專利名稱：：一種檢測(cè)三聚氰胺的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)三聚氰胺的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：三聚氰胺(英文名Melamine)，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，性狀為純白色單斜棱晶體，無味。簡(jiǎn)稱三胺，俗稱蜜胺、蛋白精，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，分子式見式(I);三聚氰胺是一種用途廣泛的基本有機(jī)化工中間產(chǎn)品，最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂(MF)的原料。三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。但是它被禁止用于食品和寵物飼料中，長(zhǎng)期攝入三聚氰胺會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。2007年，美國(guó)爆發(fā)寵物食品受污染事件。事后調(diào)查表明摻雜了《6.6%三聚氰胺的小麥蛋白粉是寵物食品導(dǎo)致中毒的原因。2008年9月，中國(guó)爆發(fā)三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導(dǎo)致食用了受污染奶粉的嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。目前，三聚氰胺檢測(cè)已經(jīng)被列入我國(guó)新食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，并制定三聚氰胺在乳與乳制品中的管理限量值。嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg;液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。現(xiàn)有的檢測(cè)方法有主要為高效液相色譜法、氣相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜_質(zhì)譜/質(zhì)譜法，這些檢測(cè)方法涉及到使用大型精密儀器，需要專業(yè)人員操作，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用高昂。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)三聚氰胺的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種三聚氰胺抗原，是式(II)所示化合物和載體蛋白的偶聯(lián)物；所述式(ii)所示化合物和所述載體蛋白的物質(zhì)的量的比值具體可為20:i。所述載體蛋白具體可為牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白。應(yīng)用所述三聚氰胺抗原制備得到的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)三聚氰胺的試劑盒，它包括包被有包被抗原的酶標(biāo)板；所(I)c3述包被抗原為任一所述的三聚氰胺抗原。所述試劑盒還可包括抗體工作液；所述抗體工作液為所述單克隆抗體或其稀釋液。所述單克隆抗體具體可為由保藏編號(hào)為CGMCCNO.3237的雜交瘤細(xì)胞株3B11分泌產(chǎn)生的。雜交瘤細(xì)胞株3B11已于2009年08月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏登記號(hào)為CGMCCNo.3237。所述抗體工作液具體可為所述單克隆抗體的10倍稀釋液。所述包被抗原的濃度具體可為0.2iig/mL。所述試劑盒還可包括系列濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品。所述試劑盒還可包括其它ELISA常用試劑，如酶標(biāo)二抗(如HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG)、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、底物顯色液、終止液等。所述三聚氰胺抗原、所述單克隆抗體或所述試劑盒均可應(yīng)用于檢測(cè)三聚氰胺。本發(fā)明按照通過偶聯(lián)劑1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽介導(dǎo)的縮合反應(yīng)把三聚氰胺的類似物SM(用一個(gè)碳原子取代三聚氰胺的含氮雜環(huán)中的一個(gè)氮原子，并在此碳原子上連接一個(gè)帶有羧基的側(cè)鏈)偶聯(lián)到載體蛋白(匙孔血藍(lán)蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA);用SM-KLH作為免疫抗原，取免疫小鼠的脾臟，分離出淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行融合，HAT選擇性培養(yǎng)基初步篩選出融合的雜交瘤細(xì)胞，間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞3B11，有限稀釋法對(duì)3B11細(xì)胞進(jìn)行亞克隆化，獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株；采用單層細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞株，獲得培養(yǎng)上清中的單克隆抗體；也可采用體內(nèi)誘導(dǎo)法制備細(xì)胞株分泌的腹水抗體，然后用ProteinA蛋白親和層析法純化腹水，得到單克隆個(gè)抗體。檢測(cè)三聚氰胺的方法(間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA):SM-BSA作為包被抗原被固定在酶標(biāo)板上；用含10%小牛血清的磷酸鹽緩沖液371:封閉1小時(shí)；每孔分別加入系列濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品和抗三聚氰胺抗體的工作液各50L，37t:孵育0.5小時(shí)；每孔加入100iiL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體工作液，37t:孵育0.5小時(shí)；OPD顯色系統(tǒng)顯色；酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)490nm，讀出A49。