專利名稱：藥物內(nèi)包活性靶向型高分子微團、醫(yī)藥組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有對腫瘤細胞、炎癥細胞、免疫活性細胞、新生血管和血管內(nèi)皮等給藥對象物的指向性的活性靶向型藥物內(nèi)包高分子微團，以及利用該微團得到的醫(yī)藥組合 物。
背景技術：
如果通過口服或者靜脈注射將藥物向全身給藥，則不僅向作為給藥對象物的病灶 部位供給藥物，而且也向正常組織供給藥物。結(jié)果產(chǎn)生由藥物投與所導致的副作用，因而有 時需要改變或者中斷治療方法。以降低副作用為目的，具有與給藥對象物固有的受體、配體 和酶等分子標記物特異性結(jié)合能力的稱為分子標的藥的藥物被開發(fā)(參照非專利文獻1)。 但是，目前為止，這樣的分子標的藥不能充分降低例如已知的由吉非替尼(Gefitinib)給 藥造成間質(zhì)性肺炎的發(fā)生事例這樣的副作用，并且，對病灶部位的治療效果也不充分。從將藥物選擇性供給給藥對象物，并且在給藥對象物附近維持最適的藥物濃度的 觀點出發(fā)，被稱為藥物遞送系統(tǒng)(Drug DeliverySystem, DDS)的技術受到矚目。專利文獻 1公開了藥物和配體處于結(jié)合在合成聚合物上的狀態(tài)的活性靶向型的高分子結(jié)合DDS。專利文獻1 國際公開第2002/087497號小冊子非專利文獻 1 :Asahina H, Yamazaki K,Kinoshita I, et al. ,BritishJournal of Cancer,95，2006, p. p. 998-100
發(fā)明內(nèi)容
從降低副作用的觀點出發(fā)，期望將未能準確送達至給藥對象物的藥物在損傷正常 細胞之前從體內(nèi)除去。專利文獻1中所記載的高分子結(jié)合物，是將藥物和配體結(jié)合在一個 合成聚合物鏈上，因此，當與對應的受體結(jié)合但是沒有被攝入作為給藥對象物的細胞內(nèi)時， 藥物就會持續(xù)暴露在血液中。因此，這樣的現(xiàn)有的活性靶向型DDS，為了降低副作用，還有進 一步改善的余地。本發(fā)明目的在于提供一種藥物內(nèi)包活性靶向型高分子微團，包括具有標的結(jié)合部 位的骨架聚合物單元α、和具有藥物而不具有上述標的結(jié)合部位的骨架聚合物單元β，上 述骨架聚合物單元α和骨架聚合物單元β，以上述標的結(jié)合部位朝向外側(cè)并且上述藥物 朝向內(nèi)側(cè)的狀態(tài)呈放射狀排列，i)當在維持上述放射狀排列的狀態(tài)下與標的結(jié)合時，通過 胞吞作用被攝入供給該標的的細胞的內(nèi)部，上述放射狀排列在上述細胞內(nèi)崩解，由此使上 述藥物在該細胞內(nèi)釋放， )當與標的結(jié)合之前在血液中上述放射狀排列崩解時，上述骨架 聚合物單元β通過代謝排出體外，由此能夠防止上述藥物對正常細胞造成損傷。本說明書中，骨架聚合物單元α含有的標的結(jié)合部位，是指可以對機體或者病毒 來源的物質(zhì)特異性結(jié)合從而形成與該物質(zhì)的生物學上的結(jié)合對、具有生物學上的識別機能 的部位。作為機體和病毒來源的物質(zhì)，能夠例示存在于機體細胞、細菌、真菌和病毒中的分 子。作為機體細胞，能夠例示腫瘤細胞和新生血管細胞及其周邊的細胞、免疫活性細胞(例如B細胞)、炎癥細胞(例如白血球)、血管內(nèi)皮細胞、構(gòu)成各種臟器的細胞。骨架聚合物單 元α，通過含有與這些物質(zhì)形成結(jié)合對的蛋白質(zhì)、肽和糖鏈等化合物，處于含有標的結(jié)合部 位的狀態(tài)。另一方面，本發(fā)明也提供含有上述高分子微團和制藥學上可接受的載體的醫(yī)藥組 合物。發(fā)明的效果本發(fā)明中，通過在不同的聚合物單元上分別含有藥物和標的結(jié)合部位，為微團組 裝了安全機構(gòu)，該安全機構(gòu)能夠在微團結(jié)構(gòu)被攝入作為給藥對象物的細胞之前崩解時，通 過代謝將藥物排出體外。由此，與現(xiàn)有的活性靶向型DDS相比 ，容易避免副作用的產(chǎn)生。


圖1是用于表示本發(fā)明的高分子微團對癌細胞的損傷作用的數(shù)據(jù)的一個例子的 圖。圖2是用于表示本發(fā)明的高分子微團對癌細胞的損傷作用的數(shù)據(jù)的另外的例子 的圖。圖3是用于表示由本發(fā)明的高分子微團的給藥引起的腫瘤體積的經(jīng)時變化的數(shù) 據(jù)的圖。圖4是用于表示由本發(fā)明的高分子微團的給藥引起的被檢測動物的體重的經(jīng)時 變化的數(shù)據(jù)的圖。圖5是用于表示不含藥物的活性靶向型高分子微團對癌細胞的損傷作用的數(shù)據(jù) 的一個例子的圖。圖6是用于說明本發(fā)明的高分子微團的構(gòu)造和作用的模式圖。
具體實施例方式本發(fā)明的高分子微團100，如圖6的a)所示，具有骨架聚合物單元α 10和骨架聚 合物單元β 20。骨架聚合物單元α 10具有含有標的結(jié)合部位11的化合物、以聚乙二醇鏈 為代表的親水性聚合物片段12、以及以聚氨基酸鏈為代表的疏水性聚合物片段13。另外， 下文有時以PEG表示聚乙二醇。標的結(jié)合部位11結(jié)合在親水性聚合物片段12上。骨架聚 合物單元β 20具有藥物14、以聚乙二醇鏈為代表的親水性聚合物片段12、以及以聚氨基酸 鏈為代表的疏水性聚合物片段13。藥物14以酯鍵或者酰胺鍵結(jié)合在疏水性聚合物片段13 上。這樣，骨架聚合物單元α 10具有標的結(jié)合部位11但不具有藥物14，而骨架聚合物單元 β 20具有藥物14但不具有標的結(jié)合部位11。這樣，骨架聚合物單元α10和骨架聚合物單 元β 20以標的結(jié)合部位11朝向外側(cè)、藥物14朝向內(nèi)側(cè)的狀態(tài)呈放射狀排列。高分子微團 100，如圖6的a)所示，也可以含有不具有標的結(jié)合部位11和藥物14、由親水性聚合物片段 12和疏水性聚合物片段13形成的骨架聚合物單元Y 30。本說明書中，骨架聚合物單元α 10和骨架聚合物單元β 20呈放射狀排列，是指只 要是標的結(jié)合部位11朝向外側(cè)而藥物14朝向內(nèi)側(cè)的凝聚狀態(tài)即可，也可以是各單元的排 列起點不集中于一點，具有稍微崩解的放射狀排列的構(gòu)造的微團。高分子微團100也可以 是由骨架聚合物單元α 10和骨架聚合物單元β 20形成的高分子凝聚體處于干燥狀態(tài)的物質(zhì)。高分子微團100，如圖6的b)所示，當在維持放射狀排列的狀態(tài)下結(jié)合于標的40 時，通過胞吞作用被攝入供給標的40的細胞50的內(nèi)部(圖6的b)中的中央表示)，之后， 放射狀的排列在細胞50內(nèi)崩解，由此內(nèi)包的藥物14在細胞50內(nèi)釋放。