專利名稱：：優(yōu)化的串連細(xì)胞因子及其在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的干細(xì)胞研究，具體涉及串連的密碼子優(yōu)化的人源細(xì)胞因子，并將該細(xì)胞因子用于iPS細(xì)胞(inducedPluripotentStemcells)的誘導(dǎo)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：iPS(inducedPluripotentStemcells)技術(shù)作為一個(gè)新興的技術(shù)解決了胚胎干細(xì)胞的來(lái)源的限制，并繞開(kāi)了倫理的約束，為再生醫(yī)學(xué)研究的提供了新的希望。早期的iPS使用0ct3/4，Klf4，Sox2與Myc組合或0ct3/4，Klf4，Nanog與Lin28組合。為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，提高iPS效率以及提高iPS的安全性，人們對(duì)iPS誘導(dǎo)技術(shù)方面進(jìn)行了諸多改進(jìn)，主要可以分為以下幾個(gè)方面1)減少細(xì)胞因子個(gè)數(shù)。Myc和Klf有導(dǎo)致細(xì)胞癌變的特性，使用較少的細(xì)胞因子將會(huì)有更高的安全性。實(shí)驗(yàn)證明可以使用0ct3/4和Klf4(Kim，J.B.etal，Pluripotentstemcellsinducedfromadultneuralstemcellsbyr印rogrammingwithtwofactors.Nature454(2008)，646-50.該文獻(xiàn)中文名為，使用兩個(gè)重編程細(xì)胞因子從小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。)，或者單獨(dú)使用0ct3/4誘導(dǎo)出iPS(Kim，J.B.，etal.0ct4-inducedpluripotencyinadultneuralstemcells.Cell136(2009)，411-9.該文獻(xiàn)中文名為，0ct4在成體神經(jīng)干細(xì)胞中誘導(dǎo)的多能性。)2)使用同一載體表達(dá)多個(gè)誘導(dǎo)因子。在做iPS誘導(dǎo)的過(guò)程中，同時(shí)轉(zhuǎn)染或者感染多個(gè)誘導(dǎo)因子在實(shí)驗(yàn)操作上比較繁瑣，特別使用質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。多個(gè)研究小組使用串聯(lián)的基因進(jìn)行iPS誘導(dǎo)(Carey，B.W.，etal.R印rogrammingofmurineandhumansomaticcellsusingasinglepolycistronicvector.ProcNatlAcadSciUSA106(2009)，157-62.該文獻(xiàn)中文名為，用單個(gè)多順?lè)醋虞d體重編程小鼠和人體細(xì)胞。Gonzalez,F.，etal.Generationofmouse—inducedpluripotentstemcellsbytransientexpressionofasinglenonviralpolycistronicvector.ProcNatlAcadSciUSA106(2009)，8918-22.該文獻(xiàn)中文名為，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)一個(gè)單個(gè)非病毒多順?lè)醋虞d體來(lái)產(chǎn)生小鼠的iPS細(xì)胞。)。3)使用安全的非整合誘導(dǎo)方式。如腺病毒，質(zhì)粒，和蛋白形式的外源誘導(dǎo)因子。由于腺病毒載體不整合到細(xì)胞的基因組并具有感染多種細(xì)胞的能力，人們用腺病毒進(jìn)行iPS誘導(dǎo)，但是此種方法得到的iPS誘導(dǎo)效率較低(Stadtfeld，M.，etal.Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science322(2008)，945-9.該文獻(xiàn)中文名為，產(chǎn)生非病毒整合的iPS細(xì)胞。)。這可能是由于腺病毒攜帶了太多的病毒基因所致。為了避免外源的細(xì)胞因子整合到細(xì)胞的基因組，人們也采取了多次轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法來(lái)獲得iPS細(xì)胞(0kita，K.，etal.Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science322(2008)，949-53.該文獻(xiàn)中文名為，使用非病毒載體產(chǎn)生小鼠iPS細(xì)胞。)。為了徹底避免核酸引入，人們也開(kāi)發(fā)了通過(guò)直接在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子蛋白來(lái)誘導(dǎo)iPS(Kim，D.，etal.Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsbydirectdeliveryofr印rogrammingproteins.CellStemCell4(2009)，472-6.該文獻(xiàn)中文名為，直接使用重編程蛋白產(chǎn)生人iPS細(xì)胞。Li，W.，etal.Generationofratandhumaninducedpluripotentstemcellsbycombininggeneticr印rogrammingandchemicalinhibitors.CellStemCell4(2009)，16_9.該文獻(xiàn)中文名為，綜合使用基因重編程蛋白和化學(xué)抑制物產(chǎn)生大鼠和人iPS細(xì)胞。)