專利名稱：基于豬瘟病毒ns3建立的間接elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，是基于豬瘟病毒(Classical Swine FeverVirus CSFV)重組蛋白NS3為包被抗原，建立檢測CSFV抗體的間接ELISA方法。

背景技術(shù)：
豬瘟(Classical Swine Fever CSF)是由CSFV引起的一種急性熱性傳染病，各種年齡階段的豬都可感染發(fā)病，該病被國際動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病，我國將其列為一類傳染病。雖然該病在北美洲、大洋洲及部分歐洲國家已經(jīng)消滅，但在其他養(yǎng)豬國家仍廣泛存在，并對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害。我國長期對豬群免疫接種豬瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapizined Virus HCLV)疫苗，基本控制了豬瘟的大流行，但豬瘟在我國各地豬群中廣泛存在，并呈現(xiàn)地區(qū)性散發(fā)性特點，在豬群中存在一定隱性感染和持續(xù)性感染現(xiàn)象。
當前CSF實驗室診斷方法主要存在的問題之一是如何有效地區(qū)分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染，雖然有報道特異性RT-PCR能夠區(qū)分病毒野毒和疫苗毒感染，但其對技術(shù)性要求過高，不適合大規(guī)模的流行病學調(diào)查。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)具有操作簡單、敏感性高、快速、易標準化等優(yōu)點，適合于大規(guī)模血清學檢測。但當前研制開發(fā)的絕大部分CSFV抗體檢測試劑盒，包括廣泛用于CSFV-Ab血清學檢測的IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒，同樣不能區(qū)分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染產(chǎn)生的抗體。隨著基因工程疫苗技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已研究開發(fā)出以CSFV E2作為抗原的基因工程標記疫苗，和基于CSFV Erns的鑒別診斷ELISA。雖然CSFV E2基因工程疫苗能夠?qū)σ赘胸i群提供保護，但在實際臨床中以Erns為抗原建立的鑒別診斷ELISA在血清學檢測方面存在敏感性低的缺陷(75～80％)，導致CSFV基因工程標記疫苗在實際臨床應用中受到限制。上述問題存在導致開展CSFV凈化工作受到嚴重阻礙，使得我國豬群中CSFV長期存在并對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于豬瘟病毒NS3建立的間接ELISA方法，可用于豬群中CSFV NS3蛋白抗體檢測，以此判斷豬群中CSFV NS3抗體水平、豬群中CSF自然感染的情況，以及為CSFV E2基因工程標記疫苗提供鑒別診斷ELISA。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種基于豬瘟病毒NS3建立的間接ELISA方法，該方法包括如下步驟 (1)、包被抗原的制備 根據(jù)GenBank中豬瘟病毒全基因序列(登錄號AF351433)，設(shè)計兩條引物，上游引物fP5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′，通過PCR方法從豬瘟病毒兔化弱毒(HCLV)cDNA中擴增到長度為2049bp NS3基因序列，將其克隆到原核表達載體pET-32a(+)(購自Novagen公司，產(chǎn)品編號69015-3)中，構(gòu)建重組原核表達載體pETNS3；將重組原核表達載體pETNS3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)細胞，經(jīng)0.1mM IPTG誘導高效表達了重組蛋白NS3，該蛋白主要以包含體形式表達，部分為可溶性表達，采用Ni+親和層析方法(參照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin試劑盒說明書)純化得到重組蛋白NS3，制得抗原。對照孔包被的抗原硫氧還蛋白由pET-32a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)細胞誘導表達，采用Ni+親和層析方法進行純化。