更具體而言，骨架 聚合物單元β 20移行入細胞50內(nèi)的溶酶體內(nèi)，利用以脂酶為代表的酶切斷酯鍵從而使藥 物14釋放。作為分子量為數(shù)萬以下的高分子，原則上通過腎臟迅速從尿中排泄。因此，即使高 分子微團100的放射狀排列如圖6的C)所示那樣在被攝入給藥對象物之前崩解從而使藥 物14處于在血液60中暴露的狀態(tài)，分子量為數(shù)萬以下的骨架聚合物單元β 20也不會固定 于標的40而使藥物14持續(xù)暴露于血液60中，從而通過代謝迅速地排出體外。這樣，在高 分子微團100中組裝有安全機構(gòu)，防止在被攝入給藥對象物之前微團構(gòu)造崩解時導致藥物 對正常細胞造成損傷。優(yōu)選骨架聚合物單元α優(yōu)選以通式I =Z-A1-B1表示，由具有標的結(jié)合部位的化合 物和嵌段共聚物形成，骨架聚合物單元β優(yōu)選以通式II =A2-B2(-D)表示，由藥物和嵌段共 聚物形成。其中，Z是具有標的結(jié)合部位的化合物，A1和A2是相互獨立的聚乙二醇鏈片段， B1和B2是相互獨立的聚氨基酸鏈片段，D是藥物。骨架聚合物單元α，能夠通過將在聚乙二醇鏈片段的α末端具有羥基、羧基、醛 基、氨基、巰基、馬來酰亞胺基等連接基團的嵌段共聚物與具有標的部位的化合物通過縮合 或者加成反應形成。骨架聚合物單元β的聚乙二醇鏈片段的α末端，可以具有如羥基這樣的上述連 接集團，但是優(yōu)選具有碳原子數(shù)在1 12的范圍內(nèi)(C1-C12)的直鏈或者具有支鏈的烷基或
烷氧基，或者羥基。作為聚氨基酸鏈片段，能夠列舉聚谷氨酸或者其酯或酰胺衍生物、聚天冬氨酸或 者其酯或酰胺衍生物。這樣的酯或酰胺衍生物，能夠通過使具有疏水性有機基團相應的羥 基化合物或氨基化合物與聚谷氨酸或聚天冬氨酸的反應性衍生物(例如酯)反應而形成。 作為疏水性有機基團，能夠列舉具有碳原子數(shù)在1 6的范圍內(nèi)(C1-C6)的烷基苯酚、膽固 醇、直鏈或者具有支鏈的碳原子數(shù)在8 18的范圍內(nèi)(C8-C18)的烷基。骨架聚合物單元α和骨架聚合物單元β中的嵌段共聚物，例如，能夠以日本特 開平2-300133號公報中記載的方法形成，該方法中，以Y-PEG-CH2CH2CH2-NH2 (Y表示官能 團或取代基或者被保護的官能團或取代基)為引發(fā)劑，在脫水后的有機溶劑中，添加N-羧 基-Υ -苯甲基-L-谷氨酸酯或者N-羧基- β -苯甲基-L-天冬氨酸酯以達到期望的聚合 度，使其反應。導入比苯甲基體積大的疏水基團時，可以用C4烷基-苯基、膽固醇、C8 C18 的烷基取代苯甲基。這樣的疏水基團，可以使用二環(huán)己基碳二亞胺以及二異丙基碳二亞胺 這樣的縮合劑，在脫水后的有機溶劑中，將具有羥基或氨基的疏水性化合物導入聚谷氨酸 側(cè)鏈中。骨架聚合物單元α，優(yōu)選具有下述通式I-a或者通式I_b所示的結(jié)構(gòu)，骨架聚合物 單元β，優(yōu)選具有下述通式ΙΙ-a或者通式ΙΙ-b所示的結(jié)構(gòu)。<formula>formula see original document page 7</formula>
其中，R1是具有標的結(jié)合部位的化合物，R2是碳原子數(shù)在1 12的范圍內(nèi)的烷基 或者是末端具有羥基的碳原子數(shù)在1 12的范圍內(nèi)的烷基，L1是O(CH2)pNH, L2是O(CH2) p-CO-, ρ是1 5范圍內(nèi)的整數(shù)，R是氫原子或者疏水性有機基團，q是1或2，Ii1和Ii2是相 互獨立的40 450范圍內(nèi)的整數(shù),Hi1和m2是相互獨立的20 80范圍內(nèi)的整數(shù)，R3是藥物 殘基或者總數(shù)m2的至少10 70%具有連接基團的藥物殘基，當存在時，其它的基團為氫原 子或者疏水性有機基團。H1和Ii2都優(yōu)選為40 450范圍內(nèi)的整數(shù)，更優(yōu)選70 350范圍內(nèi)的整數(shù)，特別 優(yōu)選110 280范圍內(nèi)的整數(shù)。HI1和m2都優(yōu)選為20 80范圍內(nèi)的整數(shù)，更優(yōu)選25 50 范圍內(nèi)的整數(shù)。I^rvmpm2的數(shù)值為平均值。高分子微團100中，骨架聚合物單元α 10和骨架聚合物單元β 20的摩爾比處于 1 19 19 1的范圍內(nèi)。作為具有標的結(jié)合部位11的化合物，如上所述，能夠列舉與機體和病毒來源的物 質(zhì)形成結(jié)合對的蛋白質(zhì)、肽或者糖鏈。作為這樣的蛋白質(zhì)，能夠列舉與機體和病毒來源的 物質(zhì)結(jié)合的抗體及其片段、鐵傳遞蛋白以及上皮生長因子(EGF)。作為抗體，可以列舉識別 作為在以癌細胞為代表的給藥對象物的表面高表達的受體和細胞表面抗原的EGFR、Her2、CD20、VEGFR和CD52等抗原的抗體?？贵w可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。作為 抗體的片段，可以是具有能夠特異識別抗原的長度的片段，能夠列舉(Fab’)2和Fab。作為 肽，能夠列舉胰島素、LHRH、IGF以及它們的衍生物。作為糖類，能夠列舉具有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖殘基的糖類。當具有標的結(jié)合部位11的化合物用于形成結(jié)合對的標的40為病毒來源的物質(zhì) 時，供給該物質(zhì)的細胞因感染的病毒破壞細胞膜而處于細胞死亡的狀態(tài)，因此，不能通過胞 吞作用將高分子微團100攝入細胞內(nèi)。因此，本說明書中，當標的40為病毒來源的物質(zhì)時， 將標的40的周邊存在的細胞作為供給標的40的細胞處理。當病毒來源的物質(zhì)存在于細胞 外時，其周邊的細胞也被病毒感染的可能性高，因此具有對該周邊細胞供給藥物的意義。作為藥物14，能夠列舉核酸衍生物、多西紫杉醇、喜樹堿類、埃博霉素A、埃博霉 素B、埃博霉素C、埃博霉素D以及這些埃博霉素類的衍生物、西羅莫司、依維莫司、曲貝替 定、伏立諾他、醋酸奧曲肽、米托蒽醌、長春新堿、頭孢氨芐、頭孢克洛、氨芐西林、巴氨西林、 阿莫西林、卡那霉素、阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、西索米星、妥布霉素、紅霉素、克拉霉 素、羅他霉素、氯霉素、萬古霉素、氟康唑、阿糖腺苷、阿昔洛維、去羥肌苷、齊多夫定、扎西 他濱、拉米夫定、扎那米韋、奧塞米韋、洛匹那韋、利托那韋。