專利名稱：豬瘟合成肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于豬瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有該多肽的疫苗及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
豬瘟(Classical Swine Fever, CSF)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性傳染病，其主要表現(xiàn)為特征性病理變化、內(nèi)臟出血、梗塞和壞死，死亡率高達(dá)80% 90%，幾乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外)，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織將豬瘟列入A類烈性傳染病。豬瘟在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感， 一年四季均可發(fā)生。此外患病和弱毒株感染的母豬也可以經(jīng)胎盤垂直感染胎兒，產(chǎn)生弱仔豬、死胎等。該病的潛伏期一般為5 7天，根據(jù)臨床癥狀可分為最急性、急性、慢性和溫和型四種類型。豬瘟病毒(CSFV)屬黃病毒科(Flavividae)瘟病毒屬(Pestivirus)，基因組為單股正鏈RNA病毒，大小約為12. 31Λ，含有一個(gè)開放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)含3898aa的多聚前體蛋白。CSFV基因組由11個(gè)基因組成，已定位的蛋白有5種Npro、C、E0、El和E2，未明確定位的有6種NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其中C為核衣殼蛋白，E0、El和E2 為結(jié)構(gòu)糖蛋白，其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白。在結(jié)構(gòu)蛋白中，最具有免疫防治研究?jī)r(jià)值的是EO和 E2基因。E2囊膜糖蛋白(gp5Q是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體及激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的主要抗原蛋白，具有種屬特異性。E2基因的變異將影響CSFV的免疫原性和抗原性。E2存在A、B、 C和D 4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原區(qū)域，而A又進(jìn)一步分為Al、A2和A3三個(gè)亞區(qū)。A1、A2亞區(qū)在 CSFV不同分離毒株間是保守的，而A3、B、C、D均呈不同程度的變異性。A、B和C區(qū)是中和抗原表位區(qū)，可誘導(dǎo)動(dòng)物的中和反應(yīng)，且Al和B、Al和C之間誘導(dǎo)的中和反應(yīng)存在協(xié)同作用。在所有抗原區(qū)或亞區(qū)中，只有Al亞區(qū)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單克隆抗體不僅對(duì)病毒感染具有中和作用，而且能識(shí)別所有CSFV分離毒株，并與相關(guān)病毒BVDV和BDV無(wú)交叉反應(yīng)。因此，Al抗原區(qū)的精確定位及克隆、表達(dá)，對(duì)CSFV的診斷、免疫研究具有重要價(jià)值。A、B、C和D各區(qū)域的抗原表位數(shù)分別是8、6、3和1，而A1、A2和A3的抗原表位數(shù)分別為4、3和1。有研究進(jìn)一步確定了 E2蛋白上4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原區(qū)域的抗原表位的位置所有抗原位點(diǎn)均在E2 的N端690 866的176aa之上，其中B的所有表位和C的一個(gè)表位位于第1 83aa殘基之間，C區(qū)域的其它表位所處區(qū)域較寬，在第1 IlOaa殘基之間，Al位于第86 176aa殘基之間，A2、A3位于第86 123aa殘基之間，D區(qū)域僅有一個(gè)抗原表位，位于第86 IlOaa 殘基之間。目前已經(jīng)報(bào)道的豬瘟B細(xì)胞線性表位有E2上的TAVSPTTLR (aa829-837)、 SPTTL (aa 289-293), CTAVSPTTLRTEVVK (aa 828-842), LFDGTNP (aa 772-778)和 Erns 上的 DKN(aa 117-119)，這些抗原表位的確定將有助于促進(jìn)豬瘟病毒的診斷分析和表位標(biāo)記疫
苗的發(fā)展。
傳統(tǒng)疫苗是將病原體滅活或減毒制成的，存在生物危害性和遺傳變異致使原疫苗效力喪失等問(wèn)題。表位疫苗是用抗原表位制備的疫苗，是目前研制感染性疾病疫苗的方向。 相對(duì)于傳統(tǒng)的弱毒苗和滅活苗以及其他幾種新型的疫苗，肽類疫苗安全、無(wú)毒、穩(wěn)定，由于其分子結(jié)構(gòu)小而簡(jiǎn)單，很少會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥及醫(yī)源性感染問(wèn)題。肽類疫苗可精確定位， 合成τ、B細(xì)胞抗原表位且可以進(jìn)行不同的組合，制成針對(duì)多種病原體的疫苗。特別是可選用微生物中無(wú)突變的小片段制備合成肽疫苗。有些病原(如流感病毒)可通過(guò)快速而高頻的突變逃避宿主免疫系統(tǒng)，若選擇無(wú)突變的小肽片段作為疫苗就可克服其自身蛋白的局限性。研制合成多肽疫苗最重要的一步是尋找抗原表位。解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所的劉思國(guó)等人在CSFV E2基因遺傳變異分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析、預(yù)測(cè)E2蛋白的抗原表位，合成短肽。與抗 mE2蛋白的兔血清(或單克隆抗體)進(jìn)行反應(yīng)，鑒定短肽的反應(yīng)原性，并與載體蛋白(BSA) 偶聯(lián)后免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測(cè)定免疫原性。結(jié)果顯示，僅其中一條多肽能產(chǎn)生抗體。Dong等報(bào)道合成5段豬瘟石門株B/C區(qū)693-777位氨基酸，偶聯(lián)BSA制成合成肽苗，結(jié)果免疫豬能產(chǎn)生高滴度的抗體，并能完全保護(hù)強(qiáng)毒的攻擊。以此多肽制備高免血清，此血清1 4和1 6 稀釋后能抑制C株的兔體熱反應(yīng)，而用合成多肽對(duì)高免血清進(jìn)行親和層析處理后，則不能抑制C株的兔體熱反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于豬瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有該多肽的疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述多肽以及上述疫苗的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一方面，本發(fā)明提供一種用于豬瘟合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列為 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4 所示的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供一種豬瘟合成肽疫苗，其中包括一種或多種氨基酸序列為 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的多肽；優(yōu)選地，所述疫苗包含佐劑。