專利名稱：一種高純度光甘草定的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從豆科植物光甘草中分離純化光甘草定的方法，屬于植物中單體 活性成分的分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘草屬光果甘草(洋甘草)Glycyrrhiza glabra L.主產(chǎn)于我國(guó)東北，華北、西北 各省區(qū)，生于河岸階地，溝邊、田邊、路旁，歐洲、地中海區(qū)域、哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦、土 庫(kù)曼斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、俄羅斯西伯利亞地區(qū)以及蒙古亦產(chǎn)。光甘草中的黃 酮類化合物除了有明顯的抗?jié)?、抗菌消炎、降血脂外，還有明顯的清除自由基和抗氧化作 用，其中 光甘草定(Glabridin)是光果甘草中的主要黃酮類成分之一，其分子式為C2tlH2tlO4, 分子量為324. 3704，結(jié)構(gòu)式如式I所示。光甘草定既能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多 巴色素互變酶和DHICA氧化酶的活性，在細(xì)胞色素P450/NADPH氧化系統(tǒng)中顯示出很強(qiáng)的抗 自由基氧化作用，能明顯抑制體內(nèi)新陳代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的自由基、以免受對(duì)氧化敏感的 生物大分子(低密度脂蛋白LDL，DNA)和細(xì)胞壁等被自由基氧化損傷，從而可以防治與自 由基氧化有關(guān)的某些病理變化，如動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞衰老等。故光甘草定被認(rèn)為是一種快 速、高效、安全、綠色的天然美白化妝品添加劑，目前已在化妝品美白領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然 而，由于光甘草定在光果甘草中的含量約為0. 1 0. 3%，因此得到高純度的光甘草定單體 的工藝流程復(fù)雜，成本昂貴。目前，國(guó)內(nèi)外多采取反復(fù)硅膠柱層析等傳統(tǒng)方法分離純化光 甘草定單體，產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量都難以滿足市場(chǎng)需求，且試劑消耗大，產(chǎn)品收率低。中國(guó)專利 200410079233. 1公開(kāi)了一種光甘草產(chǎn)品的生產(chǎn)方法，該方法用有機(jī)溶劑提取光甘草粗品后 上硅膠柱，用氯仿、丙酮梯度洗脫，收集目標(biāo)溶液減壓濃縮，真空干燥后得光甘草定含量為 40%的黃棕色粉末。該方法使用了有毒的有機(jī)溶劑，操作繁復(fù)，所得產(chǎn)品純度較低。中國(guó)專 利200510023860. 8公開(kāi)了一種高純度光甘草定的生產(chǎn)方法，該方法將光甘草提取液超濾 后再進(jìn)一步用高分子樹(shù)脂吸附、淋洗液淋洗及重結(jié)晶精制，可獲得純度90%以上的光甘草 定，但產(chǎn)品的純度難以進(jìn)一步提高，且該方法使用了超濾技術(shù)和高分子樹(shù)脂分離方法，操作 繁復(fù)、成本較高且產(chǎn)品收率低。隨著科技的進(jìn)步，近年來(lái)國(guó)際市場(chǎng)對(duì)該類產(chǎn)品的質(zhì)量要求有 所提高，對(duì)光甘草定單體成分的含量也有所要求，因而需要提供一種成本低廉、產(chǎn)品純度高 的光甘草定分離純化方法。<formula>formula see original document page 4</formula>(J式 I