值；以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸，抑制率(B/B。值)y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；同樣，用待測(cè)樣品液代替三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的三聚氰胺濃度。本發(fā)明的試劑盒的檢測(cè)原理(參見圖8):以SM-BSA作為包被抗原吸附在固相載體酶標(biāo)板上，加入樣品或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，然后加入抗三聚氰胺的單克隆抗體，游離的三聚氰胺與固定包被抗原SM-BSA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體，游離的三聚氰胺量愈多，結(jié)合在固相上SM-BSA的抗體就愈少，繼而結(jié)合的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體也愈少。顯色后終止，測(cè)定樣品A490值，該值與樣品中三聚氰胺的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可計(jì)算出樣品中三聚氰胺的含量。本發(fā)明提供的試劑盒最低檢測(cè)量可達(dá)30ppb，遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的食品中三聚氰胺含量的限定值，而且勿需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，適當(dāng)稀釋后直接檢測(cè)，簡(jiǎn)化程序，縮短時(shí)間，適用于大量樣品的快速檢測(cè)，故可作為檢測(cè)食品中三聚氰胺含量的一種非常實(shí)用的檢測(cè)工具。本發(fā)明的試劑盒具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)樣品量大等特點(diǎn)，此外，與同類檢測(cè)方法相比，被檢測(cè)的液態(tài)乳制品無需樣品前處理，固態(tài)檢測(cè)樣品只需使用磷酸鹽緩沖液做適量濃度溶解即可上樣檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間。因此，本發(fā)明對(duì)解決大批量待檢三聚氰胺含量的樣品監(jiān)控有重要的現(xiàn)實(shí)意義。圖1為SM-KLH/BSA的結(jié)構(gòu)圖。圖2為質(zhì)譜分析SM與BSA的偶聯(lián)結(jié)果。圖3為SDS-PAGE分析ProteinA親和層析純化腹水。圖4為單克隆抗體稀釋滴度對(duì)A，值的影響。圖5為SM-BSA濃度對(duì)三聚氰胺抑制率的影響。圖6為單克隆抗體與三聚氰胺類似物的交叉反應(yīng)曲線。圖7為標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。圖8為試劑盒的反應(yīng)原理。圖9為化合物SM的核磁共振氫譜圖。圖10為化合物SM的核磁共振碳譜圖。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。三聚氰胺、三聚氰胺一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl，EDC)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、匙孑L血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、完全弗氏佐劑(completeFreund'sadjuvant,CFA))、不完全弗氏佐劑(incompleteFreund'sadjuvant,IFA)、石蠟油、辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠的IgG均購自sigma公司；HAT、HT、RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、L_谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司；HitraprproteinAFFcolumn柱購自Amersham公司；68周齡的BALB/c純系鼠購自北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0購自ATCC，貨號(hào)為CRL-1581。其它常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。液態(tài)純牛奶購自伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；脫脂奶粉購自完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司；固體貓糧NutroChoice購自Nutro公司。酶標(biāo)儀680(BIO-RED)，二氧化碳培養(yǎng)箱371(themo)，生物安全柜(LABC0NC0)倒置生物顯微鏡XDS-1B(重光)，電泳儀(BIO-RED)，垂直電泳槽(BIO-RED)，臺(tái)式離心機(jī)5810R(印pendorf)，AutoflexIIT0F/T0F質(zhì)譜儀(BrukerDaltonics，北京生命科學(xué)研究所蛋白質(zhì)中心)。抑制率(B/B0)=[(A柳(x「A柳(o))/(A柳(ctD-A柳(o))]X100X;A柳(x)-有三聚氰胺(或有三聚氰胺類似物，或有待測(cè)樣品)抑制的A49。值，A49。(etl)_無三聚氰胺(或無三聚氰胺類似物，或無待測(cè)樣品)抑制的A49。值，A49。(。)_無抗體的空白對(duì)照的A49。值。實(shí)施例1、三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物(SM)的制備SM的分子式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>把2，3-二氫妣喃(化合物1)(0.56g，6.63mmol)，6--1-己醇(lg，5.52,1)和吡啶對(duì)甲基苯磺酸鹽(0.28g，l.lmmol)溶解在15mL二氯甲烷(DCM)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌23小時(shí)。用飽和NaHC03溶液和飽和食鹽水洗滌反應(yīng)液，無水Na2S04干燥。