此外，本發(fā)明還提供了上述多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護(hù)反應(yīng)在體積比為15% -30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中， 在20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除樹脂氨基上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮?dú)獯蹈桑?N-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個(gè)氨基酸與 ι-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-ι-羥基苯丙三唑酯；(3)縮合反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動(dòng)加至反應(yīng)器中，在20-28°C條件下反應(yīng)0. 5-2. 5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，N-甲基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙?；磻?yīng)使用重量體積比(g/ml)為1. 5% 的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28°C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌樹脂?br> (5)合成過(guò)程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1) 0)，反應(yīng)完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時(shí)后置于o°c下反應(yīng)10分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過(guò)濾得多肽溶液；(7)超濾純化多肽及無(wú)菌處理使用膜包在20_28°C條件下超濾多肽，使用0. 22微米在線濾器除菌保存。上述多肽的制備方法中，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85 8 3 3 1。本發(fā)明還提供了上述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將多肽稀釋至200 μ g/ml制得抗原水相；(2)在20-28°C條件下，按照抗原水相佐劑=1 1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，90-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1. 5-3分鐘；(3)緩慢加入抗原水相，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。在上述疫苗的制備方法中，所述高速攪拌為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述的多肽或疫苗在制備治療和/或預(yù)防豬瘟的藥物中的用途。綜上所述，本發(fā)明通過(guò)對(duì)豬瘟毒株的序列測(cè)定，研究豬瘟主要抗原位點(diǎn)的變異情況，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助方法進(jìn)行豬瘟抗原位點(diǎn)的分析預(yù)測(cè)，對(duì)可能的抗原位點(diǎn)肽段進(jìn)行化學(xué)合成，進(jìn)而經(jīng)過(guò)大量的動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到免疫反應(yīng)水平高，可以很好地保護(hù)動(dòng)物免受豬瘟毒株的攻擊的多肽抗原，并基于此研制出一種效力好、安全性高、 生產(chǎn)工藝穩(wěn)定且成本低的抗豬瘟病毒的合成肽疫苗。對(duì)這些多肽進(jìn)行的疫苗安全性和效力試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的疫苗可以有效應(yīng)對(duì)豬瘟病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問(wèn)題，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中的血清檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 合成肽疫苗多肽抗原的固相合成本實(shí)施例為本發(fā)明所提供的合成肽疫苗的多肽抗原的固相合成。本發(fā)明的多肽抗原可以通過(guò)ABI 433A全自動(dòng)多肽合成儀，利用Merrifield固相合成法制備，其中采用了 9-芴甲氧羰基(Fmoc)修飾的氨基酸，固相載體為Rink Amide MBHA樹脂。生產(chǎn)過(guò)程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。1、合成原料的準(zhǔn)備合成肽疫苗多肽抗原序列分別為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ INNO. 3和SEQID NO. 4所示的氨基酸序列。依據(jù)上述多肽抗原序列以及Immol的合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的Fmoc修飾的氨基酸，加入相應(yīng)的Cartridge (裝氨基酸的小瓶)中。同樣按要求稱量RinkAmide MBHA樹脂，放入反應(yīng)腔中，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成的肽的名稱，批號(hào)，反應(yīng)腔的皮重以及所稱取樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等并放置到對(duì)應(yīng)的試劑瓶中。2、合成儀狀態(tài)的檢測(cè)檢查433A多肽合成儀器是否正常運(yùn)行，開機(jī)后，運(yùn)行Run Self Test程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查隊(duì)是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對(duì)儀器的性能有所了解，所以要對(duì)每種合成試劑的流速進(jìn)行測(cè)定。433A合成儀發(fā)送Flow Ratel-18 至Ij合成儀，選擇 Main Menu-ModuleTest-按 Prer 或 next 找 Module A、ModuleD、ModuleI、 Modulel,Module A-按Mart-按more進(jìn)行測(cè)量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門壓力， 直至達(dá)到要求。3、合成肽疫苗多肽抗原的制備(1)去保護(hù)反應(yīng)在15% -30% (體積/體積)的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除樹脂氨基上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮?dú)獯蹈桑琋-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個(gè)氨基酸與 ι-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-ι-羥基苯丙三唑酯；(3)縮合反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動(dòng)加至反應(yīng)器中，在20-28°C條件下反應(yīng)0. 