作為核酸衍生物，能夠列舉吉 西他濱、奈拉濱(Nelarabine)、克羅拉濱(Clofarabine)、地西他濱(Decitabine)、鏈佐星 (Str印tozocin)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、氟達拉濱。核酸衍生物也可以是鹽，但在 通過酯鍵使其結(jié)合在骨架聚合物單元β上時，優(yōu)選不是鹽的物質(zhì)。作為艾博霉素類的衍生 物，能夠列舉 Patupilone、Ixab印ilone、BMS-310705、K0S-862、ZK-EPO0當藥物中存在多個羥基時，骨架聚合物單元β可以形成該羥基中的一個以上以 酯鍵結(jié)合在聚谷氨酸側(cè)鏈的羧基上的構(gòu)造。本說明書中，骨架聚合物單元β中也包括1個 藥物以酯鍵結(jié)合于聚谷氨酸側(cè)鏈中的多個羧基上的構(gòu)造、以及兩個以上的嵌段共聚物部分 通過一個藥物而交聯(lián)的構(gòu)造。本發(fā)明的高分子微團，例如，能夠通過將骨架聚合物單元α和骨架聚合物單元β 在水性溶液中混合，使其自組裝成微團狀而形成。另外，例如，本發(fā)明的高分子微團，能夠通 過在將骨架聚合物單元β和骨架聚合物單元Y在水性溶液中混合、使其自組裝成微團狀 之后，將具有標的結(jié)合部位的化合物結(jié)合在骨架聚合物單元Y的親水性片段的α末端上 而形成。水性溶液，例如，能夠通過在精制水中添加乙醇和二甲基亞砜等可與水混合的有機 溶液和公知的緩沖劑而形成。準備具有相互不同的標的結(jié)合能力的多種骨架聚合物單元 α，和結(jié)合有相互不同的藥物的多種骨架聚合物單元β，通過分別適當進行組合，能夠容易 地形成各種活性靶向型藥物內(nèi)包高分子微團，非常方便。以專利文獻1中記載的高分子結(jié)合物為代表的現(xiàn)有的活性靶向型DDS，通過在以 酯鍵結(jié)合有藥物的嵌段共聚物上，結(jié)合具有標的結(jié)合部位的化合物而形成。但是，在使藥物 結(jié)合在嵌段共聚物上的過程中，在嵌段共聚物中用于結(jié)合具有標的結(jié)合部位的化合物的官 能團或者取代基有可能失去與該化合物結(jié)合的能力。另外，在結(jié)合該化合物的過程中，藥物 有可能發(fā)生分解。因此，現(xiàn)有的活性靶向型DDS難以簡便地進行調(diào)制。另一方面，如上所述， 本發(fā)明的高分子微團不僅能夠避免藥劑的失活，還能夠容易地形成各種活性靶向型內(nèi)包高 分子微團。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供含有上述的高分子微團和制藥學上可接受的載體的醫(yī)藥組合物。制藥學上可接受的載體，根據(jù)目的的給藥劑型，可以是該技術領域中常用的稀釋劑以及賦形劑，但是優(yōu)選適用于調(diào)制作為非口服藥劑的液劑、冷凍干燥劑的精制水、去離子水、 等滲劑以及PH調(diào)整劑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的給藥方法，優(yōu)選皮下、靜脈、動脈、局部等的非口服給藥方 法。醫(yī)藥組合物的給藥量可以根據(jù)藥物的種類、用法、患者的年齡、性別、患者的健康狀態(tài)等 進行適當調(diào)整，以藥物進行換算，以每天0. 1 lOOOOmg/m2的范圍、優(yōu)選1 1000mg/m2的 范圍給藥。實施例以下，通過實施例進一步詳細地說明本發(fā)明。(實施例1)如下操作形成作為高分子微團的鐵傳遞蛋白結(jié)合喜樹堿微團，該高分子微團中， 具有鐵傳遞蛋白作為具有標的結(jié)合部位的化合物，內(nèi)包喜樹堿(CPT)作為藥物。首先，作為骨架聚合物單元β，如下操作形成喜樹堿結(jié)合物(PEG-pGlu-CPT)。使 Ig的PEG-pGlu-Ac在80mL的無水二甲基甲酰胺(無水DMF)中溶解后，添加387mg的喜樹 堿(和光純藥)。另外，該PEG-pGlu-Ac中的PEG鏈長為12kDa，天冬氨酸的平均殘基數(shù)為 40，天冬氨酸的側(cè)鏈為羧酸。接著，依次添加823mg的N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(國產(chǎn)化 學)和136mg的二甲基氨基吡啶(和光純藥)，在4°C攪拌3天，升溫至室溫之后進一步攪 拌過夜。將這樣得到的反應液移至透析管(Spectrum Laboratories, Spectra/Por ，截留 分子量值為3500)，相對于精制水，在4°C進行透析。除去白色沉淀之后，將得到的黃色溶液 以孔徑為0. 8 μ m的過濾器(MilliPore公司生產(chǎn)的Millex _AA)進行過濾。將濾液冷凍 干燥，由此得到1. Ig淡黃色粉末的PEG-pGlu-CPT。該PEG-pGlu-CPT中，喜樹堿處于通過酯 鍵結(jié)合在PEG-pGlu上的狀態(tài)(MeO-PEG-pGlu-CPT)。該PEG-pGlu-CPT具有上述通式II_a 所示的構(gòu)造。PEG的鏈長為12kDa。準備在PEG末端具有馬來酰亞胺基的聚合物(Maieimide-PEG-PBLA)。該聚合 物中的PEG的鏈長為12kDa。在樣品瓶中精確稱取IOmg的PEG-pGlu-CPT和IOmg的 Maleimide-PEG-PBLAj^W ImL 精制水。在 4°C攪拌一晝夜之后，使用 Biodisruptor (日本 精機制作所High Power Unit)，在冰浴下超聲波處理10分鐘，以孔徑為0. 22 μ m的過濾器 (MiIliPore公司生產(chǎn)的MiIlex -GP PES)進行過濾，回收濾液。將濾液進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0))，回收微團成分(1. 5mL)。 在該微團成分中，含有PEG-pGlu-CPT和Maleimide-PEG-PBLA呈放射狀排列的微團。在人類來源的鐵傳遞蛋白(Sigma-Aldrich公司)(以下，有時將鐵傳遞蛋白表示 為Tf)40mg中，添加0. 2M的硼酸緩沖液(pH 8. 0)、IOOmM的乙二胺四乙酸(EDTA)和精制水， 溶解Tf。接著添加10mg/mL的Traut' s試劑(Pierce Chemical公司)138 μ L，使硼酸緩 沖液的最終濃度為50mM，EDTA的最終濃度為2mM，形成共計ImL的混合液之后，在30°C靜置 45分鐘。將這樣得到的反應液進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM 磷酸鈉緩沖液(PH7. 0)，2mMEDTA)，回收高分子成分(1. 5mL)。混合該回收液0. 75mL和上述的微團成分0. 75mL，在30°C靜置2小時，由此使 Maleimide-PEG-PBLA的馬來酰亞胺基與Tf反應，形成含有作為骨架聚合物單元α的鐵 傳遞蛋白結(jié)合聚合物的微團。