，但是遇到同樣的問(wèn)題iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率較低。4)結(jié)合輔助手段提高iPS效率?；瘜W(xué)小分子藥物丙戊酸(valproicacid(VPA))可以提高0ct3/4禾口Sox2的誘導(dǎo)效率(Huangfu，D.，etal.Inductionofpluripotentstemcellsbydefinedfactorsisgreatlyimprovedbysmall—moleculecompounds.NatBiotechnol26(2008)，795-7.該文獻(xiàn)中文名為，小分子化合物可以大大提高固定因子的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程。)使用MicroRNA也可以提高iPS的誘導(dǎo)效率(Judsonetal.，Embryonicstemcell—specificmicroRNAspromoteinducedpluripotency.NatBiotechnol27(2009)，459-61.該文獻(xiàn)中文名為，胚胎干細(xì)胞特異的microRNA提高誘導(dǎo)效率。)。由此可見(jiàn)，iPS誘導(dǎo)技術(shù)呈現(xiàn)出多樣性的特征。高效的iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)是可以減少樣本細(xì)胞的用量，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高成功率，更加有利于iPS細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。在同一個(gè)質(zhì)粒上表達(dá)多個(gè)基因的策略有多種1)使用多個(gè)啟動(dòng)子，每個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)獨(dú)立的編碼框。這個(gè)策略的缺陷是由于不同啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力不同，并且重復(fù)串聯(lián)的相同啟動(dòng)子之間的相互干擾導(dǎo)致兩個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)效率都降低。2)在一個(gè)啟動(dòng)子內(nèi)部使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件表達(dá)兩個(gè)基因。IRES容易導(dǎo)致串聯(lián)的表達(dá)框中的第二個(gè)基因表達(dá)水平低于第一個(gè)基因。3)在融合蛋白的連接位點(diǎn)引入蛋白酶切位點(diǎn)，利用細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶將串聯(lián)蛋白切割成單個(gè)的功能蛋白，但是細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶酶切不充分，這個(gè)策略是最不常用。能夠在蛋白水平實(shí)現(xiàn)自我剪切的蛋白酶元件的發(fā)現(xiàn)為串聯(lián)基因的發(fā)現(xiàn)提供了新的可能性。研究表明，一些正鏈病毒的基因組編碼一個(gè)全長(zhǎng)的融合蛋白，該融合蛋白沒(méi)有活性。其中有一段2A短肽(18-22氨基酸)可以在融合蛋白中自我切割，產(chǎn)生單個(gè)獨(dú)立的蛋白(參見(jiàn)如下文獻(xiàn)SzymczakAL，WorkmanCJ，WangY，VignaliKM，DilioglouS，VaninEF，VignaliDA(2004)Correctionofmulti-genedeficiencyinvivousingasingle'self-cleaving'2Ap印tide-basedretroviralvector.Naturebiotechnology22:589-594;該文獻(xiàn)中文名為使用單個(gè)基于2A短肽'自剪切'的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以在體內(nèi)矯正多基因缺陷)。通過(guò)串聯(lián)的2A序列可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)，其特點(diǎn)為，1)串聯(lián)基因由同一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單個(gè)長(zhǎng)片段信使RNA(mRNA)用于表達(dá)融合蛋白，2)融合蛋白高效自我切割，切割后的蛋白可以行使其獨(dú)立的功能，3)串聯(lián)基因等物質(zhì)的量表達(dá)，前后兩個(gè)蛋白的表達(dá)量一致。
發(fā)明內(nèi)容為了提高iPS的誘導(dǎo)效率，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的串連細(xì)胞因子并將該細(xì)胞因子用于誘導(dǎo)iPS中。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。本發(fā)明所采用的細(xì)胞因子包含0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt，所述0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt的基因序列分另U如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。