專利名稱：一種從黑米中分離制備高純度花色苷單體的方法
一種從黑米中分離制備高純度花色苷單體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從黑米中分離制備高純度花色苷單
體的方法。背景技術(shù)：
黑米(0ryza sativa L. indica)是有色特種稻中的一個(gè)重要類型，因其營養(yǎng)豐富，同時(shí)具有一定的保健功效，歷來深受人們的喜愛，在我國及東亞地區(qū)其它國家有著悠久的種植和食用歷史。目前，在我國黑米稻主要分布在云南、貴州、廣東、廣西、湖南和陜西等省。在黑米成熟過程中，種皮內(nèi)會(huì)積聚大量花色苷類色素，從而使其糙米呈現(xiàn)出棕紅色、紫紅色、紫黑色乃至黑色等顏色。除了黑米，花色苷在其他深色谷薯、漿果和蔬菜中也有廣泛分布。作為一種天然色素，花色苷安全無毒、資源豐富、色彩鮮艷且色質(zhì)好。另外，已有的研究表明，花色苷還具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂和改善胰島素抵抗等生物活性，是一種潛在的醫(yī)藥資源。 目前較常用的花色苷分離制備方法是溶劑浸提法，通常采用酸性醇溶液進(jìn)行提取，得到的粗提物總花色苷含量多在10% 35%之間，往往含有較多的雜質(zhì)，難于對(duì)其進(jìn)行鑒定，也限制了花色苷的開發(fā)利用。目前有報(bào)道采用高效液相色譜(HPLC)或高速逆流色譜技術(shù)對(duì)粗提物進(jìn)行純化制備花色苷單體，但存在產(chǎn)量小、成本高等問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種工藝過程簡單、提取時(shí)間相對(duì)較
短、原料和設(shè)備成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)的采用酸性醇溶液浸提及中壓液相色譜技術(shù)從黑
米中分離制備高純度花色苷單體的方法。 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包含三個(gè)主要工藝步驟 (1)制備黑米皮取一定量的黑米糙米，用精米機(jī)磨取黑米外層5% -8%種皮得到黑米皮。 (2)制備黑米花色苷粗提濃縮液稱取一定量黑米皮，用60%乙醇(含有O. 1%HC1)作為浸提劑，室溫下浸提2次，每次4-6h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；將濃縮液合并后用石油醚萃取去脂，棄去萃取液上層脂質(zhì)溶劑，下層的水溶液用大孔樹脂吸附，待吸附結(jié)束，用0. 01 % HC1洗除雜質(zhì)；用80%乙醇溶液將樹脂柱上吸附的花色苷類物質(zhì)洗脫下來，收集洗脫液于45t:下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇得到花色苷提取濃縮液。
(3)利用中壓液相色譜技術(shù)分離花色苷單體取一定量的花色苷提取濃縮液，上反相C18色譜柱，用0. 1%三氟乙酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，梯度洗脫，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)洗出液，根據(jù)所得的色譜圖分別收集黑米中不同的花色苷組分，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無甲醇，冷凍干燥得到兩種花色苷單體(純度=95% )粉末。 所述的黑米要求成熟度較高，著色良好，其它性狀達(dá)到大米國家標(biāo)準(zhǔn)(GB1354-2009) —級(jí)大米要求。
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所述化學(xué)試劑均為分析純。 本發(fā)明的有益效果是在黑米皮乙醇浸提液脫脂試劑為石油醚，脫脂效果好，沸點(diǎn) 低，回收容易；黑米皮乙醇粗提物采用Amberlite XAD_7大孔樹脂作為吸附材料，對(duì)花色苷 的選擇性較好；中壓液相色譜采用反相C18填料(粒徑50iim)裝柱，O. 1%三氟乙酸水溶液 和甲醇作為流動(dòng)相，梯度洗脫，花色苷矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷出峰時(shí) 的甲醇濃度分別為33% -35%和38% _40%，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到花色苷 單體粉末。 黑米糙米在磨去米皮后，能夠去掉原有的粗澀感，改善食用口感和風(fēng)味；純化設(shè)備 采用中壓制備液相色譜，而非高壓液相色譜或高速逆流色譜，流動(dòng)相為分析純而非色譜純， 設(shè)備要求低，流速高，上樣量大；所用試劑乙醇、石油醚和甲醇均可回收利用，環(huán)保無污染， 同時(shí)可以大大降低生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明具有工藝過程設(shè)計(jì)簡單、提取時(shí)間 短、適合大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明的工藝流程方框示意圖。具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明 參見圖l，一種從黑米中分離制備高純度花色苷單體的方法，其工藝流程是