該鐵傳遞蛋白結(jié)合聚合物具有上述通式I_a所示的構(gòu)造。PEG的鏈長為12kDa。該反應液中的磷酸鈉緩沖液的最終濃度為20mM，EDTA的最終濃度為ImM。接著，在反應液中添加200mM甲酸銨緩沖液，將pH調(diào)整為5之后，進行凝膠過濾精制 (Sepharose CL-4B (1Φ X 30cm)，洗脫液20mM乙酸鈉緩沖液(ρΗ5. 0))，由此除去未反應的 Tf0將回收的微團成分通過進行超濾(MilliPore公司生產(chǎn)的AmiconUltra_15)濃縮 至2mL之后，添加NaHCO3-Na2CO3緩沖液(pH9. 6)將pH調(diào)整至7，接著在添加了 IOOmM的半 胱氨酸溶液20 μ L的狀態(tài)下，在室溫下靜置10分鐘。將這樣得到的反應液進行凝膠過濾 (GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 4))，回收高分子成分 (3mL)。向該高分子成分中分別添加IM的FeCljP IOOmM的Na2CO3 (以IOOmM的檸檬酸調(diào)整 為PH7.0)各30yL。將這樣得到的混合液在4°C靜置過夜之后，進行超濾(MilliPore公司 生產(chǎn)的AmiconUltra-15)，通過重復進行利用20mM的磷酸鈉緩沖液(pH7. 4)稀釋和去除鐵 離子，最終濃縮為2mL。將該濃縮液以0.22 μ m的過濾器(MilliPore公司生產(chǎn)的MiIlex GV)進行過濾，回收濾液，由此得到含有鐵傳遞蛋白結(jié)合喜樹堿微團的溶液。(實施例2)使用多西紫杉醇(DTX)作為藥物，以多西紫杉醇結(jié)合物(PEG-pGlu-DTX)作為骨架 聚合物單元β，除此以外，與實施例1相同進行操作，得到作為高分子微團的鐵傳遞蛋白結(jié) 合多西紫杉醇，該高分子微團中具有鐵傳遞蛋白作為具有標的結(jié)合部位的化合物，內(nèi)包多 西紫杉醇作為藥物。另外，構(gòu)成骨架聚合物單元α和骨架聚合物單元β的嵌段共聚物部分 的PEG的鏈長均為lOkDa。PEG-pGlu-DTX中，多西紫杉醇處于以通過酯鍵結(jié)合在PEG-pGlu 上的狀態(tài)(MeO-PEG-pGlu-DTX)，具有上述通式II_a所示的構(gòu)造。作為骨架聚合物單元β的PEG-pGlu-DTX如下操作形成。將聚谷氨酸的單末端 處于乙?；癄顟B(tài)的500mg聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(PEG-pGlu-Ac)在IOmL無水 DMF(關東化學)中溶解后，再添加1.06g多西紫杉醇(ScinoPharm Taiwan, Ltd)。另外， 該PEG-pGlu-Ac中的PEG的平均分子量為10000，谷氨酸的平均殘基數(shù)為40，谷氨酸的側(cè)鏈 為羧酸。接著，依次添加160mg的4-二甲基氨基吡啶(和光純藥)和210yL的N，N’ - 二 異丙基碳二亞胺(國產(chǎn)化學)，在室溫下攪拌過夜。將這樣得到的反應液向己烷和乙酸乙 酯的混合溶液(體積比1 l)500mL中滴下使聚合物結(jié)晶析出后，減壓過濾收集該聚合物。 將過濾收集得到的聚合物在IOOmL精制水中懸濁，作為高分子微團進行超濾(MilliPore 公司生產(chǎn)的實驗室規(guī)模TFF系統(tǒng)，截留分子量值為100000，5倍稀釋后，濃縮至100mL)。將 該超濾操作重復進行5次之后，進行冷凍干燥。將通過冷凍干燥得到的聚合物在IOmL無 水DMF中溶解的狀態(tài)下，向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(體積比1 l)500mL中滴下使聚 合物結(jié)晶析出之后，減壓過濾收集該聚合物。將過濾收集得到的聚合物以粉末狀態(tài)原樣向 己烷和乙酸乙酯的混合溶液(體積比1 DlOOmL中添加從而洗凈之后，進行減壓過濾收 集。將過濾收集得到的聚合物在室溫下進行減壓干燥過夜，由此得到530mg淡黃色粉末的 PEG-pGlu-DTX。使Img的PEG-pGlu-DTX在精制水和乙醇的混合溶液(體積比1 1) IOmL中溶 解，根據(jù)對波長233nm的光線的吸光度測定多西紫杉醇的含量，結(jié)果為每一聚合物中含有 14. 3個分子。該PEG-pGlu-DTX中，多西紫杉醇處于以酯鍵結(jié)合在PEG-pGlu-Ac上的狀態(tài) (MeO-PEG-pGlu-EVE)。該PEG-pGlu-EVE具有上述通式II_a所示的構(gòu)造。PEG的鏈長為<formula>formula see original document page 11</formula>
(實施例3)如下操作形成作為高分子微團的EGF結(jié)合多西紫杉醇微團，該高分子微團中具有 上皮生長因子(EGF)作為具有標的結(jié)合部位的化合物，內(nèi)包多西紫杉醇(DTX)作為藥物。與實施例2相同地形成作為骨架聚合物單元β的DTX結(jié)合物(PEG-pGlu-DTX)。準備PEG鏈長為IOkDa的在PEG末端具有馬來酰亞胺基的聚合物 (Maleimide-PEG-PBLA)。在樣品瓶中精確稱取5mg該聚合物和5mg的PEG-pGlu-DTX，添加 ImL精制水之后，進行與實施例1相同的處理，回收微團成分(1.5mL)。該微團成分中含有 PEG-pGlu-DTX 和 Maleimide-PEG-PBLA 呈放射狀排列的微團。在添加有Img重組人類EGF (R&D System公司)的瓶中，添加精制水lmL，調(diào)制Img/ mL的EGF溶液。對該EGF溶液0. 5mL添加0. 2M的硼酸緩沖液(pH8. 0)、IOOmM的乙二胺四乙 酸(EDTA)和精制水，進一步添加 10mg/mL 的 Traut，s 試劑(Pierce Chemical 公司)138 μ L， 以使硼酸緩沖液的最終濃度為50mM、EDTA的最終濃度為2mM，形成合計ImL的混合液之后， 在30°C靜置45分鐘。接著，將這樣得到的反應液進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的 PD-10，洗脫液:20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0), 2mM EDTA)，回收高分子成分(1. 5mL)?；旌显摶厥找?. 5mL和上述微團成分0. 5mL,在30°C靜置2小時，由此使 Maleimide-PEG-PBLA的馬來酰亞胺基與EGF反應，形成含有作為骨架聚合物單元α的EGF 結(jié)合聚合物的微團。該EGF結(jié)合聚合物具有上述通式I-a所示的構(gòu)造。