過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去溶劑得到無色油狀液體化合物3(1.4g，收率為96%)。2、化合物3的表征4畫R(CDC13，400MHz)S4.57(m，1H)，3.86(m，1H)，3.74(m，1H)，3.50(m，1H)，3.36-3.43(m，3H)，1.82—1.91(m，3H)，1.71(m，1H)，1.381.64(m，10H)。二、化合物4的制備和表征1、化合物4的制備把NaH(規(guī)格活性氫含量95%，銀灰色顆粒含量60%)(0.18g，4.52mmol)和二甲醚(DME)(5mL)加入25mL的兩口瓶中，然后依次滴加丙二腈(Malononitrile)(0.5g，7.45mmol)的DME(8mL)溶液和化合物3(lg，3.77mmol)的DME(2mL)溶液，然后反應(yīng)混合液在室溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌過夜。用5%NH4C1溶液中止反應(yīng)，調(diào)pH至8，向反應(yīng)液中加入乙酸乙酯，依次用水和飽和食鹽水洗滌有機(jī)相，無水Na2S04干燥。過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去溶劑，柱層層析得到無色油狀液體化合物4(0.6g，收率為63.8%)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、化合物4的表征"匪R(CDCl3，400MHz)S4.56(m，1H)，3.71-3.86(m，3H)，3.37-3.52(m，2H)，2.01-2.07(m，2H)，1.43—1.82(m，14H)。三、化合物5的制備和表征1、化合物5的制備把胍的鹽酸鹽(0.19g，1.98,1)，甲醇鈉(0.38mL，1.98mmol，含量28%)和5mL無水甲醇加入25mL圓底燒瓶中，反應(yīng)混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌0.5小時(shí)。過濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的氯化鈉，濾液在減壓條件下濃縮，然后逐滴加入化合物4(0.45g，1.8mmo1)的二甲基甲酰胺(DMF)(5mL)溶液，把反應(yīng)液加熱到8(TC在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌過夜。把反應(yīng)液冷卻至室溫，用lM的鹽酸溶液調(diào)pH至8，用乙酸乙酯萃取，無水Na^04干燥。過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去溶劑得到黃色固體化合物5(0.54g，97%)。2、化合物5的表征4畫R(CDC13，400MHz)S4.56(m，1H)，3.87(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，1H)，3.38(m，1H)，2.19-2.31(m，2H)，1.36-1.71(m，14H)。四、化合物6的制備和表征1、化合物6的制備向化合物5(0.33g，0.363mmol)的四氫呋喃(THF)(20mL)溶液中依次加入二碳酸二叔丁酉旨(Boc)20(l.55g，7.12mmol)，三乙胺(TEA)(1.09mL，7.83,1)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(87mg，0.712mmol)。反應(yīng)液在室溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌過夜。用質(zhì)量含量5%NaHC03溶液中止反應(yīng)，減壓除去溶劑，用乙醚溶解剩余物，依次用質(zhì)量含量5%NaHC(^溶液，水和飽和食鹽水洗滌有機(jī)相，無水Na2S04干燥。過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析得到化合物6(0.38g，58.5%)。2、化合物6的表征^NMR(CDCl3，400MHz)S4.57(t，J=4Hz，1H)，3.86(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，1H)，3.38(m，1H)，2.29-2.46(m，2H)，1.22-1.59(m，68H)。五、化合物7的制備和表征1、化合物7的制備把化合物6(0.33g，0.363mmol)，甲醇(10mL)和對(duì)甲苯磺酸(pTsOH)(0.013g，0.0726mmol)加入25mL單口圓底燒瓶中，在室溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌2小時(shí)。用質(zhì)量含量5%NaHC03溶液中止反應(yīng)，減壓除去溶劑，用乙醚溶解剩余物，依次用質(zhì)量含量5%NaHC03溶液，水和飽和食鹽水洗滌有機(jī)相，無水Na2S04干燥。過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去溶劑得到化合物7(0.25g，83%)。7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>672、化合物7的表征丄匪R(CDC13，400MHz)S3.65(m，2H)，2.33-2.45(m，2H)，1.22-1.60(m，62H)。六、化合物8的制備和表征1、化合物8的制備向化合物7(140mg，0.17mmol)的二氯甲烷(DCM)(8mL)溶液中依次加入N-甲基嗎啉-N-氧化物(腦)(34.4mg，0.255,1)和過釕酸四內(nèi)胺(TPAP)(6.lmg，O.017,1)，反應(yīng)液在室溫下攪拌2小時(shí)。用一根短硅膠柱過濾反應(yīng)液得到無色油狀液體化合物8(0.12g，83.5%)。(Boc)2NvN(Boc)2(Boc)2N、^N(Boc)2TTPAP'NM0I丫N、^\a■-N、aa工HODCM,83.5%N(Boc)2782、化合物8的表征^NMR(CDCl3，400MHz)S9.77(s，1H)，2.43-2.45(m，4H)，1.39-1.63(m，60H)。七、化合物9的制備和表征1、化合物9的制備把NaC102(19.6mg，純度80%，0.174,1)和NaH2P04(20.9mg，0.174,1)力口入0.14mL水中，然后把這種配制好的溶液逐滴加入盛有化合物8(0.llg，O.134mmo1)，93yL2-甲基2-丁烯和2mL叔丁醇的圓底燒瓶中，反應(yīng)液在室溫下攪拌過夜。向反應(yīng)體系中加入水中止反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，無水NS04干燥。