專利名稱：一種多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的非病毒基因載體，具體地講是一種多苯并咪唑金屬配合物
非病毒基因載體及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì) 胞，以糾正基因缺陷從而達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委煹年P(guān)鍵是獲得安全、有效的進(jìn)行基 因轉(zhuǎn)染的載體?；蛑委煹妮d體一般分為病毒型和非病毒型，前者轉(zhuǎn)染效率較高，但存在導(dǎo) 向性差、攜帶能力低、具免疫原性和潛在致癌性等缺點(diǎn)；后者則具有低毒性、低免疫原性、低 致癌性、易制備等優(yōu)點(diǎn)因此近年來備受關(guān)注。 非病毒基因釋放的載體包括陽離子脂類、金屬配合物、聚合物(如聚-L-賴氨酸 和聚胺等)、樹狀物(端基主要為胺基)、多肽(肽核酸)、納米粒子(如量子點(diǎn)和碳納米管 等)和環(huán)糊精衍生物等，這些化合物具有低毒性、攜帶基因能力高、低免疫原性、低致癌性、 易制備等優(yōu)點(diǎn)。研究表明大多數(shù)陽離子基因載體均能通過其帶正電基團(tuán)與DNA的帶負(fù)電 荷磷酸基發(fā)生靜電作用，從而減弱DNA鏈上磷酸根負(fù)電荷之間的排斥作用，導(dǎo)致DNA彎曲、 凝聚(壓縮)，甚至使DNA被包裹。這些化合物的不足之處主要是(l)由于受到細(xì)胞內(nèi)外 屏障的阻礙，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低；(2)由于載體-DNA復(fù)合物是通過靜電作用與生物膜結(jié)合， 故不能轉(zhuǎn)染膜表面含大量蛋白多糖的不帶負(fù)電荷的細(xì)胞系；(3)由于載體的細(xì)胞毒性通常 與其正電荷密度成正比，表面帶過多正電荷的載體-DNA復(fù)合物易與血清白蛋白等血液組 分相互作用，從而不利于靶細(xì)胞吸收。然而，非病毒基因載體優(yōu)良的生物兼容性、對(duì)基因的 大小基本沒有限制和可大劑量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，使其在基因治療中具有強(qiáng)大的吸引力和潛在的 應(yīng)用價(jià)值。研究者盡管設(shè)計(jì)合成了大量可驅(qū)動(dòng)DNA凝聚的陽離子化合物，且在一定程度上 能克服基因治療中的體內(nèi)、體外障礙，但金屬配合物作為一類潛在有效的基因載體，卻一直 沒有得到重視。 與其它陽離子化合物相比，多苯并咪唑金屬配合物具有水溶性好、結(jié)構(gòu)多樣化、正 電荷密度合理、制備容易等特點(diǎn)，故是一類潛力巨大的基因載體。由于這類配合物分子中具 有較多電中性苯并咪唑基團(tuán)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境具有顯著的緩沖作用，這樣由多種驅(qū)動(dòng) 力共同作用(包括靜電作用以及金屬配合物與DNA分子間堿基對(duì)的插入作用)誘導(dǎo)的DNA 凝聚體不會(huì)因?yàn)橄♂尰蚺c其他陰離子物種相互作用而解離，并且聚集體表面也不會(huì)積聚過 高的正電荷，有助于減弱與血液中帶負(fù)電物種間的相互作用，從而更加有利于凝聚體進(jìn)入 細(xì)胞核并被細(xì)胞吸收。申請(qǐng)人在工作中發(fā)現(xiàn)，驅(qū)動(dòng)DNA凝聚的作用力包括靜電作用和配合 物與DNA堿基對(duì)間的插入作用。這是首次發(fā)現(xiàn)以多苯并咪唑?yàn)橹髋潴w的多核金屬配合物對(duì) DNA凝聚具有顯著促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在提供一種多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體及其制備與應(yīng) 用，該類金屬配合物具有較好的水溶性、結(jié)構(gòu)多樣性和合理的正電荷密度等特點(diǎn)，而且容易 制備，故是一類潛力巨大的基因載體。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括 —種非病毒基因載體，它是以多苯并咪唑?yàn)榕潴w的多核金屬配合物，具體是由1， 1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二 乙基三胺、N，N，N'，N'-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、&&『，『-四 (2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺、N，N-二 (2-苯并咪唑甲基)亞胺或者三(2-苯并咪唑 基甲基)胺為主配體，以苯環(huán)或脂肪鏈多元羧酸為橋連配體，以H20、Cr、N(V、Ac—或C1(V為 輔助配體或抗衡陰離子，合成的同多核或雜多核Mg2+、 Ca2+、 Zn2+、 Cu2+、 Co2+/3+、 Mn2+、 Fe2+/3+或 Ni2+金屬離子的配合物。 其中，所述的配體l，l，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)的
合成，由三乙四胺六乙酸與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比i : 4 i : s，優(yōu)選i : e，以乙二醇
為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至120°C 倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入適量無水乙醇，靜置過夜；過 濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗 滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。 所述的配體1，1，4，7，7_五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)的合成(參 見圖1、圖2)，由二乙三胺五乙酸(DTPA)與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比1 : 5，以乙二醇為溶 劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入 燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅 褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到 白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。 所述的配體N，N，N'，N'-四(2-苯并咪唑甲基)-l，10-二氮-4，7-二氧癸烷(EGTB) 的合成，由乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比1 : 2 1 : 6，優(yōu)選1 : 4，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出 為止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入 無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到 白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
