專利名稱：重組人胞紅蛋白復(fù)性及其對酒精肝損傷保護的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種重組人胞紅蛋白(rhCYGB)表達復(fù)性的制備方法及其對酒精肝損傷的保護作用的醫(yī)藥用途，即用于預(yù)防或治療酒精急性肝損傷的用途。
背景技術(shù)：
2001年，Kawada等首次從TAA誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞(H印atic stellatecell, HSC)中發(fā)現(xiàn)了肝星狀細胞激活相關(guān)蛋白(Stellate cell activation-associatedprotein, STAP) 。 STAP與血紅蛋白(Hemoglobin, HB)和肌紅蛋白(Myoglobin, Mb)結(jié)構(gòu)相似，功能相近，因此STAP現(xiàn)被稱胞紅蛋白(Cytoglobin， CYGB)。人源CYGB由190個氨基酸殘基組成，分子量約為21KD。 CYGB是一個較新的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它具有攜氧與貯氧、氧感受器和清除自由基等生物學(xué)功能。 CYGB具有過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性，其清除自由基抗氧化活性受到生物制藥研究者的關(guān)注。許瑞安等將大鼠體內(nèi)通過基因治療方式給予大鼠CYGB基因后，HSC中過量表達CYGB，可減少細胞外基質(zhì)合成，預(yù)示CYGB具有抗肝纖維化作用。吳梧桐等開展重組人rhCYGB的克隆表達、分離純化和抗肝纖維化研究，采用CC14肝損傷動物模型發(fā)現(xiàn)rhCYGB具有抗肝纖維化作用，其研究成果已申請中國發(fā)明專利200710020563.7。本項專利申請是在上述專利(200710020563.7)基礎(chǔ)上的延續(xù)和拓展。
CYGB為六配位體血紅素蛋白，蛋白質(zhì)多肽鏈形成八段a -螺旋(A_H)和一對二硫鍵的二級結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e2+位于血紅素鐵卟啉環(huán)中心、形成6個配位鍵，CYGB最終形成類似于肌紅蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。CYGB復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和多樣性的生物學(xué)功能，給大腸桿菌表達制備重組rhCYGB帶來挑戰(zhàn)。我們在前期研究工作的基礎(chǔ)上，改進和優(yōu)化了分離純化工藝，發(fā)現(xiàn)通過人工添加血紅素輔基和采用S印hacryl S-200凝膠層析法純化，可以提高rhCYGB復(fù)性和分離純化效率。 酒精性肝損傷已成為現(xiàn)代社會的一種富貴病，長期飲酒易引發(fā)酒精性脂肪肝，從而導(dǎo)致慢性肝纖維化，并由纖維化直接進入肝硬化。酒精損傷機理是由于酒精能誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致肝細胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭，引起肝損傷，并可轉(zhuǎn)化為肝纖維化。本研究采用動物急性酒精肝損傷模型，測試rhCYGB抗酒精性氧化作用，發(fā)現(xiàn)rhCYGB在細胞與動物水平對酒精急性肝損傷具有保護作用，這將拓寬rhCYGB的研究與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供(rhCYGB)的方法。 本發(fā)明的第二個目的在于提供-防和治療酒精急性肝損傷中的應(yīng)用。
3
-種從基因工程菌高效分離純化重組人胞紅蛋白種上述純化所得重組人胞紅蛋白(rhCYGB)在預(yù)
重組胞紅蛋白rhCYGB表達復(fù)性制備方法，其步驟如下 1. pET28a/hCYGB/BL21 (DE3)基因工程菌，在最佳表達條件(IPTG 0. ImM至0. 5mM， 37° C誘導(dǎo)表達6小時至8小時)培養(yǎng)后，離心收獲細胞。 2.每克細胞加入10ml裂解液(50mM Tris_Cl，pH8. 0， 50mM EDTA， ImM PMSF);細胞 經(jīng)過三步的反復(fù)凍融后，再用超聲破碎菌體；7000g，30min，4t:離心除去上清，包涵體中加 入洗滌液(Tris-Cl，pH 8.0，5mM EDTA， 2%去氧膽酸)5ml洗滌，再次離心除去上清。