過濾除去干燥劑，減壓蒸餾除去溶劑，所得粗品不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。(Boc)2N/UBoc)2"ifY(Boc)2NvnvN(Boc)2N、^/CHONaCI02,NaH2P04I1TVVv-^N^^^/^/^/COOHN(Boc^2-methyl-2-butene,t-BuOH丁N(Boc)2892、化合物9的表征"誦R(CDCl3，400MHz)S2.44(t，J=8Hz，2H)，2.35(t，J=7.6Hz，2H)，1.24-1.66(m，60H)。八、化合物10的制備和表征1、化合物10的制備8把化合物9(0.llg，O.131,1)，9.4mL三氟乙酸(TFA)和0.6mL苯甲醚加入50mL單口圓底燒瓶中，反應(yīng)液在室溫下攪拌過夜。在減壓條件下除去三氟乙酸和苯甲醚得到粗品，向粗品中加入乙醚，離心，抽去乙醚得到白色固體，向這種白色固體中重新加入乙醚，離心，重復(fù)三次得到化合物10(0.021g，66%(兩步總產(chǎn)率))。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>2、化合物10的表征"HNMR(D2()，400MHz)S2.38(t，J=7.6Hz，2H)，2.35(t，J=6.8Hz，2H)，1.47-1.63(m，2H)，1.34-1.47(m，4H)?；衔?0的氫譜圖見圖9。13CNMR(D20，100MHz)S179.5，157.8，153.0，86.2，34.1，28.2，26.5，24.7，22.3ppm?；衔?0的碳譜圖見圖10?；衔?0即三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物(SM)。實(shí)施例2、抗原的制備抗原SM-BSA(SM-KLH)偶聯(lián)反應(yīng)物的示意圖見圖1。—、SM-BSA(包被抗原)的制備稱取5mgSM和20mgBSA，充分溶解于5ml鹽酸酸化的去離子水(pH4.7)中，向混合溶液中加入46mgEDC，4t:攪拌下反應(yīng)過夜；反應(yīng)產(chǎn)物4t:透析過夜，外透液為0.01MPBS緩沖溶液(PH7.0);分別取相同濃度(2mg/mL)的BSA和SM-BSA進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定偶聯(lián)結(jié)果。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果見圖2。BSA分子量為66.32KD。SM-BSA的平均分子量為70.57KD，與BSA相比增加了4.25KD。SM的分子量為221D，SM-BSA的形成是通過EDC將SM側(cè)鏈上的羧基與BSA表面的賴氨酸上游離的氨基脫水形成酰胺健，所以BSA分子每偶聯(lián)上一個(gè)SM分子，分子量就增加203D(221D(SM)-18D(H20))。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，平均每個(gè)BSA分子偶聯(lián)20個(gè)SM分子(4.25KD/203D=20)。二、SM-KLH(免疫抗原)的制備用KLH代替BSA，其它方法同步驟一。實(shí)施例3、單克隆抗體的制備—、小鼠免疫1、取5只68周齡的BALB/c小鼠，每只小鼠皮下注射20yg弗氏完全佐劑乳化的SM-KLH(初次免疫)。2、每隔15天皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的同劑量的SM-KLH(加強(qiáng)免疫)。3、第4次免疫10天后眼眶采血，間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體相對(duì)三聚氰胺的特異性。5只小鼠抗血清效價(jià)均為1:72000。1#、2#、3#小鼠的抗血清較其它2只小鼠的抗血清更能特異地識(shí)別三聚氰胺；加入同等劑量三聚氰胺的情況下，3#小鼠的抗血清的B/B。值更小，即抑制現(xiàn)象更明顯。4、取抗血清效價(jià)較高并且特異性較好的小鼠(3#小鼠)在細(xì)胞融合前3天進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫(腹腔注射20gSM-KLH)。二、細(xì)胞融合1、準(zhǔn)備工作①于細(xì)胞融合前1天取68周齡的BALB/c小鼠拉頸處死，分離腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，制成HAT的細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度2X10s個(gè)/mL)加入96孔板，37°CC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。②于細(xì)胞融合前兩周復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)至最佳，備用。③步驟一的4中的3#小鼠，最后一次加強(qiáng)免疫3天后取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，使用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，備用。2、細(xì)胞融合淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10:1的數(shù)量比混合，滴加lmL50%PEG融合，離心后加入50mLHAT培養(yǎng)液，接種到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37。CC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，確認(rèn)非雜交細(xì)胞死亡后，改用完全RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞共接種6塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，HAT選擇培養(yǎng)基篩選后，進(jìn)行顯微鏡觀察，細(xì)胞融合率為100%。三、雜交瘤細(xì)胞篩選1、間接ELISA用SM-BSA包被酶標(biāo)板(20ng/孔)，4。C過夜；洗板4次；含10%FBS的封閉液封閉，37t:溫育2h;洗板4次；加入待測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(以SP2/0細(xì)胞的上清液作為陰性對(duì)照；以含10%FBS封閉液作為空白對(duì)照；37t:溫育0.5h;洗板4次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG，37t:溫育lh;洗板4次；加入OPD顯色液，酶標(biāo)儀測(cè)A49。