專利名稱：一種黃柏堿單體的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物中分離化合物單體技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種黃柏堿單體的分離純 化方法。
背景技術(shù)：
黃柏Cortex Phellodendri Chinensis 是蕓香科植物黃皮樹 Phellodendron chinensisSchneid.及黃檗P. amurense Rupr.的干燥樹皮，前者習(xí)稱“川黃柏”主產(chǎn)于四 川、云南及湖北，后者稱為關(guān)黃柏，主產(chǎn)遼寧、吉林、河北?！吨袊?guó)藥典》2005年版一部對(duì)二者 均有收載，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之功效。用于濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、腳 氣、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒。黃柏藥材中主要含小檗堿、藥根堿、黃柏堿、巴馬亭、木 蘭花堿等生物堿；7-脫氫豆留醇、谷留醇等留醇；金絲桃苷、雙氫山奈酚等黃酮類成分 以及少量的揮發(fā)油等成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃柏提取液中生物堿類成分有免疫抑制、 抗腫瘤、抗?jié)?、抗菌、抗腎炎等作用。黃柏堿(Phellodendrine)作為黃柏藥材的特征性成分，具有中樞神經(jīng)抑制、植物 神經(jīng)阻斷、抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答期的誘導(dǎo)期、抗腎炎等作用，其在藥材中的含量差異較大，大 約為0. 11% -0. 43%，其結(jié)構(gòu)式如下《中國(guó)藥典》2005年版一部，成方制劑中收載了以黃柏為主要組分的藥品如二妙 丸、三妙丸、九圣散、大補(bǔ)陰丸、小兒肝炎顆粒、小兒清熱片、木香檳榔丸等制劑，在質(zhì)量控制 方面均采用鹽酸小檗堿作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定。雖然小檗堿為黃柏生物堿中含量較 高的成分，但是由于其并非黃柏的特征性成分，用其標(biāo)定黃柏在成方中的用量存在著一定 的片面性。黃柏堿是黃柏中的特有成分，目前在黃連與小檗屬其它藥材中尚未發(fā)現(xiàn)，因此，以 黃柏堿及小檗堿共同作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，既能較真實(shí)地反映其質(zhì)量又具有專屬性；但目前 只有高純度小檗堿單體在售，黃柏堿則無。近年來，隨著對(duì)黃柏研究的深入，對(duì)黃柏制劑的 開發(fā)也呈現(xiàn)勃勃生機(jī)如納米黃柏制劑、黃柏分散片、黃柏搽劑、黃柏林芝茶、黃柏洗滌劑、手 帕紙等。為更好的評(píng)價(jià)黃柏藥材及制劑的質(zhì)量，迫切需要對(duì)黃柏中特有成分黃柏堿單體進(jìn) 行高純度的分離，以滿足黃柏藥材及制劑定量以及對(duì)黃柏堿單體藥效進(jìn)一步研究的需要。 但目前，國(guó)內(nèi)外多采用溶劑法和反復(fù)硅膠柱層析等傳統(tǒng)方法分離黃柏堿單體，分離周期長(zhǎng)， 且都需要用到大量三氯甲烷，毒性大，產(chǎn)品得率低(通常為萬分之幾)，產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量都難以滿足市場(chǎng)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中缺少高純度黃柏堿單體化合物、無法通過黃柏堿的含量測(cè)定加強(qiáng)對(duì)黃柏藥材的質(zhì)量控制等問題，提供一種黃柏堿單體的分離純化方 法；該方法操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短，分離效率高，工藝穩(wěn)定，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)大量黃柏堿單 體的高純度分離制備，得到純度大于98%的黃柏堿單體。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材，切成寬l_5mm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度為 1-10%的鹽酸水溶液，其加入量按照藥材重量鹽酸水溶液體積=lKg (5-25)L計(jì)算，浸 泡5-36h，控制流速為l-10L/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液，棄去藥渣，于45°C _85°C水浴減 壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提取液，進(jìn)行下述步驟B。本步驟通過鹽酸水溶液浸泡、滲漉提取、減壓濃縮，所得的總生物堿提取液中主要 含有黃柏堿、小檗堿等成分。B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加鹽酸至pH = 1-2，室溫靜置 10-36h，濾除黃色沉淀物，母液(即濾液)于45°C-85°C水浴減壓濃縮至有黃色固體析出， 室溫靜置10_36h，再濾除黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作3-6次，將最終所得母液攪 拌滴加氫氧化鈉水溶液(可優(yōu)選重量百分比為1-5% )調(diào)pH至7-9，于60°C _85°C水浴減 壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品，再進(jìn)行下述步驟C。本步驟中，采用鹽酸調(diào)pH使總生物堿提取液中大量的小檗堿成分沉淀、再過濾去 除，通過反復(fù)濃縮、過濾，可較完全的去除小檗堿(可單獨(dú)收集、制成鹽酸小檗堿)，為后續(xù) 分離減少雜質(zhì)干擾，并同時(shí)起到富集黃柏堿的作用。C、過濾進(jìn)一步除雜將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用彡70 %的甲醇(包括體積百分 比彡70%甲醇水溶液和純甲醇，下同)溶解，甲醇用量按固體物重量甲醇體積= lg (4-10)ml計(jì)算，溶解后的溶液用孔徑0.22um-0.45um的有機(jī)濾膜過濾，得澄清透明濾 液；再進(jìn)行下述步驟D。本步驟通過甲醇溶解、有機(jī)濾膜過濾，可進(jìn)一步除去大分子雜質(zhì)，純化黃柏堿。