專利名稱：使用gm-csf拮抗劑治療骨質流失病癥的方法
使用GM-CSF拮抗劑治療骨質流失病癥的方法相關申請的交叉引用本申請要求于2008年1月15號提交的美國第61/021，218號臨時申請的權益，該 申請被通過引用的方式并入本文。
背景技術：
骨質疏松癥是老年女性和男性的常見疾病，其中骨質流失、骨微結構的破壞以及 骨中非膠原蛋白的變化導致骨折的風險增加。美國所有白人女性中約25至30%出現(xiàn)了有 癥狀的骨質疏松癥。在45歲以及更大歲數(shù)的女性中，骨質疏松和臀、股、頸和股骨粗隆間骨 折的發(fā)生率之間存在直接的聯(lián)系。老年男性在50至70歲間出現(xiàn)有癥狀的骨質疏松癥，但 該疾病主要侵襲女性。骨質疏松癥的主要病因是骨重建(bone remodeling)的不平衡，其中骨的再吸收 占據優(yōu)勢。在正常骨中，存在持續(xù)的骨基質重建。骨被來自骨髓的破骨細胞再吸收，新骨被 成骨細胞沉積。多種體液因子影響骨重建。例如，破骨細胞的活化受多種因子調節(jié)，包括骨 保護素(osteoprotegerin，0PG)和核因子κ B受體活化因子配體(RANKL)。RANKL與其受 體結合時增加骨再吸收。結合RANKL的OPG能夠通過抑制其與受體的結合而抑制其增加骨 再吸收的能力。多種其他細胞因子和因子通過影響骨細胞和骨細胞前體的增殖、成熟和分 泌活性調節(jié)骨的再吸收。這些細胞因子和生長因子包括IL-6，TNF-α，IL-I和M-CSF。有大量的證據表明GM-CSF通過將前體轉化為樹突狀細胞而抑制破骨細胞的 分化(參見，例如，Khapli et al, J. Immunol. 171 :142_151，2003 ；Miyamoto et al, Blood 98 2544-2554,2001 ；Myint et al. , Am. J. Pathol. 154 553-566,1999 ；Shuto et al, Endocrinology 134 1121-1126,1994 ；and Kim et al, J.Biol.Chem.280 16163-16169,2005)。也有報道稱在某些條件下，GM-CSF可以在體外促進破骨細胞的形 成(例如，U. S. Patent No. 6, 331,562)以及在特定環(huán)境中，集落刺激因子可以是治療靶標 (U. S. Patent Application Publication No. 20020141994)。因此，GM-CSF 在骨質疏松中 的作用尚未被闡述清楚。本發(fā)明通過提供靶向GM-CSF的治療骨質疏松癥的新方法，解決了對其中骨密度 減少的骨質疏松癥和其他病癥另外治療的需要。發(fā)明概述本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)=GM-CSF拮抗劑能夠用于治療諸如骨質減少癥的骨質流失 病癥。因此，本發(fā)明提供了給予患有骨質減少癥的患者GM-CSF拮抗劑，例如抗體。在一些 實施方案中，通過重組方式制備GM-CSF拮抗劑，例如，重組單克隆抗體。在其他實施方案 中，GM-CSF拮抗劑，例如來自人血漿的純化的抗GM-CSF從天然來源中純化。一方面，本發(fā) 明提供了治療患有骨質流失病癥，例如骨質減少癥的患者的方法，該方法包括以足以減輕 骨質流失癥狀的量給予患者治療有效量的純化的GM-CSF拮抗劑。GM-CSF拮抗劑可以是例 如抗GM-CSF抗體、抗GM-CSF受體抗體，可溶性GM-CSF受體，細胞色素b562抗體模擬物， adnectin、脂質運載蛋白(lipocalin)支架抗體模擬物，杯芳烴(calixarene)抗體模擬物 或抗體樣結合肽模擬物。
在一些實施方案中，患有骨質減少癥的患者具有骨質疏松癥。在代表性實施方案 中，骨質減少癥是由于雌激素耗損。在一些實施方案中，將GM-CSF拮抗劑，例如GM-CSF抗 體給予診斷為骨質減少癥例如骨質疏松癥的患者，或者給予診斷為涉及骨質流失的另外病 癥的患者，其中患者已被診斷患有其他疾病，例如自身免疫性疾病諸如類風濕性關節(jié)炎。在 其他實施方案中，將拮抗劑，例如GM-CSF抗體給予已經診斷為骨質減少癥如骨質疏松癥但 沒有被診斷為類風濕性關節(jié)炎的患者；或者給予沒有被診斷為自身免疫疾病的患者。在許多實施方案中，GM-CSF拮抗劑是針對GM-CSF的抗體，即抗GM-CSF抗體。在 各種實施方案中，所述抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體或諸如納米抗體或駱駝科動物 的抗體(camelid antibody) 0在一些實施方案中，所述抗體是抗體片段，諸如Fab，F(xiàn)ab'， F(ab' )2，scFv，或結構域抗體(domain antibody, dAB)?？贵w也可以被修飾，例如以增加 穩(wěn)定性。因此，在一些實施方案中，所述抗體與聚乙二醇偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述抗體具有約IOOpM至約IOnM的親和力，例如從約ΙΟΟρΜ， 約 200pM,約 300pM,約 400pM,約 500pM,約 600pM,約 700pM,約 800pM,約 900pM 或約 InM 直 到約ΙΟηΜ。在另外的實施方案中，所述抗體具有約IpM至約IOOpM的親和力，例如約ΙρΜ，約 5pM,約 IOpM,約 15pM,約 20pM,約 25pM,約 30pM,約 40pM,約 50pM,約 60pM,約 70pM,約 80pM 或約90pM至約IOOpM的親和力。在一些實施方案中，抗體具有約10至約30pM的親和力。在一些實施方案中，抗體是中和抗體。在另外的實施方案中，抗體是重組的或嵌合 的抗體。在一些實施方案中，抗體是人抗體。在一些實施方案中，抗體包含人可變區(qū)。在一 些實施方案中，抗體包含人輕鏈恒定區(qū)。在一些實施方案中，抗體包含人重鏈恒定區(qū)，諸如 Y鏈。在另外的實施方案中，所述抗體與嵌合的19/2抗體結合相同的抗原表位。所述抗 體可以，例如，包含嵌合的19/2的V1^n八區(qū)。所述抗體也可以包含人重鏈恒定區(qū)，諸如Y 區(qū)。