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高純度光甘草定單體的分離純化方法，此方法不但可 實(shí)現(xiàn)光甘草定單體的高效分離，而且工藝穩(wěn)定，成本低廉，可大量制備得到純度大于98 %的 單體。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下—種高純度光甘草定的分離純化方法，包括以下步驟(1)、有效部位的提取取光甘草藥材，用體積百分比濃度為20% 95%的乙醇提 取3次，提取溫度為30°C 60°C，提取時(shí)間分別為3、2、Ih，合并提取液，在40°C 50 V的溫 度下減壓濃縮，得提取物浸膏；以防光甘草定受熱分解；(2)、有效部位的富集及除雜提取物浸膏用水懸浮后加入等體積乙酸乙酯、二氯 甲烷或三氯甲烷萃取3次或3次以上，至水相中不能檢出光甘草定為止，在40°C 50°C的 溫度下濃縮回收乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷至干，得光甘草定粗品；光甘草定粗品用水分散后過(guò)聚酰胺柱層析或大孔樹(shù)脂DlOl柱層析分離除雜，得 光甘草定樣品光甘草定粗品分散液吸附后聚酰胺柱后依次用水、20%甲醇、50%甲醇、 95%甲醇洗脫，分別收集洗脫液，HPLC檢測(cè)，80%甲醇洗脫液中包含產(chǎn)品，收集80%甲醇洗 脫液，濃縮至干；光甘草定粗品分散液吸附于大孔樹(shù)脂DlOl柱后依次用水、10%乙醇、30% 乙醇、50%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，HPLC檢測(cè)，50%乙醇洗脫液中包含產(chǎn)品，收集50% 乙醇洗脫液，濃縮至干；(3)、光甘草定單體的高效液相色譜分離將步驟⑵所得光甘草定產(chǎn)品用 80% -95%甲醇溶解，利用制備型高效液相色譜柱，對(duì)光甘草定甲醇溶液進(jìn)行高效分離，以 乙腈水溶液或甲醇水溶液作為流動(dòng)相，流速100 300mL/min，HPLC在線檢測(cè)，針對(duì)性收集 光甘草定單體的制備溶液，收集產(chǎn)品純度98%以上的段落，于40°C 50°C溫度下減壓回收 濃縮至干，得淡黃粉末狀的光甘草定單體；(4)、制備所得單體溶液的處理及產(chǎn)品干燥將步驟(3)所得光甘草定單體干品分 別用20倍量(g/mL)正己烷、石油醚或甲苯在50°C下溶解為飽和溶液，4°C冰箱靜置析晶，收 集晶體干燥至恒重，得結(jié)晶純度98. 5%以上的光甘草定單體。由于高效液相色譜對(duì)樣品溶液的純度、色澤等要求均較高，通過(guò)提取等簡(jiǎn)單處理 得到的提取液不能直接作為樣品溶液進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)，否則既可能達(dá)不到良好的分 離效果，還可能對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)的色譜柱等配件產(chǎn)生難以逆轉(zhuǎn)的影響，縮短其使用周期；而色譜柱等液相色譜的相關(guān)配件成本通常較高，其使用周期的縮短顯然將造成最終產(chǎn) 品的生產(chǎn)成本大大提高；因而，對(duì)進(jìn)入高效液相色譜的樣品溶液要求較高，其前處理過(guò)程非
常重要。本發(fā)明方法提取有效部位后用乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷對(duì)提取物進(jìn)行萃取，得到的光甘草定粗品用水分散后過(guò)聚酰胺柱層析或大孔樹(shù)脂DlOl柱層析分離，經(jīng)過(guò)上 述步驟的組合，富集有效部位并除去提取物中的大量雜質(zhì)，獲得可以進(jìn)入制備型高效液相 色譜系統(tǒng)的樣品溶液，不至對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)造成很大的影響，盡量延長(zhǎng)其使用周期，節(jié) 約生產(chǎn)成本。在高效液相色譜分離過(guò)程中，色譜條件的選擇非常重要，它對(duì)樣品溶液中各物質(zhì) 的出峰順序、峰形、分離效果等起著決定性的作用；色譜條件主要包括色譜柱(包括填料、 柱長(zhǎng)及直徑等)、流動(dòng)相(包括組成及流速等)、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)、檢測(cè)器等，各色譜條件的選 擇及其組合至關(guān)重要。本發(fā)明人通過(guò)大量的試驗(yàn)研究及對(duì)比分析，確定了如上所述的各色譜條件，使樣 品溶液中各物質(zhì)的出峰時(shí)間、峰形、分離效果等最佳化，有利于光甘草定單體得到充分有效 的分離。制備所得單體再經(jīng)重結(jié)晶處理后可獲得純度為98. 5%以上的光甘草定單體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果1、采用制備型高效液相色譜柱對(duì)光甘草定單體進(jìn)行分離，HPLC檢測(cè)器在線檢測(cè)， 針對(duì)性收集光甘草定單體，目標(biāo)明確，避免了常規(guī)柱分離的盲目性和先分離后檢測(cè)造成的 資源浪費(fèi)。