專利名稱：一種非洲豬瘟病毒vp73基因的原核表達(dá)蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的制備方法，具體地說是一種鑒定非洲豬瘟病 毒抗體的VP73基因序列原核表達(dá)蛋白抗原及其制備方法。
背景技術(shù)：
非洲豬癌(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。其臨床癥狀主要特征包括高熱、 病程短、高死亡率、內(nèi)臟器官廣泛性出血以及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能改變等。由于該病高 傳染性、高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且野生宿主不可能被根除，因此對該 病的防控面臨著巨大挑戰(zhàn)。ASF盡管在我國從未發(fā)生，但隨著國際間交往和進(jìn)出口貿(mào)易的日益頻繁，ASF跨邊 境傳播的風(fēng)險越來越大，如不引起足夠重視，一旦發(fā)生該病將導(dǎo)致災(zāi)難性后果。由于ASF保 護(hù)性免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，目前尚無理想的疫苗用于主動或被動免疫，防治上主要采用嚴(yán)格 的診斷和檢疫措施，因此建立快速、無感染性的診斷方法對我國十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的非洲豬瘟病毒VP73基因的原核表達(dá)蛋白及其制備方法目的在于通 過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP73蛋白，為建立ASFV的ELISA檢測方法提供檢測抗原。提供 一種無散毒危險、穩(wěn)定性好、靈敏度高的原核表達(dá)檢測抗原及其制備方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。非洲豬瘟病毒VP73基因片段含有1188個堿基，編碼396個氨基酸殘基，在用原核 表達(dá)載體PET3M進(jìn)行表達(dá)時，VP73基因片段與融合表達(dá)載體上的硫氧還蛋白(Trx)得到 融合表達(dá)，融合蛋白Trx_VP73的分子量約為65KD。VP73基因片段的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列為1ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC1MASGGAFCLIANDGKADKI I61TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT21LAQDLLNSRISNIKNVNKSY121GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC41GKPDPEPTLSQIEETHLVHF181AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT61NAHFKPYVPVGFEYNKVRPH241ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT81TGTPTLGNKLTFGIPQYGDF301TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT


下
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381FIPGRPSRRNIRFKPff 本發(fā)明提供的非洲豬瘟病毒VP73基因的原核表達(dá)蛋白及其制備方法，其步驟如
1.人工合成VP73基因序列；
2.將VP73基因定向克隆至pET3h原核表達(dá)載體；
3.VP73基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)；
將重組表達(dá)載體pET3h-VP73轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)，進(jìn)行表達(dá)。
4.VP73基因表達(dá)蛋白的親和層析純化，主要包括
(1)將E. coli BL21/pET32aVP73轉(zhuǎn)化子的過夜培養(yǎng)物，以接種量，轉(zhuǎn)接至新鮮 配制的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液體培養(yǎng)基200ml，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)。
(2)待其 OD600 達(dá)至Ij 0. 8-1. 0，加入 IPTG 至終濃度 0. 2mmol/L,轉(zhuǎn)移至 30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)4h，12000rpm, 4°C，3min離心收集菌體。(3)將得到的菌體重懸于100ml PBS中，冰上放置30min，超聲裂解破碎細(xì)胞 (360W, 30 %，5min重復(fù)5次)，4°C，12000rpm離心15min,棄上清，得包涵體沉淀。(4)將包涵體沉淀分別用含 2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea 的 PBS 洗 滌，離心，去上清。然后將包涵體溶解于40ml結(jié)合緩沖液中(0. 6mol/L NaCl,0. 05mol/L NaH2PO4, IOmM 咪唑，8mol/L Urea, pH 8. 0)。(5)包涵體溶解后，4°C，12000rpm離心15min，取上清，與His-Bind(結(jié)合緩沖液預(yù) 先平衡)樹脂結(jié)合1. 5h，用4體積分別含40，60，80，120，150, 200, 250mmol/L咪唑的漂洗、 洗脫緩沖液(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/LNaH2PO4,8mol/LUrea, pH 8. 0)漂洗、洗脫蛋白，收集 漂洗液和洗脫液，12% SDS-PAGE電泳檢測和Western blot鑒定。5、表達(dá)產(chǎn)物的flfestern-blot鑒定(I)SDS-PAGE 將制備好的蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電壓80V， 40min后調(diào)為180V直到電泳結(jié)束(整個過程在冰上進(jìn)行)。