專(zhuān)利名稱(chēng)：取自牛樟芝的新穎化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于取自牛樟芝(Antrodia camphorata)的新穎且具有免疫刺激性及抗發(fā)炎性化合物。

背景技術(shù)：
牛樟芝(Antrodia camphorata，其等同于Taiwanofungus camphorata)系臺(tái)灣原生種。其子實(shí)體系非常少見(jiàn)及昂貴的蕈類(lèi)，其在野外緩慢生長(zhǎng)，且極難以在溫室中種植。在臺(tái)灣，牛樟芝的子實(shí)體傳統(tǒng)上已被作為中草藥，且其常稱(chēng)為「樟芝(jang-jy)」或「牛樟芝(niu-chang-chih)」(Shen C.C.et al.，J.Chin.Med.2003，14，247-258)。
在自然中，牛樟芝系生長(zhǎng)于牛樟(Cinnamomun kanehirai Hay(樟科(Lauraceae)))的內(nèi)心材壁上，牛樟系一種臺(tái)灣的特有且瀕臨絕種的原生物種。野生牛樟芝子實(shí)體含有脂肪酸、木酚素、苯基衍生物、倍半萜、類(lèi)固醇、及三萜類(lèi)化合物(Shen C.C.et al.，上述文獻(xiàn))。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，牛樟芝的子實(shí)體已被用于治療食物及藥物中毒、腹瀉、異常疼痛、高血壓、皮膚搔癢、以及肝癌。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供來(lái)自于牛樟芝的新穎化合物。在本發(fā)明中，其已自固態(tài)培養(yǎng)的牛樟芝子實(shí)體中分離出部分新穎的順丁烯二酸及琥珀酸衍生物。
本發(fā)明的目標(biāo)系提供一種化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其系選自由下列者所組成的群
式I
式II
式III
式IV
式V 及
式VI 其中R獨(dú)立系H、

甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、、

或，

其中X＝H、OH、OR、NH2、或NHR(其中R＝烷基或酰基)。
根據(jù)本發(fā)明，該等化合物可提供抗發(fā)炎或免疫刺激作用。本發(fā)明的另一目的系提供一種以上述化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽用于制備免疫調(diào)節(jié)醫(yī)藥的用途。

具體實(shí)施例方式 除非另外定義，本文中所用的所有技術(shù)及科學(xué)詞匯具有所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常明了的相同意義。
在本文中，冠詞“一”是指一個(gè)或一個(gè)以上(亦即，至少一個(gè))的該冠詞的文法客體。舉例而言，“一組件”意謂一個(gè)組件或一個(gè)以上的組件。
本發(fā)明提供一種化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其系選自由下列者所組成的群
式I
式II
式III
式IV
式V 及
式VI 其中R獨(dú)立系H、

甲基、乙基、丙基、 丁基、異丙基、或

其中X＝H、OH、OR、NH2、或NHR(其中R＝烷基或?；?。
本發(fā)明的化合物可分離自天然來(lái)源，諸如牛樟芝的子實(shí)體，或可由化學(xué)合成。為自牛樟芝的子實(shí)體取得本發(fā)明的化合物，可經(jīng)由任何習(xí)知的方法進(jìn)行萃取。在一實(shí)例中，其收集似靈芝(Ganoderma)真菌(如，牛樟芝)的子實(shí)體，干燥，再浸泡于醇中(如，甲醇、乙醇、或其混合物)一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(如，至少四天)。在經(jīng)由，如，真空，除去該醇后，加入水。以適當(dāng)?shù)臉O性溶劑(如，EtOAc)對(duì)該懸浮相進(jìn)行分離。將該極性溶劑層濃縮成為黑色的糖漿(如，藉由蒸餾)。接著，經(jīng)由任何形式的純化，分離該糖漿中的混合物，諸如，但不限于，管柱層析，使用正己烷、EtOAc、及MeOH。以1H及13C NMR鑒定該終化合物，取得六種新穎的化合物 反式-3-異丁基4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮(式I，其亦稱(chēng)為化合物1)， 反式-1-羥基-3-(4-羥苯基)-4-異丁基吡咯啶-2，5-二酮(式II，其亦稱(chēng)為化合物2)， 順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2，5-二酮(式III，其亦稱(chēng)為化合物3)， 3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2，5-二酮(式IV，其亦稱(chēng)為化合物4)，3-(4-羥苯基)-4-異丁基呋喃-2，5-二酮(式V，其亦稱(chēng)為化合物5)，及二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯(式VI，其亦稱(chēng)為化合物6)。