3.包涵體用2ml(6M鹽酸胍，50mM Tris-Cl， pH7. 5， 50mM DTT)溶液煮沸5分鐘。 離心(10000g，10分鐘，4tO除去不溶物，得到上清蛋白質(zhì)溶液，用染料結(jié)合比色法測定蛋 白溶液濃度。 4.上述所得蛋白質(zhì)溶液按總蛋白濃度中含有60^rhCYGB計算，加入1.0倍至2.0 倍于rhCYGB摩爾濃度的血紅素于蛋白質(zhì)溶液中，輕輕攪拌并靜置5分鐘至20分鐘，離心 (lOOOOg， 10分鐘，4t:)除去不溶物。 5.將離心后的上清液透析(透析液5mM Tris-Cl， pH8. 5)過夜，次日使用聚乙二 醇(PEG8000)濃縮至蛋白濃度為2mg/ml。透析復(fù)性后的蛋白溶液用S印hacryl-S200柱 層析(1. 5cmx40cm)進行純化，層析柱體積約為50ml。上樣2ml (2mg/ml)rhCYGB樣品后用 50mMTris-Cl， pH8. 5緩沖液進行洗脫，流速0. 8ml/min，紫外檢測并分部收集。
6. SDS-PAGE檢測洗脫液，根據(jù)蛋白電泳圖譜合并含有純rhCYGB收集管，所 得rhCYGB純化品使用SDS-PAGE和HPLC方法(Shimadzu， column Zorbax SB-C8， 5咖， 4. 6xl50mm)分析檢測純度，見圖1和圖2。 本發(fā)明研究了 rhCYGB的過氧化物酶活性及對酒精性肝損傷的保護作用，見實施 部分。試驗結(jié)果表明重組人胞紅蛋白能有效地預(yù)防急性酒精性肝損傷，能降低小鼠血清中 AST和ALT含量，降低肝組織中MDA含量，可用于預(yù)防或治療酒精中毒和酒精肝損傷。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點 本發(fā)明在蛋白質(zhì)包涵體分離與溶解后，人工添加血紅素輔基可以快速有效地 促進胞紅蛋白的復(fù)性，同時在純化階段采用S印hacryl S-200進一步促進蛋白質(zhì)復(fù)性， S印hacryl S-200介質(zhì)具有很好的機械性能，分離速度快，分辨率高，化學(xué)穩(wěn)定性高于傳統(tǒng) 凝膠如S印hadex G25，適宜于大規(guī)模制備生產(chǎn)工藝。


圖1SDS-PAGE分析復(fù)性純化rhCYGB蛋白 圖2HPLC分析純化復(fù)性純化rhCYGB蛋白 圖3rhCYGB的過氧化物酶活性分析 圖4紫外光譜法分析鑒定rhCYGB中的血紅素輔基 圖5圓二色譜法分析rhCYGB的二級結(jié)構(gòu)
具體實施方式

實施例1 本發(fā)明所得到的rhCYGB過氧化物酶的活性測定，分別取2份3ml的5%焦性沒食 子酸(pyrogall)溶液與O. 5%的H202100 yl混勻，在可見分光光度計上測定A420吸收值不再增加后，加入100 1 (lmg/ml)的rhCYGB溶液，另一份加入相同體積的緩沖液作為對照。 每隔20秒測定酶催化生成物紅掊酚(purpurogallin)的A420吸光度值，連續(xù)測定5分鐘。 按文獻方法分析計算酶活性單位，在標準測定條件下，20秒內(nèi)生成lmg紅掊酚所需要的 酶量為1個酶活性單位。過氧化物酶活性分析表明純化的rhCYGB蛋白酶活性單位為5u/ mg，見圖3。
實施例2 采用紫外掃描儀(Shimadzu spectrophotometer UV-1700)記錄rhCYGB (0. 5mg/ ml，Tris-Cl，pH8. 5)在300-670nm內(nèi)的紫外吸收圖譜，掃描后加2mg的連二亞硫酸鈉粉，溶 解后還原1分鐘后的蛋白質(zhì)溶液再在相同的條件下進行掃描記錄吸收圖譜，以確定血紅素 的結(jié)合。含有血紅素輔基的蛋白質(zhì)其血紅素在堿性條件下可以被吡啶所取代，這時血紅素 的吸收峰消失。故采用相似方法另取一份樣品，用O. 2M Na0H、20X吡啶溶液將rhCYGB溶液 稀釋至約10nM，在600-500nm掃描吸收基線。再加入還原劑連二亞硫酸鈉后rhCYGB的血 紅素吸收峰再次出現(xiàn)在531、557nm處。這表明復(fù)性純化后的rhCYGB分子中含有血紅素輔 基，見圖4。運用圓二色譜儀(J-810-150S JASCO)測定rhCYGB(2mg/ml， Tris-Cl， pH8. 5) 在190-250nm內(nèi)CD圖譜，分析鑒定rhCYGB的空間結(jié)構(gòu)特征，見圖5。