值。檢測(cè)結(jié)果以A49。；(A樣品-A空白)/(A陰性對(duì)照-A空白)>2.1為陽性。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，能夠識(shí)別SM-BSA的雜交瘤細(xì)胞株共10株1B11、2E10、3A2、3B1、3B3、3B11、4F9、5F3、5H7、6D3。2、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA將步驟1中10株陽性細(xì)胞進(jìn)行如下檢測(cè)用SM-BSA包被酶標(biāo)板(20ng/孔)，4°C過夜；洗板4次；用含10%FBS的封閉液封閉，37t:溫育2h;洗板4次；每孔加入待測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和濃度為1Pg/ml的游離三聚氰胺各50PL(對(duì)照孔用等體積的PBS代替三聚氰胺溶液)，37"溫育0.5h;洗板4次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG，37"溫育lh;洗板4次；加入OPD顯色液，酶標(biāo)儀測(cè)A49。值。如果試驗(yàn)孔的A49。值比對(duì)照孔的A49。值小，表明加入到該孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有抗三聚氰胺的特異性抗體。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果表明，只有3B11細(xì)胞株分泌的單克隆抗體在加入游離的三聚氰胺時(shí)有抑制反應(yīng)，即能夠特異性識(shí)別三聚氰胺。四、雜交瘤細(xì)胞的克隆化和凍存將3B11雜交瘤細(xì)胞吹散，取0.lmL的細(xì)胞懸液加入含0.9mLHAT培養(yǎng)液的24孔板的第1個(gè)L混勻后加入第2L同法稀釋第3、4孔；對(duì)第1孔進(jìn)行記數(shù)，計(jì)算后從相應(yīng)的孔中取100個(gè)細(xì)胞，加入10mL的完全RPMI-1640培養(yǎng)液；接種含小鼠巨噬細(xì)胞的96孔板，0.lmL/孔，37t:C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；第89d時(shí)，應(yīng)用間接ELISA進(jìn)行抗體檢測(cè)，克隆化后陽性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。最后獲得穩(wěn)定分泌抗三聚氰胺單克隆抗體細(xì)胞株3B11，該細(xì)胞株已于2009年08月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏登記號(hào)為CGMCCNo.3237。穩(wěn)定分泌抗三聚氰胺單克隆抗體細(xì)胞株3B11擴(kuò)大培養(yǎng)后離心收集，用凍存液(70%小牛血清，20%不完全培養(yǎng)液，10%DMS0)將細(xì)胞懸浮，移入凍存管內(nèi)，-7(TC保存。五、單克隆抗體的制備1、體外直接培養(yǎng)將三聚氰胺單克隆抗體細(xì)胞株3B11進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%的胎牛血清，置于37t:和5%C02孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度大于105/ml時(shí)停止換液，持續(xù)孵育至細(xì)胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清液，1500-2000Xg，離心IO分鐘，上清液含有高水平的單克隆抗體(體外培養(yǎng)單克隆抗體)，_201:保存?zhèn)溆谩?、體內(nèi)誘導(dǎo)每只小鼠腹腔注射0.5mL石蠟油，1周后每只小鼠腹腔注射1Xl(f個(gè)3B11雜交瘤細(xì)胞；待小鼠腹部明顯膨大到一定程度時(shí)，用9號(hào)針頭抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次；腹水經(jīng)13，000r/min離心15min后，取上清分裝，置-2(TC冰箱保存?zhèn)溆?。?0mm的PBS(pH7.0)對(duì)腹水進(jìn)行2倍稀釋，再用0.45ym孔徑的過濾器過濾，濾出液逐滴加入已經(jīng)平衡的Hitr即rproteinAFF柱內(nèi)，5倍柱體積的20Mm的PBS(pH7.0)洗滌后，用0.1M的檸檬酸鈉(pH3.0)溶液進(jìn)行洗脫，分管收集洗脫液并用碳酸鹽緩沖液(pH9.0)調(diào)節(jié)pH至中性，得到純化的單克隆抗體(體內(nèi)培養(yǎng)單克隆抗體)。純化單克隆抗體的純度用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE結(jié)果(見圖3)表明，純化后的抗體已經(jīng)達(dá)到電泳純。實(shí)施例4、間接ELISA測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)—、體外培養(yǎng)單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定1、用SM-BSA包被酶標(biāo)板(20ng/孔)，4。C放置過夜；每孔用含0.05%Tween20的磷酸鹽洗滌緩沖液(PBST)注滿，放置5min，連續(xù)洗滌4次；2、每孔加入100iiL封閉液(含有10X小牛血清的PBST)，37t:溫育2h;洗滌4次；3、用抗體稀釋液將體外培養(yǎng)單克隆抗體進(jìn)行梯度稀釋，分別加入酶標(biāo)板的不同孔(每孔加入100iiL)，以細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，抗體稀釋液為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔；37t:放置lh;洗滌4次；4、加入按1:5000比例稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔100iiL，37t:放置lh;洗滌4次；5、每孔加入OPD顯色液100iiL，室溫閉光放置顯色(可根據(jù)每孔的顏色變化決定顯色時(shí)間)；6、每孔加入100iiL2mol/L硫酸終止反應(yīng)；7、酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)490nm，讀出A49。值；取2孔的平均值。