專(zhuān)利名稱(chēng)：：一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：該發(fā)明涉及一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法，屬于免疫診斷及食用菌栽培
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：羊肚菌是一種珍稀的食用真菌，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)羊肚菌的人工栽培，但是，由于重復(fù)性差，在關(guān)鍵栽培環(huán)節(jié)尚存在技術(shù)問(wèn)題，因此，目前仍不能實(shí)現(xiàn)羊肚菌的規(guī)?；a(chǎn)，自野生資源中采集仍是收獲羊肚菌的主要渠道。羊肚菌的生活史是這樣的，由子實(shí)體產(chǎn)生子囊孢子，在合適的條件下萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)菌絲，營(yíng)養(yǎng)菌絲經(jīng)過(guò)積累并經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的質(zhì)配、核配后形成結(jié)實(shí)菌絲，進(jìn)而在合適的條件下形成菌核、原基、子實(shí)體。由此可知菌絲狀態(tài)在羊肚菌的一生中占有及其重要地位，羊肚菌的菌種基本都是羊肚菌的菌絲體。目前羊肚菌菌絲的鑒別方法主要是形態(tài)學(xué)方法。這就要求生長(zhǎng)出子實(shí)體才能證明菌絲是該品種的菌絲，而羊肚菌卻難以人工栽培，因此，借助形態(tài)學(xué)方法難以鑒別羊肚菌菌絲。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)等生物技術(shù)的進(jìn)步，利用核酸序列分析也就是DNA測(cè)序已能解決菌絲的鑒別問(wèn)題，但是，由于試齊U、儀器價(jià)格昂貴，這種方法難以普及。在免疫學(xué)領(lǐng)域，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株獲得單克隆抗體是一種常規(guī)技術(shù)。單克隆抗體用于免疫診斷具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、費(fèi)用低、診斷周期短的特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)在羊肚菌鑒別上的不足，通過(guò)快速、準(zhǔn)確、低成本地鑒別羊肚菌菌絲，探尋、跟蹤羊肚菌在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中菌絲的生長(zhǎng)、分布、存亡規(guī)律，我們發(fā)明了一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法。本發(fā)明之一株抗羊肚菌單克隆抗體其特征在于，該單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明之一株抗羊肚菌單克隆抗體制備方法其特征在于，制備羊肚菌菌絲抗原，用制備的羊肚菌菌絲抗原免疫BALB/C小鼠獲得致敏的B淋巴細(xì)胞，再將該B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選得到能夠分泌抗羊肚菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，用該細(xì)胞株制備抗羊肚菌單克隆抗體。本發(fā)明其效果在于，在免疫學(xué)領(lǐng)域通過(guò)免疫診斷識(shí)別羊肚菌菌絲、檢測(cè)羊肚菌含量。既能夠定性地鑒別羊肚菌菌絲，也能夠定量地檢測(cè)樣品中羊肚菌的含量。例如，雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明該單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲反應(yīng)，而不與試驗(yàn)所采用的其他擔(dān)子菌目食用菌菌絲反應(yīng)，見(jiàn)下表3<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>同樣，通過(guò)雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)建立與本發(fā)明之單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的羊肚菌抗原蛋白濃度酶標(biāo)儀OD值工作曲線(xiàn)，一個(gè)線(xiàn)性回歸方程為y=0.0053x+0.0196，x為標(biāo)準(zhǔn)樣品中羊肚菌抗原蛋白濃度，y為標(biāo)準(zhǔn)樣品的0D值。該線(xiàn)性回歸方程的線(xiàn)性回歸系數(shù)R為R2=0.9879，見(jiàn)附圖所示，根據(jù)該工作曲線(xiàn)，即可檢測(cè)羊肚菌抗原蛋白濃度，再換算出羊肚菌含附圖是通過(guò)雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)建立與本發(fā)明之單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的羊肚菌抗原蛋白濃度酶標(biāo)儀OD值工作曲線(xiàn)圖，該圖兼作為摘要附圖。具體實(shí)施例方式間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明該單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲發(fā)生反應(yīng)，具體特征包括a、間接酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)表明該單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲蛋白發(fā)生反應(yīng)；b、間接免疫熒光表明該單克隆抗體能夠與羊肚菌菌絲細(xì)胞膜上特異位點(diǎn)結(jié)合；c、該單克隆抗體為IgG型，特別是其中的IgG3亞型。本發(fā)明之一株抗羊肚菌單克隆抗體制備方法其具體特征在于a、羊肚菌菌絲抗原的制備將羊肚菌菌種接種到滅過(guò)菌的含有50ml馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)的250ml三角瓶中，23.5°C、120rpm培養(yǎng)；收集菌絲球，研磨、超聲波破碎，9000g離心15分鐘，取上清做為羊肚菌抗原，同時(shí)測(cè)定抗原液蛋白濃度。b、免疫BALB/C小鼠獲得致敏的B淋巴細(xì)胞免疫純種BALB/C小鼠，經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)免疫小鼠產(chǎn)生滿(mǎn)意的效價(jià)后，無(wú)菌取脾制成脾細(xì)胞懸液，獲得致敏的B淋巴細(xì)胞。