D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱；流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)10% -40%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為 0. 2% -0. 5%的氨水)；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm ；取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在 線監(jiān)測(cè)，針對(duì)性收集黃柏堿單體的制備餾分溶液，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E。本步驟在進(jìn)行高效制備液相色譜分離前，可通過液_質(zhì)聯(lián)用或其它本技術(shù)領(lǐng)域常用的方法(如氣-質(zhì)聯(lián)用，核磁共振碳譜、氫譜等)確定高效液相色譜中黃連堿單體的峰 形。以液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)方法為例，可采用填料為C18的色譜柱，流動(dòng)相組成可同 上(也可略有差異)，柱溫為室溫(柱溫?zé)o特別要求，室溫即可)，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，取步驟 C所得的澄清透明濾液適量進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的HPLC-MS檢測(cè)，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)， 并根據(jù)質(zhì)譜正離子檢測(cè)結(jié)果，確定黃柏堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形及歸屬(由于制 備型高效液相色譜分離黃柏堿單體也采用C18色譜柱，對(duì)同樣的樣品，即使流動(dòng)相等有差異 而導(dǎo)致出峰時(shí)間有所不同，但出峰順序及峰形等大致相同，因而可用于推斷在制備型高效 液相色譜中黃柏堿單體的出峰位置及峰形等)。E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于45 °C -85 °C水浴減壓濃縮至原體積的 1/4-1/2，再加入0. 8-1. 5倍水飽和的二氯甲烷等體積萃取2-4次，收集二氯甲烷層，用無水 硫酸鈉脫水，得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F ；F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于25°C-55°C減壓濃縮至干，再將固體 物于45°C _85°C與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得所述的黃 柏堿單體產(chǎn)品。由于高效液相色譜對(duì)樣品溶液的純度、色澤等要求均較高，通過提取等簡(jiǎn)單處理 得到的提取液不能直接作為樣品溶液進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)，否則既可能達(dá)不到良好的分 離效果，還可能對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)的色譜柱等配件產(chǎn)生難以逆轉(zhuǎn)的影響，縮短其使用周 期；而色譜柱等液相色譜的相關(guān)配件成本通常較高，其使用周期的縮短顯然將造成最終產(chǎn) 品的生產(chǎn)成本大大提高；因而，對(duì)進(jìn)入高效液相色譜的樣品溶液要求較高，其前處理過程非 常重要。黃柏藥材中除含有黃柏堿外，還含有小檗堿、藥根堿、巴馬亭、木蘭花堿、7-脫氫豆 甾醇、日-谷甾醇、金絲桃苷、雙氫山奈酚等非常復(fù)雜的成分，要獲得可直接進(jìn)入高效液相色 譜系統(tǒng)的樣品，需要先進(jìn)行特殊的提取及分離純化處理。針對(duì)黃柏藥材中存在的各種成分 的理化性質(zhì)，本發(fā)明方法通過前述步驟A、B、C的順序搭配，以及適當(dāng)?shù)膮?shù)組合，可有效提 取出黃柏藥材中的黃柏堿等成分，并除去提取液中含有的小檗堿、大分子物質(zhì)等大量雜質(zhì)， 獲得可以進(jìn)入制備型高效液相色譜系統(tǒng)的樣品溶液(即步驟C得到的澄清透明濾液)，不至 對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)造成很大的影響，盡量延長(zhǎng)其使用周期，節(jié)約生產(chǎn)成本。在高效液相色譜分離過程中，色譜條件的選擇非常重要，它對(duì)樣品溶液中各物質(zhì) 的出峰順序、峰形、分離效果等起著決定性的作用；色譜條件主要包括色譜柱(包括填料、 柱長(zhǎng)及內(nèi)徑等)、流動(dòng)相(包括組成及流速等)、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)、檢測(cè)器等，各色譜條件的選 擇及其組合至關(guān)重要。本發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)研究及對(duì)比分析，確定了如上所述的各色譜條件，使樣 品溶液中各物質(zhì)的出峰時(shí)間、峰形、分離效果等最佳化，有利于黃柏堿單體得到充分有效的 分離。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明方法采用制備型高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)黃柏堿單體進(jìn)行分離，通過最適宜的前處理方法和色譜條件等，達(dá)到良好的分離效果，并且紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，針對(duì)性收集 黃柏堿單體，目標(biāo)明確，避免了常規(guī)柱層析和先分離后檢測(cè)造成的資源浪費(fèi)。2、本發(fā)明方法制備型高效液相色譜分離過程直觀，目標(biāo)性強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量易于 控制，產(chǎn)品純度可達(dá)98%以上。