所述的配體N， N， N'， N'-四(2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺(EDTB)的合成， 由乙二胺四乙酸(EGTA)和鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比l : 2 1 : 6，優(yōu)選1 : 4，以乙二醇 為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至120°C 倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得 到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌， 得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。 所述的配體三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)的合成，由胺基三乙酸(NTA)與鄰
苯二胺按物質(zhì)的量之比i : i i : 5，優(yōu)選i : 3，以乙二醇為溶劑，160 18(rc共熱縮
合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn) 品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶 體目的產(chǎn)品。 所述的配體N，N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亞胺(IDB)的合成，由亞胺基二乙酸與
鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比i : i i : 3，優(yōu)選i : 2，以乙二醇為溶劑，160 lscrc共熱
縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加 入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗 產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色 晶體目的產(chǎn)品。 本發(fā)明的非病毒基因載體的制備方法，其特征是，以1， 1，4， 7， 10， 10-六(2-苯并 咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)、 N， N， N' ， N'-四-(2-苯并咪唑甲基)-1 ， 10- 二氮-4， 7- 二氧癸烷(EGTB) 、 N， N， N' ， N'-四 (2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺(EDTB)、或者N，N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亞胺(IDB) 為配體的金屬配合物的合成將配體溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金屬離子的可溶 性鹽，配體和金屬鹽的摩爾比為1 : 0. 5 1 : 4，60 9(TC反應(yīng)1 4小時(shí)，然后過濾、干 燥得到產(chǎn)品，用自然揮發(fā)或擴(kuò)散法得到多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體晶體。
以三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)為配體的金屬配合物的合成，合成步驟為
步驟1 、配合物[Cu (NTB) (H20) ] (C104) 2 5. 2 (H20)的合成: 將4mL CuCl2 *2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB (0. 02mol)乙醇溶液 中，攪拌，水浴加熱30 9(TC，反應(yīng)半個(gè)小時(shí)后，加入10mlNaC104(0 . 04mmol)水溶液，繼續(xù) 使反應(yīng)進(jìn)行2 6個(gè)小時(shí)，冷卻靜置，過夜，有淺綠色晶體析出，過濾，洗滌，真空干燥得到淺 黃綠色片狀固體，即為目的配合物； 步驟2、將步驟1得到的配合物和所述金屬離子的可溶性鹽按摩爾比1 : 0.5 1 : 4加入蒸餾水中，然后在每一種配體和金屬離子的溶液中再分別加入苯甲酸鈉、4， 4'-聯(lián)吡啶、對(duì)苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、煙酸、異煙酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二 酸或已二酸橋連配體，橋連配體和金屬鹽的摩爾比為1 : 0.5 1 : 5，調(diào)節(jié)溶液pH 4.0 9.0，將混合溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中并封閉在80 18(TC反應(yīng)36 80h，然后以 5°C /h的速率降低反應(yīng)溫度至室溫，在混合液中得到適于X-射線單晶衍射的多苯并咪唑金 屬配合物非病毒基因載體晶體。 本發(fā)明的非病毒基因載體的應(yīng)用，其特征是，用于誘導(dǎo)DNA凝聚形成凝聚體。該載 體和DNA形成的凝聚體，用于細(xì)胞核的轉(zhuǎn)染染色。


圖1 、配體DTPB合成路線。 圖2、配體DTPB配體分子結(jié)構(gòu)圖。 圖3、配合物[Cu2(DTPB)Cl2]Cl2 5H20 2(^3011分子結(jié)構(gòu)圖。 圖4、用ctDNA滴定配合物[Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H的紫夕卜_可見光譜圖。 測(cè)試方法不同濃度的ctDNA在20mM Tris-HCl (pH7. 4)的緩沖體系中滴定濃度為M的配合物，37t:下反應(yīng)相同時(shí)間，掃描測(cè)定體系在200 450nm的吸收值，采用雙通道 方法，用相應(yīng)濃度的ctDNA樣品作為空白，測(cè)定紫外吸收光譜。
圖5、配合物[Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H與入DNA凝聚體電鏡圖。