本發(fā)明使用人源0ct4，Sox2和Klf4基因，在優(yōu)化的過(guò)程使用了人偏好的密碼子，并去掉了潛在的內(nèi)含子和外顯子位點(diǎn)，我們稱之為0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt。優(yōu)選的，所述0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因連接順序由5'端到3'端依次為0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt。優(yōu)選的，所述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子還含有串聯(lián)片段，所述串聯(lián)片段為2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分別如SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2所示。所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。所述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子為0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(命名為OKSopt)。其中，所述0ct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分別如SEQIDNO:6、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:4禾PSEQIDNO:8所示。本發(fā)明還提供了一種將上述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子應(yīng)用在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞中的方法。作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照，我們構(gòu)建了基因子編碼沒(méi)有修改的原始基因序列，并且其連接方式與優(yōu)化的序列保持一致，0ct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2命名為(OKS(N))。為了驗(yàn)證優(yōu)化的OKS在iPS誘導(dǎo)方面的效率提高效果，我們選擇相應(yīng)的表達(dá)載體來(lái)攜帶這三個(gè)串聯(lián)基因。優(yōu)選的，選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，特別是pMXs載體用于攜帶優(yōu)化的串聯(lián)基因，這是因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體可以在誘導(dǎo)了iPS細(xì)胞后可以有效的沉默。攜帶OKSopt的載體也包括腺病毒載體、慢病毒載體和質(zhì)粒等其它多種形式的載體。本發(fā)明使用的構(gòu)建的串聯(lián)OKSopt序列可以提高iPS的誘導(dǎo)效率，高效的iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)是可以減少樣本細(xì)胞的用量，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高成功率，更加有利于iPS細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。本發(fā)明使用的串聯(lián)OKSopt序列可以潛在的應(yīng)用于人，猴，豬，馬，牛，羊，狗，小鼠，大鼠等諸多種屬哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)。圖1是本發(fā)明中的串聯(lián)三個(gè)因子的酶切鑒定圖；圖2是本發(fā)明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)酶切鑒定圖；圖3是本發(fā)明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)質(zhì)粒包裝成為逆轉(zhuǎn)錄病毒后的表達(dá)鑒定圖；圖4是本發(fā)明所得到的iPS效率差異的統(tǒng)計(jì)圖。具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例舉例了發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，用于示例本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實(shí)施例的范圍。這些實(shí)施例，根據(jù)本文公開(kāi)和本領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍水平，技術(shù)人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過(guò)本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變動(dòng)、修飾和改造。其中所涉及的技術(shù)，除非特別說(shuō)明，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1:優(yōu)化的誘導(dǎo)因子基因序列的獲得根據(jù)人偏好的密碼子編碼，我們對(duì)四個(gè)細(xì)胞因子的編碼序列進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，在進(jìn)行基因優(yōu)化的同時(shí)，我們也去除了基因內(nèi)部可能的內(nèi)含子剪接位點(diǎn)，這個(gè)可以最大程度的保持mRNA的完整性，提高蛋白的表達(dá)水平。