2、過(guò)程直觀，目標(biāo)性強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量易于控制，產(chǎn)品純度均在98%以上。3、本發(fā)明整體工藝高效，環(huán)保，收率高，產(chǎn)量大，重現(xiàn)性好，容易收集產(chǎn)品，適合工 業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為光果甘草20%乙醇提取液的HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為17. ISmin處即為
光甘草定。圖2為光果甘草60%乙醇提取液的HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為17.78min處即為
光甘草定。圖3為光果甘草95%乙醇提取液的HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為17. 7min處即為光
甘草定。圖4為光果甘草乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷萃取液的HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間 為17. 5min處即為光甘草定。圖5為光果甘草聚酰胺20% 50%甲醇洗脫液HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為17min 處即為光甘草定。圖6為光果甘草聚酰胺80%甲醇洗脫液HPLC圖譜，圖中第二個(gè)峰即為光甘草定。圖7為光果甘草大孔樹(shù)脂10% 30%乙醇洗脫液HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為 15. 24min處即為光甘草定。圖8為光果甘草大孔樹(shù)脂50%乙醇洗脫液HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為15. 59min 處即為光甘草定。圖9為光果甘草制備分離后HPLC圖譜，圖中保留時(shí)間為18. 9min處即為光甘草定。 圖10為光果甘草產(chǎn)品HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的光甘草定單體的分離純化方法作進(jìn)一步說(shuō)明。本 發(fā)明所列舉的實(shí)施例中所涉及的原料藥材購(gòu)自哈薩克斯坦，用20% 90%的乙醇作為提 取溶劑，采用超聲提取15 45min 進(jìn)行含量測(cè)定，光果甘草中光甘草定的含量為0. 2%。實(shí)施例1本實(shí)施例的光甘草定單體的分離純化方法，按如下工藝步驟進(jìn)行(1)、有效部位的提取取光果甘草藥材10KG，加入80L體積百分比濃度為20%的 乙醇溶液，于60°C下加熱提取三次，提取時(shí)間分別為3、2、讓，合并提取液，在401 501 的溫度下減壓濃縮，回收乙醇至干，得提取物流浸膏3L，HPLC檢測(cè)(流動(dòng)相乙睛-水 (50 50)波長(zhǎng)292nm流速lml/min C18(250X4. 6mm)進(jìn)樣量10ul)該提取物中含有 光甘草定(見(jiàn)圖1)。(2)、有效部位的富集及除雜將提取物浸膏用3倍質(zhì)量的自來(lái)水懸浮后加入等體 積乙酸乙酯萃取3次，以HPLC檢測(cè)產(chǎn)品已被大量萃取出來(lái)(見(jiàn)圖4)，水相中不能檢出光甘 草定為止，除去極性雜質(zhì)，在40°C 50°C的溫度下濃縮回收乙酸乙酯至干，得光甘草定粗 品 95g ；將95g光甘草定粗品分散于IOOOmL自來(lái)水中制備成光甘草定樣品，用2% NaOH溶 液活化40cm的聚酰胺(120目)層析柱，用水更替洗至流出液pH值中性后上樣，待光甘草 定樣品吸附于聚酰胺柱后，依次用水、20% (ν/ν)甲醇、50% (ν/ν)甲醇、80% (ν/ν)甲醇、 95% (ν/ν)甲醇洗脫產(chǎn)品，分別收集洗脫液，HPLC定性定量檢測(cè)，產(chǎn)品主要集中在80%甲醇 洗脫液中(見(jiàn)圖5-圖6)，將80%甲醇洗脫液濃縮至干回收光甘草定產(chǎn)品38g，采用歸一法 經(jīng) HPLC 檢測(cè)(流動(dòng)相乙睛-水(50 50)，波長(zhǎng):292nm，流速:lml/min，C18 (250 X 4. 