測(cè)試方法濃度為2 50 ii M的配合物與A DNA在20mM Tris-HCl (pH7. 4)的緩 沖體系中，37°C反應(yīng)不同的時(shí)間，然后取5 L的樣品，滴加于銅網(wǎng)上，自然干燥，用Tecnai G220透射電鏡在175kV觀察(未染色)，單獨(dú)DNA體系作為對(duì)照一并進(jìn)行。圖5中圖a、b、 c、 d依次表示的是5. 6iiMADNA和10iiM配合物分別反應(yīng)30min、30min、60min、 120min形 成凝聚體的形貌。 圖6、配合物[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20與入DNA凝聚體在細(xì)胞中的 定位。 測(cè)試方法5 ii M的配合物和5 ii M的A DNA反應(yīng)30min后與細(xì)胞共培養(yǎng)，然后加入 熒光染料DAPI和Greenview分別對(duì)對(duì)細(xì)胞核和凝聚體進(jìn)行標(biāo)記，然后通過倒置熒光顯微鏡 觀察凝聚體在細(xì)胞中的定位。圖六中箭頭所指黃色部分為凝聚體在細(xì)胞核內(nèi)的定位，綠色 部分為整個(gè)細(xì)胞核。 圖7、配合物1、2、3、4與A DNA凝聚體的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
其中，配合物1為[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20，
配合物2為[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20，
配合物3為[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20， 配合物4為[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20。 測(cè)試方法不同濃度的配合物和A DNA反應(yīng)30min后與細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)凝
聚體的細(xì)胞毒性。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞
數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。 圖8、單獨(dú)配合物1、2、3、4的細(xì)胞毒性 其中，配合物1為[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20， 配合物2為[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20， 配合物3為[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20， 配合物4為[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20的細(xì)胞毒性。
圖9、配合物1、2、3、4與質(zhì)粒pGL3-Control Vector凝聚體的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
配合物1為[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20，
配合物2為[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20，
配合物3為[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20、 配合物4為[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20。 測(cè)試方法不同濃度的配合物和質(zhì)粒pGL3-Control Vector反應(yīng)30min后和細(xì)胞 共培養(yǎng)，通過熒光素酶檢測(cè)法分析配合物種類及配合物濃度對(duì)pGL3-Contro1 Vector質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染效率的影響。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 [Mn2 (TTHB) Cl2] Cl2 □ 2/3C2H50H □ 4H20的合成
稱取提純后的TTHB (0. 5mmo1)粉末溶解于20mL乙醇中，然后加入含有 MnCl2 2H20(1. 5mmo1)乙醇溶液，控溫75。C攪拌反應(yīng)5h，冷卻、過濾，得到澄清的無色溶液；
將溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出的方形單晶即為目的物。
實(shí)施例2 [Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H的合成 稱取提純后的DTPB(O. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 CuCl2 '2H20(lmmo1)甲醇溶液，控溫6(TC攪拌反應(yīng)2h，冷卻、過濾，得到澄清的綠色溶液；將
溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出的方形單晶即為目的物(參見圖3)。
實(shí)施例3 [Cu2 (EGTB) (H20) 2] (C104) 4的合成稱取提純后的EGTB (0. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 Cu (C104)2 *6H20(lmmol)的甲醇溶液，控溫6(TC攪拌反應(yīng)2h，冷卻、過濾，得到綠色的粉末與 綠色溶液；將溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出的塊狀單晶即為目的物。
實(shí)施例4 Cu (EDTB) (C104) 2 CH30H的合成 稱取提純后的EDTB(lmmol)粉末溶解于2mL乙二醇中，然后加入含有 (Cu(C104)2 6H20) (lmmol)的10mL水溶液中，控溫60。C攪拌反應(yīng)2h，冷卻、過濾，得到綠色
的粉末與綠色溶液；將溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出的塊狀單晶即為目的物。
實(shí)施例5 [Cu(IDB)Cl2] CH30H的合成 稱取提純后的IDB(O. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 CuCl2 '2H20(lmmo1)甲醇溶液，控溫6(TC攪拌反應(yīng)2h，冷卻、過濾，得到澄清的綠色溶液；將
溶液靜置于室溫下數(shù)周后析出的方形單晶即為目的物。