5-2. 5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑琋-甲基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙?；磻?yīng)使用1. 5% -4% (重量/體積)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28°C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮?dú)獯蹈桑状枷礈鞓渲?5)合成過(guò)程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1) 0)，反應(yīng)完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑(各組分的體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85 8 3 3 1)，勻速攪拌1-4小時(shí)后置于0°C下反應(yīng)10分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過(guò)濾得多肽溶液；(7)超濾純化多肽及無(wú)菌處理使用膜包在20_28°C條件下超濾多肽，使用0. 22微米在線濾器除菌保存。實(shí)施例2 合成肽疫苗的配制本實(shí)施例為本發(fā)明所提供的合成肽疫苗的配制。用注射用水將多肽溶液分別稀釋到50μ g/ml，制成抗原水相；將 SEPPICMONTANIDE ISA 50V油佐劑經(jīng)121°C，30分鐘滅菌，備用作為油相。在22°C條件下， 按照抗原水相與滅菌的油相50V為1 1的體積比，先將油相加入乳化罐內(nèi)，100轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌2分鐘，緩慢加入水相，加完后攪拌30分鐘，再高速9000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌20分鐘， 然后靜置5分鐘，分裝后即得抗禽流感病毒的合成肽疫苗，即SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的合成肽疫苗、SEQID NO. 2所示氨基酸序列的合成肽疫苗，SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列的合成肽疫苗、SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的合成肽疫苗。實(shí)施例3 合成肽疫苗的效力試驗(yàn)本實(shí)施例提供了本發(fā)明合成肽疫苗的效力試驗(yàn)，具體詳述如下。1、試驗(yàn)方法采用阻斷ELISA檢測(cè)實(shí)施例2所配制的豬瘟合成肽疫苗免疫豬血清的效力。四批合成肽疫苗一共設(shè)為四組，試驗(yàn)動(dòng)物為40日齡經(jīng)檢測(cè)CSF抗原、抗體為陰性的健康豬16頭，具體分組情況見(jiàn)表1。分別于免疫前和2次免疫21d耳緣靜脈采血分離血清，作為檢測(cè)血清。表1疫苗分組情況
權(quán)利要求
1.一種用于豬瘟合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。
2.一種豬瘟合成肽疫苗，其中包括一種或多種權(quán)利要求1所述的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。
4.一種權(quán)利要求1所述多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護(hù)反應(yīng)在體積比為15%-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在 20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除樹脂氨基上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮?dú)獯蹈桑?N-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個(gè)氨基酸與1-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-ι-羥基苯丙三唑酯；(3)縮合反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動(dòng)加至反應(yīng)器中，在20-28°C條件下反應(yīng)0. 5-2. 5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，N-甲基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙?；磻?yīng)使用重量體積比為1.5% -4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28°C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌樹脂?5)合成過(guò)程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1) G)，反應(yīng)完成后， 用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時(shí)后置于 0°C下反應(yīng)10分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過(guò)濾得多肽溶液；(7)超濾純化多肽及無(wú)菌處理使用膜包在20-28°C條件下超濾多肽，使用0.22微米在線濾器除菌保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85 8 3 3 1。
6.一種權(quán)利要求2或3所述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將多肽稀釋至200μg/ml制得抗原水相；(2)在20-28°C條件下，按照抗原水相佐劑=1 1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，90-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1. 5-3分鐘；(3)緩慢加入抗原水相，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述高速攪拌為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2或3所述的疫苗在制備治療和/或預(yù)防豬瘟的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬瘟合成肽疫苗及其制備方法，具體涉及用于豬瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有該多肽的疫苗及它們的制備方法。所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。由該多肽制成的疫苗可以有效應(yīng)對(duì)豬瘟病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問(wèn)題，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/04GK102485749SQ20091023580
公開日2012年6月6日 申請(qǐng)日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者宋芳, 巴利民, 肖進(jìn), 鄭應(yīng)華, 郭麗清, 齊鵬 申請(qǐng)人:中牧實(shí)業(yè)股份有限公司