效價(jià)以抗血清的稀釋度表示，檢測(cè)結(jié)果以A柳；(A樣品-A空白)/(A陰性對(duì)照-A空白)>2.1為陽性，以陽性孔相應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)為效價(jià)。體外培養(yǎng)單克隆抗體的效價(jià)為1:250。二、體內(nèi)培養(yǎng)單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定用體內(nèi)培養(yǎng)單克隆抗體代替體外培養(yǎng)單克隆抗體，陰性對(duì)照為同種方法制備的Sp2/0細(xì)胞的BALB/c小鼠腹水，空白對(duì)照為抗體稀釋液。其它同步驟一。體外培養(yǎng)單克隆抗體的效價(jià)為1:80,000。實(shí)施例5、最佳抗原抗體反應(yīng)濃度的確定[OH5]—、試劑配制包被液15.9g無水碳酸鈉(Na2C03)，2.93g碳酸氫鈉(NaHC03)，調(diào)整pH至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL;洗滌緩沖液(PBST):0.2g磷酸二氫鉀(KH2P04)，2.9g磷酸氫二鈉(Na2HP0412H20)，8g氯化鈉(NaCL)，0.2g氯化鉀(KCL)，500mLTween20，調(diào)整pH至7.2，加雙蒸水定容至lOOOmL;封閉液含有10%小牛血清的洗滌緩沖液；樣品稀釋液(PBST):同洗滌緩沖液；顯色液:A液19.2g檸檬酸(C6H807*H20)，加雙蒸水定容至lOOOmL;B液71.7g磷酸氫二鈉(Na2HP0412H20)，加雙蒸水定容至lOOOmL;使用前取4.86mLA液，5.14mLB液，4.OOmg鄰苯二胺(0PD)，15mL30%過氧化氫(H202);終止液2mol/L硫酸(H2S04)。二、應(yīng)用棋盤滴定法進(jìn)行最佳抗原抗體反應(yīng)濃度的確定1、包被抗原為SM-BSA，包被濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0yg/mL，100yL/孔，4t:過夜；洗板4次；2、用含10%FBS的封閉液封閉，37。C溫育2h;洗板4次；3、用樣品稀釋液將體外培養(yǎng)單克隆抗體分別進(jìn)行10、20、100、200倍稀釋，每孔加入50iiL，同時(shí)每孔再加入50iiL三聚氰胺溶液(liig/iiL)或PBST，37。C溫育0.5h，洗滌；4、加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG(稀釋度1:5000)，37。C溫育lh，洗滌；5、加OPD底物顯色，加終止液終止反應(yīng)后，讀取A49。值；以上操作同時(shí)做兩塊酶標(biāo)板的平行實(shí)驗(yàn)，A49。值取兩板相對(duì)應(yīng)的平行孔的平均值。①以包被抗原的濃度為橫坐標(biāo)，以無三聚氰胺競(jìng)爭(zhēng)情況下孵育不同稀釋度抗體時(shí)的A49。值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析最適的抗體工作量，結(jié)果見圖4和表1。表l抗體滴度對(duì)A，值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果表明，當(dāng)包被抗原濃度從O.2iig/mL變化到5iig/mL，單克隆抗體按l:10倍稀釋時(shí)所得到的A，值始終接近i.o，故單克隆抗體的最適稀釋滴度(稀釋度)為i:io。②計(jì)算B/B。值，以包被抗原濃度為橫坐標(biāo)，以B/B。值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析包被抗原的最適工作濃度，結(jié)果見圖5和表2。表2SM-BSA包被抗原濃度對(duì)三聚氰胺抑制率的影響包被抗原濃度B/B。(yg/mUmAb1:10mAb1:20mAb1:100mAbl:2000.20.20350.20830.1420.3910.50.3050.4290.290.3861.00.3760.3050.3050,4242.00.43560,45590.3410.3975.00,4550.4390.3360.385結(jié)果表明，無論對(duì)抗體進(jìn)行多少倍稀釋，包被抗原SM-BSA的濃度為0.2yg/mL，B/B。值始終最小，即游離三聚氰胺的抑制現(xiàn)象最明顯，故包被抗原SM-BSA的最適濃度是0.2iig/mL。實(shí)施例6、試劑盒的制備—、試劑盒組件的制備1、溶液的配置包被液15.9g無水碳酸鈉(Na2C03)，2.93g碳酸氫鈉(NaHC03)，調(diào)整pH至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL;洗滌緩沖液(PBST):0.2g磷酸二氫鉀(KH2P04)，2.9g磷酸氫二鈉(Na2HP0412H20)，8g氯化鈉(NaCL)，0.2g氯化鉀(KCL)，500mLTween20，調(diào)整pH至7.2，加雙蒸水定容至1000mL;封閉液含有10%小牛血清的洗滌緩沖液；樣品稀釋液(PBST):同洗滌緩沖液；顯色液:A液19.2g檸檬酸(C6H807*H20)，加雙蒸水定容至lOOOmL;B液71.7g磷酸氫二鈉(Na2HP0412H20)，加雙蒸水定容至lOOOmL;使用前取4.86mLA液，5.14mLB液，4.OOmg鄰苯二胺(0PD)，15mL30%過氧化氫(H202);終止液2mol/L硫酸(H2S04)。2、包被抗原(SM-BSA)包被的酶標(biāo)板的制備使用包被液將SM-BSA稀釋至O.2iig/mL，100yL/孔，4。C過夜；洗滌緩沖液連續(xù)洗滌4次，每孔注入200iiL，放置5min，甩干；每孔加入100yL封閉液，37。C溫育2h，連續(xù)洗滌4次；放置_201:保存?zhèn)溆谩＝?jīng)過性能測(cè)定，該酶標(biāo)板具有良好的穩(wěn)定性，且抗原具有良好的特異性。二、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的組裝檢測(cè)三聚氰胺的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，由以下組件組成①包被SM-BSA的酶標(biāo)板；13②5瓶三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為300ppb、200卯b、150ppb、100卯b、50卯b)和1瓶不含三聚氰胺的空白對(duì)照液。③抗體工作液稀釋度為1:10的體外培養(yǎng)單克隆抗體；HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG;⑤洗滌緩沖液；⑥樣品稀釋液；⑦顯色液；⑧終止液。