實(shí)施例6 由芳香羧酸橋連的銅的NTB配合物 步驟1 、 [Cu (NTB) (H20) ] (C104) 2 5H20的合成 將4mL CuCl2 *2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB (0. 02mol)乙醇溶液 中，攪拌，水浴加熱6(TC，反應(yīng)半個(gè)小時(shí)后，加入10mLNaC104(0 . 04mmol)水溶液，繼續(xù)使反應(yīng) 進(jìn)行3個(gè)小時(shí)，冷卻靜置，過夜，有淺綠色晶體析出。過濾，依次用少量乙醇，乙醚，洗滌，真 空干燥得到淺黃綠色片狀固體即為目的物。 步驟2、 [Cu (NTB) (PhCOO) ] C104的合成(PhCOO代表苯甲酸) 將步驟1得到的化合物(0. 2mmo1)加入到15mL蒸餾水中，然后加入lmL苯甲酸鈉 (0. 2mmo1)水溶液，并調(diào)節(jié)溶液pH7. 2，將混合好的溶液轉(zhuǎn)移到25mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中并 封閉在120°C反應(yīng)72h，然后以5°C /h的速率降低反應(yīng)溫度至室溫，濾液中得到適于X-射線
單晶衍射的黃綠色塊狀晶體，手工分離出晶體即為目的物。
實(shí)施例7 由脂肪羧酸橋連的銅的NTB配合物 {[Cu (NTB) ] 2 (ii -f麗)} (C104) 2 8 (H20)的合成(f麗代表反丁烯二酸根)
將實(shí)施例6步驟1得到的化合物(0. 2mmo1)加入到10mL蒸餾水中，然后加入5mL反丁烯二酸(0. lmmol)水溶液，并調(diào)節(jié)溶液pH值pH7. 2 ;將混合好的溶液轉(zhuǎn)移到25mL聚四 氟乙烯反應(yīng)釜中并封閉在12(TC反應(yīng)72h，然后以5°C /h的速率降低反應(yīng)溫度至室溫，濾液 中得到適于X-射線單晶衍射的藍(lán)色片狀晶體，手工分離出晶體即為目的物。
實(shí)施例8 透射電子顯微鏡(TEM)觀察DNA凝聚體形態(tài)在20mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液中，加入5. 6 ii DNA和2 50 ii M濃度的配合 物(Cu2(DTPB)Cl2]Cl2 5H20 2CH30H) ， 37。C反應(yīng)5min 2h不同時(shí)間。然后取5ii L樣品， 滴加于銅網(wǎng)上，自然干燥，用Tecnai G2 20透射電鏡在175kV觀察(未染色)，單獨(dú)DNA體 系作為對(duì)照一并進(jìn)行，結(jié)果見圖5。
實(shí)施例9 共聚焦顯微鏡觀察凝聚體跨膜實(shí)驗(yàn) 凝聚體制備實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)用D-Hank' s緩沖液中進(jìn)行，5iiM的ctDNA分別 與5iiM的配合物(Cu2(EGTB) (C104)2 (H20)2] (C104)2 6H20)于37。C反應(yīng)30min ;加入熒光 染料Greenview( —種可替代溴化乙錠的新型核酸染料)于37。C繼續(xù)反應(yīng)30min，實(shí)驗(yàn)中 61^6群1^用于雙鏈0脆凝聚體染色，4，6-二氨基-2-苯基噴哚(DAPI)用于細(xì)胞核染色。
細(xì)胞培養(yǎng)H印G2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清及雙抗(100U/mL青霉素、 100ii g/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，37t:、5X C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔一天更換 一次細(xì)胞培養(yǎng)液，每隔三天細(xì)胞傳代一次。培養(yǎng)一段時(shí)間后以合適的密度接種細(xì)胞至6孔 培養(yǎng)板進(jìn)行分組培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。分組情況為空白組 (加入無血清培養(yǎng)基50 ii L)、配合物系列組(各孔加入對(duì)應(yīng)樣品50 ii L)。
細(xì)胞樣后處理(1)加入藥物培養(yǎng)24h后，加入DAPI繼續(xù)培養(yǎng)20min ; (2)用磷酸 鹽緩沖液PBS (含有EDTA的磷酸鹽緩沖液稱取適量EDTA鈉鹽溶于pH為8. 3的0. 1M磷酸 鹽溶液中配成含有5mM EDTA的磷酸鹽緩沖液)洗滌細(xì)胞3次；(3)用0. 25%胰蛋白酶消化 細(xì)胞使其從培養(yǎng)板上脫落，即時(shí)制板于激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果參見圖6。
實(shí)施例10
凝聚體細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 ii L，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至 1000 10000孔，邊緣孔用無菌PBS填充。5% 0)2，371:孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔 平底板)，加入濃度梯度(5、10、20、40、75微摩爾/升)的藥物。5XC02，37。C孵育16 48 小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入20 ii L MTT溶液(5mg/ml，即0. 5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。 終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150iiL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié) 晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng) 基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜) 結(jié)果參見圖7、圖8。
實(shí)施例11 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凝聚體的轉(zhuǎn)染效率 采用上述圖9中所述的配合物1 : [Cii2(EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104)2 6H20， 配合物2 : [Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20， 配合物3 : [Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20，