(2)轉(zhuǎn)膜采用半干轉(zhuǎn)膜儀10V，40min轉(zhuǎn)至PVDF膜上。(3)封閉電轉(zhuǎn)后的膜，靠近膠面的膜面朝上，加入封閉液，4°C搖床緩慢搖動過 夜。(4)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(5) 一抗孵育將非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用BSA倍比稀釋(1 3000), 搖床搖動Ih。(6)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(7) 二抗孵育將堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗豬二抗用BSA倍比稀釋(1 5000)，搖 床搖動Ih。(8)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(9)顯色30mll XAP反應(yīng)緩沖液buffer，BCIP.NBT各一管混勻，室溫暗處緩慢搖
動顯色。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于鑒別非洲豬瘟病毒抗體的間接-ELISA。本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在1、由于該檢測抗原是非洲豬瘟VP73基因片段原核表達(dá)蛋白，并非全病毒，因此應(yīng) 用該抗原進(jìn)行檢測時絕無散毒危險。2、作為ELISA檢測的抗原檢測非洲豬瘟病毒抗體，其檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，與 豬瘟、豬細(xì)小、豬圓環(huán)、豬藍(lán)耳、豬流感和豬偽狂犬等病毒血清無交叉反應(yīng)。。


圖ITrx蛋白和Trx_VP73融合蛋白的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖譜圖2Trx蛋白和Trx_VP73融合蛋白的Western blot鑒定圖譜下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖1為SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖譜，其中泳道1為泳道純化的Trx蛋白；2為蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為94. OkDa, 66. 2kDa, 45. OkDa, 35. OkDa, 28. 5kDa, 20. OkDa, 14. 4kDa ；泳道3為融合蛋白Trx_VP73。
圖2為Trx蛋白和I~rX-VP73融合蛋白的Wfestern blot鑒定圖譜，其中泳道1為 純化的Trx蛋白；2為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為100kDa，62kDa，40kDa，30kDa， 24kDa, 14KDa ；泳道 3 為融合蛋白 χ_νΡ73。
具體實施例方式本發(fā)明提供的一種非洲豬瘟病毒VP73基因的原核表達(dá)蛋白及其制備方法的具體 實施方式如下1.人工合成VP73基因序列；2.將VP73基因定向克隆至pET3h原核表達(dá)載體；3. VP73基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)；將重組表達(dá)載體pET3h_VP73轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)，進(jìn)行表達(dá)。4. VP73基因表達(dá)蛋白的親和層析純化，主要包括(1)將E. coli BL21/pET32aVP73轉(zhuǎn)化子的過夜培養(yǎng)物，以接種量，轉(zhuǎn)接至新鮮 配制的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液體培養(yǎng)基200ml，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)。(2)待其 OD6tltl 達(dá)到 0. 8-1. 0，加入 IPTG 至終濃度 0. 2mmol/L,轉(zhuǎn)移至 30°C，250rpm 振蕩培養(yǎng)4h，12000rpm, 4°C，3min離心收集菌體。(3)將得到的菌體重懸于100ml PBS中，冰上放置30min，超聲裂解破碎細(xì)胞 (360W, 30 %，5min重復(fù)5次)，4°C，12000rpm離心15min,棄上清，得包涵體沉淀。(4)將包涵體沉淀分別用含 2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea 的 PBS洗滌， 離心，去上清。然后將包涵體溶解于40ml結(jié)合緩沖液中(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/LNaH2PO4, IOmM 咪唑，8mol/L Urea, pH 8. 0)。(5)包涵體溶解后，4°C，12000rpm離心15min，取上清，與His-Bind(結(jié)合緩沖液預(yù) 先平衡)樹脂結(jié)合1. 5h，用4體積分別含40，60，80，120，150, 200, 250mmol/L咪唑的漂洗、 洗脫緩沖液(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/L NaH2PO4,8mol/L Urea, pH 8.0)漂洗、洗脫蛋白，收 集漂洗液和洗脫液，12% SDS-PAGE電泳檢測和非洲豬瘟陽性血清Western blot鑒定。5、表達(dá)產(chǎn)物的flfestern-blot鑒定(I)SDS-PAGE 將制備好的蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電壓80V， 40min后調(diào)為180V直到電泳結(jié)束(整個過程在冰上進(jìn)行)。(2)轉(zhuǎn)膜采用半干轉(zhuǎn)膜儀10V，40min轉(zhuǎn)至PVDF膜上。(3)封閉電轉(zhuǎn)后的膜，靠近膠面的膜面朝上，加入封閉液，4°C搖床緩慢搖動過 夜。