實(shí)施例7、試劑盒的性能采用實(shí)施例6制備的試劑盒進(jìn)行性能測(cè)定?！?、最低檢測(cè)量和線性范圍①分別取50iiL不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(300ppb、200卯b、150ppb、100卯b、50卯b、30卯b)加入酶標(biāo)板的不同孔內(nèi)，每孔再加入抗體工作液50iiL，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)孔，37t:溫育0.5h，連續(xù)洗滌4次；②加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG(稀釋度1:5000)，37t:溫育lh，用洗滌緩沖液連續(xù)洗滌4次；③取顯色液，每孔100iiL，室溫閉光放置顯色(310min，可根據(jù)每孔的顏色變化決定顯色時(shí)間)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，終止反應(yīng)；⑤酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)490nm，讀出A49。值。結(jié)果表明，本試劑盒的最低檢測(cè)量(90%抑制率對(duì)應(yīng)的濃度)為30ppb，線性范圍為50300ppb。二、特異性①分別取50iiL不同濃度的三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺或三聚氰胺二酰胺加入酶標(biāo)板的不同孔內(nèi)，再加入抗體工作液50iiL，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)孔，37t:溫育0.5h，連續(xù)洗滌4次；②加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG(稀釋度1:5000)，37t:溫育lh;用洗滌緩沖液連續(xù)洗滌4次；③加入顯色液(根據(jù)每孔的顏色變化決定顯色時(shí)間)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，終止反應(yīng)；⑤酶標(biāo)儀測(cè)A，值。計(jì)算IC5。和交叉反應(yīng)率(CR%)。IC5。為最大A49。值降低到50%時(shí)對(duì)應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)物的濃度；CR%=(三聚氰胺的IC5。/類似物IC5。)X100%。結(jié)果見表3。表33B11單克隆抗體與不同競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)物的IC5。和CR%14競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)物IC5。值(yg/ml)交叉反應(yīng)率(CR%)B/B。值見圖6。三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺作為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)物，B/B。值基本接近1.O，表明單克隆抗體對(duì)這三種結(jié)構(gòu)類似物不識(shí)別。三、精密度和準(zhǔn)確度取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，添加到不同樣品(液態(tài)奶；奶粉，用樣品稀釋液溶解；貓糧用樣品稀釋液溶解)中，每種樣品設(shè)置3個(gè)三聚氰胺濃度，應(yīng)用試劑盒檢測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度，計(jì)算變異系數(shù)和回收率(取3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值)。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作①分別取50iiL不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板的不同孔內(nèi)，每孔再加入抗體工作液50iiL，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)孔，37t:溫育0.5h，連續(xù)洗滌4次；②加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG(稀釋度l:5000)，37t:溫育lh，用洗滌緩沖液連續(xù)洗滌4次；③取顯色液，每孔100iiL，室溫閉光放置顯色(310min，可根據(jù)每孔的顏色變化決定顯色時(shí)間)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，終止反應(yīng)；⑤酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)490nm，讀出A49。值。根據(jù)A49。值計(jì)算B/B。值，以B/B。值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線的回歸方程(見圖7)。2、用待測(cè)樣品代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其它步驟同上，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。根據(jù)回歸方程計(jì)算得到待測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。3、計(jì)算變異系數(shù)和回收率變異系數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)方差/平均數(shù))X100%，由OriginPro8.0科學(xué)繪圖和數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算求得?；厥章?(三聚氰胺的實(shí)驗(yàn)測(cè)定量/三聚氰胺加入量)X100X。表4變異系數(shù)與回收率的檢測(cè)結(jié)果1003100.498.5110.0100.498.5110.03.064.750.91503171.8160.4175.1114.5106.9116.71.942.922.322003208.7195.5210.1104.497.8105.15.594.631.55<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果顯示，變異系數(shù)符合低于20%的規(guī)定，液態(tài)牛奶中添加三聚氰胺的回收率為97.7114.0%之間，表明本試劑盒有良好重復(fù)性和準(zhǔn)確性。