(2)、以純化的重組蛋白NS3作為包被抗原建立間接ELISA ①包被用pH為9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原包被96孔ELISA板(美國Costa公司)，檢測孔NS3蛋白包被量為200ng/孔，對照孔包被硫氧還蛋白40ng/孔，4℃條件下包被24小時后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐溫-20，下同)洗滌2遍； ②封閉封閉采用PBST稀釋5％脫脂奶粉，300μl/孔，37℃條件下封閉2h后甩干，用PBST洗滌3次； ③血清作用條件血清樣品稀釋液為PBST稀釋5％脫脂奶粉，添加5％大腸桿菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀釋為2μl/孔；37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ④酶標兔抗豬抗體作用條件酶標兔抗豬抗體(購自美國Sigma公司，產(chǎn)品目錄號A5670)用PBST做104倍稀釋，100μl/孔，37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ⑤底物顯色TMB底物(購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號T8768)100μl/孔，37℃條件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，終止反應； ⑥讀數(shù)采用酶標儀吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)，計算結(jié)果。
本發(fā)明中提及的PBST皆為0.05M PH7.4PBS+0.05％吐溫-20。(3)、間接NS3-ELISA結(jié)果判定標準 參考血清的確定經(jīng)IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒和IFA檢測為陽性的血清，在該NS3-ELISA條件下重復性檢測OD值為1.0±0.1確定為參考陽性血清；經(jīng)IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒和IFA檢測為陰性的血清，在該NS3-ELISA條件下重復性檢測OD值為0.1±0.05確定為參考陰性血清。
S/P值判定結(jié)果計算公式如下 樣品OD值＝檢測孔OD值-對照孔OD值 臨界OD值＝陰性血清平均OD值(n＞30)+3×標準差 樣品S/P值＝樣品OD值/參考陽性血清OD值 臨界S/P值＝臨界OD值/參考陽性血清OD值 判定標準當參考陽性血清OD值≥0.75，參考陰性血清OD值＜0.25，同時參考陰性血清OD值/參考陽性血清OD值＜0.2，表明試驗成立；臨界S/P值為0.3，S/P≥0.3判定為陽性，S/P＜0.3判定為陰性。
黃病毒科各成員NS3在功能方面相似，在人醫(yī)方面已有報道用丙型肝炎(HCV)重組蛋白NS3建立ELISA應用于感染人群血清學檢測。牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Virus Diarrhea Virus BVDV)與CSFV同屬于瘟病毒屬，運用BVDV NS3建立ELISA檢測牛群中BVDV的抗體水平在國外已經(jīng)報道。利用分子生物學技術(shù)克隆表達CSFV NS3基因獲取重組蛋白NS3，運用WesternBlotting分析證明能與血清中的CSFV NS3特異性抗體結(jié)合，以重組蛋白NS3為抗原建立間接ELISA，依據(jù)ELISA原理以S/P值作為該方法的結(jié)果判定標準，使該方法在檢測血清抗體過程中標準化，減少在實驗操作過程中造成的系統(tǒng)誤差，可以作為一種可靠的CSFV抗體血清學檢測方法，成為CSFV E2基因工程標記疫苗一種候選鑒別ELISA檢測方法。NS3-ELISA的建立理論上能為我國利用CSFV E2基因工程標記疫苗代替?zhèn)鹘y(tǒng)HCLV提供鑒別診斷自然感染的方法，使得運用基因工程標記疫苗結(jié)合配套鑒別診斷ELISA凈化我國豬群中的CSFV感染有可靠的技術(shù)保障。
本發(fā)明方法首次利用分子生物學基因克隆表達技術(shù)，獲取CSFV重組蛋白NS3，以重組蛋白NS3為抗原建立起間接ELISA。該NS3-ELISA可用于豬群中CSFV NS3特異性抗體檢測，以此判斷豬群中CSFV NS3抗體水平、豬群中CSF自然感染的情況，以及為CSFV E2基因工程標記疫苗提供鑒別ELISA檢測方法。



圖1是重組蛋白NS3在大腸桿菌Rosetta中誘導表達及蛋白純化SDS-PAGE分析圖。
