專利名稱：豬附紅細胞體抗原、抗體、樣品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫技術(shù)領(lǐng)域的抗原、抗體、樣品的制備方法，具體是一種豬附紅 細胞體雙抗夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)方法中抗原、抗體、樣品的制備方法。
背景技術(shù)：
附紅細胞體病(Eperythrozoonosis)是由附紅細胞體(hemoplasmas)寄生于紅細
胞表面、血漿及骨髓內(nèi)引起的以紅細胞壓積降低、血紅蛋白濃度下降、白細胞增多、貧血、黃
疸、發(fā)熱為主要臨床特征的人獸共患傳染病。由于該病分布范圍廣、多呈隱性感染、感染宿
主多，給人的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大的危害及公共衛(wèi)生問題。近年來國內(nèi)外醫(yī)學工
作者對附紅細胞體病進行了深入的研究，特別是上世紀八十年代以來，報道人及畜禽等附
紅細胞體病的爆發(fā)流行，越來越引起了國內(nèi)外學者對該病的高度重視。 目前附紅細胞體的檢測方法有顯微鏡檢測、血清學檢測、PCR檢測方法等。但目前
最常用的檢測方法是血液直接鏡檢或血涂片Giemsa染色；直接鏡檢以紅細胞變形作為附
紅細胞體感染的診斷依據(jù)特異性較差，因為附紅細胞體不是引起紅細胞變形的唯一原因，
人為因素、宿主感染了其他的病原都會對結(jié)果產(chǎn)生影響，容易出現(xiàn)假陽性。血涂片染色鏡檢
操作方便，準確性較鮮血直接鏡檢高，但檢測結(jié)果與操作者的經(jīng)驗密不可分。 經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Hoelzle等在《Haemotrophic mycoplasmas:
Recentadvances in Mycoplasma suis》中指出通過顯微技術(shù)檢測附紅細胞體特異性及敏感
性較差，而PCR等分子生物學方法操作步驟復(fù)雜，試劑及儀器要求較高，故需開發(fā)一種快速
高效的ELISA檢測技術(shù)具有重要意義。雙抗夾心ELISA方法主要用于檢測大分子抗原，具
有較高的敏感性和特異性，現(xiàn)有技術(shù)中，雙抗夾心ELISA的具體操作流程已經(jīng)標準化，應(yīng)用
該方法的關(guān)鍵在于制備相應(yīng)的包被抗體及待檢抗原，現(xiàn)有技術(shù)中，沒有披露有關(guān)應(yīng)用雙抗
夾心ELISA檢測附紅細胞體所需包被抗體及待檢抗原的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬附紅細胞體抗原、抗體、樣品
的制備方法。本發(fā)明提供了雙抗夾心ELISA檢測附紅細胞體所需包被抗體及待檢抗原、以
及所需檢測樣品的制備方法；本發(fā)明可方便地應(yīng)用雙抗夾心ELISA法檢測豬附紅細胞體。 本發(fā)明涉及一種豬附紅細胞體抗原的制備方法，包括如下步驟 步驟一，取感染附紅細胞體的豬血，用淋巴分離液去除血液中的白細胞、血小板及
細胞碎片，得紅細胞泥； 步驟二， PBS懸浮紅細胞泥，置于解離試劑中水浴，離心，取上清； 步驟三，濾膜過濾上清，得濾液，之后超速離心得沉淀，PBS重懸，裂解，離心得上
清，即豬附紅細胞體抗原。 步驟二中，所述解離試劑為所述解離試劑為加入了 Tween-20及EDTA的pH為 7. 4的PBS緩沖液，其中，Tween-20的最終體積分數(shù)為0. 15% ， EDTA的最終質(zhì)量體積百分數(shù)為3%。 步驟二中，所述水浴具體為5(TC水浴30min。 步驟二中，所述離心具體為1600rpm離心10min。 步驟三中，所述過濾具體為使用1. 2 ii m濾器過濾。 步驟三中，所述超速離心具體為12000rpm離心lh。 本發(fā)明還涉及一種豬附紅細胞體抗體的制備方法，包括如下步驟 步驟一，取豬附紅細胞體抗原，按常規(guī)方法免疫家兔和小鼠，得血清； 步驟二，將血清與健康豬血紅細胞泥混合，孵育，離心，取上清； 步驟三，采用硫酸銨鹽析法純化上清，得IgG抗體。 本發(fā)明還涉及一種豬附紅細胞體樣品的制備方法，包括如下步驟 步驟一，取待檢的豬血液，用淋巴分離液除去白細胞、血小板及細胞碎片，得紅細
胞泥； 步驟二，用預(yù)冷PBS洗滌紅細胞泥，生理鹽水懸浮，加Tris-Hcl裂解，超速離心，