在一些實施方案中，抗體包含嵌合的19/2的Vh區(qū)的⑶R1，⑶R2和⑶R3。在另外的實 施方案中，抗體包含嵌合的19/2的\區(qū)的⑶R1，⑶R2和⑶R3。在另外的實施方案中，抗體 包含嵌合的19/2抗體的V1^P \區(qū)的⑶R1，⑶R2和⑶R3。在一些實施方案中，抗體包含嵌 合的19/2的Vh區(qū)的CDR3和\區(qū)的CDR3。在一些實施方案中，抗體具有約7至約25天的半衰期。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，GM-CSF拮抗劑，例如，抗GM-CSF抗體通過注射 或通過灌輸給藥。例如，GM-CSF拮抗劑可以在約15分鐘至約2小時的時間段靜脈給藥。在其它實施方案中，GM-CSF拮抗劑通過彈丸式注射(bolusinjection)皮下給藥。在另外的實施方案中，GM-CSF拮抗劑肌內給藥。GM-CSF抗體可以，例如以約lmg/kg體重至約10mg/kg體重的劑量給藥。在一些實施方案中，用GM-CSF拮抗劑的治療包括GM-CSF拮抗劑的第二次給藥。在一些實施方案中，本發(fā)明的治療方法還包括給予第二治療劑用于治療骨質流 失，所述第二治療劑例如諸如阿侖膦酸鈉(alendronate)、依替膦酸鈉(etidronate)、利 塞膦酸鈉(risedronate)或伊班膦酸(ibandronicacid)的雙磷酸鹽，或者諸如雷洛昔芬 (raloxifene)、牛寺立中白月太(teriparatide)或雷奈酸 思(strontium ranelate)的藥齊Ll ；或 者諸如氟化物或鈣的骨增強礦物質。其他的治療劑包括降鈣素、激素替代治療、諸如骨保護 素(osteoprotegerin) (OPG)的RANKL拮抗劑如OPG-Fc融合蛋白以及針對RANKL的抗體如
4denosumab。GM-CSF拮抗劑，例如GM-CSF抗體可以與一種或多種理想的額外治療劑同時或 相繼給藥。在一些實施方案中，患者可以最初用例如雙磷酸鹽的藥劑治療，然后在雙磷酸 鹽治療已經停止后接受用GM-CSF拮抗劑的治療。在一些實施方案中，與沒有用GM-CSF拮 抗劑治療時通常給予患者的治療劑如雙磷酸鹽的量相比，當患者還在經歷GM-CSF拮抗劑 如GM-CSF抗體的治療時，可以使用較低劑量和/或較低頻率的另外治療劑如雙磷酸鹽的給 藥。附圖簡述

圖1顯示了在評價GM-CSF抗體對骨質疏松癥小鼠模型的骨質流失的影響時的治 療組。給藥途徑是腹腔內(IP)或皮下(SC)的。(NA:不適用)圖2顯示了分析骨松質密度的數(shù)據。圖2顯示了對卵巢切除誘導的小鼠骨質減少 癥的抑制骨松質密度的組織形態(tài)計量學分析。圖3顯示了脫鈣脛骨的骺(epiphyseal)區(qū)的切片的顯微照片，所述脫鈣脛骨來自 如圖1所示處理的小鼠，切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色。圖3A)對照治療的小鼠(組1)表 明了患有卵巢切除誘導的骨質減少癥的小鼠中，骨小梁的體積、數(shù)目和密度的降低；圖3B) 用阿侖膦酸鈉治療(組2)卵巢切除的小鼠顯示骨小梁體積、數(shù)目和密度增加；圖3C)用抗 GM-CSF抗體治療(組3)卵巢切除的小鼠顯示骨小梁體積、數(shù)目和密度增加；圖3D)組4(假 手術)中的動物顯示了常態(tài)的骨小梁體積、數(shù)目和密度。圖4顯示了用蘇木精和伊紅(H&E)染色的顯微照片，在來自切除卵巢和假手術的 小鼠的脫鈣骨的切片中呈現(xiàn)了成骨細胞和破骨細胞的形態(tài)和活性。圖4A)說明了來自組 1(卵巢切除的；對照治療)的動物中的成骨細胞和破骨細胞的形態(tài)和活性；圖4B)說明了 來自組2(卵巢切除的；用阿侖膦酸鈉治療)的動物中的成骨細胞和破骨細胞的形態(tài)和活 性；圖4C)說明了來自組3(卵巢切除并用抗GM-CSF抗體治療)的動物中的成骨細胞和破 骨細胞的形態(tài)和活性；圖4D)說明了來自組4(假手術的)的動物中的成骨細胞和破骨細胞 的形態(tài)和活性。圖5顯示了用GM-CSF抗體治療的動物與沒有接受該抗體的正常及切除卵巢的動 物的血液學比較(hematological comparison)。發(fā)明詳述^X如本文所用的，“骨質流失病癥”指局部或非特異性的骨密度降低。本發(fā)明中的“骨 質減少癥”指骨密度普遍降低至正常以下，其中骨質流失不是部位特異性的?！肮琴|疏松癥” 是一種類型的骨質減少，其中骨質流失更明顯并基于常用的臨床標準被診斷。如本文所使用的，“粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF) ”指小的天然存在的 具有內部二硫鍵的糖蛋白，分子量為約23kDa。在人類，它是由位于人類第5號染色體上的 細胞因子簇內的基因編碼。人類基因和蛋白的序列是已知的。該蛋白具有N-末端信號序 列和C-末端受體結合結構域(Rasko and Gough In :The Cytokine Handbook (細胞因子手 冊)，A. Thomson, et al, Academic Press, New York(1994)，第 349-369 頁)。其三維結構 與白介素的結構相似，盡管氨基酸序列并不相似。GM-CSF在應答由存在于造血環(huán)境中和炎 癥周圍部位的間充質細胞產生的許多炎癥介質時產生。GM-CSF能夠刺激嗜中性粒細胞、巨 噬細胞和混合的粒細胞_巨噬細胞集落從骨髓細胞產生，并能夠刺激嗜酸性粒細胞集落從胎兒肝臟祖細胞形成。GM-CSF也能夠刺激成熟的粒細胞和巨噬細胞的一些功能活性。術語“粒細胞巨噬細胞集落刺激因子受體(GM-CSFR) ”指表達在細胞上的膜結合的 受體，其與粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)結合時轉導信號。GM-CSFR由配體特異 性的低親和力結合鏈(GM-CSFR α)以及高親和力結合與信號轉導所需的第二鏈組成。該 第二鏈由白介素3(IL_3)和白介素5(IL_5)受體的配體特異性α鏈共享，因此被稱為β 共有(beta common, β c)。