配合物4 : [Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20， 在37°C，5% C02條件下，在含0. 5%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞H印G2，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶壁95%左右時(shí)，接種到96孔板在相同的條件下繼續(xù) 培養(yǎng)24h至細(xì)胞鋪滿率達(dá)90X。pGL3-Contro1 Vector質(zhì)粒分別與不同濃度的配合物反應(yīng)， 在室溫下于pH7. 4， 20mM Tris-HCl緩沖液中反應(yīng)30min。用180 y L不含血清DMEM培養(yǎng)基 置換培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，30min后，每孔加入20 L轉(zhuǎn)染溶液(質(zhì)粒-配合物凝聚體 溶液)，質(zhì)粒最終堿基對(duì)濃度為1. 5 M，配合物濃度依次為1、2、3、4、5 M，細(xì)胞在37°C ， 5% C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后每孔加入200 L含10%小牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基溶 液置換原來的培養(yǎng)液。細(xì)胞在37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。
熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)通過熒光素酶檢測(cè)法分析配合物種類及配合物濃度對(duì) pGL3-Control Vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的影響。吸凈培養(yǎng)基后，每孔細(xì)胞用100 y L PBS/ Triton裂解液裂解，然后加入100 y L螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑，混勻后在酶標(biāo)儀上設(shè)定激 發(fā)波長為338nm，最大發(fā)射波長為590nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果參見圖9。
權(quán)利要求
一種非病毒基因載體，其特征是它是以多苯并咪唑?yàn)榕潴w的多核金屬配合物，具體是由1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-二乙胺、N，N-二(2-苯并咪唑甲基)亞胺或者三(2-苯并咪唑基甲基)胺為主配體，以苯環(huán)或脂肪鏈多元羧酸為橋連配體，以H2O、Cl-、NO3-、Ac-或ClO4-為輔助配體或抗衡陰離子，合成的同多核或雜多核Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+/3+、Mn2+、Fe2+/3+或Ni2+金屬離子的配合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體1， 1，4， 7， 10， 10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺，由三乙四胺六乙酸與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比 1 : 4 1 : 8，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為 止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無 水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白 色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的三乙四胺六乙酸與鄰 苯二胺的物質(zhì)的量之比為1 : 6。
4. 如權(quán)利要求l所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體l，l，4，7，7-五 (2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺，由二乙三胺五乙酸與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比1 : 5， 以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷 卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過 夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用 丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體N， N， N'， N'-四 (2-苯并咪唑甲基)-1 ， 10- 二氮-4， 7- 二氧癸烷，由乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸與鄰 苯二胺按物質(zhì)的量之比l : 2 1 : 6，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)， 直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至 室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重 結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的乙二醇雙(2-氨基乙基 醚)四乙酸與鄰苯二胺的物質(zhì)的量之比為1 : 4。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體N， N， N'， N'-四 (2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺，由乙二胺四乙酸和鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比l : 2 1 : 6，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止滯合產(chǎn) 物冷卻至12(TC倒入燒杯，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置 過夜；過濾得到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物， 用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
8. 如權(quán)利要求7所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的乙二胺四乙酸和鄰苯 二胺的物質(zhì)的量之比為1 : 4。