c、將該B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合準(zhǔn)備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1X107個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與1X108個(gè)脾細(xì)胞，之后混合于50ml離心管中，在60s內(nèi)滴加完lml50X的細(xì)胞融合劑聚乙二醇(PEG);之后緩慢加入50mll64Q培養(yǎng)液；離心后加入100ml的選擇性培養(yǎng)液(HAT)，以每孔100yl滴加到10塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。d、篩選抗羊肚菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株用處理好的羊肚菌抗原免疫兔，取兔抗羊肚菌陽(yáng)性血清建立ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))。待96孔細(xì)胞板上的單克隆細(xì)胞長(zhǎng)到1/4孔時(shí)，無(wú)菌吸取上清，用建立的ELISA間接法檢測(cè)上清中是否有抗體，陽(yáng)性孔按位置編號(hào)，再用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，亞克隆細(xì)胞板的單克隆細(xì)胞株上清的抗體檢測(cè)100%陽(yáng)性后，完成抗羊肚菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選，編號(hào)為W8C9，并凍存。e、單克隆抗體的制備用W8C9雜交瘤細(xì)胞株上細(xì)胞瓶培養(yǎng)，同時(shí)將W8C9雜交瘤細(xì)胞株注入BALB/C小鼠腹腔培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞上清及腹水中含有抗羊肚菌單克隆抗體，腹水的效價(jià)可達(dá)到i:12000以上。抗羊肚菌單克隆抗體的檢驗(yàn)1、抗羊肚菌單克隆抗體的純化與鑒定用飽和硫酸銨法初步純化制備的抗羊肚菌單克隆抗體。所制備的抗羊肚菌單克隆抗體與中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(CCCA)的536#、537#、589#、579#羊肚菌菌種ELISA均顯陽(yáng)性反映，而與平菇、木耳、香菇、金針菇、滑子蘑、雙孢菇均無(wú)交叉，說(shuō)明所制備的抗羊肚菌單克隆抗體對(duì)羊肚菌菌絲有較好的特異性，見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)第2頁(yè)表格中的內(nèi)容。2、雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)先制備捕捉抗體。選健康的新西蘭成年實(shí)驗(yàn)兔，皮下注射與弗氏完全佐劑完全混合羊肚菌抗原lml，20天后采血，分離血清，測(cè)定抗體效價(jià)。用純化的抗羊肚菌單克隆抗體以合適濃度包被酶標(biāo)板，以標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原按濃度稀釋作被檢樣，37t:1小時(shí)后洗板3次；以合適濃度的制備的兔抗羊肚菌抗血清作捕捉抗體，37t:l小時(shí)后洗板3次；以說(shuō)明書(shū)注明稀釋濃度的羊抗兔HRP標(biāo)記抗體作酶標(biāo)二抗，37°C1小時(shí)后洗板3次；加底物顯色。進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)第2頁(yè)表格中的內(nèi)容，證明由W8C9雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗羊肚菌單克隆抗體與羊肚菌菌絲特異性結(jié)合。3、間接免疫熒光檢測(cè)羊肚菌菌絲先處理羊肚菌菌絲。把經(jīng)過(guò)處理的羊肚菌菌絲與合適濃度的抗羊肚菌單克隆抗體在37t:作用1小時(shí)，離心、洗三次，再加合適濃度羊抗鼠FITC二抗，同上處理，處理后的菌絲懸浮，鏡檢。熒光顯微鏡觀察，在495nm光源下，可以觀察到羊肚菌菌絲體發(fā)出綠色的熒光。進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，用同樣處理方法處理其他食用菌菌絲，均觀察不到菌絲熒光，說(shuō)明抗羊肚菌單克隆抗體只與羊肚菌特異性結(jié)合。權(quán)利要求一株抗羊肚菌單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲發(fā)生反應(yīng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗羊肚菌單克隆抗體，其特征在于，間接酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)表明該單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲蛋白發(fā)生反應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗羊肚菌單克隆抗體，其特征在于，間接免疫熒光表明該單克隆抗體能夠與羊肚菌菌絲細(xì)胞膜上特異位點(diǎn)結(jié)合。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗羊肚菌單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體為IgG型，特別是其中的IgG3亞型。5.—株抗羊肚菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于，制備羊肚菌菌絲抗原，用制備的羊肚菌菌絲抗原免疫BALB/C小鼠獲得致敏的B淋巴細(xì)胞，再將該B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選得到能夠分泌抗羊肚菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，用該細(xì)胞株制備抗羊肚菌單克隆抗體。全文摘要一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法，屬于免疫診斷及食用菌栽培
技術(shù)領(lǐng)域：
?，F(xiàn)有技術(shù)鑒別羊肚菌的方法一是形態(tài)學(xué)方法，要求生長(zhǎng)出子實(shí)體才能證明菌絲是該品種的菌絲，而羊肚菌難以人工栽培，因此，形態(tài)學(xué)方法難以鑒別羊肚菌菌絲。二是分子生物學(xué)方法，利用核酸序列分析鑒別菌絲，但是，由于試劑、儀器價(jià)格昂貴，這種方法難以普及。本發(fā)明之抗羊肚菌單克隆抗體能夠特異性地與羊肚菌菌絲發(fā)生反應(yīng)；抗羊肚菌單克隆抗體的制備方法為，制備羊肚菌菌絲抗原，用該抗原免疫BALB/C小鼠獲得致敏的B淋巴細(xì)胞，再將該B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選得到能夠分泌抗羊肚菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，用該細(xì)胞株制備抗羊肚菌單克隆抗體。本發(fā)明用于羊肚菌的定性鑒別和定量檢測(cè)。文檔編號(hào)C07K16/14GK101724068SQ20091021815公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月30日優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日發(fā)明者劉建,王一東申請(qǐng)人:長(zhǎng)春理工大學(xué)