GM-CSFRa的細胞質區(qū)由膜近端保守區(qū)和C-末端可變區(qū)組成， 膜近端保守區(qū)為al和a 2亞型所共有，而C-末端可變區(qū)在al和α2間不同。B_c的細 胞質區(qū)包含膜近端絲氨酸和對由GM-CSF誘導的增殖反應重要的酸性結構域。術語“可溶性粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子受體”(sGM-CSFR)指結合GM-CSF的 非膜結合受體，但當與配體結合時不轉導信號。如本文所使用的，"GM-CSF拮抗劑”指與GM-CSF或其受體相互作用以(部分地或 完全地)降低或阻斷信號轉導的分子或化合物，否則GM-CSF就會結合到其表達在細胞上的 相應受體引起信號轉導。GM-CSF拮抗劑可以通過降低可用于結合受體的GM-CSF配體的量 發(fā)揮作用(例如，一旦結合到GM-CSF就增加GM-CSF清除率的抗體)或通過與GM-CSF或受 體結合來阻止配體結合到其受體(例如，中和抗體)。GM-CSF拮抗劑也可以包括抑制劑，其 可以包括結合GM-CSF或其受體以部分或完全抑制信號傳導的化合物。GM-CSF拮抗劑可以 包括抗體、其天然或合成的配體或片段、多肽、小分子等。如本文所使用的，“純化的”GM-CSF拮抗劑指基本上或本質上沒有那些通常伴隨拮 抗劑的組分的GM-CSF拮抗劑，所述組分在拮抗劑的天然狀態(tài)下存在。例如，從血液或血漿 中純化的GM-CSF拮抗劑諸如抗GM-CSF抗體，基本上沒有諸如其他免疫球蛋白分子的其他 血液或血漿組分。通常使用分析化學技術如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜來確定純 度和同質性。為存在于制劑中的主要物質的蛋白基本上是純化的。通常，“純化的”指相對 于蛋白與其天然存在的組分，蛋白的純度是至少85%純，更優(yōu)選地，至少95%純，且最優(yōu)選 地，至少99%純。如本文使用的，“抗體”指功能上定義為結合蛋白的蛋白和結構上定義為包含氨基 酸序列的蛋白，所述氨基酸序列由本領域技術人員公認為衍生自產生抗體的動物內編碼免 疫球蛋白基因的框架區(qū)?？贵w可以由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編 碼的一個或多個多肽組成。公認的免疫球蛋白基因包括κ，λ，a，Y，δ，ε和μ恒定區(qū) 基因，以及各種免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分為κ或λ。重鏈分為Y，μ，a，δ或 ε，其進一步確定免疫球蛋白的類別，分別為IgG, IgM, IgA, IgD和IgE0已知典型的免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。每個四聚體由兩個相同的 成對多肽鏈組成，每一對具有一個“輕”鏈(約25kD)和一個“重”鏈(約50kD)。每一鏈的 N-末端確定主要負責抗原識別的約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)。術語可變輕鏈 (Vl)和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。本文使用的術語抗體包括保留結合特異性的抗體片段。例如，有許多已明確表征 的抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵近C末端消化抗體，以產生F(ab)' 2， 即Fab的二聚體，其本身是通過二硫鍵連接到VH-CHl的輕鏈。F(ab) ‘ 2可以在溫和的條件 下被還原以打破鉸鏈區(qū)的二硫鍵，由此將(Fab' )2 二聚體轉換為Fab'單體。該Fab'單 體本質上是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab (對于其他抗體片段的更詳細的描述，參見，F(xiàn)undamental
6Immunology (基礎免疫學),W. E. Paul, ed.，Raven Press, N. Y. (1993))。盡管依據完整抗 體的消化確定了多種抗體片段，但本領域技術人員理解，片段可以通過化學方式或利用重 組DNA方法學從頭合成。因此，術語抗體還包括通過完整抗體的修飾產生的抗體片段或利 用重組DNA方法學合成的抗體片段?？贵w包括諸如二聚體、Vh 二聚體或\ 二聚體的二聚體，包括單鏈抗體(作為 單多肽鏈存在的抗體)，諸如單鏈Fv抗體(sFv或scFv)，其中可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)連 接在一起(直接的或通過肽連接子)以形成連續(xù)的多肽。單鏈Fv抗體是共價連接的 異源二聚體，其可以由包括編碼Vh和\的序列的核酸表達，所述序列直接連接或通過編碼 肽的連接子連接(例如，Huston，et al. Proc. Nat. Acad. ScLUSA，85 :5879_5883，1988)。盡 管Vh和\彼此相連為單多肽鏈，Vh和\結構域非共價連接。可選擇地，抗體可以是另一片 段，諸如二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dSFv)。也可以產生其他片段，包括利用重組技術。本領域技術人 員已知，scFv抗體和許多其他結構將天然聚集的但通過化學方式分離的來自抗體V區(qū)的輕 鏈和重鏈轉化為折疊成三維結構的分子，所述結構與抗原結合位點的結構基本上相似(參 見例如，美國專利第5，091，513，5，132，405和4，956，778號)。在一些實施方案中，抗體包 括如下的那些已在噬菌體上展示過或已使用載體通過重組技術產生，其中鏈分泌為可溶 性蛋白，例如SCFV，F(xiàn)V，F(xiàn)ab，(Fab' )2或使用載體通過重組技術產生，其中鏈分泌為可溶性 蛋白。用于本發(fā)明的抗體也可以包括雙抗體和迷你抗體(miniantibodies)。本發(fā)明的抗體也包括重鏈二聚體，諸如來自駱駝科動物(camelids)的抗體。因為 駱駝科動物抗體中的重鏈二聚體IgG的Vh區(qū)不必與輕鏈形成疏水相互作用，將正常與輕鏈 接觸的重鏈的區(qū)域改變?yōu)轳橊効苿游锟贵w中的疏水氨基酸殘基。