PBS懸浮沉淀，得樣品。 步驟二中，所述PBS的pH為7. 4 。 步驟二中，所述裂解為fC下裂解lh。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明提供了雙抗夾心ELISA檢 測附紅細胞體所需包被抗體及待檢抗原、以及所需檢測樣品的制備方法；在本發(fā)明的基礎(chǔ) 上，可方便地應(yīng)用雙抗夾心ELISA法檢測豬附紅細胞體；采用雙抗夾心ELISA方法加強了 抗原抗體反應(yīng)的特異性，減少了假陽性結(jié)果，雙抗夾心ELISA方法具有較高的靈敏度，測得 抗原的最低檢出量為3.812ii g/ml，即最低檢出率下限為lml感染率O. 2%的血液樣品；同 時，本發(fā)明中的樣品制備方法可將全血樣品裂解離心后直接用于檢測，在大規(guī)模檢測時，省 去了提純附紅細胞體的繁瑣操作，能更快速有效地檢測附紅細胞體。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明
而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條
件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實施例1 豬附紅細胞體抗原的制備 步驟一，從感染附紅細胞體的巴馬小型豬無菌前腔靜脈采集ACD抗凝血，采用淋 巴細胞分離液(Axis-shield公司，挪威，型號為Lymphopr印TM)經(jīng)3000rpm離心20min分 離出抗凝血中的白細胞、血小板及細胞碎片等組分，然后收集紅細胞泥；
步驟二，用PBS懸浮，置于解離試劑中5(TC水浴中熱致敏30min，所述解離試劑為 加入了 Tween-20及EDTA的pH為7. 4的PBS緩沖液，其中，Tween-20的終濃度為0. 15% (V/V) ， EDTA的終濃度為3% (W/V) 。 1600rpm離心10min，收集上清液;其中，PBS配制過程 為8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HP04和0. 24g KH2P04，溶于800ml蒸餾水中，用HC1調(diào)節(jié) 溶液的PH值至7. 4，最后加蒸餾水定容至11，即得。
步驟三，經(jīng)1. 2 ii m濾器過濾后，濾液12000rpm離心lh，沉淀即為附紅細胞體，沉
淀經(jīng)PBS反復(fù)離心洗滌3次后去除殘余宿主血漿蛋白，加lml PBS重懸沉淀，超聲波裂解
lOmin，得裂解液；裂解液2000rpm離心10min ;取上清液用紫外分光光度計測定其蛋白含
量，-2(TC保存。 實施例2 豬附紅細胞體抗體的制備 步驟一，對鏡檢及PCR檢測陰性的家兔和小鼠采集抗凝血，fC過夜，2000rpm離心 5min，分離上清液作為陰性對照，-2(rC保存。 步驟二，按常規(guī)方法免疫家兔和小鼠(首免加入弗氏完全佐劑，二免加入弗氏不 完全佐劑)，最后一次免疫2周后心臟采血分離血清； 步驟三，將血清與健康豬血紅細胞泥37t:孵育lh，離心取上清(去除非特異性結(jié) 合蛋白)； 步驟四，將上清用硫酸銨鹽析法純化IgG抗體，-2(TC保存。 步驟五，間接ELISA法檢測抗體效價。用100 iil抗原(實施例1中的豬附紅細胞 體純化抗原，10. 2ii g/ml)包被96孔酶標板，設(shè)空白對照，4t:過夜；棄掉包被液，以PBST洗 滌液洗滌3次，每次3 5min ;每孔加入封閉液(1 %明膠)200 y 1， 37。C孵育lh后洗滌；將 待測抗體(步驟二中的兔源、鼠源抗體)與陰性抗體(步驟一中的兔源、鼠源陰性血清)分 別稀釋100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200倍，每孔分別加入100 ii 1 不同稀釋倍數(shù)的待測抗體，設(shè)相應(yīng)的陰性對照和空白對照，37t:反應(yīng)lh，洗滌；每孔加入 100 iil辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG，37t:作用lh，洗滌；每孔加底物TMB溶液100 yl， 室溫下閉光反應(yīng)10min。用酶標儀在波長450nm條件下測定各孔0D值。以測定孔0D值 (P)/陰性對照孔0D值(N) > 2. 1判為陽性，P/N < 1. 5為陰性。結(jié)果顯示鼠源抗體效價為 1 : 1600，比值為2. 667 ;兔源抗體效價為1 : 25600，比值為2. 550。
實施例3
豬附紅細胞體樣品的制備將lml感染附紅細胞體抗凝血樣經(jīng)2000rpm離心15min ;用lml生理鹽水將紅細 胞泥懸浮，加入等體積的淋巴細胞分離液3000rpm離心20min，棄上清和白細胞，將剩余的 紅細胞用預(yù)冷ra 7. 4PBS洗滌2次；生理鹽水懸浮后，加入3倍體積pH 7. 4的Tris-Hcl， 4。C作用lh裂解紅細胞。12000rpm離心lh，沉淀用100 yl pH 7. 4的PBS懸浮，4。C保存。