3、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短，分離效率高，收率高，產(chǎn)量大，工藝穩(wěn)定可 靠，重現(xiàn)性好，成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是實(shí)施例1黃柏堿的高效液相制備色譜圖，圖中記錄為3針樣品連續(xù)進(jìn)樣色 譜圖，圖中峰1、2、3為黃柏堿；圖2是實(shí)施例2黃柏堿單體產(chǎn)品復(fù)檢的高效液相分析色譜圖，圖中峰A為黃柏堿。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。下述各實(shí)施例中，終產(chǎn)品黃柏堿單體的純度復(fù)檢均采用反相分析型液相色譜 (RP-HPLC)法，色譜條件如下流動(dòng)相組成為乙腈-0. 磷酸水(其中每100ml水中加入十二烷基磺酸鈉0. 2 克)，二者體積比為25 75 ；流速1. OmL/min ；色譜柱填料為C18，粒度為5um，色譜柱內(nèi)徑為4. 6mm,長(zhǎng)度為150mm ；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm。實(shí)施例1本實(shí)施例黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材2Kg，切成寬約3mm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度為 10%的鹽酸水溶液10L，浸泡36h，控制流速為4L/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液共9. 6L，棄 去藥渣，于65°C水浴減壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提 取液6L，進(jìn)行下述步驟B。本步驟通過鹽酸水溶液浸泡、滲漉提取、減壓濃縮，所得的總生物堿提取液中主要 含有黃柏堿、小檗堿等成分；B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加濃鹽酸至pH = 1. 5，室溫靜 置10h，濾除黃色沉淀物，母液于45°C水浴減壓濃縮至有黃色固體析出，室溫靜置10h，再濾 除黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作3次，將最終所得母液攪拌滴加5%氫氧化鈉水溶 液調(diào)PH至7，于60°C水浴減壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品(黃色固體)12g，再 進(jìn)行下述步驟C。本步驟中，采用鹽酸調(diào)pH使總生物堿提取液中大量的小檗堿成分沉淀、再過濾去 除，通過反復(fù)濃縮、過濾，可較完全的去除小檗堿(小檗堿單獨(dú)收集、制成鹽酸小檗堿)，為 后續(xù)分離減少雜質(zhì)干擾，并同時(shí)起到富集黃柏堿的作用。
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C、過濾進(jìn)一步除雜
將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用純甲醇溶解，甲醇用量按固體物重 量甲醇體積=Ig 6ml計(jì)算(即約72ml)，溶解后的溶液用孔徑0. 22um的有機(jī)濾膜過 濾，得約70ml淡黃色澄清透明濾液；再進(jìn)行下述步驟D。本步驟通過甲醇溶解、有機(jī)濾膜過濾，可進(jìn)一步除去大分子雜質(zhì)，純化黃柏堿。D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體(a)、確定高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形及歸屬通過液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)，采用填料為C18的色譜柱(C18粒度為5um，柱長(zhǎng)為 250mm,內(nèi)徑4. 6mm)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)20%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為 0. 3%的氨水)，流速lmL/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，取步驟C所得的澄清透明濾 液SOul進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的HPLC-MS檢測(cè)，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并根據(jù)質(zhì)譜正離子檢 測(cè)結(jié)果，確定黃柏堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形，出峰時(shí)間t = 17. 88-19. 39min的峰 所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為黃柏堿單體(由于制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體也采用C18色譜 柱，對(duì)同樣的樣品，雖然因?yàn)榱鲃?dòng)相等略有差異而導(dǎo)致出峰時(shí)間有所不同，但出峰順序及峰 形等大致相同，因而可推斷出在制備型高效液相色譜中黃柏堿單體的出峰位置及峰形等)。(b)、制備黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱(內(nèi)徑80mm，C18粒度為Sum)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù) 20%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為0.3%的氨水)，流速為140mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 284nm，取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在線 監(jiān)測(cè)，根據(jù)步驟(a)確定的高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形等情況，針對(duì)性收集黃柏堿 單體的制備餾分溶液(出峰時(shí)間為29-32min)，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E。