其中第1泳道蛋白質(zhì)標準，從上至下分別是97.2KDa、66.4KDa、44.3KDa、29KDa；第2泳道純化后的重組蛋白NS3；第3泳道誘導菌裂解后上清；第4泳道誘導菌裂解后沉淀；第5泳道誘導后全菌；第6泳道未誘導全菌；第7泳道Western Blotting分析誘導菌裂解液；第8泳道WesternBlotting分析未誘導菌裂解液。
圖2是IFA檢測血清樣品結(jié)果圖。
其中A參考陽性血清；B參考陰性血清；C陰性血清；D陽性血清。

具體實施例方式 1、包被抗原的制備 1.1特異性引物設(shè)計與合成利用Primer 5.0引物分析軟件，根據(jù)GenBank收錄CSFV全基因序列(GenBank登陸號為AF351433)中NS3編碼區(qū)基因序列設(shè)計一對引物fP和rP，引物兩端分別設(shè)有Sac I和Xho I酶切位點，預計可擴增出CSFV基因組中5,142-7,191bp(長度為2,049bp)的基因片段。
上游引物fP5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′；下游引物rP5′-TCTCCTCGAGTTATAGACCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′。上、下游引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。
1.2pETNS3原核表達載體的構(gòu)建采用NS3特異性上下游引物從質(zhì)粒pPOHCLV(包含HCLV全長cDNA)中擴增NS3基因片段，用限制性內(nèi)切酶SacI和Xho I(購自大連寶生物公司)分別對NS3PCR產(chǎn)物和pET-32a(+)載體進行酶切，用T4DNA連接酶連接兩者酶切產(chǎn)物(購自大連寶生物公司)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，采用PCR方法和酶切鑒定陽性克隆，陽性克隆送至上海英俊生物技術(shù)公司進行測序。
挑取單個陽性克隆菌落PCR鑒定結(jié)果表明能擴增到2,000bp多目的條帶，與預計NS3基因片段大小一致。挑取單個陽性克隆菌落增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Sac I和Xho I進行酶切鑒定，酶切后得到5,300bp和2,000bp大小的片段。陽性克隆測序結(jié)果顯示NS3基因插入位置、插入方向和閱讀框正確，結(jié)果表明重組原核表達載體pETNS3構(gòu)建成功。
1.3重組蛋白NS3誘導表達與鑒定將構(gòu)建好的重組原核表達載體pETNS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，挑單個菌落進行增菌培養(yǎng)，LB液體培養(yǎng)基中添加50μg/ml濃度Amp和1％濃度葡萄糖，30℃條件下140rpm培養(yǎng)4h左右至對數(shù)生長期(620nm吸光度為0.6)，加入IPTG終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后收菌。分別取誘導和非誘導菌液2ml，離心后收集細菌沉淀，用50μl PBS(0.05M PH7.4)懸浮細菌。樣品加2×SDS凝膠加樣緩沖液50μl混勻，煮沸處理5min后振蕩裂解細菌，稍離心后取上清進行SDS-PAGE，鑒定蛋白是否表達。取誘導培養(yǎng)菌液離心后棄上清收集細菌沉淀，用PBS懸浮細菌后超聲波裂解至清亮，4℃條件下10,000×g/min離心5min，分別取上清和沉淀懸浮液加2×SDS凝膠加樣緩沖液混勻，煮沸處理5min后SDS-PAGE鑒定蛋白表達方式。
1.4蛋白純化取100ml LB液體培養(yǎng)基，按照1.3中蛋白誘導表達條件進行大量誘導培養(yǎng)。取包含體參照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin試劑盒說明書進行蛋白純化，取回收蛋白質(zhì)樣品加2×SDS凝膠加樣緩沖液煮沸處理5min后，進行SDS-PAGE鑒定蛋白純度?；厥盏鞍讟悠凡捎梅止夤舛扔嫓y定蛋白質(zhì)濃度，加入50％甘油置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白NS3在大腸桿菌Rosetta(DE3)細胞中成功表達，主要以包含體的形式表達，部分以可溶性方式表達，蛋白分子量大小為95kDa，與預測的重組蛋白NS3大小基本一致(參見圖1)?；厥蘸蟮鞍踪|(zhì)樣品進行SDS-PAGE鑒定純度，結(jié)果表明蛋白純化效果較好，純度在90％以上，測定蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/ml(見圖1)。