重鏈二聚體IgGs的Vh結 構域稱為VHH結構域。用于本發(fā)明的抗體包括單結構域抗體(dAbs)和納米抗體(參見，例 如，Cortez-Retamozo, et al, Cancer Res. 64 :2853_2857,2004)。如本文所用的，“V-區(qū)”指抗體可變區(qū)結構域，包含框架(framework) 1、⑶Rl、框架 2、⑶R2、框架3節(jié)段，并包括⑶R3以及框架4節(jié)段，所述節(jié)段作為重鏈和輕鏈V-區(qū)基因在 B-細胞分化過程中重排的結果，被添加到V-節(jié)段。如本文所使用的，“互補決定區(qū)(CDR) ”指每一鏈中的三個高度可變區(qū)，其中斷由輕 鏈和重鏈可變區(qū)確立的四個“框架”區(qū)。⑶Rs主要負責結合抗原表位。每一鏈的⑶R通常 稱為⑶Rl，⑶R2和⑶R3，從N-末端開始順序編碼，且通常也通過特定⑶R定位的鏈來鑒定。 因此，例如，Vh⑶R3位于其所存在的抗體的重鏈的可變結構域，而VfDRl是來自其所存在 的抗體的輕鏈的可變結構域的CDRl。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在一個物種內相對保守。抗體的框架區(qū)，也就是 組成性輕鏈和重鏈的組合的框架區(qū)，用于定位和排列三維空間內的⑶Rs。CDRs和框架區(qū)的氨基酸序列可以使用本領域各種已知的定義來確定，例如 Kabat, Chothia,國際 ImMunoGeneTics 數(shù)據庫(IMGT)和 AbM(參見，例如，Johnson et al, 上述；Chothia&Lesk，1987, Canonicalstructures for the hypervariable regions of immunoglobulins (免疫球蛋白高變區(qū)的標準結構).J Mol. Biol. 196,901-917 ； Chothia C. et al. , 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (免疫球蛋 白高變區(qū)的構像)· Nature 342,877-883 ；Chothia C. et al. , 1992, structuralrepertoire of the human VH segments (人 VH節(jié)段的結構庫)J. Mol. Biol. 227，799-817 ;Al_Lazikaniet al, J. Mol. Biol 1997，273 (4)).抗原結合位點的定義也在下文中被描述Ruiz et al. , IMGT, the internationalImMunoGeneTics database(國際 ImMunoGeneTics 數(shù)據 庫)· NucleicAcids Res.，28，219—221 (2000) ；and Lefranc,M. -P. IMGT, theinternational ImMunoGeneTics database(國際 ImMunoGeneTics 數(shù)據庫).Nucleic Acids Res. Jan 1 ；29 (1) 207-9(2001) ；MacCalIum et al, Antibody-antigen interactions :Contact analysis and binding sitetopography (抗體-抗原相互作用接觸分析和結合位 點的形貌學)，J.MoI.Biol，262 (5)，732-745 (1996) ； and Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA,86,9268-9272 (1989) ；Martin, et al, Methods Enzymol，203，121—153， (1991) ；Pedersen et al, Immunomethods,1,126, (1992) ；andRees et al, In Sternberg M. J.E. (ed.), Protein Structure Prediction (蛋白質結構預測)· Oxford University Press, Oxford,141—1721996)?！翱乖砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”指抗原上與抗體結合的位點。抗原表位可以由連續(xù) 的氨基酸或通過蛋白的三級折疊緊靠但非連續(xù)的氨基酸形成。從連續(xù)的氨基酸形成的抗原 表位一般在暴露于變性溶劑時保留，而通過三級折疊形成的抗原表位通常在用變性溶劑處 理時丟失?？乖砦辉讵毺氐目臻g構像中一般包括至少3個，且通常更多個，至少5個或 8-10個氨基酸。確定抗原表位的空間構像的方法包括，例如，χ-射線晶體學和2-維核磁共 振° 參見，例如 Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology (分子生 物學方法中抗原表位定位方案)，Vol. 66，Glenn Ε. Morris, Ed (1996)。如本文使用的，“中和抗體”指與GM-CSF結合并阻止通過GM-CSF受體的信號轉導 或抑制GM-CSF與其受體結合的抗體。如本文使用的，“嵌合抗體”指免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、 替代或交換以使抗原結合位點(可變區(qū))連接到不同的或改變的種類、效應器功能和/或 物種的恒定區(qū)，或者連接一個完全不同的分子，所述分子賦予嵌合抗體新的特性，例如，酶、 毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其部分被用具有不同或改變的抗原特異性 的可變區(qū)或其部分改變、替代或交換；或者用來自另一物種或來自另一抗體類別或亞類別 的相應序列改變、替代或交換。如本文使用的，“人源化抗體(humanized antibody)，，指其中供者抗體的CDRs 被移植到人框架序列上的免疫球蛋白分子。