在本發(fā)明中，其發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物具有免疫刺激作用，并具有抗發(fā)炎作用。就本發(fā)明化合物的免疫刺激作用而言，其使用一種巨噬細(xì)胞株RAW264.7的細(xì)胞激素生成模式進(jìn)行判定。已知巨噬細(xì)胞系組織中源自稱(chēng)為單核細(xì)胞(monocyte)的特定白血球的細(xì)胞。其系先天性免疫系統(tǒng)的一部份，其可辨識(shí)、吞噬、并摧毀諸多潛在的病原體，包括細(xì)菌、病原性原生動(dòng)物、真菌、及蠕蟲(chóng)。和分泌細(xì)胞相同，活化的巨噬細(xì)胞對(duì)于免疫反應(yīng)的調(diào)控及發(fā)炎的發(fā)展而言極為重要；其會(huì)大量生產(chǎn)出令人驚異群組的強(qiáng)力化學(xué)物質(zhì)(單核因子(monokines))，包括酶、補(bǔ)體蛋白、以及調(diào)控因子，諸如，IL-1β、TNF-α、IL-6、及一氧化氮(NO)。巨噬細(xì)胞株(諸如小鼠RAW264.7及人類(lèi)THP-1)已被推薦作為快速體外篩選免疫調(diào)控作用劑的方法(Singh，U.et al.，Clin.Chem.2005，51，2252-2256)。在本發(fā)明的實(shí)例中，本發(fā)明的化合物經(jīng)證實(shí)可誘發(fā)TNF-α的自發(fā)性生成(參見(jiàn)實(shí)例3)；且該等化合物經(jīng)證實(shí)可抑制IL-6的自發(fā)性生成(參見(jiàn)實(shí)例4)。
由于其絕佳的體外免疫調(diào)控活性，該化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽可在用以刺激免疫力或抗發(fā)炎的醫(yī)藥組合物中作為活性成分。
在另一態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，其包含該化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，以及醫(yī)藥上可接受的載體。特定言的，本發(fā)明提供一種用以刺激免疫反應(yīng)及/或抗發(fā)炎的免疫調(diào)節(jié)醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的該化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽。
名辭「治療有效量」在本文中系指一種組合物的量，其可在欲治療的對(duì)象體內(nèi)誘發(fā)上述的醫(yī)學(xué)目標(biāo)結(jié)果。舉例而言，足以降低或減少免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)的細(xì)胞激素(如，TNF-α、IL-6)生成的該化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽的量，系為調(diào)節(jié)免疫力的有效量。在個(gè)別情形下，該治療有效量可由熟習(xí)技藝者使用技藝中已知且已建立方法而由經(jīng)驗(yàn)判定。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可由習(xí)知的方法而以一或多種醫(yī)藥上可接受的載體制造。名辭「醫(yī)藥上可接受的載體」在本文中涵括任何標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)藥載體。此等載體可包括，但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
投藥的途徑可以任何方式投與。舉例而言，其可經(jīng)口服、皮下、血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、經(jīng)鼻、或經(jīng)肺投藥。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可被制成任何適于所選投藥方式的形式。舉例而言，適于口服投藥的組合物包括固體形式，諸如，丸劑、膠囊、顆粒、錠劑、及粉末，以及液體形式，諸如，溶液、糖漿、酊劑、及懸浮液?？捎糜谀c外投藥的形式包括無(wú)菌溶液、乳液、及懸浮液。其中可納入本發(fā)明的組合物以進(jìn)行口服或是注射投藥的液體形式包括水溶液、經(jīng)適當(dāng)調(diào)味的糖漿、水或油懸浮液、以及以食用油(諸如，玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)調(diào)成的乳液、以及酊劑及類(lèi)似的醫(yī)藥載劑。
除標(biāo)準(zhǔn)的載體外，本發(fā)明的口服醫(yī)藥組合物可添加一或多種正常用于口服調(diào)配物中的賦形劑，諸如，界面活性劑、助溶劑、安定劑、乳化劑、增稠劑、著色劑、甜味劑、調(diào)味劑、以及防腐劑。此等賦形劑系為熟習(xí)技藝者所熟知。
本發(fā)明進(jìn)一步由下例實(shí)例說(shuō)明，其目的系為說(shuō)明而非限制的提供。