原始的編碼序列與優(yōu)化后的編碼序列的差異見(jiàn)表l，表1所示為本發(fā)明中優(yōu)化后與優(yōu)化前序列使用的密碼子差異比較。表1優(yōu)化前后密碼子差異分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>優(yōu)化基因的序列見(jiàn)序列表，優(yōu)化序列在商業(yè)化公司合成。連接到pMD18T-simple載體(TaKaRa公司，大連)上pT-0ct4opt-F2A-P2A，pT-Klf4opt，pT-Sox2opt。實(shí)施例2:密碼子未優(yōu)化細(xì)胞因子的T載體構(gòu)建以0ct4(NCBI登錄號(hào)為NM_002701.4)基因?yàn)槟０?，以h0ct4(1+20)HS與h0ct4(1077-22)BEI為引物，進(jìn)行PCR，Tm=63°C;以Klf4(NCBI登錄號(hào)為NM_004235.4)基因?yàn)槟０澹詇Klf4(l+20)HS與hKlf4(1410-25)BEI為引物，進(jìn)行PCR，Tm=63°C;Sox2(NCBI登錄號(hào)為NMJ)03106.2)基因?yàn)槟０?，以hSox2(1+25)HS與hSox2(951-22)BEI為引物，進(jìn)行PCR，Tm=63°C。引物名稱引物序列h0ct4(l+20)HSGGAaagctactagtATGGCGGGACACCTGGCTTCh0ct4(1077-22)BEIGATgaattctttaggatccGTTTGAATGCATGGGAGAGCCChKlf4(l+20)HSGGAaagcttactagtATGGCTGTCAGCGACGCGCThKlf4(1410-25)BEIGATgaattctttaggatccAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGhSox2(l+25)HSGGAaagcttactagtATGTACAACATGATGGAGACGGAGChSox2(951-22)BEIGATgaattctttaggatccCATGTGTGAGAGGGGCAGTGTG在構(gòu)建過(guò)程中使用了復(fù)能公司高保真PCR反應(yīng)試劑。引物序列如上。PCR反應(yīng)體系的配制(50iU):Buffer(5X):10ii110XMgS04母液5iUd證(10ilM)1模板100ng引物(20iiM):0.5iU/條Ultr即fuTaq酶2UH20S50iilPCR反應(yīng)條件步驟198°Clmin步驟298。C10sec步驟3Tm63。C30sec步驟472。C30sec步驟5回到步驟2共28個(gè)循環(huán)步驟672。C7min步驟616。ClhPCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，插入到pMD18T-simple載體(TaKaRa公司，大連)中，分別得到pT-0ct4，pT-Klf4與pT-Sox2。實(shí)施例3:串聯(lián)因子的質(zhì)粒構(gòu)建優(yōu)化OKSopt序列的構(gòu)建按如下步驟進(jìn)行步驟1:pT-0ct4opt-F2A-P2A經(jīng)過(guò)Spel和BamHI酶切，回收質(zhì)粒骨架，pT-Klf4opt也經(jīng)Spel和BamHI酶切，得到Klf4opt基因片段，連接得到pT-0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A。步驟2:此質(zhì)粒進(jìn)一步經(jīng)過(guò)NheI和EcoRI酶切，回收質(zhì)粒骨架，pT-Sox2opt同樣經(jīng)過(guò)Nhel和EcoRI得到Sox2opt基因片段，連接得到pT-0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(簡(jiǎn)寫(xiě)pT-0KSopt)，酶切結(jié)果見(jiàn)圖1，預(yù)期酶切后，得到的片段大小分別為3644bp，1760bp，932bp。圖1中#1和#2分別為構(gòu)建的兩個(gè)獨(dú)立的pT-0KSopt質(zhì)粒克隆，由圖1中#1和#2可知，酶切結(jié)果與預(yù)期一致，初步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確。非優(yōu)化hu0KS序列的構(gòu)建步驟1:pT-0ct4opt-F2A-P2A經(jīng)過(guò)Xbal和BglII酶切，回收質(zhì)粒骨架，pT-0ct4也經(jīng)Spel和BamHI酶切，得到0ct4基因片段，連接得到pT-0ct4-F2A-P2A。步驟2:pT-0ct4-F2A-P2A經(jīng)過(guò)Spel和BamHI酶切，回收質(zhì)粒骨架，pT-Klf4也經(jīng)Spel和BamHI酶切，得到Klf4基因片段，連接得到pT-0ct4-F2A-Klf4-P2A。步驟3:此質(zhì)粒進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Nhel和EcoRI酶切，回收質(zhì)粒骨架，pT_Sox2同樣經(jīng)過(guò)Spel和EcoRI得到Sox2基因片段，連接得到pT-0ct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2(N)(簡(jiǎn)寫(xiě)pT-0KS(N))。其酶切結(jié)果見(jiàn)圖l，預(yù)期酶切后，得到的片段大小分別為3644bp，1760bp和932bp。圖1中#7和#8分別為兩個(gè)獨(dú)立的pT-0KS(N)質(zhì)?？寺?，由圖1中#7和#8可知，酶切結(jié)果與預(yù)期一致，初步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確。