人源化抗體在框架序列中還可以包含供者來 源的殘基。所述人源化抗體還可以包含人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。人源化抗體 還可以包含既不在受者抗體也不在引入的CDR或框架序列中的殘基?？梢岳帽绢I域已 知的方法(例如，Jones et al, Nature 321 522~525 ； 1986 ；Riechmann et al, Nature 332 323-327,1988 ；Verhoeyen et al, Science 239 1534-1536，1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596，1992 ；U. S. Patent No. 4，816，567)進行人源化，包括諸如“超 人源化(superhumanizing) ”抗體(Tan et al, J. Immunol. 169 1119,2002)和“表面重塑 (resurfacing)，，的技術(例如，Staelens et al，Mol Immunol. 43 1243, 2006 ；and Roguska et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 91 :969，1994)。本發(fā)明所述的“人工程化的(humaneered) ”抗體指具有參照抗體結合特異性的工 程化的人抗體。用于本發(fā)明的“人工程化的”抗體具有包含衍生自供者免疫球蛋白的最小 序列的免疫球蛋白分子。通常，通過將編碼來自參照抗體重鏈⑶R3區(qū)的結合特異性決定簇(BSD)的DNA序列連接到人段序列，且將來自參照抗體輕鏈⑶R3BSD連接到人\節(jié)段序 列來“人工程化”抗體。⑶R3的"BSD"指介導結合特異性的⑶R3-FR4區(qū)，或該區(qū)的一部分。 因此結合特異性決定簇可以是CDR3-FR4、CDR3或CDR3的最小必需結合特異性決定簇(其 指存在于抗體的V區(qū)時，賦予結合特異性的小于CDR3的任一區(qū))、D節(jié)段(關于重鏈區(qū))， 或者賦予參照抗體結合特異性的CDR3-FR4的其它區(qū)。在美國專利申請公布第20050255552 號和美國專利申請公布第20060134098號提供了進行人工程化(humaneering)的方法。本發(fā)明所用的術語“結合特異性決定簇”或“BSD”指確定抗體結合特異性必需的 CDR區(qū)內的最小鄰接的或非鄰接的氨基酸序列。術語“異源的”當被用于提及核酸部分時，表明所述核酸包含兩個或多個子序列， 其通常沒有被發(fā)現(xiàn)本質上彼此關系相同。例如，核酸通常通過重組產生，其具有例如來自不 相關的基因排列的兩個或多個序列以產生新的功能核酸。類似地，異源蛋白經常指兩個或 多個子序列，其沒有被發(fā)現(xiàn)本質上彼此關系相同。當用術語“重組的”提及例如細胞、核酸、蛋白或載體時，指所述細胞、核酸、蛋白或 載體已經通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白被修飾，或者指所述細胞來自進 行過如此修飾的細胞。因此，例如，重組的細胞表達不在所述細胞的天然形式(非重組的) 內存在的基因或表達否則會異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。本文所用術語“重 組的核酸”指正常不在自然界存在的形式的核酸，其最初一般通過例如利用聚合酶和核酸 內切酶操縱核酸在體外形成。以這種方式，實現(xiàn)不同序列的可操作連接。因此出于本發(fā)明 的目的，線性形式的分離的核酸，或者通過連接正常不相連的DNA分子在體外形成的表達 載體都被認為是重組的?？梢岳斫?，一旦重組的核酸被制備并重新導入宿主細胞或有機體， 它會以非重組形式復制，即，利用宿主細胞的體內細胞機制而不是體外操縱；然而，出于本 發(fā)明的目的，這類核酸，一旦被重組制備，盡管隨后非重組復制，仍然被認為是重組的。類似 地，“重組蛋白，，是利用重組技術制備的蛋白，即，通過上文所述的重組核酸的表達。當提及蛋白或肽時，短語“特異性(或選擇性)結合”到抗體或“特異性(或選擇 性)與...免疫反應”指抗體結合感興趣蛋白的結合反應。在本發(fā)明中，抗體通常結合蛋白 或肽的親和力為500nM或更小，但對其他抗原，抗體具有5000nM或更大的親和力。如本文使用的，“用于治療骨質流失病癥的治療劑”指當以治療有效劑量給予患有 骨質流失病癥諸如骨質疏松癥的患者時，至少部分抑制骨密度的降低以及減輕或減緩該病 癥的癥狀和與該病癥有關的并發(fā)癥的藥劑。用于兩個或更多個核酸或多肽序列時，術語“一致的”或“一致性”百分比指兩個 或多個序列或子序列相同或者具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，當在比較 窗(comparison window)或指定區(qū)域比較并對齊以進行最大的對應時，在特定的區(qū)域有約 60%的一致性，優(yōu)選 70%, 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%，99%或更高的一致性)，如使用下述的帶缺省參數(shù)的BLAST或BLAST 2. 0序列比較 算法或通過手工比對和目測(參見，例如NCBI萬維網站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/等)所測量的。這樣的序列被稱為“基本上一致的”。這一定義還指或可以適用于 測試序列的互補物。該定義也包括具有刪除和/或添加的序列，和具有取代的那些，還有例 如多態(tài)或等位變體的天然存在的變體，以及人工變體。如下文所述的，優(yōu)選的算法可以解釋 空位及類似情況。優(yōu)選地，一致性存在于至少約25個氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域，或更優(yōu)