實施例4 (1)雙抗夾心ELISA操作程序 步驟一，用100iU捕獲抗體(實施例2得到的鼠源抗體)包被96孔酶標板，設(shè)陰 性對照和空白對照，4°C過夜； 步驟二，棄掉包被液，以洗滌液洗滌3次，每次3 5min ; 步驟三，每孔加入封閉液200 ii 1， 37t:孵育lh后洗滌； 步驟四，每孔加入100 iil抗原，37t:反應(yīng)lh，洗滌； 步驟五，每孔加入100 iil檢測抗體，37t:反應(yīng)lh，洗滌； 步驟六，每孔加入100 ii 1辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG， 37°CT lh，洗滌； 步驟七，每孔加底物溶液100 ii 1，室溫下閉光反應(yīng)10min ;
步驟八，每孔加入終止液50 ii 1終止反應(yīng)，用酶標儀在波長450nm條件下測定各孔0D值。P/N > 2. 1的樣品為陽性，1. 5《P/N《2. 1為可疑，P/N < 1. 5
為陰性。 (2)雙抗夾心ELISA反應(yīng)參數(shù)的確定 分別對捕獲抗體的稀釋倍數(shù)、包被時間、封閉條件、檢測抗體稀釋倍數(shù)、酶標二抗 的稀釋倍數(shù)、反應(yīng)時間、顯色時間等反應(yīng)條件進行優(yōu)化。(以鼠源抗體作為捕獲抗體，兔源抗 體作為檢測抗體)用包被液將鼠源抗體、陰性血清分別作50、100、200、400、800、1600、3200倍稀釋，
包被96孔酶標板，設(shè)空白對照，分別37t:下作用2h和4t:過夜。封閉；按陽性抗原i : ioo
稀釋；兔源抗體l : 100稀釋；酶標二抗1 : 4000稀釋進行雙抗夾心ELISA，每個稀釋倍數(shù) 及作用條件各做3個重復(fù)，取其平均值。當捕獲抗體l : 200稀釋，4t:包被過夜時，P/N值 為6. 298，最佳。 捕獲抗體按最佳條件包被酶標板，分別用1 %明膠溶液，5 %脫脂奶粉，2. 5 % BSA 作為封閉液，設(shè)空白對照，于37t:分別作用lh、2h，按陽性抗原1 : IOO稀釋；兔源抗體 1 : IOO稀釋；酶標二抗I : 4000稀釋進行雙抗夾心ELISA，每種封閉液及作用條件各做3 個重復(fù)，取其平均值。當1%明膠溶液37°〇封閉lh時，P/N值為2.642，最佳。
捕獲抗體按最佳條件及時間包被酶標板，最佳條件封閉，陽性抗原1 : 100稀釋， 兔源抗體、陰性血清分別作50 、 100 、 200 、 400 、 800 、 1600 、 3200倍稀釋，設(shè)空白對照，37 °C作 用lh，酶標二抗1 : 4000稀釋，進行雙抗夾心ELISA，每個稀釋倍數(shù)做3個重復(fù)，取其平均 值。當檢測抗體l : 400稀釋時，P/N值為7.071，最佳。 捕獲抗體按最佳條件包被酶標板，最佳條件封閉，陽性抗原1 : IOO稀釋，檢測抗 體按最佳條件稀釋，酶標二抗按2000、4000、8000、 16000倍稀釋，設(shè)空白對照，37。C作用lh， 進行雙抗夾心ELISA，每個稀釋倍數(shù)做3個重復(fù)，取其平均值。當酶標二抗l : 8000稀釋 時，P/N值為4. 484，最佳。 捕獲抗體按最佳條件包被酶標板，最佳條件封閉，陽性抗原l : IO稀釋，檢測抗體 按最佳條件稀釋，酶標二抗按最佳條件稀釋，分別室溫及37t:避光顯色10min，各做3個重 復(fù)，取其平均值。當37t:顯色10min時，P/N值為5.023，最佳。
(3)雙抗夾心ELISA檢測方法的評估
①敏感性實驗將陽性抗原作50、100、200、400、800、1600、3200、6400倍稀釋，按最佳條件進行雙 抗夾心ELISA，每個稀釋度做3個重復(fù)，分別測定其光密度值，取其平均值，P/N值大于2. 1 時陽性抗原最大稀釋倍數(shù)所對應(yīng)的抗原濃度即為抗原最低檢出量。結(jié)果表明當陽性抗原 3200倍稀釋(3.812iig/ml)時符合上述要求，所以抗原的最低檢出量為3.812yg/ml。
②特異性阻斷實驗 將陽性抗原分別與按最佳條件稀釋后的兔抗附紅細胞體及鼠抗附紅細胞體的陽 性、陰性血清混合，4t:過夜，37t:孵育lh后進行雙抗體夾心ELISA檢測，計算阻斷率。阻 斷率=(0DNeg-0DTest)/0DNegX100%。阻斷率小于30%為陰性，阻斷率在30% 40%之間 為可疑，大于40%為陽性。結(jié)果表明，陰性血清不能阻斷抗原的顯色反應(yīng)，而抗附紅細胞體 的鼠源、兔源陽性抗體可阻斷抗原的顯色反應(yīng)，且P/N值在1. 5以下，阻斷率分別為62%和69%，表明反應(yīng)具有特異性。