(4)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(5) 一抗孵育將非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用BSA倍比稀釋(1 3000), 搖床搖動Ih。(6)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(7) 二抗孵育將堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗豬二抗用BSA倍比稀釋(1 5000)，搖 床搖動Ih。(8)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(9)顯色30mll XAP反應(yīng)緩沖液buffer，BCIP.NBT各一管混勻，室溫暗處緩慢搖動顯色。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所<120> 一種非洲豬瘟病毒VP73基因的原核表達(dá)蛋白技其制備方法<160>1<210>1<211>1188<212>DNA<213> 非洲豬瘟病毒(African swine fever virus)<400>1
0108]atggcatccggaggagctttttgtttgattgctaacgatggaaaggccgacaagattatc600109]ttggcccaagacttgttgaactctagaatttctaacattaaaaatgtcaacaaatcctat1200110]ggtaaaccagacccagaaccaactttgtcccaaatcgaagaaacacatttggttcatttc1800111]aatgctcattttaagccttatgttccagttggattcgaatacaataaggttagacctcat2400112]accggtaccccaaccttgggaaacaaattgacctttggtattccacagtacggagacttt3000113]ttccatgatatggtcggacaccatatcttgggtgcatgtcattcttcctggcaggatgct3600114]cctattcagggtaccgcccagatgggtgcccatggtcagttgcaaacctttcctagaaac4200115]ggatatgactgggacaaccaaacacctttggagggtgccgtttacaccttggttgatcca4800116]ttcggaagacctattgttccaggaacaaagaatgcttacagaaacttggtttactactgc5400117]gaatacccaggagaaagattgtatgaaaacgttagattcgatgttaatggaaattccttg6000118]gacgaatattcctctgatgtcacaaccttggtcagaaaattttgcatcccaggagataaa6600119]atgactggatataagcacttggtcggtcaggaggtttctgtcgagggaacttccggacct7200120]ttgttgtgcaacattcatgatttgcacaagcctcaccaatctaaacctattttgaccgat7800121]gaaaatgatacccagagaacctgctctcataccaaccctaaattcttgtcccaacatttt8400122]ccagagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctattaccgac9000123]gcaacctatttggacatcagaagaaatgttcattactcttgtaatggacctcaaacccct9600124]aaatactatcagccacctttggctttgtggattaagttgagattttggttcaacgagaac10200125]gtcaacttggctattccatctgtttccattccattcggtg agagattcatcaccatcaaa10800126]ttggcatctcaaaaggatttggtcaatgaatttcctggattgttcatcag acagtctaga11400127]ttcatccctggaagaccatccagaagaaatatcagattca aaccatgg1188
權(quán)利要求
1.一種非洲豬瘟病毒VP73基因的原核表達(dá)蛋白，其特征是該重組表達(dá)蛋白為硫氧還 蛋白與非洲豬瘟病毒VP73基因編碼的融合蛋白，其中非洲豬瘟病毒VP73基因的核苷酸序 列為1 ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC 61 TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT 121 GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC 181 AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT 241 ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT 301 TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT 361 CCTATTCAGGGTACCGCCCAGATGGGTGCCCATGGTCAGTTGCAAACCTTTCCTAGAAAC 421 GGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTGGAGGGTGCCGTTTACACCTTGGTTGATCCA 481 TTCGGAAGACCTATTGTTCCAGGAACAAAGAATGCTTACAGAAACTTGGTTTACTACTGC 541 GAATACCCAGGAGAAAGATTGTATGAAAACGTTAGATTCGATGTTAATGGAAATTCCTTG 601 GACGAATATTCCTCTGATGTCACAACCTTGGTCAGAAAATTTTGCATCCCAGGAGATAAA 661 ATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGTCAGGAGGTTTCTGTCGAGGGAACTTCCGGACCT 721 TTGTTGTGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCTCACCAATCTAAACCTATTTTGACCGAT 