E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于65°C水浴減壓濃縮至原體積的1/4，再加入水 飽和的二氯甲烷等體積萃取3次，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，得黃柏堿單體的二 氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F;F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于35°C減壓濃縮至干，再將固體物于 65°C與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黃柏堿單體產(chǎn)品6. 82g。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(6. 82/2000) X 100 % = 0. 341 %。通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得 結(jié)果為98. 82%。實(shí)施例2本實(shí)施例黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材0. 5Kg，切成寬約Imm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度 為1 %的鹽酸水溶液12. 5L，浸泡5h，控制流速為lL/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液共12L，棄 去藥渣，于45°C水浴減壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提 取液8. 5L，進(jìn)行下述步驟B。本步驟通過鹽酸水溶液浸泡、滲漉提取、減壓濃縮，所得的總生物堿提取液中主要含有黃柏堿、小檗堿等成分；B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加濃鹽酸至PH = 2，室溫靜置 36h，濾除黃色沉淀物，母液于55°C水浴減壓濃縮至有黃色固體析出，室溫靜置36h，再濾除 黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作4次，將最終所得母液攪拌滴加3%氫氧化鈉水溶液 調(diào)PH至8，于65°C水浴減壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品(黃色固體)3. 6g，再 進(jìn)行下述步驟C。本步驟中，采用鹽酸調(diào)pH使總生物堿提取液中大量的小檗堿成分沉淀、再過濾去 除，通過反復(fù)濃縮、過濾，可較完全的去除小檗堿(小檗堿單獨(dú)收集、制成鹽酸小檗堿)，為 后續(xù)分離減少雜質(zhì)干擾，并同時(shí)起到富集黃柏堿的作用。C、過濾進(jìn)一步除雜將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用70%甲醇(水溶液，下同)溶解，甲 醇用量按固體物重量甲醇體積=Ig 4ml計(jì)算(即約14. 4ml)，溶解后的溶液用孔徑 0. 45um的有機(jī)濾膜過濾，得約13ml淡黃色澄清透明濾液；再進(jìn)行下述步驟D。本步驟通過甲醇溶解、有機(jī)濾膜過濾，可進(jìn)一步除去大分子雜質(zhì)，純化黃柏堿。D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體(a)、確定高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形及歸屬通過液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)，采用填料為C18的色譜柱(C18粒度為5um，柱長(zhǎng)為 250mm,內(nèi)徑4. 6mm)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為
0.2%的氨水)，流速lmL/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，取步驟C所得的澄清透明濾 液50ul進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的HPLC-MS檢測(cè)，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并根據(jù)質(zhì)譜正離子檢 測(cè)結(jié)果，確定黃柏堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形，出峰時(shí)間t = 31. 95-34. 30min的峰 所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為黃柏堿單體(由于制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體也采用C18色譜 柱，對(duì)同樣的樣品，雖然因?yàn)榱鲃?dòng)相等略有差異而導(dǎo)致出峰時(shí)間有所不同，但出峰順序及峰 形等大致相同，因而可推斷出在制備型高效液相色譜中黃柏堿單體的出峰位置及峰形等)。(b)、制備黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱(內(nèi)徑50mm，C18粒度為5um)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)10% 的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為0. 2%的氨水)，流速為60mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm， 取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，根 據(jù)步驟(a)確定的高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形等情況，針對(duì)性收集黃柏堿單體的制 備餾分溶液(出峰時(shí)間為53-57min)，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E。E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于85°C水浴減壓濃縮至原體積的1/3，再加入