9. 如權(quán)利要求l所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體三(2-苯并咪唑基甲基)胺，由胺基三乙酸與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比i : i i : 5，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至12(TC倒入燒 杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐 色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌，得到白 色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
10. 如權(quán)利要求9所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的胺基三乙酸與鄰苯二 胺的物質(zhì)的量之比為1 : 3。
11. 如權(quán)利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體N， N-二 (2-苯并咪唑甲基)亞胺，由亞胺基二乙酸與鄰苯二胺按物質(zhì)的量之比i : i i : 3，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時(shí)，直到無水蒸汽放出為止；縮合產(chǎn)物冷卻至120°C 倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得 到紅褐色粗產(chǎn)品，然后粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶2 3次得到白色固體產(chǎn)物，用丙酮洗滌， 得到白色固體粉末或無色晶體目的產(chǎn)品。
12. 如權(quán)利要求11所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的亞胺基二乙酸與鄰 苯二胺的物質(zhì)的量之比為1 : 2。
13. 權(quán)利要求l所述的一種非病毒基因載體的制備方法，其特征是，以1，1，4，7，10， 10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、 N，N，N'，N，-四-(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、&&^，『-四(2-苯 并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺，或者N， N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亞胺為配體的金屬配合 物的合成步驟將配體溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金屬離子的可溶性鹽，配體和金 屬鹽的摩爾比為l : 0. 5 1 : 4，60 90。C反應(yīng)l 4小時(shí)，然后過濾、干燥得到產(chǎn)品，用 自然揮發(fā)或擴(kuò)散法得到非病毒基因載體晶體。
14. 權(quán)利要求l所述的一種非病毒基因載體的制備方法，其特征是，以三(2-苯并咪唑 基甲基)胺為配體的金屬配合物的合成步驟為步驟1、配合物[Cu(NTB) (H20)] (C104)2 5. 2(H20)的合成:將4mL CuCl2 2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB(0. 02mol)乙醇溶液中， 攪拌，水浴加熱30 90°C ，反應(yīng)半個(gè)小時(shí)后，加入10mlNaC104 (0 . 04mmol)水溶液，繼續(xù)使反 應(yīng)進(jìn)行2 6個(gè)小時(shí)，冷卻靜置，過夜，有淺綠色晶體析出，過濾，洗滌，真空干燥得到淺黃綠 色片狀固體，即為目的配合物；步驟2、將步驟1得到的配合物和所述金屬離子的可溶性鹽按摩爾比1 : 0.5 1 : 4 加入蒸餾水中，然后在每一種配體和金屬離子的溶液中再分別加入苯甲酸鈉、4，4'-聯(lián)吡 啶、對(duì)苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、煙酸、異煙酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二酸或己 二酸橋連配體，橋連配體和金屬鹽的摩爾比為1 : 0. 5 1 : 5，調(diào)節(jié)溶液pH 4. 0 9. 0， 將混合溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中并封閉在80 18(TC反應(yīng)36 80h，然后以5°C / h的速率降低反應(yīng)溫度至室溫，在混合液中得到適于X-射線單晶衍射的非病毒基因載體晶 體。
15. 權(quán)利要求1所述的一種非病毒基因載體的應(yīng)用，其特征是用于誘導(dǎo)DNA凝聚形成凝 聚體。
16. 按權(quán)利要求15所述的一種非病毒基因載體的應(yīng)用，其特征是，該載體和DNA形成的 凝聚體，用于細(xì)胞核的轉(zhuǎn)染染色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非病毒基因載體的制備與應(yīng)用。該非病毒基因載體為多苯并咪唑金屬配合物。它是由多苯并咪唑TTHB、DTPB、EGTB、EDTB、IDB或者NTB為主配體，含苯環(huán)或脂肪鏈多元羧酸為橋連配體，H2O、Cl-、NO3-、Ac-或ClO4-為輔助配體或抗衡陰離子，合成和表征了大量含一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)相同及不同的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+/3+、Mn2+、Fe2+/3+或Ni2+金屬離子的配合物。該類配合物作為新型基因載體，具有合成方法簡(jiǎn)單高效、水溶性好、細(xì)胞毒性低和轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)。通過紫外-可見吸收光譜、光散射、透射電鏡等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這類配合物可有效誘導(dǎo)DNA凝聚；倒置熒光顯微鏡和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)多苯并咪唑金屬配合物作為載體釋放的基因可以有效地進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。
文檔編號(hào)C07F15/06GK101705245SQ20091027280
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者劉梁, 劉長林, 孟祥高, 張航, 殷俊, 胡思 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)