加入含體積比10%FBS 的PBST封閉液300^1， 37°C， 2h;用PBST洗滌3次，每次2分鐘，拍干；加入待 檢血清樣品，37'C， lh;用PBST洗滌3次，每次2分鐘，拍干；加入HRP-標(biāo)記的 兔抗雞IgG (1:2000) lOOpl, 37°C， lh;用PBST洗滌4次，每次2分鐘，拍干；加 入顯色劑A液(四甲基聯(lián)苯胺溶液)、B液(過氧化氫脲溶液)液各一滴，暗盒顯色； 2M H2S04終止，測A450值，判定結(jié)果。IBD疫苗(B87株)免疫20d后的雞血清 (陽性血清)檢測孔爿45o值^0.90，而SPF雞血清、牛血清以及PBST對照孔的爿450 值均為0.00。
2.7.2 IBD病毒樣顆粒基因工程疫苗的制備，其方法為取重組桿狀病毒vBac-VP2
10感染的Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融三次，用IBDV抗體夾心ELISA檢測，ELISA效價(jià) ^1600，加等體積的白油免疫佐劑，混合乳化，即為IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙?。 2.7.3重組VP2蛋白的免疫攻毒試驗(yàn)
將100只2周齡SPF雞(購自南京天邦生物科技有限公司)隨機(jī)分成三組重組 VP2蛋白加免疫佐劑組60只，將重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物(ELISA 效價(jià)^1600)與等體積的白油免疫佐劑(購自南京天邦生物科技有限公司)混合乳化， 經(jīng)胸部肌肉注射，0.4ml/只/次，第l次免疫14d后進(jìn)行第2次免疫；單用免疫佐劑組 20只，免疫程序與前者相同，只注射免疫佐劑，0.4ml/只/次；空白對照組20只，不 注射，只是與其它兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在同樣條件下飼養(yǎng)。全部的實(shí)驗(yàn)雞均在免疫實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)翅 靜脈采血，并在免疫后每間隔14d采血一次，檢測抗體。
第一次免疫14d后，重組VP2蛋白加免疫佐劑組的ELISA抗體效價(jià)為800，而 單用免疫佐劑組與空白對照組ELISA抗體效價(jià)均小于IOO。第二次免疫14d后，重 組VP2蛋白加免疫佐劑組ELISA抗體效價(jià)達(dá)到3200以上，此時(shí)采用點(diǎn)眼、滴鼻、擦 肛三種途徑人工感染IBDV強(qiáng)毒(BC6-85株，購自中國獸藥監(jiān)察所)，攻毒劑量0.2m1/ 只(20倍稀釋法氏囊組織懸液，夾心ELISA效價(jià)為8000)，攻毒后觀察7 d，重組 VP2蛋白加免疫佐劑組的免疫保護(hù)率為100% (60/60)，而單用免疫佐劑組與空白對 照組ELISA檢測抗體效價(jià)仍小于100，攻毒雞全部死亡，死亡率為100% (40/40)， 檢査病死雞的法氏囊組織，發(fā)現(xiàn)有典型的IBD病理變化腫脹、出血。
IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙绲挠梅ㄐ夭考∪庾⑸洌?.4ml/只/次，第l次免疫 14d后進(jìn)行第2次免疫。
11序列表
江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重組蛋白 說明書 4
Patentln version 3.1 1
36
DNA
人工合成
VP2基因擴(kuò)增引物正向VP2F(36) (1)..(36)
<120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400> 1
cagatctgaa加atggcga acctgcaaga tcaaac 36 <210> 2 <211> 34
DNA
人工合成
VP2基因擴(kuò)增引物反向VP2R(34) (1)..(34)
<212> <213> <220> <221> <222> <223> <400> 2
ctactaccte cttatggccc ggattatgtc tttg 34
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213>人工
<220>
<221>鑒定引物M13F(17)下游序列 <222> (1)..(17) <223> <400> 3
gttttcccag tcacgac 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213>人工
<220>
<221>鑒定引物M13F(17)下游序列 <222> (1)..(17) <223> <400> 4
caggaaacag ctatgac 1權(quán)利要求
1、傳染性法氏囊病病毒變異株AH1 VP2基因病毒樣顆粒重組蛋白，是通過構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2，用pBac-VP2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞獲得的重組桿狀病毒vBac-VP2表達(dá)獲得的。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重組 蛋白，其重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2和重組桿狀病毒vBac-VP2的構(gòu)建方法為 根據(jù)VP2基因序列和供體質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)VP2基因擴(kuò)增引物正向VP2F(36): 5'陽CAGATCTGAATTCATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC-3， 反向VP2R(34): 5，-CTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTCTTTG-3， 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物M13F(17): 