1.5Western Blotting分析按照1.3中方法誘導表達蛋白，分別取誘導和非誘導全菌SDS-PAGE，參照常規(guī)Western Blotting方法進行操作，最后采用增強型HRP-DAB底物顯色試劑(購自北京天根生化科技公司)進行顯色。結(jié)果顯示與SDS-PAGE對比，pETNS3轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)誘導后在Western Blotting對應位置出現(xiàn)特異性的條帶，而對照未誘導菌則無(見圖1)。結(jié)果表明重組蛋白NS3能與陽性血清中抗體發(fā)生特異性抗原抗體反應。
2、以重組蛋白NS3建立間接ELISA 取純化后重組蛋白NS3做包被抗原建立間接ELISA方法，采用方陣法摸索ELISA最佳蛋白包被濃度和血清稀釋濃度，以及ELISA最佳反應條件。最終確定條件如下 ①包被檢測孔重組蛋白NS3包被量為200ng/孔，對照孔硫氧還蛋白包被量為40ng/孔，4℃條件下包被24小時后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐溫-20)洗滌2遍； ②封閉封閉采用PBST稀釋5％脫脂奶粉，300μl/孔，37℃條件下封閉2h后甩干，用PBST洗滌3次； ③血清作用條件血清稀釋液為PBST稀釋5％脫脂奶粉，添加5％的大腸桿菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀釋為2μl/孔；37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ④酶標兔抗豬抗體作用條件酶標兔抗豬抗體用PBST做104倍稀釋后，100μl/孔，37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次； ⑤底物顯色TMB底物100μl/孔，37℃條件下作用10min后加2M H2SO4終止反應； ⑥讀數(shù)采用酶標儀吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)。
3、結(jié)果判定 檢測結(jié)果計算公式 樣品OD值＝檢測孔OD值-對照孔OD值 樣品S/P值＝樣品OD值/參考陽性血清OD值 判定標準當參考陽性血清OD值≥0.75，參考陰性血清OD值＜0.25，同時參考陰性血清OD值/參考陽性血清OD值＜0.2，表明試驗成立。血清樣品臨界S/P值為0.3，S/P≥0.3判定為陽性，S/P＜0.3判定為陰性。
ELISA重復性試驗按照確定好的ELISA條件，用參考陽性血清和參考陰性血清進行批次間重復性試驗，檢驗所建立ELISA的穩(wěn)定性，結(jié)果見下表1。結(jié)果顯示參考陽性血清10次重復性試驗后，NS3檢測孔OD值變異系數(shù)為3.8％，對照孔OD值變異系數(shù)為10.9％，檢測OD值變異系數(shù)為4.2％；參考陰性血清NS3檢測孔OD值變異系數(shù)為21％，對照孔OD值變異系數(shù)為10.5％，檢測OD值變異系數(shù)為40.6％。結(jié)果表明參考陽性血清重復性檢測變異性小，NS3檢測孔OD值和測定OD值變異系數(shù)均低于10％，檢測結(jié)果具有很好的重復性，所以該NS3-ELISA以S/P值作為判定標準；而參考陰性血清重復性變異性大，各個指標變異系數(shù)均大于10％，所以以P/N值判定結(jié)果變異性大，不適合作為本方法的判定標準。
表1 批次間重復性試驗結(jié)果
無交叉反應應用CSFV重組蛋白NS3建立起的間接NS3-ELISA檢測豬群中常見傳染性病毒性疾病，如豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)參考陽性血清、偽狂犬病毒(PRV)參考陽性血清、口蹄疫病毒(FMDV)參考陽性血清和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)參考陽性血清，結(jié)果均為陰性。表明運用NS3融合蛋白建立的相關(guān)ELISA方法與豬群中常見病原抗體之間無交叉反應。
本發(fā)明的間接NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒比較檢測不同年齡和種群豬的血清樣品325份，比較間接NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒檢測結(jié)果之間一致性，結(jié)果顯示陽性血清符合率為88.42％，陰性血清符合率為85.19％，總符合率為87.08％，表明兩者之間檢測結(jié)果有較高的一致性，見下表2。