將這樣得到的反應液 進行凝膠過濾精制(S印harose CL-4B (1Φ X 30cm)，洗脫液20mM乙酸鈉緩沖液(pH7. 4))， 由此除去未反應的EGF。將回收的微團成分通過進行超濾(MilliPore公司生產(chǎn)的AminconUltra-15)濃縮至約2mL，得到含有EGF結(jié)合多西紫杉醇的溶液。(實施例4)如下操作形成作為高分子微團的抗RANKL抗體結(jié)合依維莫司微團，該高分子微團 具有抗RANKL抗體作為具有標的結(jié)合部位的化合物，內(nèi)包依維莫司(EVE)作為藥物。首先，如下操作形成作為骨架聚合物單元β的依維莫司結(jié)合物(PEG-pGlu-EVE)。 將聚谷氨酸的單末端處于乙?；癄顟B(tài)的140mg聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物 (PEG-pGlu-Ac)在IOmL無水DMF (關東化學)中溶解后，再添加142mg的依維莫司(M0LCAN. Co.)。另外，該PEG-pGlu-Ac中的PEG的平均分子量為10000，谷氨酸的平均殘基數(shù)為40，谷 氨酸的側(cè)鏈為羧酸。接著，依次添加16. 9mg的4-二甲基氨基吡啶(和光純藥)和22. OyL 的N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(國產(chǎn)化學)，在室溫下攪拌過夜。將這樣得到的反應液向己 烷和乙酸乙酯的混合溶液(體積比3 DlOOmL中滴下使聚合物結(jié)晶析出后，減壓過濾收 集該聚合物。將由過濾收集得到的聚合物在無水DMF中溶解的狀態(tài)下，對蒸餾水透析兩天 (截留分子量(MWCO) = 3500，交換4次蒸餾水)后，進行冷凍干燥。將由冷凍干燥得到聚合 物在IOmL無水DMF中溶解的狀態(tài)下，向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(體積比3 1) IOOmL 中滴下使聚合物結(jié)晶析出之后，減壓過濾收集該聚合物。將過濾收集得到的聚合物以粉末 狀態(tài)原樣向己烷和乙酸乙酯的混合溶液(體積比3 DlOOmL中添加從而洗凈之后，進行 減壓過濾收集。將過濾收集得到的聚合物在室溫下進行減壓干燥過夜，由此得到ISOmg淡 黃色粉末的PEG-pGlu-EVE。
使Img的PEG-pGlu-EVE在精制水和甲醇的混合溶液(體積比1 1) 25mL中 溶解，根據(jù)對波長278nm的光線的吸光度測定依維莫司的含量，結(jié)果為每一聚合物中含 有12. 6個分子。該PEG-pGlu-EVE中，依維莫司處于以酯鍵結(jié)合在PEG-pGlu上的狀態(tài) (MeO-PEG-pGlu-EVE)。該PEG-pGlu-EVE具有上述通式II_a所示的構(gòu)造。PEG的鏈長為 IOkDa0在樣品瓶中精確稱取5mg的PEG-pGlu-EVE，添加ImL精制水。在4°C攪拌一晝夜 之后，使用Biodisruptor (日本精機制作所生產(chǎn)HighPower Unit)，在冰浴下超聲波處理10 分鐘，使用0.22 μ m的過濾器(MilliPore公司生產(chǎn)的Millex GP PES)進行過濾，回收濾 液。在該濾液中，含有作為骨架聚合物單元β的PEG-pGlu-EVE。如下操作形成作為骨架聚合物單元α的抗RANKL抗體結(jié)合聚合物。準備在PEG末 端具有馬來酰亞胺基的聚合物(Maleimide-PEG-PBLA)。該聚合物中的PEG的鏈長為lOkDa。 在樣品瓶中準確稱取5mg的Maleimide-PEG-PBLA，添加ImL 20mM的磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)。在4°C攪拌一晝夜之后，使用Biodisruptor (日本精機制作所生產(chǎn)HighPower Unit)， 在冰浴下超聲波處理10分鐘，使用0. 22 μ m的過濾器(MilliPore公司生產(chǎn)的Millex GP PES)進行過濾，回收含有Maleimide-PEG-PBLA的濾液。在添加有500 μ g的抗RANKL抗體(R&D Systems公司)的瓶中，添加0. 5mL的PBS， 調(diào)制lmg/mL的抗RANKL抗體溶液。對該抗RANKL抗體溶液0. 4mL添加0. 2M的硼酸緩沖液 (ρΗ8. 0)、IOOmM 的 EDTA 和精制水，再添加 10mg/mL 的 Traut’ s 試劑(Pierce Chemical 公 司)2 μ L，以使硼酸緩沖液的最終濃度為50mM、EDTA的最終濃度為2mM，形成合計0. 6mL的 混合液之后，在30°C靜置45分鐘。接著，將這樣得到的反應液進行凝膠過濾(GE Science 公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0), 2mM EDTA)，回收高分子成分 (1. 5mL) ο混合該回收液1. 5mL和上述含有Maleimide-PEG-PBLA的濾液38 μ L，在30°C靜 置2小時，再在4°C靜置過夜，由此使Maleimide-PEG-PBLA的馬來酰亞胺基與抗RANKL抗 體反應，形成作為骨架聚合物單元α的抗RANKL抗體結(jié)合聚合物。該抗RANKL抗體結(jié)合聚 合物具有上述通式Ι-a所示的構(gòu)造。將這樣得到的反應液進行凝膠過濾精制(Si^pharose CL-4B (1Φ X 30cm)，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 4))，由此除去未反應的SH化抗體。通過將回收的微團成分進行超濾(MilliPore公司生產(chǎn)的AminconUltra_15，截留 分子量值為100000)，濃縮至約lmL，得到含有抗RANKL抗體結(jié)合聚合物的溶液?；旌虾蠵EG-pGlu-EVE的濾液36 μ L和含有抗RANKL抗體結(jié)合聚合物的溶液 500 μ L，在4°C靜置3天，由此得到含有抗RANKL抗體結(jié)合依維莫司微團的溶液。使用 Zetasizer (Malvern Instruments公司)進行測定，抗RANKL抗體結(jié)合依維莫司微團的平均 粒徑為119nm。(實施例5)如下操作形成作為高分子微團的鐵傳遞蛋白結(jié)合依維莫司微團，該高分子微團具 有鐵傳遞蛋白作為具有標的結(jié)合部位的化合物，內(nèi)包依維莫司作為藥物。與實施例4相同地得到含有作為骨架聚合物單元β的PEG-pGlu-EVE的濾液。如下操作形成作為骨架聚合物單元α的鐵傳遞蛋白結(jié)合聚合物。首先，與實施例 4相同地得到含有Maleimide-PEG-PBLA的濾液。