9選地存在于50-100個氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域。對于序列比較，通常一個序列作為參照序列，測試序列與其進行比較。當使用序 列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，指定序列坐標，必要時指定序列算法程序參 數(shù)。優(yōu)選地，可以使用缺省程序參數(shù)或可以指定可選的參數(shù)。然后基于程序參數(shù)，序列比較 算法計算測試序列相對于參照序列的序列一致性百分比。如本文使用的，“比較窗”包括選自一般為20-600，通常為約50-約200，更通常 約100-約150的連續(xù)位的數(shù)目中的一個的片段的參照，其中可以將序列與具有相同數(shù) 目連續(xù)位的參照序列最佳比對后進行比較。用于比較的序列比對方法在本領域是公知 的。例如，可以通過Smith&Waterman，Adv. App 1. Math. 2 =482(1981)的局部同源性算法、 通過 Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)的同源比對算法、通過 Pearson & Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sci USA 85 =2444(1988)的相似性檢索方法、通過這些算法的 計算機實施(Wisconsin Genetics SoftwarePackage (威斯康星遺傳學軟件包)中的GAP， BESTFIT，F(xiàn)ASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (遺傳學計算機組)，575 Science Dr.，Madison, WI)或通過手工比對和目測(參見，例如 Current Protocols inMolecular Biology(通用分子生物學技術)(Ausubel et al.，eds. 1995supplement))進行用于比較 的序列的最優(yōu)化比對。適于確定序列一致性和序列相似性百分比的算法的優(yōu)選實例包括BLAST和BLAST 2. 0算法，其在Altschul et al,Nuc. Acids Res. 25 :3389_3402 (1977)和Altschul et al, J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)中被描述過。BLAST 和 BLAST 2. 0，與本文描述的參數(shù)一 起用于確定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列一致性百分比。公眾可以通過國立生物技術信息中 心(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)獲得進行BLAST分析的軟件。這種算法包括通過確 定查詢序列中的短字長W來首先確定高得分序列對(HSPs)，其與數(shù)據庫序列中相同字長比 對時匹配或滿足某一正值的閾值分數(shù)Τ。T指鄰近字分數(shù)閾值(neighborhood word score threshold, Altschul et al，見上)。這些初始鄰近字采樣數(shù)作為初始檢索以查到包含它們 的更長HSPs的種子。這些字采樣數(shù)沿著每一序列在兩個方向延伸以至累積比對分數(shù)能被 增加。例如對于核苷酸序列，利用參數(shù)M(對于一對匹配殘基的獎分；總是大于0)和N(對 于錯配的罰分(penaltyscore)；總是小于0)計算累積分數(shù)。對于氨基酸序列，利用得分矩 陣(scoring matrix)計算累積分數(shù)。當在如下情形下，字采樣數(shù)在每一方向的延伸被停 止累積比對分數(shù)從它最大實現(xiàn)值下降量X ；由于一個或多個負得分殘基比對的累積，累積 分數(shù)降到0或以下；或者達到了每一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈 敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默認字長(W)為11，期望值(E)為10，M = 5，N = -4以及用于兩條鏈的比較。對于氨基酸序列而言，BLASTP程序默認字長為3，且期 望值(E)為 10，以及 BLOSUM62 得分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 =10915(1989))比對(B)為 50，期望值(E)為 10，M = 5，N = _4 且用于比較兩 條鏈。BLAST算法也在兩條序列間進行相似性統(tǒng)計分析(參見，例如Kar 1 in & Altschul，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787 (1993))。BLAST 算法提供的相似性 的一個度量是最小和概率(P(N))，其提供了兩條核苷酸或氨基酸序列偶然發(fā)生匹配的概率 的指征。例如，如果測試核酸與參照核酸比較的最小和概率低于0. 2，更優(yōu)選地低于0. 01且最優(yōu)選地低于0.001，則該測試核酸被視為與參照核酸相似。Log值可以是大的負數(shù)，例如 5，10，20，30，40，40，70，90，110，150，170 等。如下文所述，兩核酸序列或多肽基本上一致的指征是第一核酸編碼的多肽與針對 由第二核酸編碼的多肽的抗體發(fā)生免疫交叉反應。因此，例如如果兩肽的差異僅在于保守 性取代，一多肽通常與另一多肽基本上是一致的。兩核酸序列基本上一致的另一指征是這 兩分子或它們的互補物在嚴緊條件下彼此雜交，如下文所述。兩核酸分子基本一致的另一 指征是相同的引物能夠用于擴增這些序列。術語“分離的”、“純化的”或“生物學上純的”指一種物質基本上或本質上沒有那 些通常伴隨著所述物質的成分，這些成分在所述物質的天然狀態(tài)中存在。純度和同質性一 般使用分析化學技術，諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜來確定。