表2 間接NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒檢測結(jié)果對比表 IFA檢測42份NS3-ELISA與IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒檢測結(jié)果存在差異的血清樣NS3-ELISA和IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒檢測結(jié)果比較有42份樣品存在差異性，進一步采用IFA進行檢測，結(jié)果顯示與IFA結(jié)果比較NS3-ELISA的總符合率為66.67％，而IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒為33.33％。表明這42份血清樣品中NS3-ELISA檢測結(jié)果與IFA檢測結(jié)果有較好的一致性，同時從總的血清檢測結(jié)果來看NS3-ELISA在敏感性和特異性方面稍高于IDEXX公司CSFV-Ab檢測試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種基于豬瘟病毒NS3建立的間接ELISA方法，其特征在于該方法根據(jù)間接ELISA的原理建立，包括如下步驟
(1)、包被抗原的制備
根據(jù)GenBank中豬瘟病毒全基因序列(登錄號AF351433)，設(shè)計兩條引物，上游引物fP5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′；通過PCR方法從豬瘟病毒兔化弱毒cDNA中擴增到長度為2049bp NS3基因序列，將其克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，構(gòu)建重組原核表達載體pETNS3；將重組原核表達載體pETNS3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)細胞，經(jīng)1mM IPTG誘導高效表達了重組蛋白NS3，該蛋白主要以包含體形式表達，部分為可溶性表達，采用Ni+親和層析方法純化得到重組蛋白NS3；
(2)、以純化后的豬瘟病毒重組蛋白NS3做包被抗原建立間接ELISA
①包被用pH為9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原包被96孔ELISA板，檢測孔NS3蛋白包被量為200ng/孔，4℃條件下包被24小時后甩干，采用PBST洗滌2遍；
②封閉封閉采用PBST稀釋5％脫脂奶粉，300μl/孔，37℃條件下封閉2h后甩干，用PBST洗滌3次；
③血清作用條件血清樣品稀釋液為PBST稀釋5％脫脂奶粉，添加5％大腸桿菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀釋為2μl/孔；37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次；
④酶標兔抗豬抗體作用條件酶標兔抗豬抗體用PBST做104倍稀釋后，100μl/孔，37℃條件下孵育1h后甩干，用PBST洗滌4次；
⑤底物顯色TMB底物100μl/孔，37℃條件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，終止反應；
⑥讀數(shù)采用酶標儀吸光度450nm下讀取數(shù)據(jù)；
(3)、結(jié)果判定標準當參考陽性血清OD值≥0.75，參考陰性血清OD值＜0.25，同時參考陰性血清OD值/參考陽性血清OD值＜0.2，表明試驗成立，樣品臨界S/P值為0.3，S/P≥0.3判定為陽性，S/P＜0.3判定為陰性。
全文摘要
一種基于豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus CSFV)NS3建立的間接ELISA方法，通過基因克隆表達技術(shù)，獲取豬瘟病毒重組蛋白NS3。以重組蛋白NS3為包被抗原建立起間接ELISA方法，包括抗原重組蛋白NS3的制備、間接ELISA建立、判定標準的建立及臨床血清學檢測的應用?？捎糜谪i群中CSFV NS3特異性抗體檢測，以此判斷豬群中CSFV NS3抗體水平、豬群中CSFV自然感染的情況，以及為CSFV E2基因工程標記疫苗提供鑒別ELISA檢測方法。目前該方法是國際上首次利用CSFV NS3建立檢測豬群中CSFV抗體的ELISA，其敏感性和特異性明顯高于基于Ems建立的ELISA。
文檔編號C07K14/18GK101799471SQ20091021556
公開日2010年8月11日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者余興龍, 蔣大良, 李潤成, 葛猛 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學