使IOmg的人鐵傳遞蛋白(Sigma-Aldrich公司)在ImL精制水中溶解，調(diào)制鐵傳遞蛋白溶液。對該鐵傳遞蛋白溶液696 μ L，添加0. 2Μ 的硼酸緩沖液(ΡΗ8. 0) UOOmM的EDTA和精制水，再添加10mg/mL的Traut，s試劑(Pierce Chemical公司)34 μ L，使硼酸緩沖液的最終濃度為50mM，EDTA的最終濃度為2mM，形成合 計ImL的混合液之后，在30°C靜置45分鐘。接著，將這樣得到的反應液進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0), 2mM EDTA)，回收高分子 成分(1. 5mL)。混合該回收液1. 5mL和含有上述Maleimide-PEG-PBLA的濾液0. 9mL (聚合物濃度 5mg/mL)，在30°C靜置2小時(磷酸鈉緩沖液(ρΗ7. 0)的最終濃度為20mM，EDTA的最終濃 度為ImM)，再在4°C靜置過夜，由此使Maleimide-PEG-PBLA的馬來酰亞胺基與鐵傳遞蛋白 反應，形成作為骨架聚合物單元α的鐵傳遞蛋白結(jié)合聚合物。該鐵傳遞蛋白結(jié)合聚合物具 有上述通式I-a所示的構(gòu)造。將這樣得到的反應液進行凝膠過濾精制(S印harose CL-4B (1Φ X 30cm)，洗脫液 20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 4))，由此除去未反應的SH化鐵傳遞蛋白。將回收的微團成分通過 超濾(MilliPore公司生產(chǎn)的Amicon Ultra_15，截留分子量值為100000)濃縮至約2mL之 后，添加NaHCO3-Na2CO3緩沖液(pH9. 6)將pH調(diào)整為7，進一步在添加IOOmM的半胱氨酸溶液 20 μ L的狀態(tài)下，在室溫下靜置10分鐘。將這樣得到的反應液進行凝膠過濾(GE Science 公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 4))，回收高分子成分(3mL)。向該 高分子成分中分別添加IM的FeCl3UOOmM的Na2CO3 (以IOOmM的檸檬酸調(diào)整為pH 7. 0)各 30 μ L0將這樣得到混合液在4°C靜置過夜之后，進行超濾(MilliPore公司生產(chǎn)的Amicon Ultra-15，截留分子量值為100000)，重復進行以20mM的磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)稀釋和除 去鐵離子，由此最終濃縮至約3mL，得到含有鐵傳遞蛋白結(jié)合聚合物的溶液?；旌虾蠵EG-pGlu-EVE的濾液200 μ L和含有鐵傳遞蛋白結(jié)合聚合物的溶 液500yL，在4°C靜置3天，由此得到含有鐵傳遞蛋白結(jié)合依維莫司微團的溶液。使用 Zetasizer(Malvern Instruments公司)進行測定，鐵傳遞蛋白結(jié)合依維莫司微團的平均 粒徑為106nm。(比較例1)如下操作形成不具有標的結(jié)合部位而內(nèi)包多西紫杉醇作為藥物的高分子微團 (下面，為了容易地進行說明，稱為Tf非結(jié)合DTX微團)。在樣品瓶中準確稱取實施例2中 形成的PEG-pGlu-DTX 10mg，添加20mM的磷酸鈉緩沖液(pH 7.0) ImL使之懸濁。在4°C攪 拌一晝夜之后，使用Biodisruptor (日本精機制作所生產(chǎn)High Power Unit)，在冰浴下超聲 波處理10分鐘，以孔徑0.22 μ m的過濾器(MilliPore公司生產(chǎn)的MiIlex GP PES)進行 過濾，回收濾液。將該濾液進行凝膠過濾(GEScience公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液10%蔗糖 溶液)，由此得到含有Tf非接合DTX微團的高分子成分。(比較例2)如下操作形成不具有含有標的結(jié)合部位的化合物而內(nèi)包喜樹堿作為藥物的高分 子微團(下面，為了容易地進行說明，稱為Tf非接合CPT微團)。在樣品瓶中準確稱取實 施例1中形成的PEG-pGlu-CPT 10mg，添加精制水ImL使之懸濁。在4°C攪拌一晝夜之后， 使用Biodisruptor (日本精機制作所生產(chǎn)High Power Unit)，在冰浴下超聲波處理10分 鐘，以孔徑0.22 μ m的過濾器(MiIliPore公司生產(chǎn)的MiIlex GP PES)進行過濾，回收濾液。將該濾液進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液 (pH 7. 0)，由此得到含有Tf非接合CPT微團的高分子成分。(比較例3)
如下操作形成具有Tf作為含有標的結(jié)合部位的化合物但不內(nèi)包藥物的高分子微 團(下面，為了容易地進行說明，稱為Tf結(jié)合空微團)。準備在PEG末端具有馬來酰亞胺基的聚合物(Maleimide-PEG-PBLG)。該聚合物中 的PEG的鏈長為lOkDa。在樣品瓶中精確稱取5mg的Maleimide-PEG_PBLG」^W ImL 20mM 的磷酸鈉緩沖液(PH 7. 0)。在4°C攪拌一晝夜之后，使用BiodisruptoH日本精機制作所生 產(chǎn)HighPower Unit)，在冰浴下超聲波處理10分鐘，以孔徑0. 22 μ m的過濾器(MilliPore 公司生產(chǎn)的Millex GP PES)進行過濾，由此回收含有Maleimide-PEG-PBLG的濾液。在人類來源的Tf (和光純藥)IOmg中，添加0. 2M的硼酸緩沖液(ρΗ8· 0)、IOOmM的 乙二胺四乙酸(EDTA)和精制水，溶解Tf。接著再添加lOmg/mL的Traut，s試劑(Pierce Chemical公司)34μ L，使硼酸緩沖液的最終濃度為50mM，EDTA的最終濃度為2mM，形成 合計為ImL的混合液之后，在30°C靜置45分鐘。將這樣得到的反應液進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0), 2mM EDTA)，回收高分子 成分(1. 5mL)?；旌显摶厥找?. 5mL和上述含有Maleimide-PEG-PBLG的濾液0. 9mL,在30°C靜置 2小時，再在4°C靜置過夜，由此使Maleimide-PEG-PBLG的馬來酰亞胺基與Tf反應。將這 樣得到的反應液進行凝膠過濾精制(S印harose CL-4B (2Φ X 30cm)，洗脫液20mM磷酸鈉 緩沖液(PH7. 0))，由此除去未反應的SH化Tf。