上游序列5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3， 下游序列5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，將克隆質(zhì)粒pUC-VP2 (AH1)和含有6個(gè)組氨酸His的供體質(zhì)粒pFastBacHTA分 別用EcoR I和Hind ffl雙酶切，將IBDV變異株AH1的VP2基因，定向克隆入桿狀 病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFas但acHTA中，構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBaeHTA-VP2， 轉(zhuǎn)化含有Bacmid和Helper plasmid的五.co// DH10Bac感受態(tài)，用VP2基因正向擴(kuò)增 引物VP2F(36)和M13 R(17)引物下游序列PCR鑒定Bacmid DNA，可得一條大小為 2100bp的條帶，獲得含VP2基因的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2，用pBac-VP2 轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒vBac-VP2。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒 重組蛋白，其特征在于，所述重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2和重組桿狀病毒 vBac-VP2含有6個(gè)組氨酸His標(biāo)簽和煙草蝕紋病毒TEV蛋白酶識別位點(diǎn)，便于重組 VP2蛋白的純化。
4、 權(quán)利要求1-3之一所述傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重組 蛋白的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求1-3之一所述傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重組 蛋白的純化方法，包括用第3代重組桿狀病毒vBac-VP2感染Sf9昆蟲細(xì)胞，待細(xì) 胞完全病變之后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，3000rpm離心30min收集細(xì)胞，用HisTrap HP 結(jié)合緩沖液重懸，并加入20jil 100mmol/L PMSF，置于0'C冰水浴，超聲功率 500~600W、每次超聲時(shí)間10min、重復(fù)2~4次超聲，至細(xì)胞懸液清亮，4'C， 10000rpm 離心30min，去除細(xì)胞碎片，取上清用0.45pm孔徑濾膜過濾，然后按照說明書用 HisTrap HP層析柱純化重組VP2蛋白。
6、 用權(quán)利要求1-3之一所述傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重 組蛋白檢測IBDV血清抗體的ELISA方法，包括用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋純化 的重組VP2蛋白至5叫/ml，包被ELISA板，100^1/孔，4'C過夜；用PBST洗滌3次， 每次2分鐘，拍干；每孔加入含體積比10%FBS的PBST封閉液300^1, 37°C， 2h;用PBST洗滌3次，每次2分鐘，拍干；加入待檢血清樣品，37°C， lh;用PBST洗 滌3次，每次2分鐘，拍干；加入HRP-標(biāo)記的1:2000兔抗雞IgG100nl， 37°C， lh; 用PBST洗滌4次，每次2分鐘，拍干；加入顯色劑A液即四甲基聯(lián)苯胺溶液、B液 即過氧化氫脲溶液各一滴，暗盒顯色；2MH2S04終止，測^45Q值。
7、 權(quán)利要求1-3之一所述傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重組 蛋白的病毒樣顆?；蚬こ桃呙?，其制備方法為取重組桿狀病毒vBac-VP2感染的 Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融三次，用IBDV抗體夾心ELISA檢測，ELISA效價(jià)^ 1600, 加等體積的白油免疫佐劑，混合乳化，即為IBD病毒樣顆粒基因工程疫苗。
8、 權(quán)利要求7所述病毒樣顆?；蚬こ桃呙绲膽?yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及傳染性法氏囊病病毒變異株VP2基因病毒樣顆粒重組蛋白，屬于生物制藥領(lǐng)域。將IBDV變異株(AH1)VP2基因，克隆、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染，獲得重組桿狀病毒vBac-VP2。感染的Sf9昆蟲細(xì)胞具有特異性熒光，抗原效價(jià)在1.6×10³以上，重組VP2蛋白分子量53kDa，在感染細(xì)胞中呈病毒樣顆粒形態(tài)。用純化的重組VP2蛋白為包被抗原建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法具有良好的特異性和敏感性；免疫雞，可抵抗IBDV強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率達(dá)到100％。本發(fā)明用IBDV變異株VP2基因制備的新型病毒樣顆粒重組VP2蛋白對當(dāng)前IBDV流行毒株的免疫預(yù)防針對性更高，具有良好的實(shí)用價(jià)值和推廣前景。
文檔編號C07K14/08GK101624421SQ20091018404
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者何孔旺, 宇 周, 唐雨德, 張海彬, 歐陽偉, 王忠燦, 王曉麗, 王永山, 范紅結(jié) 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院