1.5倍量水飽和的二氯甲烷萃取2次，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，得黃柏堿單體 的二氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F ；F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于25°C減壓濃縮至干，再將固體物于 45°C與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黃柏堿單體產(chǎn)品1. 86g。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(1.86/500) X 100%= 0. 373%。
通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得 結(jié)果為99. 11%。實(shí)施例3本實(shí)施例黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材4Kg，切成寬約5mm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度為 6%的鹽酸水溶液60L，浸泡24h，控制流速為10L/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液共57L，棄去 藥渣，于65°C水浴減壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提取 液45L，進(jìn)行下述步驟B。本步驟通過鹽酸水溶液浸泡、滲漉提取、減壓濃縮，所得的總生物堿提取液中主要含有黃柏堿、小檗堿等成分；B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加濃鹽酸至pH = 1，室溫靜置 16h，濾除黃色沉淀物，母液于85°C水浴減壓濃縮至有黃色固體析出，室溫靜置15h，再濾除 黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作6次，將最終所得母液攪拌滴加氫氧化鈉水溶液 調(diào)PH至9，于85°C水浴減壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品(黃色固體)23. 38g， 再進(jìn)行下述步驟C。本步驟中，采用鹽酸調(diào)pH使總生物堿提取液中大量的小檗堿成分沉淀、再過濾去 除，通過反復(fù)濃縮、過濾，可較完全的去除小檗堿(小檗堿單獨(dú)收集、制成鹽酸小檗堿)，為 后續(xù)分離減少雜質(zhì)干擾，并同時(shí)起到富集黃柏堿的作用。C、過濾進(jìn)一步除雜將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用90%甲醇溶解，甲醇用量按固體物重 量甲醇體積=Ig IOml計(jì)算(即約233. 8ml)，溶解后的溶液用孔徑0. 45um的有機(jī)濾膜 過濾，得約230ml淡黃色澄清透明濾液；再進(jìn)行下述步驟D。本步驟通過甲醇溶解、有機(jī)濾膜過濾，可進(jìn)一步除去大分子雜質(zhì)，純化黃柏堿。D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體(a)、確定高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形及歸屬通過液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)，采用填料為C18的色譜柱(C18粒度為5um，柱長(zhǎng)為 250mm,內(nèi)徑4. 6mm)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)40%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為 0. 5%的氨水)，流速lmL/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，取步驟C所得的澄清透明濾 液IOOul進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的HPLC-MS檢測(cè)，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并根據(jù)質(zhì)譜正離子 檢測(cè)結(jié)果，確定黃柏堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形，出峰時(shí)間t = 7. 81-8. 93min的峰 所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為黃柏堿單體(由于制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體也采用C18色譜 柱，對(duì)同樣的樣品，雖然因?yàn)榱鲃?dòng)相等略有差異而導(dǎo)致出峰時(shí)間有所不同，但出峰順序及峰 形等大致相同，因而可推斷出在制備型高效液相色譜中黃柏堿單體的出峰位置及峰形等)。(b)、制備黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱(內(nèi)徑200mm，C18粒度為IOum)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù) 40%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為0. 5%的氨水)，流速為300mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 284nm，取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，根據(jù)步驟(a)確定的高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形等情況，針對(duì)性收集黃柏堿單體的制備餾分溶液(出峰時(shí)間為13-15min)，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E。E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于45°C水浴減壓濃縮至原體積的1/2，再加入 0. 8倍體積水飽和的二氯甲烷萃取4次，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，得黃柏堿單 體的二氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F ；F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于55°C減壓濃縮至干，再將固體物于85°C與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黃柏堿單體產(chǎn)品12. 