實施例3 利用酒精損傷作為氧化應(yīng)激模型。將大鼠肝臟星狀細胞按lxlOVcm2接種至6孔 板，待細胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。更換新鮮培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基內(nèi)分別加入終濃度為 50mM的酒精以制造細胞氧化應(yīng)激模型，空白組不加酒精。加入酒精12小時后，更換新鮮培 養(yǎng)基并分別加入終濃度為10 ii M， 1 ii M，O. 1 ii M rhCYGB，并以Tris-Cl溶液作為對照，每種 濃度做6個復(fù)孔。12小時后吸棄培養(yǎng)基，加入lml PBS緩沖液吹打細胞使其脫落成細胞懸 液。吸取上述細胞懸液至離心管內(nèi)，超聲裂解細胞(60Hz，2個脈沖作用時間各為3秒，間隔 3秒)。將細胞裂解液進行離心(4t:、10000g、15分鐘)，離心后吸取上清轉(zhuǎn)移至另一離心 管內(nèi)待測或者-2(TC凍存。取上述細胞裂解液檢測其中GSH、 MDA含量，檢測方法按照公司 試劑盒說明書進行操作。上述得到的實驗數(shù)據(jù)用t檢驗的方法進行統(tǒng)計分析，與對照相比 P < 0. 05，結(jié)果見表1。 表1 rhCYGB對肝星狀細胞酒精損傷的保護(n = 6， X±s)
組別GSH(nM)MDA(nM/mg protein)
正常組2.58 ±0.291.57 ±0.63
模型組2.46 ±0.361.72 ±0.67
rhCYGBO.luM4.25 ±0.531.84 ±0.73
rhCYGB luM5.03 ± 0.490.77 ±0.3
rhCYGB 10uM5.96 ±0.770.97 ±0,38 谷胱甘肽是細胞內(nèi)重要的還原性物質(zhì)，可減輕氧化應(yīng)激對細胞的損傷。當細胞受 到乙醇氧化應(yīng)激時，細胞內(nèi)谷胱甘肽將減少。在細胞受乙醇損傷模型中，向受損傷的細胞培 養(yǎng)液中加入終濃度分別為10uM、luM、0. luM的rhCYGB，結(jié)果可以看出10uM濃度的rhCYGB能
5顯著地增加谷胱甘肽含量。另外，luM和10uM的rhCYGB還可以減少MDA在細胞內(nèi)的含量， 表明rhCYGB的抗氧化功能。
實施例4 取60只體重在18 22g的雄性小鼠，隨機分成5組，分別為對照組(給予Tris-Cl)、 模型組(給予Tris-Cl)、及高(rhCYGB， 10mg/kg)、中(rhCYGB， 5mg/kg)、低(rhCYGB， lmg/ kg)劑量組，分別經(jīng)腹腔注射給予不同劑量的rhCYGB，對照組和模型組給予相同體積的 Tris-Cl連續(xù)6天，標準飲食。第七天將模型組和高、中、低給藥組小鼠用50%酒精(15m1/ kg)灌胃造成小鼠急性酒精肝損傷模型，對照組給予同等于酒精熱量的麥芽糖灌胃。造模后 禁食12h(不禁水)后，摘眼球取血，靜置30分鐘后，3000r/min離心15分鐘分離血清，4t: 冰箱保存。取肝組織200mg，加入生理鹽水4ml，制成5%組織勻漿(W/V) ， 3500r/min離心 10min取上清液放冰箱待測。按照試劑盒方法，分別檢測各小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及各小鼠肝組織勻漿中總蛋白及丙二醛(MDA)含量。上述得到的實驗 數(shù)據(jù)用t檢驗的方法進行統(tǒng)計分析，與對照相比P < 0. 05，結(jié)果見表2。
表2rhCYGB對小鼠急性酒精肝損傷的保護作用(7d， n = 10， x±s)
GroupASTALTMDA
(Units)(Units)(nM/mg protein)
正常組129.06±54.77221.4 ±52.03.40 ±0.75
模型組200.88 ±47.76305.1 ±50.15.46 ±0.43
rhCYGB (lmg/kg)176.04 ±45.27338.6±149. 65.42 ±0.98
rhCYGB(5mg/kg)176.04 ±50.70366.1 ±99. 95.01 ±1.10