6mm) 進(jìn)樣量10 μ L)，產(chǎn)品純度為44. 5%。(3)、光甘草定單體的高效液相色譜分離將步驟(2)所得光甘草定產(chǎn)品用90%甲 醇溶解，利用制備型高效液相色譜柱，對(duì)光甘草定甲醇溶液進(jìn)行高效分離，分離柱直徑5cm， C18填料，以乙腈水溶液(乙腈水=80 20)作為流動(dòng)相，流速300mL/min，進(jìn)樣量IOOmL, HPLC在線檢測(cè)，收集產(chǎn)品純度98%以上的段落，于40°C溫度下減壓回收乙腈至干，得光甘 草定單體，高效液相色譜圖見(jiàn)圖9 ；(4)、制備所得單體溶液的處理及產(chǎn)品干燥將步驟(3)所得光甘草定單體用正己 烷在50°C下溶解為飽和溶液，4°C冰箱靜置析晶，晶體于50°C下與五氧化二磷共存真空干 燥至恒重，收集產(chǎn)品，得結(jié)晶純度98%以上的光甘草定單體12g，產(chǎn)品得率為60%，HPLC圖 譜見(jiàn)圖10。實(shí)施例2本實(shí)施例的光甘草定單體的分離純化方法，按如下工藝步驟進(jìn)行(1)、有效部位的提取取光果甘草藥材20KG，加入160L體積百分比濃度為60% 的乙醇溶液，于50°C下加熱提取三次，提取時(shí)間分別為3、2、lh，合并提取液，在40°C 50°C的溫度下減壓濃縮，回收乙醇至干，得提取物流浸膏6L，HPLC檢測(cè)(流動(dòng)相乙睛-水(50 50)，波長(zhǎng)292nm，流速lml/min C18 (250 X 4. 6mm)，進(jìn)樣量IOul)該提取物中含有 光甘草定(見(jiàn)圖2)。(2)、有效部位的富集及除雜將提取物浸膏用3倍量自來(lái)水懸浮后加入等體積二氯甲烷反復(fù)萃取，以HPLC檢測(cè)產(chǎn)品已被大量萃取出來(lái)(見(jiàn)圖4)，水相中不能檢出光甘草 定為止，除去極性雜質(zhì)，在40°C 50°C的溫度下濃縮回收二氯甲烷至干，得光甘草定粗品 190g ；將190g光甘草定粗品分散于2000mL純化水中制備成光甘草定樣品，用2% NaOH 溶液活化80cm的DlOl打孔吸附層析柱，用水洗至流出液pH值為中性后上樣，待光甘草定 樣品吸附于聚酰胺柱后，依次用水、10% (ν/ν)乙醇、30%乙醇(ν/ν)、50%乙醇(ν/ν)洗 脫產(chǎn)品，分別收集洗脫液，HPLC定性定量檢測(cè)，產(chǎn)品主要集中在50%乙醇洗脫液中(見(jiàn)圖 7-圖8)，將50%乙醇洗脫液濃縮至干，回收光甘草定產(chǎn)品73g，采用歸一法經(jīng)HPLC檢測(cè)，產(chǎn) 品純度為50%。(3)、光甘草定單體的高效液相色譜分離將步驟(2)所得光甘草定產(chǎn)品用95% 甲醇溶解，利用制備型高效液相色譜柱，對(duì)光甘草定甲醇溶液進(jìn)行高效分離，分離柱直徑 15cm, C18填料，以甲醇水溶液(甲醇水=80 20)作為流動(dòng)相，流速300mL/min，進(jìn)樣量 300mL, HPLC在線檢測(cè)，針對(duì)性收集光甘草定單體的制備溶液，收集產(chǎn)品純度98%以上的段 落，于40°C溫度下減壓回收甲醇至干，得淡黃粉末狀的光甘草定單體，高效液相色譜圖見(jiàn)圖 9 ；(4)、制備所得單體溶液的處理及產(chǎn)品干燥將步驟(3)所得光甘草定單體用石油 醚在50°C下溶解為飽和溶液，4°C冰箱靜置析晶，晶體于50°C下與五氧化二磷共存真空干 燥至恒重，收集產(chǎn)品，得結(jié)晶純度98%以上的光甘草定單體25g，產(chǎn)品得率為62.5%，HPLC 圖譜見(jiàn)圖10。實(shí)施例3本實(shí)施例的光甘草定單體的分離純化方法，按如下工藝步驟進(jìn)行(1)、有效部位的提取取光果甘草藥材30KG，加入340L體積百分比濃度為95%的 乙醇溶液，于40°C下加熱提取三次，提取時(shí)間分別為3、2、Ih，合并提取液，在40°C 50°C的 溫度下減壓濃縮，回收乙醇至干，得提取物流浸膏10L，HPLC檢測(cè)該提取物中含有光甘草定 (見(jiàn)圖3)。