9g。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(12. 9/4000) XlOO%= 0. 323%。通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得 結(jié)果為98. 25%。實(shí)施例4本實(shí)施例黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材5Kg，切成寬約3mm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度為 5 %的鹽酸水溶液60L，浸泡36h，控制流速為8L/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液共57L，棄去 藥渣，于65°C水浴減壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提取 液35L，進(jìn)行下述步驟B。本步驟通過鹽酸水溶液浸泡、滲漉提取、減壓濃縮，所得的總生物堿提取液中主要 含有黃柏堿、小檗堿等成分；B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加濃鹽酸至pH = 1，室溫靜置 10h，濾除黃色沉淀物，母液于45°C水浴減壓濃縮至有黃色固體析出，室溫靜置10h，再濾除 黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作3次，將最終所得母液攪拌滴加5%氫氧化鈉水溶液 調(diào)PH至8，于60°C水浴減壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品(黃色固體)38. 2g，再 進(jìn)行下述步驟C。本步驟中，采用鹽酸調(diào)pH使總生物堿提取液中大量的小檗堿成分沉淀、再過濾去 除，通過反復(fù)濃縮、過濾，可較完全的去除小檗堿(小檗堿單獨(dú)收集、制成鹽酸小檗堿)，為 后續(xù)分離減少雜質(zhì)干擾，并同時(shí)起到富集黃柏堿的作用。C、過濾進(jìn)一步除雜將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用純甲醇溶解，甲醇用量按固體物重 量甲醇體積=Ig 6ml計(jì)算(即約230ml)，溶解后的溶液用孔徑0. 45um的有機(jī)濾膜過 濾，得約226ml淡黃色澄清透明濾液；再進(jìn)行下述步驟D。本步驟通過甲醇溶解、有機(jī)濾膜過濾，可進(jìn)一步除去大分子雜質(zhì)，純化黃柏堿。D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體(a)、確定高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形及歸屬通過液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)，采用填料為C18的色譜柱(C18粒度為5um，柱長(zhǎng)為 250mm,內(nèi)徑4. 6mm)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)16%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為0. 3%的氨水)，流速lmL/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，取步驟C所得的澄清透明濾 液SOul進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的HPLC-MS檢測(cè)，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并根據(jù)質(zhì)譜正離子檢 測(cè)結(jié)果，確定黃柏堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形，出峰時(shí)間t = 22. 08-23. 95min的峰 所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為黃柏堿單體(由于制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體也采用C18色譜 柱，對(duì)同樣的樣品，雖然因?yàn)榱鲃?dòng)相等略有差異而導(dǎo)致出峰時(shí)間有所不同，但出峰順序及峰 形等大致相同，因而可推斷出在制備型高效液相色譜中黃柏堿單體的出峰位置及峰形等)。(b)、制備黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱(內(nèi)徑80mm，C18粒度為Sum)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù) 20%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為0.3%的氨水)，流速為140mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 284nm,取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在線 監(jiān)測(cè)，根據(jù)步驟(a)確定的高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形等情況，針對(duì)性收集黃柏堿 單體的制備餾分溶液(出峰時(shí)間為36-40min)，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E。E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于65°C水浴減壓濃縮至原體積的1/4，再加入水飽和的二氯甲烷等體積萃取3次，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，得黃柏堿單體的二 氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F;F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于35°C減壓濃縮至干，再將固體物于 60°C與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黃柏堿單體產(chǎn)品17. Sg。