實(shí)施例8、實(shí)施例6制備的試劑盒的應(yīng)用—、樣品前處理(1)液態(tài)奶取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，添加到液態(tài)奶中，得到三聚氰胺濃度為400iig/mL的溶液Al;用樣品稀釋液梯度稀釋溶液Al。溶液Al及其梯度稀釋液各取50iiL用于分析。(2)奶粉用樣品稀釋液溶解奶粉得到奶粉質(zhì)量百分含量為20X的溶液B0;取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，添加到溶液BO中，得到三聚氰胺濃度為400iig/mL的溶液Bl;用樣品稀釋液梯度稀釋溶液Bl。溶液Bl及其梯度稀釋液各取50iiL用于分析。(3)干貓糧稱取干貓糧lg，加10mL樣品稀釋液，旋渦振蕩器使其充分溶解，靜止10min后，離心10min、10000rpm/min，取上清液(溶液CO)。取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，添加到溶液CO中，得到三聚氰胺濃度為400i！g/mL的溶液Cl;用樣品稀釋液梯度稀釋溶液用樣品稀釋液梯度稀釋溶液Cl。溶液Cl及其梯度稀釋液各取50iiL用于分析。二、樣品中三聚氰胺的檢測(cè)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作①分別取50iiL不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板的不同孔內(nèi)，每孔再加入抗體工作液50iiL，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)孔，37t:溫育0.5h，連續(xù)洗滌4次；②加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG(稀釋度1:5000)，37t:溫育lh，用洗滌緩沖液連續(xù)洗滌4次；③取顯色液，每孔100iiL，室溫閉光放置顯色(310min，可根據(jù)每孔的顏色變化決定顯色時(shí)間)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，終止反應(yīng)；⑤酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)490nm，讀出A49。值。根據(jù)A49。值計(jì)算B/B。值，以B/B。值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線的回歸方程。2、用待測(cè)樣品代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其它步驟同上，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。根據(jù)回歸方程計(jì)算得到待測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。也可根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列標(biāo)準(zhǔn)三聚氰胺溶液顏色的比較，粗略地判斷樣本中三聚氰胺的濃度范圍。權(quán)利要求一種三聚氰胺抗原，是式(II)所示化合物和載體蛋白的偶聯(lián)物；式(II)。F2009102413101C0000011.tif2.如權(quán)利要求1所述的三聚氰胺抗原，其特征在于所述式(II)所示化合物和所述載體蛋白的物質(zhì)的量的比值為20:i。3.如權(quán)利要求1或2所述的三聚氰胺抗原，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白。4.應(yīng)用權(quán)利要求1至3中任一所述三聚氰胺抗原制備得到的單克隆抗體。5.—種檢測(cè)三聚氰胺的試劑盒，它包括包被有包被抗原的酶標(biāo)板；所述包被抗原為權(quán)利要求1至3中任一所述的三聚氰胺抗原。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于它還包括抗體工作液；所述抗體工作液為權(quán)利要求4所述單克隆抗體或其稀釋液。7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNO.3237的雜交瘤細(xì)胞株3B11分泌產(chǎn)生的。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述抗體工作液為稀釋度為1:10的所述單克隆抗體。9.如權(quán)利5至8中任一所述的試劑盒，其特征在于所述包被抗原的濃度為0.2iig/mL。10.權(quán)利要求1所述三聚氰胺抗原、權(quán)利要求4所述單克隆抗體或權(quán)利要求5至9中任一所述試劑盒在檢測(cè)三聚氰胺中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)三聚氰胺的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種三聚氰胺抗原，是式(II)所示化合物和載體蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的試劑盒包括包被有所述三聚氰胺抗原的酶標(biāo)板。所述試劑盒還可包括所述三聚氰胺抗原制備得到的單克隆抗體或其稀釋液。本發(fā)明的試劑盒最低檢測(cè)量可達(dá)30ppb，遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的食品中三聚氰胺含量的限定值，而且勿需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，適當(dāng)稀釋后直接檢測(cè)，簡(jiǎn)化程序，縮短時(shí)間，適用于大量樣品的快速檢測(cè)，故可作為檢測(cè)食品中三聚氰胺含量的一種非常實(shí)用的檢測(cè)工具。因此，本發(fā)明對(duì)解決大批量待檢三聚氰胺含量的樣品監(jiān)控有重要的現(xiàn)實(shí)意義。式(II)。文檔編號(hào)C07K14/435GK101717444SQ200910241310公開日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年11月27日優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日發(fā)明者丁亞芳,智剛,王校楠,石曉娟申請(qǐng)人:北京生命科學(xué)研究所