蛋白是存在于基 本上純化的制劑中的主要物質。在某些實施方案中，術語“純化的”表示蛋白在電泳中基本 上產生一條帶。優(yōu)選地，它意味著所述蛋白是至少85 %純，更優(yōu)選至少95 %純，且最優(yōu)選至 少99%純。術語“多肽”、“肽”和“蛋白，，在本文可互換使用，指氨基酸殘基的多聚體。這些術 語應用于氨基酸多聚體，其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化 學模擬物，以及應用于天然存在的氨基酸，包含修飾的殘基的那些，和非天然存在的氨基酸 多聚體。術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸作用相似 的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是有遺傳密碼編碼的那些，以及后來 被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指 具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構的化合物，例如與氫、羧基、氨基以及R基如 高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、甲基锍蛋氨酸結合的α碳。這些類似物可以具有修飾的 R基(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。 氨基酸模擬物指結構與氨基酸的一般化學結構不同的化學化合物，但功能與天然存在的氨 基酸相似。本文可以通過氨基酸公知的三字母符號，或通過IUPAC-IUB生物化學命名委員會 (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號來指代氨基酸。 同樣，核甘酸可以通過它們公認的單字母符號來提及?！氨Ｊ匦孕揎椬儺愺w”適用于氨基酸和核酸序列。關于特定的核酸序列，保守性修 飾變異體指那些編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者如果所述核酸不編碼氨 基酸序列，其指本質上相同或相關的序列，例如，天然的連續(xù)的序列。由于遺傳密碼的兼并 性，大量功能相同的核酸編碼大多數(shù)蛋白。例如，密碼子GCA，GCC, GCG和GCU都編碼氨基 酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定的丙氨酸的每一位置處，該密碼子都可以改變?yōu)榱硪粋€相 應密碼子，而不改變編碼的多肽。這種核酸變異體是“沉默變異體”，其是保守性修飾的變異 體的一種。本文編碼多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的沉默變異體。本領域的技術 人員會認識到，在某些情形下，可以修飾核酸中的每一密碼子(AUG除外，其通常是甲硫氨 酸的唯一密碼子；TGG也除外，其通常是色氨酸的唯一密碼子)以產生功能相同的分子。因 此，編碼多肽的核酸的沉默變異體經常內含在描述的序列中，所述序列與表達產物有關，而 與實際的探針序列無關。
對于氨基酸序列，本領域的技術人員會認識到，改變、添加或刪除在編碼的序列中 的單個氨基酸或小部分氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列的個別的取代、刪除或添加是 “保守性修飾的變異體”，其中所述改變導致氨基酸被化學上類似的氨基酸取代。提供了功 能類似的氨基酸的保守性取代表在本領域中是公知的。這種保守性修飾變異體為本發(fā)明 的多態(tài)變異體，種間同源體和等位體的附加，并不排除本發(fā)明的多態(tài)變異體，種間同源體和 等位體。典型的相互的保守性取代包括1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)冬氨酸(D)，谷氨酸 (E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸 (L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)，蘇 氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見，例如，Creighton, Proteins (1984)) 0I.導論本發(fā)明涉及給予GM-CSF拮抗劑用于治療患有其中骨密度丟失的骨病癥如骨質減 少的患者的方法。GM-CSF拮抗劑可以包括抗GM-CSF抗體、抗GM-CSF受體抗體或阻止或減弱 信號傳導的其它抑制劑，所述信號傳導正常情況下由GM-CSF結合到其相應受體導致。已知 許多類型的 GM-CSF 拮抗劑(參見，例如，William，in New Drugsfor Asthma, Allergy and COPD, Prog. Repir. Res. ；Hansel & Barnes, eds, Basel, Karger, 2001vol 31 :251_255 ；以 及本文引用的參考文獻)。適用于本發(fā)明的抗體，例如，抗-GM-CSF或抗-GM-CSF受體抗體，可以是單克隆的、 多克隆的、嵌合的、人源化的、人工程化的(humaneered)或人的。用于本發(fā)明的其它GM-CSF 拮抗劑可以包括天然存在的或合成的配體(或其片段)，其與GM-CSF競爭結合受體，但與 受體結合時不導致信號傳導。另外的非限定性GM-CSF拮抗劑可以包括部分或完全阻斷信 號傳導的多肽、核酸、小分子等，所述信號傳導在天然狀態(tài)下不存在GM-CSF拮抗劑時，由 GM-CSF結合到其受體導致。II.患有骨密度降低病癥的患者骨質流失病癥指與骨質降低到正常水平下有關的病況。由于骨合成速率的降低和 /或骨降解速率的增加發(fā)生了這種病況。骨質減少癥指非部位特異性的骨質的全身流失。 骨質減少癥最常見的形式主要是骨質疏松癥。這種形式的骨質疏松癥是隨著年齡增長骨質 的普遍流失的結果，并且通常是在正常骨形成速率下骨質再吸收增加的結果。女性的主要 骨質疏松癥經常是由于年齡相關的絕經導致的雌激素流失的結果。