781 GAAAATGATACCCAGAGAACCTGCTCTCATACCAACCCTAAATTCTTGTCCCAACATTTT 841 CCAGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACCGAC 901 GCAACCTATTTGGACATCAGAAGAAATGTTCATTACTCTTGTAATGGACCTCAAACCCCT 961 AAATACTATCAGCCACCTTTGGCTTTGTGGATTAAGTTGAGATTTTGGTTCAACGAGAAC 1021 GTCAACTTGGCTATTCCATCTGTTTCCATTCCATTCGGTGAGAGATTCATCACCATCAAA 1081 TTGGCATCTCAAAAGGATTTGGTCAATGAATTTCCTGGATTGTTCATCAGACAGTCTAGA 1141 TTCATCCCTGGAAGACCATCCAGAAGAAATATCAGATTCAAACCATGG
2.一種制備權(quán)利要求1所述的硫氧還蛋白與非洲豬瘟病毒VP73基因編碼的融合蛋白 的方法，其特征是(1)人工合成VP73基因序列；(2)將VP73基因定向克隆至pET3h原核表達(dá)載體；(3)VP73基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)；將重組表達(dá)載體pET3h-VP73轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21 (DE3) 7809，進(jìn)行表達(dá)。(4)VP73基因表達(dá)蛋白的親和層析純化，主要包括a.將E.coli BL21/pET32aVP73轉(zhuǎn)化子的過夜培養(yǎng)物，以1 %接種量，轉(zhuǎn)接至新鮮配制 的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液體培養(yǎng)基200ml，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)。b.待其OD600達(dá)到0.8-1. 0，加入IPTG至終濃度0. 2mmol/L,轉(zhuǎn)移至30°C，250rpm振蕩 培養(yǎng)4h, 12000rpm, 4°C，3min離心收集菌體。c.將得到的菌體重懸于100mlPBS中，冰上放置30min，超聲裂解破碎細(xì)胞(360W， 30 %，5min重復(fù)5次)，4°C，12000rpm離心15min,棄上清，得包涵體沉淀。d.將包涵體沉淀分別用含2mol/LUrea,4mol/L Urea,6mol/L toea的PBS洗滌，離心， 去上清。然后將包涵體溶解于40ml結(jié)合緩沖液中(0. 6mol/LNaCl，0. 05mol/LNaH2P04，10mM 咪唑，8mol/L Urea, pH8. 0)。e.包涵體溶解后，4°C，12000rpm離心15min，取上清，與His-Bind (結(jié)合緩沖液預(yù)先平 衡)樹脂結(jié)合1. 5h，用4體積分別含40，60，80，120，150, 200, 250mmol/L咪唑的漂洗、洗脫 緩沖液(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/LNaH2PO4,8mol/L Urea, ρΗ8· 0)漂洗、洗脫蛋白，收集漂洗 液和洗脫液。12% SDS-PAGE電泳檢測后，收集目的蛋白即為純化蛋白。 (5)表達(dá)產(chǎn)物的flfestern-blot鑒定，主要包括a.SDS-PAGE 將制備好的蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電壓80V，40min 后調(diào)為180V直到電泳結(jié)束(整個過程在冰上進(jìn)行)。b.轉(zhuǎn)膜采用半干轉(zhuǎn)膜儀10V，40min轉(zhuǎn)至PVDF膜上。c.封閉電轉(zhuǎn)后的膜，靠近膠面的膜面朝上，加入封閉液，4°C搖床緩慢搖動過夜。d.洗膜TTBS洗膜4次，每次lOmin。e.一抗孵育將非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用BSA倍比稀釋(1 3000)，搖床 搖動Ih。f.洗膜=TTBS洗膜4次，每次IOmin0g.二抗孵育將堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗豬二抗用BSA倍比稀釋(1 5000)，搖床搖 動Ih0h.洗膜=TTBS洗膜4次，每次IOmin0i.顯色30mllXAP反應(yīng)緩沖液buffer，BCIP、NBT各一管混勻，室溫暗處緩慢搖動顯色。結(jié)果，純化后的Trx_VP73融合蛋白與非洲豬瘟病毒陽性血清有特異性反應(yīng)條帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的制備方法，具體地說是一種鑒定非洲豬瘟病毒抗體的VP73基因序列原核表達(dá)蛋白抗原及其制備方法。根據(jù)GenBank中非洲豬瘟病毒(ASFV)VP73基因序列，人工合成的VP73基因全長序列，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-VP73，測序驗證后轉(zhuǎn)化原核表達(dá)受體菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組融合蛋白分子量約65KD。經(jīng)鎳柱親和層析純化的蛋白能與ASFV陽性血清發(fā)生特異性的免疫印跡反應(yīng)并且與豬瘟、豬細(xì)小、豬圓環(huán)、豬藍(lán)耳、豬流感和豬偽狂犬等病毒血清無交叉反應(yīng)。實驗表明，表達(dá)的蛋白具有檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，應(yīng)用該抗原進(jìn)行檢測時絕無散毒危險，可作為鑒定非洲豬瘟病毒抗體的ELISA方法的檢測抗原。
文檔編號C07K19/00GK102101889SQ20091025059
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者李秋霞, 楊雅麟, 滕達(dá), 王建華, 田子罡 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所