第一步是制備黑米皮選取一定量的優(yōu)質(zhì)黑米糙米，用精米機(jī)磨取黑米外層 5% _8%種皮得到黑米皮(即通常所說的米糠)，將黑米皮分裝于塑料封口袋中，避光儲(chǔ)存
于低溫干燥處備用；磨去米皮的黑米為精制黑米，具有更好的口感，可真空包裝另外上市銷售。 第二步是獲得黑米花色苷粗提濃縮液稱取一定量黑米皮，以料/液比為1 : 10 的比例與60%乙醇(含有0. 1% HC1)混合。室溫下浸提2次，每次4-6h，期間不定期攪動(dòng) 以提高浸提效率；浸提后經(jīng)布氏漏斗過濾，濾液于=42t:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇為止；蒸發(fā)后 的濃縮液合并后用石油醚萃取去脂，棄去萃取液上層脂質(zhì)溶劑，下層的水溶液合并后再次 過濾；將濾液通過預(yù)先用0. 01% HC1酸化過的大孔樹脂(Amberlite XAD-7)吸附柱，流速 1-1. 5柱體積/h，待吸附結(jié)束，用0. 01% HC1洗除雜質(zhì)；用80%乙醇溶液將樹脂柱上吸附的 花色苷類物質(zhì)洗脫下來，流速2-3柱體積/h，收集洗脫液于45t:下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇得到 花色苷提取濃縮液，PH示差法測(cè)定提取液中總花色苷含量。 第三步是利用中壓液相色譜技術(shù)分離花色苷單體反相C18填料(粒徑50 ii m) 裝柱，將色譜柱用6%甲醇?jí)簩?shí)；取一定量花色苷提取濃縮液，按照1% _3%的重量比(以 總花色苷計(jì))上樣，O. 1%三氟乙酸水溶液(A)和甲醇(B)作為流動(dòng)相，在以下條件下進(jìn) 行梯度洗脫，線形梯度為A中含有6% B(0-12min)， A中含有12% -25% B(13-24min) ， A 中含有25% -35% B(25-60min) ， A中含有35% -45% B(61-72min) ， A中含有95% -6% B(73-90min)，流速設(shè)定為30mL/min，6-8min —個(gè)柱體積；用紫外檢測(cè)器(260nm檢測(cè)波長， 280nm收集波長)檢測(cè)洗出液，根據(jù)所得的色譜圖分別收集黑米中兩種主導(dǎo)花色苷組分， 即矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin 3-0-P-glucoside， Cy-3-G)和芍藥素-3-葡萄糖苷
4(peonidin 3-0-P -glucoside， Pn_3_G)，出峰時(shí)甲醇濃度分別為33% -35%和38% -40%， 將洗脫液于45t:下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無甲醇，冷凍干燥得到花色苷單體粉末，可以利用高效液相 色譜_質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)準(zhǔn)確定性，歸一化法或標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法測(cè)定純度。 實(shí)施實(shí)例1 :稱取黑米5kg，磨制米皮300g，與3L 60%乙醇(含有0. 1%HC1)混 合，室溫下浸提2次，每次4-6h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液于=42t:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇 為止；用石油醚脫脂，過濾后通過預(yù)先酸化的大孔樹脂吸附柱，流速1-1. 5柱體積/h，待吸 附結(jié)束，用0. 01 % HC1洗除雜質(zhì)；用80%乙醇溶液洗脫，流速2-3柱體積/h，收集洗脫液于 45t:下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇得到花色苷提取濃縮液；將3支40g中壓色譜柱串聯(lián)，注射器上 樣，O. 1%三氟乙酸水溶液(A)和甲醇(B)作為流動(dòng)相梯度洗脫，收集相應(yīng)保留時(shí)間吸收峰， 可以分別得到228mg Cy-3-G和30mg Pn-3-G。 