rhCYGB (10mg/kg)145.26± 48.54256.0±118. 84.62 ±0.28 急性酒精肝動物模型是人們較常應(yīng)用的一種研究藥物對肝臟保護作用的動物模 型。乙醇在肝臟代謝過程能產(chǎn)生氧自由基，并能損傷肝臟。我們在給予小鼠6天的rhCYGB， 利用50%乙醇給小鼠灌胃制造酒精肝損傷的動物模型后12小時處死小鼠，取小鼠的血清 和肝組織進行各項指標的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10mg/kg rhCYGB(P<0.05)能夠保護乙醇對小 鼠的肝損傷(血清中的AST、ALT含量減少)。丙二醛(MDA)是體內(nèi)氧化應(yīng)激存在的主要標 志，它的存在可以誘導(dǎo)機體的基因突變，對人體有著很大的危害。10mg/kg rhCYGB能夠降低 小鼠肝臟組織內(nèi)丙二醛(MDA)的含量，具有對抗氧化應(yīng)激、保護肝臟的活性。
權(quán)利要求
一種重組人胞紅蛋白(hCYGB)表達復(fù)性制備方法，其特征是采用以下工藝步驟(1)本室構(gòu)建保存的基因工程菌pET28a/hCYGB/BL21(DE3)，在最佳表達條件(IPTG 0.1mM至0.5mM，37℃誘導(dǎo)表達4小時至8小時)培養(yǎng)后，離心收獲細胞。(2)每克細胞加入10ml裂解液(50mM Tris-Cl，pH8.0，50mM EDTA，1mM PMSF)；細胞經(jīng)過三步的反復(fù)凍融后，再用超聲破碎菌體；7000g，30min，4℃離心除去上清，包涵體中加入洗滌液(Tris-Cl，pH8.0，5mM EDTA，2％去氧膽酸)5ml洗滌，再次離心除去上清。(3)包涵體用2ml(6M鹽酸胍，50mM Tris-Cl，pH7.5，50mM DTT)溶液煮沸5分鐘。離心(10000g，10分鐘，4℃)除去不溶物，得到上清蛋白質(zhì)溶液。(4)上述所得蛋白質(zhì)溶液按總蛋白濃度中含有60％rhCYGB計算，加入1倍至2倍于rhCYGB摩爾濃度的血紅素于蛋白質(zhì)溶液中，輕輕攪拌，室溫靜置5分鐘至20分鐘，離心(10000g，10分鐘，4℃)除去不溶物。(5)將離心后的上清液透析(透析液5mM Tris-Cl，pH8.5)過夜，濃縮至蛋白濃度為2mg/ml。透析復(fù)性后的蛋白溶液用Sephacryl-S200柱層析(1.5cmx40cm)進行純化，層析柱體積約為50ml。上樣2ml(2mg/ml)rhCYGB樣品后用50mM Tris-Cl，pH8.5緩沖液進行洗脫，流速0.8ml/min，紫外檢測并分部收集。(6)SDS-PAGE檢測洗脫液，根據(jù)蛋白電泳圖譜合并含有純rhCYGB收集管，所得rhCYGB純化品使用SDS-PAGE和HPLC方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胞紅蛋白表達復(fù)性制備方法，其特征是在復(fù)性過程中 加入1倍至2倍摩爾量血紅素，輕輕攪拌，室溫靜置5分鐘至20分鐘，然后透析12小時。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人胞紅蛋白表達復(fù)性制備方法，其特征在于采用 S印hacryl-S200柱層析進行進一步復(fù)性和純化重組胞紅蛋白(hCYGB)。
4. 重組人胞紅蛋白對酒精急性肝損傷保護的醫(yī)藥用途，即利用重組人胞紅蛋白進行酒 精急性肝損傷的預(yù)防及藥物治療用途，給藥途徑包括靜脈注射，肌肉注射，口服，粘膜，皮膚 和呼吸道。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，提供了一種重組人胞紅蛋白表達復(fù)性制備方法，以及重組人胞紅蛋白對酒精急性肝損傷保護的醫(yī)藥用途。胞紅蛋白(Cytoglobin，CYGB)最初命名為肝星狀細胞激活相關(guān)蛋白(Hepatic Stellate cell activation-associated protein，STAP)。rhCYGB經(jīng)大腸桿菌表達后，通過人工添加血紅素輔基復(fù)性和采用Sephacryl S-200凝膠層析法純化，可以提高rhCYGB復(fù)性和分離純化效率。重組人胞紅蛋白能有效地預(yù)防酒精急性肝損傷，可用于預(yù)防或治療酒精中毒和酒精肝損傷。
文檔編號C07K14/795GK101693912SQ20091023307
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者吳梧桐, 張玉彬, 接振旺, 魏威 申請人:中國藥科大學(xué);