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(17. 8/5000) X 100%= 0. 356%。通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得 結(jié)果為99. 25%。實(shí)施例5本實(shí)施例黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材10Kg，切成寬約5mm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度為 4%的鹽酸水溶液100L，浸泡24h，控制流速為10L/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液共90L，棄 去藥渣，于55°C水浴減壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提 取液73L，進(jìn)行下述步驟B。本步驟通過鹽酸水溶液浸泡、滲漉提取、減壓濃縮，所得的總生物堿提取液中主要 含有黃柏堿、小檗堿等成分；B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加濃鹽酸至pH= 1. 5，室溫靜 置16h，濾除黃色沉淀物，母液于85°C水浴減壓濃縮至有黃色固體析出，室溫靜置15h，再濾 除黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作6次，將最終所得母液攪拌滴加氫氧化鈉水溶 液調(diào)PH至8，于85°C水浴減壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品(黃色固體)76. 2g， 再進(jìn)行下述步驟C。本步驟中，采用鹽酸調(diào)pH使總生物堿提取液中大量的小檗堿成分沉淀、再過濾去 除，通過反復(fù)濃縮、過濾，可較完全的去除小檗堿(小檗堿單獨(dú)收集、制成鹽酸小檗堿)，為后續(xù)分離減少雜質(zhì)干擾，并同時(shí)起到富集黃柏堿的作用。C、過濾進(jìn)一步除雜將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用90%甲醇溶解，甲醇用量按固體物重 量甲醇體積=Ig IOml計(jì)算(即約760ml)，溶解后的溶液用孔徑0. 45um的有機(jī)濾膜過 濾，得約755ml淡黃色澄清透明濾液；再進(jìn)行下述步驟D。本步驟通過甲醇溶解、有機(jī)濾膜過濾，可進(jìn)一步除去大分子雜質(zhì)，純化黃柏堿。D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體(a)、確定高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形及歸屬通過液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)，采用填料為C18的色譜柱(C18粒度為5um，柱長(zhǎng)為 250mm,內(nèi)徑4. 6mm)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)22%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為 0. 2%的氨水)，流速lmL/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，取步驟C所得的澄清透明濾 液70ul進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的HPLC-MS檢測(cè)，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并根據(jù)質(zhì)譜正離子檢 測(cè)結(jié)果，確定黃柏堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形，出峰時(shí)間t = 16. 99-18. 21min的峰 所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為黃柏堿單體(由于制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體也采用C18色譜 柱，對(duì)同樣的樣品，雖然因?yàn)榱鲃?dòng)相等略有差異而導(dǎo)致出峰時(shí)間有所不同，但出峰順序及峰 形等大致相同，因而可推斷出在制備型高效液相色譜中黃柏堿單體的出峰位置及峰形等)。(b)、制備黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱(內(nèi)徑200mm，C18粒度為IOum)，流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù) 22%的甲醇水溶液(其中還含體積分?jǐn)?shù)為0. 2%的氨水)，流速為300mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 284nm，取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在線 監(jiān)測(cè)，根據(jù)步驟(a)確定的高效液相色譜中黃柏堿單體的峰形等情況，針對(duì)性收集黃柏堿 單體的制備餾分溶液(出峰時(shí)間為28-30min)，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E。E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于45°C水浴減壓濃縮至原體積的1/2，再加入 0. 8倍體積水飽和的二氯甲烷萃取4次，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，得黃柏堿單 體的二氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F ；F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于55°C減壓濃縮至干，再將固體物于 85°C與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，得黃柏堿單體產(chǎn)品35. lg。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(35. 1/10000) X 100%= 0. 351%。通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測(cè)得 結(jié)果為99. 02%.