材料及方法 一般實(shí)驗(yàn)流程 熔點(diǎn)系以Yanagimoto微熔點(diǎn)裝置測(cè)定并未經(jīng)校正。IR光譜系在Perkin-Elmer 983G分光光度計(jì)上記錄。1H、13C、及DEPT光譜系在BrukerDMX-400分光光度計(jì)上取得，而二維NMR光譜系在Bruker DMX-500分光光度計(jì)上取得。EIMS、UV、及比旋光度系分別使用JEOL JMS-HX 300，HitachiS-3200分光光度計(jì)及JASCO DIP-180數(shù)位偏光計(jì)測(cè)定。萃取物首先系在硅膠(Merck 70-230篩目，230-400篩目，ASTM)上進(jìn)行初步分離，再接著在LDCAnalytical-III系統(tǒng)上，以半制備性正常相HPLC管柱(250×10mm，7μm，LiChrosorb Si 60)進(jìn)行純化。
植物材料 牛樟芝的固態(tài)培養(yǎng)子實(shí)體系由偉翔生技開(kāi)發(fā)股份有限公司(Well ShineBiotechnology Development，臺(tái)北，臺(tái)灣)辨識(shí)及提供。其憑證樣本寄存于偉翔生技開(kāi)發(fā)股份有限公司。
統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)系以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各處理組別間的差異顯著性系在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的中，使用策略應(yīng)用軟件(Strategic Application Software)(SASWindows 8.2版；SAS Institute Inc.，Cary，NC)，以非成對(duì)史都登氏t檢驗(yàn)(unpairedStudent′s t test)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)系以平均值±SD表示。p＜0.05的數(shù)值視為具有顯著性。
實(shí)例1化合物的分離及定性 在室溫下以MeOH(12L)浸漬牛樟芝的固態(tài)培養(yǎng)子實(shí)體(3.0kg)以進(jìn)行萃取(4天×3)。在真空下除去MeOH后，加入水使總體積成為1L。以EtOAc(1L×3)對(duì)此懸浮相進(jìn)行分離。對(duì)結(jié)合的EtOAc層進(jìn)行蒸餾產(chǎn)生黑色糖漿(212g)。在硅膠管柱上(10×70cm，Merk 70-230篩目)，使用漸增極性的正己烷、EtOAc、及MeOH作為溶析液，對(duì)該EtOAc層的區(qū)份(200g)進(jìn)行層析，取得9個(gè)區(qū)份區(qū)份1[8000mL，正己烷/EtOAc(19∶1)]，區(qū)份2[7000mL，正己烷/EtOAc(9∶1)]，區(qū)份3[6000mL，正己烷/EtOAc(8∶2)]，區(qū)份4[10000mL，正己烷/EtOAc(7∶3)]，區(qū)份5[8000mL，正己烷/EtOAc(1∶1)]，區(qū)份6[9000mL，正己烷/EtOAc(1∶3)]，區(qū)份7(8000mL，EtOAc)，區(qū)份8[7000mL，EtOAc/MeOH(1∶1)]，區(qū)份9(6000mL，MeOH)。接著進(jìn)行液體-液體的分離，以取得具有抗發(fā)炎活性的EtOAc層的區(qū)份。在硅膠管柱上進(jìn)行進(jìn)一步的分級(jí)分離，以取得富含抗發(fā)炎活性的區(qū)份，其中該粗制萃取物及EtOAc層區(qū)份，經(jīng)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)對(duì)于IL-6生成可產(chǎn)生50％抑制的濃度分別為42及30μg/mL。對(duì)具有生物活性的區(qū)份進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)分析，自區(qū)份6產(chǎn)生六種新穎的化合物。以4mL/min的正己烷/EtOAc(4∶1)作為溶析液而在正常相管柱上進(jìn)行HPLC的分離，分別產(chǎn)生化合物1(12.5mg)、化合物2(22.6mg)、化合物3(6.8mg)、化合物4(9.4mg)、化合物5(15.0mg)、化合物6(13.2mg)、及化合物7(8.9mg)。上述的化合物1-6分別為 反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮(式I，其亦稱(chēng)為化合物1)， 反式-1-羥基-3-(4-羥苯基)-4-異丁基吡咯啶-2，5-二酮(式II，其亦稱(chēng)為化合物2)， 順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2，5-二酮(式III，其亦稱(chēng)為化合物3)， 3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2，5-二酮(式IV，其亦稱(chēng)為化合物4)， 3-(4-羥苯基)-4-異丁基呋喃-2，5-二酮(式V，其亦稱(chēng)為化合物5)，及 二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯(式VI，其亦稱(chēng)為化合物6)。