實(shí)施例4:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXs-0KSopt和pMXs-0KS(N)的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pMXs-Flag(Addgene公司)經(jīng)過(guò)PmeI單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)去磷酸化處理(NEB公司，具體參照說(shuō)明書(shū))。質(zhì)粒骨架采用瓊脂糖凝膠電泳回收。pT-0KSopt和pT-0KS(N)分別經(jīng)EcoRV酶切，所得0KSopt和0KS(N)片段采用瓊脂糖凝膠電泳回收，分別插入到線性化的平端pMX載體骨架，分別得到上述pMXs-0KSopt和pMXs-0KS(N)質(zhì)粒。圖2A是pMXs-0KSopt的酶切圖，pMXs-0KSopt經(jīng)過(guò)BglII酶切后的預(yù)期片段大小為6791bp、1495bp，pMXs-0KSopt經(jīng)過(guò)BamHI酶切的預(yù)期片段大小為5678bp、2608bp;由圖2A可見(jiàn)，#2號(hào)克隆的樣品酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，初步確定，pMXs-0KSopt質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖2B是pMXs-0KS(N)的酶切圖，pMXs-0KS(N)經(jīng)過(guò)HindIII和EcoRI酶切后，預(yù)期片段大小為4664bp、2588bp、921bp、116bp，pMXs-0KS(N)經(jīng)過(guò)BamHI酶切的預(yù)期片段大小為4661、2596、1032bp;由圖2B可見(jiàn)，#2，4，6為三管獨(dú)立的pMXs-0KS(N)克隆樣品，同時(shí)進(jìn)行酶切，其酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，初步確定，pMXs-OKS(N)質(zhì)粒構(gòu)建成功。實(shí)施例5:逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與基因表達(dá)鑒定與小鼠iPS的誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝在293細(xì)胞中進(jìn)行，按照標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法得到，參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》第16章。包裝的病毒按照相同的劑量感染MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，48小時(shí)后，收集細(xì)胞?；虮磉_(dá)進(jìn)行WesternBlot鑒定。使用抗0ct4和抗Sox2的抗體可以檢測(cè)到基因的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖3，圖3是pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)質(zhì)粒包裝成為逆轉(zhuǎn)錄病毒后的表達(dá)鑒定圖，圖3中左邊的圖是檢測(cè)0ct4的表達(dá)的比較結(jié)果圖，右邊的圖是檢測(cè)Sox2的表達(dá)的比較結(jié)果圖。由圖3可見(jiàn)，優(yōu)化的0ct4和Sox2比非優(yōu)化的0ct4和Sox2表達(dá)水平稍高。MEF小鼠成纖維細(xì)胞的iPS誘導(dǎo)操作參照文獻(xiàn)(QinD，LiW，etal.DirectgenerationofES—likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/Klf4.CellRes.17(2007):959-62.該文獻(xiàn)中文名為，使用0ct4/Sox2/Myc/Klf4直接從未修飾的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中直接產(chǎn)生干細(xì)胞樣細(xì)胞。)。iPS實(shí)驗(yàn)過(guò)程聯(lián)合使用了表達(dá)Myc(Addgene公司)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。得到的iPS克隆經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4是iPS效率差異的統(tǒng)計(jì)圖，該圖表明優(yōu)化的OKS可以明顯地提高iPS效率。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。