權(quán)利要求
一種黃柏堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟A、提取總生物堿取黃柏藥材，切成寬1-5mm的細(xì)絲，裝入滲漉裝置中，加入體積百分比濃度為1-10％的鹽酸水溶液，其加入量按照藥材重量∶鹽酸水溶液體積＝1Kg∶(5-25)L計(jì)算，浸泡5-36h，控制流速為1-10L/h，進(jìn)行滲漉提取，收集滲漉液，棄去藥渣，于45℃-85℃水浴減壓濃縮收集的滲漉液至有淡黃色粉末析出，得濃縮后的總生物堿提取液，進(jìn)行下述步驟B；B、酸沉除去小檗堿取步驟A所得濃縮后的總生物堿提取液，緩慢攪拌滴加鹽酸至pH＝1-2，室溫靜置10-36h，濾除黃色沉淀物，母液于45℃-85℃水浴減壓濃縮至有黃色固體析出，室溫靜置10-36h，再濾除黃色沉淀物，重復(fù)濃縮母液、過濾操作3-6次，將最終所得母液攪拌滴加氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至7-9，于60℃-85℃水浴減壓濃縮至干，得除雜富集后的黃柏堿半成品，再進(jìn)行下述步驟C；C、過濾進(jìn)一步除雜將步驟B所得除雜富集后的黃柏堿半成品用≥70％的甲醇溶解，甲醇用量按固體物重量∶甲醇體積＝1g∶(4-10)ml計(jì)算，溶解后的溶液用孔徑0.22um-0.45um的有機(jī)濾膜過濾，得澄清透明濾液；再進(jìn)行下述步驟D；D、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體采用填料為C18的色譜柱；流動(dòng)相組成為體積分?jǐn)?shù)10％-40％的甲醇水溶液其中還含體積分?jǐn)?shù)為0.2％-0.5％的氨水；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm；取步驟C所得的澄清透明濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃柏堿單體的制備分離，紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)針對(duì)性收集黃柏堿單體的制備餾分溶液，得黃柏堿單體溶液，進(jìn)行下述步驟E；E、二氯甲烷萃取將步驟D所得的黃柏堿單體溶液，于45℃-85℃水浴減壓濃縮至原體積的1/4-1/2，再加入0.8-1.5倍水飽和的二氯甲烷萃取2-4次，收集二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水，得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，進(jìn)行下述步驟F；F、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品取步驟E所得黃柏堿單體的二氯甲烷溶液，于25℃-55℃減壓濃縮至干，再將固體物于45℃-85℃與另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得所述的黃柏堿單體產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟A“提取總生物堿”過程中，鹽 酸水溶液的濃度為5% -6%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟A“提取總生物堿”過程中，鹽 酸水溶液的加入量按照藥材重量鹽酸水溶液體積=lKg (10-15)L計(jì)算。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟B“酸沉除去小檗堿”過程中， 氫氧化鈉水溶液的重量百分比濃度為1_5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟D(b)“制備黃柏堿單體” 過程中，流動(dòng)相的組成為體積分?jǐn)?shù)16% -22%的甲醇水溶液-其中還含體積分?jǐn)?shù)為·0. 2% -0. 3%的氨水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃柏堿單體的分離純化方法，包括提取總生物堿、酸沉除去小檗堿、過濾進(jìn)一步除雜、通過制備型高效液相色譜分離黃柏堿單體、二氯甲烷萃取、干燥制備黃柏堿單體產(chǎn)品等步驟。該方法操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短，分離效率高，工藝穩(wěn)定，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)大量黃柏堿單體的高純度分離制備，得到純度大于98％的黃柏堿單體。
文檔編號(hào)C07D455/03GK101798304SQ20091031130
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月13日
發(fā)明者劉丁, 夏柯, 文煥松, 郭建華 申請(qǐng)人:成都普思生物科技有限公司