式I至式VI化合物的1H及13C NMR數(shù)據(jù)如表1及表2所示。
表1 化合物1-6的1H NMR數(shù)據(jù)(400MHz，1-3、5-6于CDCl3中，4于CD3OD中)
表2 化合物1-6的13C光譜數(shù)據(jù)(100MHz，1-3、5-6于CDCl3中，4于CD3OD中)
實(shí)例2諸等化合物的免疫刺激作用 如Chen and Lin(Chen，M.L.et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.2007，143，21-30)所述，以?shī)A層ELISA法測(cè)量培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞激素含量。簡(jiǎn)言的，以抗細(xì)胞激素抗體(PharMingen，San Diego，CA)涂覆96孔試驗(yàn)盤(pán)(Nunc，Roskilde，Denmark)后在4℃下隔夜反應(yīng)，并以1％BSA PBS緩沖液進(jìn)行阻斷30分鐘。將樣本及標(biāo)準(zhǔn)物(重組小鼠細(xì)胞激素，PharMingen)加入該等96孔試驗(yàn)盤(pán)中進(jìn)行2小時(shí)的反應(yīng)。加入生物素復(fù)合抗體(生物素連結(jié)大鼠抗小鼠細(xì)胞激素單株抗體，PharMingen)并進(jìn)行反應(yīng)。在清洗后，加入鏈霉親和素復(fù)合過(guò)氧化酶處理1小時(shí)。將受質(zhì)2，2′-次偶氮基-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，Sigma)加入各孔處理20分鐘。在微盤(pán)自動(dòng)分析儀中(Microplate autoreader；Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)，在405nm下對(duì)該等試驗(yàn)盤(pán)進(jìn)行判讀。
為評(píng)估此等新穎化合物的免疫刺激作用，以無(wú)或不同濃度的本發(fā)明化合物，于體外處理RAW264.7細(xì)胞，并使其細(xì)胞激素生成48小時(shí)。收集上清液以進(jìn)行TNF-α分析，并收集細(xì)胞以MTT法進(jìn)行存活率分析。數(shù)據(jù)系以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(其各有三次重復(fù))的平均值±SD顯示。
如表3所示，化合物1顯著增加RAW264.7細(xì)胞的自發(fā)性TNF-α分泌而不影響細(xì)胞存活率，其顯示化合物1具有活化巨噬細(xì)胞的潛力。由0.5～5μg/mL的化合物1刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α分泌量系以劑量相關(guān)形式增加。此等數(shù)據(jù)顯示，化合物1可刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α而無(wú)細(xì)胞毒性。
表3 來(lái)自牛樟芝的分離物對(duì)于RAW264.7細(xì)胞的存活率及自發(fā)性TNF-α分泌的作用
*p＜0.05；**0.05＜p＜0.1；與控制組(無(wú)萃取物處理)的差異顯著性。
實(shí)例3諸等化合物的抗發(fā)炎作用 IL-6(一種系感染時(shí)具指標(biāo)性的促發(fā)炎細(xì)胞激素)系由巨噬細(xì)胞在諸多感染及發(fā)炎狀態(tài)下分泌，包括心臟手術(shù)、心源性休克、冠狀動(dòng)脈繞道、及細(xì)菌性敗血癥(Kantar，M.et al.，Eur.J.Pediatr.2000，159，156-157)。已有研究報(bào)導(dǎo)IL-6的血清濃度與疾病的嚴(yán)重性具相關(guān)性(Pathan，N.et al.，Lancet 2004，363，203-209)。茲測(cè)量經(jīng)LPS-刺激的巨噬細(xì)胞的IL-6生成，以評(píng)估諸等化合物的抗發(fā)炎作用。將該等細(xì)胞以牛樟芝的分離物預(yù)處理30分鐘，接著以50ng/mL的LPS刺激48小時(shí)。收集上清液進(jìn)行TNF-α及IL-6分析，并收集細(xì)胞以MTT法進(jìn)行存活率分析。數(shù)據(jù)系以平均值±SD顯示。
如表4所示，此等化合物并未影響RAW264.7巨噬細(xì)胞株的存活率。當(dāng)該等細(xì)胞經(jīng)LPS刺激時(shí)，處理化合物1的組別，其IL-6生成隨劑量漸增而顯著減少?；衔?對(duì)IL-6生成產(chǎn)生50％抑制所需的濃度(IC50)系10μg/mL?；衔?、4、及6亦可抑制IL-6生成，IC50值分別為17、18、及25μg/mL?；衔?及5的IC50值分別為54及96μg/mL。
表4 來(lái)自牛樟芝的分離物對(duì)于經(jīng)LPS-刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞的存活率、TNF-α、及IL-6分泌的作用