將由凝膠過濾回收得到的高分子成分進行超濾(MilliPore公司生產(chǎn)的Amicon Ultra-15，截留分子量值為100000)，回收高分子成分(4mL)。在0. 5mL的該高分子成分中， 混合IOOmM的FeCl3 (IOOmM檸檬酸以IM的Na2CO3調(diào)整為pH 7. 0) 50 μ L。將這樣得到的混 合液在4°C靜置2小時，進行凝膠過濾(GE Science公司生產(chǎn)的PD-10，洗脫液20mM磷酸 鈉緩沖液(PH 7.0))，除去剩余的鐵離子，由此得到含有Tf結(jié)合空微團的溶液。[細胞毒性試驗1]將實施例2的Tf結(jié)合DTX微團的細胞毒性與比較例1的Tf非接合DTX微團的細胞 毒性進行比較。使用通過DS Pharma Biomedical株式會社從ECACC(European Collection of Cell Culture)購入的人乳腺癌MDA-MB-231細胞，基于WST法，對各微團的細胞毒性如 下進行評價。將該細胞在90 μ L的培養(yǎng)基中懸濁的狀態(tài)下接種在96孔板中，使每個孔中含有 約5000個人乳腺癌MDA-MB-231細胞，在37°C、5% CO2的氣氛下培養(yǎng)過夜。該培養(yǎng)基由 RPMI1640 (Gibco , Invitrogen)和 10% FBS (Fetal Bovine Serum, biowest)形成。接著， 將實施例2的微團溶液和比較例1的微團溶液以培養(yǎng)基稀釋成各種DTX濃度的樣品溶液， 向各個孔中添加(每孔IOyL),在37°C、5%C02的氣氛下培養(yǎng)2小時。之后，從孔內(nèi)除去培 養(yǎng)基，以磷酸緩沖生理鹽水(PBS)將孔內(nèi)洗凈2次，添加新鮮的培養(yǎng)基(每孔100 μ L)，繼續(xù) 培養(yǎng)直至總培養(yǎng)時間達到72小時。之后，添加WST Reagent (同仁)(每孔10 μ L)，在37°C、 5% CO2的氣氛下繼續(xù)培養(yǎng)約2小時。對各個孔測定對450nm的光線的吸光度(Abs450)，根 據(jù)下述的數(shù)學式算出細胞增殖率(^cellgrowth)。另外，該數(shù)學式中的對照的Abs450值，是指由使用不含有DTX的培養(yǎng)液進行上述培養(yǎng)的孔所得到吸光度。
<formula>formula see original document page 15</formula>圖1是表示MDA-MB-231細胞相對于多西紫杉醇濃度的細胞增殖率的圖。該圖的 橫軸是表示將樣品溶液中的微團的量換算成多西紫杉醇濃度得到的值。黑方塊是添加Tf 非結(jié)合DTX微團時的數(shù)據(jù)，黑三角是添加Tf結(jié)合DTX微團時的數(shù)據(jù)。各數(shù)據(jù)的誤差棒是標 準偏差(SD)。如圖1的圖所示，Tf結(jié)合DTX微團對MDA-MB-231細胞的細胞毒性，與Tf非 結(jié)合DTX微團相比，從低DTX濃度開始發(fā)揮顯著作用。[細胞毒性試驗2]細胞毒性試驗2中，將添加樣品溶液實施的培養(yǎng)時間變更為72小時、之后立刻將 WST Reagent以每孔10 μ L分別添加，在37°C、5% CO2的氣氛下繼續(xù)培養(yǎng)約2小時，除此以 夕卜，與細胞毒性試驗1相同地進行，研究實施例2的Tf結(jié)合DTX微團和比較例1的Tf非結(jié) 合DTX微團的細胞毒性。另外，各微團的DTX濃度，基于對波長233nm的光線的吸光度而算出。其中，對于 Tf結(jié)合DTX微團，減去對波長233nm的光線的吸光度中的Tf (脫鐵鐵傳遞蛋白)的部分的值。圖2是表示MDA-MB-231細胞相對于多西紫杉醇濃度的生存率的圖。該圖中的縱 軸、橫軸、黑方塊和黑三角所表示的意思與圖1的圖相同。各數(shù)據(jù)中的誤差棒為標準偏差 (SD)。如圖2的圖所示，Tf結(jié)合DTX微團對MDA-MB-231細胞的細胞毒性，與Tf非結(jié)合DTX 微團相比，從低DTX濃度開始發(fā)揮顯著作用。[細胞毒性試驗3]細胞毒性試驗3中，作為細胞，使用通過住商Pharma International株式會社從 ATCC(American Type Culture Collection)購入的人前列腺癌DU145細胞，作為微團，使用 實施例1的Tf結(jié)合CPT微團和比較例2的Tf非結(jié)合CPT微團，將添加樣品溶液實施的培 養(yǎng)時間變更為8小時，除此以外，與細胞損傷試驗1同樣地進行，研究各微團的細胞毒性。[細胞毒性試驗4]細胞毒性試驗4中，作為細胞，使用通過DS Pharma Biomedical株式會社從ECACC 購入的人肝癌HepG2細胞，除此以外，與細胞損傷試驗3相同地進行，研究各微團的細胞毒性。[細胞毒性試驗5]細胞毒性試驗5中，作為細胞，使用人乳腺癌MDA-MB-231細胞，除此以外，與細胞 毒性試驗3相同地進行，研究各微團的細胞毒性。細胞毒性試驗3 5的結(jié)果如表1所示。表1的“溶液”相關的數(shù)據(jù)，是直接添加 微團內(nèi)沒有內(nèi)包CPT的培養(yǎng)液而調(diào)制得到的樣品溶液相關的數(shù)據(jù)。[表 1]GI50 (pg/mL)
~~I胞名來i —溶液I Tf非結(jié)合微團I Tf結(jié)合微團Tf的效果DU145 人前列腺癌 0.01 Γθ 025^0 HepG2 人肝癌 0^04 Γθ θ Ο ”
MDA-MB-231 人乳腺癌 KO 2^0 0^0367 Tf的效果Tf非結(jié)合微團的GI50/Tf結(jié)合微團的GI50另外，各微團的CPT濃度如下進行測定。a) CPT濃度的測定方法相對微團樣品100 μ L，添加200 μ L 6Ν的HC1，在凍存管(Cryotube)(家田化學) 中以100°C加熱1小時。回收得到的反應液75 μ L，添加50 μ L 6Ν的NaOH中和之后，以 0. 22 μ m的過濾器(MilliPore公司生產(chǎn)的MILLEX _GV)過濾。將濾液以25mM的甲酸銨緩 沖液(pH 3. 0)稀釋10倍，將該處理樣品溶液填充至HPLC樣品瓶中，以下述的分析條件進 行HPLC分析，由此測定CPT濃度。b) HPLC分析條件系統(tǒng)Waters Alliance System柱TosohTSK-gel 0DS_80TM(4. 6Φ X 150mm) (40°C )流動相:25mM的甲酸銨(pH 3. 0)/乙腈=70/30流速lmL/min檢測熒光(Ex:370nm, Em :420nm)注入體積20 μ L[細胞毒性試驗6]細胞毒性試驗6中，作為細胞，使用通過DS Pharma Biomedical株式會社從ECACC 購入的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，作為微團，使用比較例3的Tf結(jié)合空微團，并且藥劑和細 胞的接觸時間延長至72小時，除此以外，與細胞損傷試驗3相同地進行，研究各微團的細胞毒性。