(2)、有效部位的富集及除雜將提取物浸膏用3倍量自來(lái)水懸浮后加入等體積三 氯甲烷反復(fù)萃取，以HPLC檢測(cè)產(chǎn)品已被大量萃取出來(lái)(見(jiàn)圖4)，水相中不能檢出光甘草 定為止，除去極性雜質(zhì)，在40°C 50°C的溫度下濃縮回收三氯甲烷至干，得光甘草定粗品 320g ；將320g光甘草定粗品分散于SOOOmL純化水中制備成光甘草定樣品，用2% NaOH 溶液活化80cm的DlOl打孔吸附層析柱，用水更替洗至流出液PH值為中性后后上樣，待光 甘草定樣品吸附于聚酰胺柱后，依次用水、10% (ν/ν)乙醇、30%乙醇(ν/ν)、50%乙醇(ν/ ν)洗脫產(chǎn)品，分別收集洗脫液，HPLC定性定量檢測(cè)，產(chǎn)品主要集中在50%乙醇洗脫液中(見(jiàn) 圖7-圖8)，將50%乙醇洗脫液濃縮至干回收光甘草定產(chǎn)品116g，經(jīng)歸一法檢測(cè)，產(chǎn)品純度 為 50%。(3)、光甘草定單體的高效液相色譜分離將步驟(2)所得光甘草定產(chǎn)品用80%甲醇溶解，利用制備型高效液相色譜柱，對(duì)光甘草定甲醇溶液進(jìn)行高效分離，分離柱直徑 30cm, C18填料，以甲醇水溶液(甲醇水=80 20)作為流動(dòng)相，流速300mL/min，進(jìn)樣量 500mL, HPLC在線檢測(cè)，收集產(chǎn)品純度98%以上的段落，于50°C溫度下減壓回收甲醇至干， 得光甘草定單體，高效液相色譜圖見(jiàn)圖9 ； (4)、制備所得單體溶液的處理及產(chǎn)品干燥將步驟(3)所得光甘草定單體用石油 醚在50°C下溶解為飽和溶液，4°C冰箱靜置析晶，晶體于50°C下與五氧化二磷共存真空干 燥至恒重，收集產(chǎn)品，得結(jié)晶純度98%以上的光甘草定單體39g，產(chǎn)品得率為65%，HPLC圖 譜見(jiàn)圖10。
權(quán)利要求
一種高純度光甘草定的分離純化方法，包括以下步驟(1)、有效部位的提取取光甘草藥材，用體積百分比濃度為20％～95％的乙醇提取3次，提取溫度為30℃～60℃，提取時(shí)間分別為3、2、1h，合并提取液，在40℃～50℃的溫度下減壓濃縮，得提取物浸膏；(2)、有效部位的富集及除雜提取物浸膏用水懸浮后加入等體積乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取3次或3次以上，在40℃～50℃的溫度下濃縮回收乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷至干，得光甘草定粗品；光甘草定粗品用水分散后過(guò)聚酰胺柱層析或大孔樹(shù)脂D101柱層析分離除雜，得光甘草定樣品光甘草定粗品分散液吸附于聚酰胺柱后依次用水、20％甲醇、50％甲醇、95％甲醇洗脫，收集80％甲醇洗脫液，濃縮至干；光甘草定粗品分散液吸附于大孔樹(shù)脂D101柱后依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇洗脫，收集50％洗脫液，濃縮至干；(3)、光甘草定單體的高效液相色譜分離將步驟(2)所得光甘草定產(chǎn)品用80％-95％甲醇溶解，利用制備型高效液相色譜柱，對(duì)光甘草定甲醇溶液進(jìn)行高效分離，以乙腈水溶液及甲醇水溶液作為流動(dòng)相，流速為100～300mL/min，將步驟(2)所得光甘草定樣品甲醇水溶液進(jìn)行高效分離，HPLC在線檢測(cè)，收集產(chǎn)品純度98％以上的段落，于40℃～50℃溫度下減壓回收濃縮至干，得淡黃粉末狀的光甘草定單體；(4)、制備所得單體溶液的處理及產(chǎn)品干燥將步驟(3)所得光甘草定單體干品分別用20倍量(g/mL)正己烷、石油醚或甲苯在50℃下溶解為飽和溶液，4℃冰箱靜置析晶，得光甘草定單體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種光甘草定單體的高效分離純化方法，它是以豆科植物甘草屬光果甘草的干燥根為原料，將原料用有機(jī)試劑A進(jìn)行提取，有機(jī)試劑B萃取，再通過(guò)聚酰胺柱和大孔吸附樹(shù)脂柱層析，最后將有效部位溶液用制備型高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，HPLC進(jìn)行在線檢測(cè)，針對(duì)性收集光甘草定單體溶液，可獲得純度大于98％的光甘草定單體。本發(fā)明產(chǎn)量大、收率高、產(chǎn)品質(zhì)量好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D493/04GK101830906SQ20091031130
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2009年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月13日
發(fā)明者劉丁, 夏柯, 文煥松, 董維珍, 郭建華 申請(qǐng)人:成都普思生物科技有限公司