*p＜0.05；**0.05＜p＜0.1；與控制組(無(wú)萃取物處理)的差異顯著性。
權(quán)利要求
1.一種化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其中該化合物為選自由下列者所組成的群
式I
式II
式III
式IV
式V
及
式VI
其中R獨(dú)立系H、
、甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、或
，其中X＝H、OH、OR、NH2、或NHR(其中R＝烷基或酰基)。
2.依權(quán)利要求1的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其中該化合物為選自由下列者所組成的群
反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮，反式-1-羥基-3-(4-羥苯基)-4-異丁基吡咯啶-2，5-二酮，順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2，5-二酮，3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2，5-二酮，
3-(4-羥苯基)-4-異丁基呋喃-2，5-二酮，及二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯。
3.依權(quán)利要求1的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其中該化合物具有免疫刺激作用。
4.依權(quán)利要求1的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其中該化合物具有抗發(fā)炎作用。
5.依權(quán)利要求1的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其中該化合物同時(shí)具有免疫刺激及抗發(fā)炎作用兩者。
6.依權(quán)利要求3、4、或5的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，其中該化合物為反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮。
7.一種醫(yī)藥組合物，其包含依權(quán)利要求1或2的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽，以及醫(yī)藥上可接受的載體。
8.依權(quán)利要求7的醫(yī)藥組合物，其提供免疫刺激作用。
9.依權(quán)利要求7的醫(yī)藥組合物，其提供抗發(fā)炎作用。
10.依權(quán)利要求7的醫(yī)藥組合物，其同時(shí)提供免疫刺激及抗炎作用兩者。
11.一種依權(quán)利要求1或2的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽用于制備刺激免疫反應(yīng)的醫(yī)藥的用途。
12.依權(quán)利要求11的用途，其中該化合物系
反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮。
13.一種依權(quán)利要求1或2的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽用于制備抗發(fā)炎的醫(yī)藥的用途。
14.依權(quán)利要求13的用途，其中該化合物為
反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮，順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2，5-二酮，3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2，5-二酮，及
二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯。
15.一種依權(quán)利要求1或2的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽用于制備刺激免疫反應(yīng)及抗發(fā)炎的免疫調(diào)節(jié)醫(yī)藥的用途。
16.依權(quán)利要求15的用途，其中該化合物為
反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮。
全文摘要
本發(fā)明提供具有免疫刺激性及抗發(fā)炎性化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽。該等化合物系分離自固態(tài)培養(yǎng)中的牛樟芝(A.camphorata)子實(shí)體。其亦提供用以制備刺激免疫力及/或抗發(fā)炎的免疫調(diào)節(jié)醫(yī)藥的用途。
文檔編號(hào)C07D207/40GK101759626SQ20091022410
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者郭悅雄, 林璧鳳 申請(qǐng)人:偉翔生技開(kāi)發(fā)股份有限公司