序列表〈160>8〈210>1〈211>29〈212>F2APRT〈400>1ArgSerLyslieValAlaProValLysGinThrLeuAsnPheAspLeu151015LeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnProGlyPro25〈210>1〈211>22〈212>P2APRT〈400>2GlySerGlyAlaThrAsnPheSerLeuLeuLysGinAlaGlyAspVal151015GluGluAsnProGlyPro0089]200090]〈210>10091]〈211>870092]〈212>F2ADNA0093]〈400>30094]agatcteagattgtggcccctgtg朋gC3g0095]ggcgatgtggagtccaaccctggcccc0096]〈210>10097]〈211>660098]〈212>P2ADNA0099]〈400>40100]ggatccggcgccaccaacttctccctgctg0101]gggccc0102]〈210>10103]〈211>12860104]〈212>Hu0ct4opt-F2A-P2ADNA0105]〈400>50106]gatetc朋gctttctegaatggctggccat0107]cctggaggtgg￡lggCg￡ltggccctggaggt0108]tggctgtccttccagggcccccctggcggc0109]tctgaggtctggggcatccccccatgccct0110]tectgtggccctc朋gtgggagtgggactg0111]cctgagggcgaggctggcgtgggCgtggElg0112]tgC3C3gtg3cccctggcgctgtg朋gctg0113]gagtcccagg3C3tC朋ggCcctgcag朋g0114]C3g朋g3gg3tcaccctgggctecacccag0115]tttggc朋ggtcttctcccagaccaccatc0116]朋g朋catgtgcaagctgaggcccctgctg0117]gag朋cctgc郷卿tttgcaaggctgag0118]acctccattgag朋ccgcgtg郷ggc雄0119]cccaccctgcagcaaatctcccacattgcc0120]agggtctggttctgcaacagg3ggC卿3g0121]3ggg3gg3Ctttgaggctgctggctcccca0122]gcccctggcccccactttggcacccctggc0123]tcctctgtgccattccctgagggcg郷cc0124]tcccccatgcactccaacagatctaagatt0125]gacctgctgaagctggctggcgatgtggag0126]ggcgccaccaacttctccctgctgaagcag0127]gctagctaaagaattctaaagatatcaccctgaactttgacctgctg朋gctggct6087aagcaggctggcgatgtggaggag朋ccct6066ctggcctctgactttgccttctctcctcct60cctgaacctggCtgggtggElccccaggacc120cctggcattggccctggcgtgggccctggc180cctccatetgagttctgtggcggcatggcc240gtgccccagggcggcctggagacctcccag300tccaactctgatggcgcctcccctgagcca360g卿3gg卿agctggagcag朋ccctgag420gagctggagcagtttgccaagctgctg朋g■gctgatgtgggcctgaccctgggcgtgctg540tgcaggtttgaggccctgcagctgtccttc600C卿3gtgggtgg郷郷ctgac朋c朋t660accctggtgc3ggCC3gg朋g郷El卿gg720ctggag朋cctgttcctgcagtgccccaag780cagcagctgggcctggagaaggEltgtggtg840ggC3卿ggtcctcctctgactetgcccag■ttctctggcggccctgtctccttccccctg960tetggctccccccacttcacagccctgtec1020ttcccccctgtctctgtgaccaccctgggc1080gtggcccctgtg朋gcagaccctgaacttt1140tccaaccctggccccactegtgccggatcc1200gctggcgatgccctgggccc126012860128]〈210>10129]〈211>10800130]〈212〉Hu0ct4optDNA0131]〈400>60132]atggctggccatctggcctctgactttgcc0133]ggccctggaggtcctgaacctggctgggtg0134]ccccctggcggccctggcattggccctggc0135]cccccatgccctcctccatetgagttctgt0136]gg3gtggg3Ctggtgccccagggcggcctg0137]gtgggcgtggagtccaactctgatggcgcc0138]gctgtg朋gctggagaaggag朋gCtggElg0139]gccctgcaga郷ElgCtggElgcagtttgcc0140]ggctecacccaggctgatgtgggcctgacc0141]C3g3CC3CC3tctgcaggtttgaggccctg0142]aggcccctgctgC卿3gtgggtgg郷3g0143]tgc朋ggctgagaccctggtgcaggccagg0144]gtg3ggggC33CCtgg3g朋cctgttcctg0145]tcccacattgcccagcagctgggCCtggElg0146]gtcctcctct0147]gctggctccccattctctggcggccctgtc0148]ggcacccctggctetggctccccccacttc0149]g郷gcg郷ccttcccccctgtctctgtg0150]〈210>10151]〈211>14380152]〈212〉HuKlf4optDNA0153]〈400>70154]aagcttectegtetggctgtctctgatgcc0155]ggccctgctggC3ggg卿3gaccctgagg0156]gaggagctgtcccacatgaagaggctgccc0157]gctgctgccacagtggccacagacctggag0158]tccaacctggcccccctgccC￡lgg￡lggg￡lg0159]gacttcatcctgtccaactccctgacccat0160]tcctctgcctctgcctcctcctcctcctcc0161]tccacctgctccttcaccteccccatcagg0162]ggc織ggcggcggcctgctgtetggcagg0163]aacctggctg3C3tC朋tg3tgtctcccca0164]cctgagctggaccctgtctecatccccccc0165]3tgggC朋gtttgtgctgaaggcctccctg0166]tctgtgatctctgtctccaagggctcccctttctctcctcctcctggaggtggaggcgat60g3CCCC3gg3cctggctgtccttccagggc120gtgggccctggctctgaggtctggggcatc180ggCggCEltggcctectgtggccctcaagtg240gagacctcccagcctgagggcgaggctggc300tcccctgagccatgcacagtgacccctggc360cagaaccctg3gg3gtCCC3ggacatc朋g420朋gctgctga3gC3g朋g3ggatcaccctg■ctgggcgtgctgtttggcaaggtcttctcc540cagctgtccttc朋g朋catgtgc朋gctg600gctgac朋caatgag朋cctgcaggagatt660朋gagg朋gaggacctccattgag朋ccgc720cagtgccccaagcccaccctgC3gC3朋tC780朋gg3tgtggtgagggtctggttctgcaac840gactetgccc卿ggg郷Elctttgaggct■tccttccccctggcccctggcccccacttt960acagccctgtactcctctgtgccattccct1020accaccctgggctcccccatgcactccaac1080ctgctgccatccttctccacctttgcctct60caggctggcgccccc朋c朋C3ggtgg郷120cctgtgctgcctggcaggccatetgacctg180tctggcggcgctggcgctgcctgtggcggc2403C3g3gg3gttcaatgacctgctggacctg300ccccctgagtctgtggctgccacagtctcc360ccatcctcctctggccctgcctctgcccca420gctggc朋tgaccctggcgtggcccctggc■gagtctgcccCCCCCCCC3Ccgccccattc540tctggcggctttgtggctgagctgctgagg600cagcagccccagccccctggcggcggcctg660tctgcccctggctctgagtetggctcccca720gatggctcccatcctgtggtggtggcccca780tec皿tggcggcccccccaggacctgcccc皿gatc皿gcaggaggctgtctcctcctgc840acccatctgggcgctggcccccccctgtcc皿tggCC3C3ggcctgctgcccatgacttc■cccctgggcaggcagctgccatccaggacc3CCCCC3CCCtgggcctggagg郷tgctg960tcctccagggactgccatcctgccctgcccctgccccctggcttccatccccatcctggc1020ccc皿ctecccatccttcctgcctgaccagatgcagccccaggtgccccccctgcactac1080C3gg3gCtg3tgccccctggctcctgcatgcctgaggagccc皿gccc皿gaggggcagg1140aggtcctggcCC3gg朋g3ggacagccacccacacctgtgactetgctggctgtggc皿g12003cctecacc3agtcctcccatctgaaggcccatctgaggaCCC3C3C3ggCg3g皿gCC31260teccactgtg3Ctggg3tggctgtggctggaagtttgccaggtctgatgagctgaccagg1320cactec3gg33gC3C3C3ggccacaggccattccagtgcc3g皿gtgtg3cagggccttc1380tccaggtctgaccatctggccctgcacatgttggatccteaagaattc1438〈210〉1〈211〉973〈212〉HuSox2optDNA〈400〉8aagcttgctegcatgtec皿ratgatggagagccccctggcccccagcag60acctctggcggcggcggcggC皿CtCC3C3gctgctgctgctggcggc皿CC3g皿g皿C120tcccctgacagggtga卿ggcccatgaatgccttcatggtctggtcraggggcc卿gg180CCC3gg3g皿ccccaagatgcacaactctg3皿tctcc皿gaggctgggc240gctgagtggaagctgctgtctrattgatg3ggcc皿gagg300ctgagggcccggagcatcctgactec皿gt3C3ggCCC3gg3gg皿g3CC360皿gaccctgatg皿g朋ggacaagtecaccctgcctggcggcctgctggcccctggcggc420aactccatggcctctggcgtgggcgtgggcgctggcctgggcgctggcgtg雄c卿gg480atggactcctatgcccacatg皿tggctggtccaatggctcctectccatgatgcaggac540cagctgggct3CCCCC3gC3tcctggcctgaatgcccatggcgctgcccagatgcagccc600atgcaccgctatgatgtctctgccctgcagtecaactccatgacctcctcccagacctec660atg皿tggctcccccacctectccatgtcctectcccagcagggcacccctggcatggcc720ctgggctccatgggctctgtggtg皿gtctgaggcctcctcctccccccctgtggtgacc780tcctcctcccactcccgcgccccatgccaggctggcgacctgagggacatgatctccatg840tecctgcctggcgctgaggtgcctgagcctgctgccccatccaggctgcacatgtcccag■cacteccagtctggccctgtgcctggcacagccatcaatggcaccctgcccctgtcccac960atgte朋g朋ttc9730199]〈210>10200]〈211>340201]〈212>h0ct4(l+20)HS0202]〈400>90203]ggaaagctactagtatggcgggacacctggcttc0204]〈210>10205]〈211>41〈212>h0ct4(1077-22)BEI〈400>10gatgaattctttaggatccgtttgaatgcatggg卿gccc〈210>1〈211>35〈212>hKlf4(l+20)HS〈400>11gga朋gcttectagtetggctgtcagcgacgcgct〈210>1〈211>44〈212>hKlf4(1410-25)BEI〈400>12gatgaattctttaggatccaaaatgcctcttcatgtgtaaggcg〈210>1〈211>40〈212>hSox2(l+25)HS〈400〉13gg朋3gcttactagtatgteg卿CggElgC〈210>1〈211>41〈212>hSox2(951-22)BEI〈400>14gatgaattctttaggatcccatgtgtg卿ggggC3gtgtg權(quán)利要求一種優(yōu)化的串連細(xì)胞因子，其特征在于，所述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子包含Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因序列分別如SEQIDNO6、SEQIDNO7和SEQIDNO8所示。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的優(yōu)化的串連細(xì)胞因子，其特征在于，所述0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因連接順序由5，端到3，端依次為0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的串連細(xì)胞因子，其特征在于，所述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子還含有串聯(lián)片段，所述串聯(lián)片段為2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的優(yōu)化的串連細(xì)胞因子，其特征在于，所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的串連細(xì)胞因子，其特征在于，所述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子為0ct4opt_F2A_Klf4opt_P2A_Sox2opt。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的優(yōu)化的串連細(xì)胞因子，其特征在于，所述0ct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分別如SEQIDNO:6、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8所示。7.權(quán)利要求l-6之一所述的優(yōu)化的串連細(xì)胞因子在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，所述優(yōu)化的串連細(xì)胞因子選用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為其載體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為pMXs載體。全文摘要本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的串連細(xì)胞因子及其將該細(xì)胞因子應(yīng)用在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞中的方法。該細(xì)胞因子為Oct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2opt，其中，Oct4、F2A、Klf4、P2A和Sox2opt的基因序列分別如SEQIDNO6、SEQIDNO3和SEQIDNO7、SEQIDNO4和SEQIDNO8所示。F2A和P2A的基因序列如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。pMXs載體用于攜帶優(yōu)化的串聯(lián)基因。本發(fā)明使用的構(gòu)建的串聯(lián)細(xì)胞因子可以提高iPS的誘導(dǎo)效率，進(jìn)而減少樣本細(xì)胞的用量，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高成功率，更加有利于iPS細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。文檔編號(hào)C07K14/52GK101709084SQ20091019419公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月26日優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日發(fā)明者馮立強(qiáng),李鋒,秦大江,米蓋爾·埃斯特班,裴端卿,謝海軍,陳凌,陳捷凱申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院