實(shí)施實(shí)例2 :稱取黑米25kg，磨制米皮1500g，與15L 60%乙醇(含有0. 1 % HC1) 混合，室溫下浸提2次，每次4-6h;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液于二 42t:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無 乙醇為止；用石油醚脫脂，過濾后通過預(yù)先酸化的大孔樹脂吸附柱，流速1-1. 5柱體積/ h，待吸附結(jié)束，用0. 01 % HC1洗除雜質(zhì)；用80%乙醇溶液洗脫，流速2-3柱體積/h，收集 洗脫液于45t:下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇得到花色苷提取濃縮液；利用保護(hù)柱(約12g C18填 料)與玻璃分離柱(400g C18填料，50mmX500mm)上樣，O. 1%三氟乙酸水溶液(A)和甲 醇(B)作為流動(dòng)相梯度洗脫，收集相應(yīng)保留時(shí)間吸收峰，可以分別得到1200mg Cy-3-G和 150mgPn-3-G。
權(quán)利要求
一種從黑米中分離制備高純度花色苷單體的方法，包括(1)制備黑米皮取一定量的黑米糙米，磨取黑米外層5％-8％種皮得到黑米皮。(2)制備黑米花色苷粗提濃縮液稱取一定量黑米皮，用含有0.1％HCl的60％乙醇作為浸提劑，室溫下浸提2次，每次4-6h；浸提后經(jīng)布氏漏斗過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；將濃縮液合并后用脫脂試劑萃取去脂，棄去萃取液上層脂質(zhì)溶劑，下層的水溶液用大孔樹脂吸附，待吸附結(jié)束，用0.01％HCl洗除雜質(zhì)；用80％乙醇溶液將樹脂柱上吸附的花色苷類物質(zhì)洗脫下來，收集洗脫液于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇得到花色苷提取濃縮液。(3)利用中壓液相色譜技術(shù)分離花色苷單體取一定量的花色苷提取濃縮液，上反相C18色譜柱，用0.1％三氟乙酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，梯度洗脫，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)洗出液，根據(jù)所得的色譜圖分別收集黑米中不同的花色苷組分，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無甲醇，冷凍干燥得到兩種花色苷單體粉末。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是在黑米皮乙醇浸提液脫脂試劑為石油醚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征是黑米皮乙醇粗提物采用Amberlite XAD-7大 孔樹脂作為吸附材料。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是中壓液相色譜采用反相C18填料裝柱，料粒徑 50 ii m。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征是收集黑米中不同的花色苷組分，花色苷矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷出峰時(shí)的甲醇濃度分別為33 % -35 %和38 % -40 % ， 將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到純度=95%的花色苷單體粉末。
全文摘要
本發(fā)明為一種從黑米中分離制備高純度花色苷單體的方法。磨取黑米糙米外層5％-8％種皮得到黑米皮，采用酸化乙醇浸提黑米皮中的花色苷，石油醚萃取脫脂；用大孔樹脂對(duì)黑米皮乙醇提取物進(jìn)行初步純化；以中壓制備液相色譜技術(shù)分離黑米皮花色苷粗提物中的花色苷，根據(jù)所得的色譜圖分別收集黑米中的兩種主導(dǎo)花色苷組分，即矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷，將洗脫液于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無甲醇，冷凍干燥得到花色苷單體粉末。
文檔編號(hào)C07H1/08GK101723996SQ20091019436
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者凌文華 申請(qǐng)人:中山大學(xué)