③交叉性實驗 附紅細胞體與健康小型豬血液中純化蛋白、大腸桿菌DH 5a、鏈球菌II型、傷寒沙門氏菌對照進行ELISA試驗，每種病原做3個重復(fù)。結(jié)果顯示只有附紅細胞體產(chǎn)生陽性反應(yīng)，而宿主蛋白、大腸桿菌DH 5a、鏈球菌II型、傷寒沙門氏菌呈陰性。表明抗體只與相應(yīng)的抗原反應(yīng)，具有特異性。
④重復(fù)性實驗 將附紅細胞體、步驟二、三處理后的陽性血樣和陰性血樣各5份按已建立的雙抗體夾心ELISA法重復(fù)檢測3次，發(fā)現(xiàn)光密度值波動很小(P > 0. 05)，差異不顯著，表明本法重復(fù)性很好。
權(quán)利要求
一種豬附紅細胞體抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取感染附紅細胞體的豬血，用淋巴分離液去除血液中的白細胞、血小板及細胞碎片，得紅細胞泥；步驟二，PBS懸浮紅細胞泥，置于解離試劑中水浴，離心，取上清；步驟三，濾膜過濾上清，得濾液，之后超速離心得沉淀，PBS重懸，裂解，離心得上清，即豬附紅細胞體抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細胞體抗原的制備方法，其特征是，步驟二中，所述解 離試劑為加入了 Tween-20及EDTA的pH為7. 4的PBS緩沖液，其中，Tween-20的最終體 積分數(shù)為0. 15%， EDTA的最終質(zhì)量體積百分數(shù)為3%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細胞體抗原的制備方法，其特征是 浴具體為50。C水浴30min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細胞體抗原的制備方法，其特征是 心具體為1600rpm離心10min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細胞體抗原的制備方法，其特征是 濾具體為使用1. 2 ii m濾器過濾。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細胞體抗原的制備方法，其特征是 速離心具體為12000rpm離心lh。
7. —種豬附紅細胞體抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，取豬附紅細胞體抗原，按常規(guī)方法免疫家兔和小鼠，得血清 步驟二，將血清與健康豬血紅細胞泥混合，孵育，離心，取上清； 步驟三，采用硫酸銨鹽析法純化上清，得IgG抗體。
8. —種豬附紅細胞體樣品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，取待檢的豬血液，用淋巴分離液除去白細胞、血小板及細胞碎片，得紅細胞泥；步驟二，用預(yù)冷PBS洗滌紅細胞泥，生理鹽水懸浮，加Tris-Hcl裂解，超速離心，PBS懸 浮沉淀，得樣品。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的豬附紅細胞體樣品的制備方法，其特征是，步驟二中，所述 PBS的pH為7. 4。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的豬附紅細胞體樣品的制備方法，其特征是，步驟二中，所述 裂解為4t:下裂解lh。，步驟二中，所述水 ，步驟二中，所述離 ，步驟三中，所述過 ，步驟三中，所述超
全文摘要
一種免疫技術(shù)領(lǐng)域的豬附紅細胞體抗原、抗體、樣品的制備方法，其中，抗原的制備方法，包括如下步驟取感染附紅細胞體的豬血，制備紅細胞泥；PBS懸浮紅細胞泥，水浴，離心，取上清；濾膜過濾上清，得濾液，之后超速離心得沉淀，PBS重懸，裂解，離心得上清，即豬附紅細胞體抗原；抗體的制備方法，包括如下步驟取豬附紅細胞體抗原，制備血清；將血清與健康豬血紅細胞泥混合，孵育，離心，取上清，純化上清，得IgG抗體；樣品的制備方法，包括如下步驟取待檢的豬血液，制備得紅細胞泥；用預(yù)冷PBS洗滌紅細胞泥，生理鹽水懸浮，加Tris-Hcl裂解，超速離心，PBS懸浮沉淀，得樣品。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可方便地應(yīng)用雙抗夾心ELISA法檢測豬附紅細胞體。
文檔編號C07K1/14GK101701033SQ200910309580
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日
發(fā)明者華修國, 崔立, 朱凝瑜, 楊志彪, 楊筱薇, 袁聰俐 申請人:上海交通大學