圖5是表示MDA-MB-231細胞相對于Tf濃度的細胞增殖率的圖。該圖的橫軸表示 將樣品溶液中的微團的量換算成Tf濃度得到的值。黑方塊表示添加Tf結(jié)合空微團時的數(shù) 據(jù)，黑三角表示添加Tf結(jié)合DTX微團時的數(shù)據(jù)，白圓表示添加Tf溶液時的數(shù)據(jù)。各數(shù)據(jù)中 的誤差棒為標準偏差(SD)。如圖5的圖所示，Tf結(jié)合多西紫杉醇顯示對MDA-MB-231細胞 的優(yōu)異的細胞毒性，但是，Tf溶液和Tf結(jié)合空微團沒有細胞毒性。[藥效評價試驗]使用由RPMI1640和10% FBS形成的培養(yǎng)基，將人乳腺癌MDA-MB-231細胞在37°C、 5% CO2的氣氛下，培養(yǎng)至增殖到移植所需要的細胞數(shù)。之后，將該細胞以在100μ L的生理 鹽水中懸濁的狀態(tài)，接種在雌性裸鼠(Balb nu/nu，5周齡，日本Charles River株式會公司 生產(chǎn))的背部皮下。每只裸鼠接種的細胞為3X IO6個。之后，在通過飼養(yǎng)裸鼠21天使腫 瘤體積達到70. 8士3. 7mm3 (Average士SE)時，開始將藥物內(nèi)包微團給藥。給藥日程為每隔四天共計3次尾靜脈內(nèi)給藥，對以下三組，每周測定3次腫瘤體積 以及小鼠體重。每組中的小鼠數(shù)量為8只。(1)對照(無處理)
(2)比較例1的Tf非結(jié)合DTX微團(每次的DTX給藥量為小鼠每Ikg體重給藥 IOmg)(2)實施例2的Tf結(jié)合DTX微團(每次的DTX給藥量為小鼠每Ikg體重給藥IOmg)圖3是表示腫瘤體積的經(jīng)時變化的圖。該圖的縱軸是表示相對試驗開始時的腫瘤 體積的相對值，橫軸表示從試驗開始所經(jīng)過的時間(Days)。該圖中的箭頭表示將藥物內(nèi)包 微團給藥的時間。黑圓表示對照組的數(shù)據(jù)，黑三角表示 Tf非結(jié)合DTX微團組的數(shù)據(jù)，黑方 塊表示Tf結(jié)合DTX微團組的數(shù)據(jù)。圖4是表示小鼠的體重變化的圖。圖4的圖的縱軸表 示相對于試驗開始時的小鼠體重的相對值。圖4的圖中的橫軸、箭頭、黑圓、黑三角和黑方 塊表示的意思與圖3的圖相同。各數(shù)據(jù)中的誤差棒為標準誤差(SE)。如圖3和圖4的圖所示，如果以Tf結(jié)合DTX微團給藥，則與對照和以Tf非結(jié)合DTX 微團給藥時相比，能夠?qū)崿F(xiàn)小鼠體重沒有變化的狀態(tài)，并且顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231 細胞的增殖。另外，雖然圖3的圖中沒有表示，但是以Tf結(jié)合DTX微團給藥時，能夠使給藥 第29天的T/C值(藥物給藥組⑴和對照組(C)的腫瘤體積比)降低至0. 33。
權利要求
一種藥物內(nèi)包活性靶向型高分子微團，其特征在于包括具有標的結(jié)合部位的骨架聚合物單元α和具有藥物而不具有所述標的結(jié)合部位的骨架聚合物單元β，所述骨架聚合物單元α和骨架聚合物單元β，以所述標的結(jié)合部位朝向外側(cè)并且所述藥物朝向內(nèi)側(cè)的狀態(tài)呈放射狀排列，i)當在維持所述放射狀排列的狀態(tài)下與標的結(jié)合時，通過胞吞作用被攝入供給該標的的細胞的內(nèi)部，所述放射狀排列在所述細胞內(nèi)崩解，由此使所述藥物在該細胞內(nèi)釋放，ii)當與標的結(jié)合之前在血液中所述放射狀排列崩解時，所述骨架聚合物單元β通過代謝排出體外，由此能夠防止所述藥物對正常細胞造成損傷。
2.如權利要求1所述的高分子微團，其特征在于所述骨架聚合物單元α，由具有標的結(jié)合部位的化合物和嵌段共聚物形成，以通式I Z-A1-B1 表示，骨架聚合物單元β，由藥物和嵌段共聚物形成，以通式II =A2-B2 (-D)表示，其中，Z是具有標的結(jié)合部位的化合物，A1和A2是相互獨立的聚乙二醇鏈片段，B1和B2 是相互獨立的聚氨基酸鏈片段，D是所述藥物。
3.如權利要求2所述的高分子微團，其特征在于所述骨架聚合物單元α以下述通式I_a或者通式I_b表示，所述骨架聚合物單元β 以下述通式ΙΙ-a或者通式ΙΙ-b表示，其中，R1是具有標的結(jié)合部位的所述化合物，R2是C1-C12的烷基或者是末端具有羥基的 C1-C12的烷基，L1是O (CH2)pNH, L2是O (CH2)p-CO-, ρ是1 5范圍內(nèi)的整數(shù)，R是氫原子或 者疏水性有機基團，q是1或2，Ii1和Ii2是相互獨立的40 450范圍內(nèi)的整數(shù)，Hi1和m2是 相互獨立的20 80范圍內(nèi)的整數(shù)，R3是所述藥物殘基或者總數(shù)m2的至少10 70%具有 連接基團的所述藥物殘基，當存在時，其它的基團為氫原子或者疏水性有機基團。<formula>formula see original document page 3</formula>
4. 一種醫(yī)藥組合物，其特征在于含有權利要求1所述的高分子微團和制藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明目的在于提供一種能夠防止不適當?shù)蒯尫潘幬锒鴵p傷正常細胞的藥物內(nèi)包活性靶向型高分子微團。該高分子微團(100)，包括具有標的結(jié)合部位(11)的骨架聚合物單元(10)、和具有藥物(14)而不具有標的結(jié)合部位(11)的骨架聚合物單元(20)，這些單元(10)、(20)，以標的結(jié)合部位(11)朝向外側(cè)并且藥物(14)朝向內(nèi)側(cè)的狀態(tài)呈放射狀排列，i)當在維持放射狀排列的狀態(tài)下與標的(40)結(jié)合時，通過胞吞作用被攝入供給標的(40)的細胞(50)的內(nèi)部，放射狀排列在細胞(50)內(nèi)崩解，由此使藥物(14)在細胞(50)內(nèi)釋放，ii)當與標的(40)結(jié)合之前在血液(60)中放射狀排列崩解時，單元(20)通過代謝排出體外，由此能夠防止藥物(14)對正常細胞造成損傷。
文檔編號C07K16/00GK101808668SQ200980100462
公開日2010年8月18日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權日2008年7月29日
發(fā)明者加藤泰己, 原田充訓, 齋藤宏之, 林達之 申請人:那野伽利阿株式會社