然而，骨質疏松癥也可 以發(fā)生在經歷過早絕經的女性，過早絕經是遺傳、疾病或醫(yī)療操作的結果?？梢愿鶕景l(fā)明進行治療的骨質流失的其他形式包括內分泌骨質疏松癥(例如， 由于甲狀腺機能亢進、甲狀旁腺機能亢進、庫欣氏綜合癥或肢端肥大癥)，遺傳或先天形式 的骨質疏松癥(成骨不全癥、高胱氨酸尿、Menkes綜合征和Riley-Day綜合征)，成人和青 少年佩吉特氏病(變形性骨炎)，導致骨質流失的骨髓炎或骨感染性缺損，以及由于四肢固 定導致的骨質流失。骨質流失還可以由類固醇給藥誘發(fā)，以及與小腸和大腸病癥有關，與慢性肝和腎 疾病有關。骨壞死或骨細胞死亡與創(chuàng)傷性損害或非創(chuàng)傷性壞死有關，所述非創(chuàng)傷性壞死與 高雪氏病(Gaucher' s disease)、鐮刀細胞貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和其他病況有關。在一些實施方案中，按照本發(fā)明治療的骨質流失病癥可以是局部化的，例如來自 手術。其他形式的部位特異性骨質流失是牙周骨質流失、下頌骨質流失和由于溶骨性轉移導致的骨質流失。骨密度的丟失，例如在骨質疏松癥中的丟失可以利用標準的檢測來診斷。例如諸 如骨密度計量學的射線照相技術。例如當骨礦物密度低于或等于年輕成年人參照群體的骨 密度負2. 5個標準差時，診斷為骨質疏松癥。該比例為報告為T分數(shù)。世界衛(wèi)生組織已經 確立了下述的診斷方針T-分數(shù)為-1. 0或更高是“正常的”T-分數(shù)為-1.0和-2. 5是“低骨質(或“骨質減少癥”)”T-分數(shù)為-2. 5或更低是骨質疏松癥。可以將GM-CSF拮抗劑，例如抗體給予具有 低骨質，即骨質減少癥的患者，或者給予滿足骨質疏松癥這些標準的患者。在一些實施方案中，將GM-CSF拮抗劑，例如GM-CSF抗體給予診斷有骨質減少癥或 骨質疏松癥、或涉及骨質減少癥的另一病癥的患者。接受該拮抗劑的患者也可以被診斷為 其他疾病，例如，自身免疫疾病諸如類風濕性關節(jié)炎。在其他實施方案中，將拮抗劑，例如 GM-CSF抗體給予尚未診斷為類風濕性關節(jié)炎的患者；或者給予尚未診斷為自身免疫性疾 病的患者。可以通過監(jiān)測骨密度來評價患者對GM-CSF拮抗劑治療的反應。對治療表現(xiàn)出治 療反應的患者顯示出與對照未治療的患者存在的骨質流失典型速率相比減緩的骨密度降 低。III. GM-CSF 拮抗劑如上文所述的，本發(fā)明提供了通過給予患者GM-CSF拮抗劑來治療骨密度降低如 骨質疏松癥的方法。適于本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑通過例如降低GM-CSF與受體的結合選擇 性地干擾通過GM-CSF受體的信號傳導的誘導。這類拮抗劑可以包括結合GM-CSF受體的抗 體、結合GM-CSF的抗體以及其它競爭GM-CSF與其受體的結合或抑制信號傳導的蛋白或小 分子，所述信號傳導通常由配體與受體的結合所引發(fā)。在許多實施方案中，用于本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑是蛋白，例如，抗GM-CSF抗體、 抗GM-CSF受體抗體、可溶性GM-CSF受體或與GM-CSF競爭結合受體，但是無活性的修飾的 GM-CSF多肽。經常利用重組的表達技術制備這類蛋白。此類方法在本領域是公知的。通用的 分子生物學方法，包括表達方法可以在例如指導手冊，諸如Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning :A laboratory manual (分子克隆實驗室手冊)3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Current Protocols in Molecular Biology (ffl用分子生物學 方法)(2006) John Wiley and Sons ISBN :0-471-50338_X 中找到?？梢岳枚喾N基于原核和真核的蛋白表達系統(tǒng)來制備GM-CS拮抗劑蛋白。許多這 類系統(tǒng)可從供應商處廣泛得到。這些既包括原核表達系統(tǒng)又包括真核表達系統(tǒng)。GM-CSF 抗體在一些實施方案中，GM-CSF拮抗劑是結合GM-CSF的抗體或結合GM-CSF受體α 或β亞單位的抗體。這些抗體可以針對GM-CSF(或GM-CSF受體)蛋白或片段產生，或重 組制備。用于本發(fā)明的GM-CSF抗體可以是結合GM-CSF的中和抗體，也可以是結合GM-CSF 的非中和抗體，并增加GM-CSF的體內清除率以使循環(huán)中的GM-CSF水平降低。GM-CSF抗體 經常是中和抗體。制備多克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的(例如，Harlow &Lane,
13Antibodies, A Laboratory manual ( Jfi #， ^t ^ ψ φ ) (1988) ；Methods in Immunology (免疫學方法))?？梢酝ㄟ^一次或多次注射免疫劑，如果需要，加上佐劑在哺乳 動物體內產生多克隆抗體。這些免疫劑包括GM-CSF或GM-CSF受體蛋白或其片段。在一些實施方案中，用于本發(fā)明的GM-CSF抗體從人血漿中純化。在這類實施方案 中，GM-CSF抗體通常是從存在于人血漿中的其它抗體中分離的多克隆抗體。例如，可以利 用已知的技術如親和層析實施這種分離方法。在一些實施方案中，GM-CSF拮抗劑是單克隆抗體?？梢岳秒s交瘤方法，諸如被 Kohler & Milstein,Nature 256 =495(1975)描述的那些方法，制備單克隆抗體。在雜交瘤 方法中，小鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物，通常被用免疫劑如人GM-CSF免疫，以激發(fā)產生 或能夠產生會特異性與免疫劑結合的抗體的淋巴細胞?？蛇x擇地，可以在體外免疫淋巴細 胞。免疫劑優(yōu)選包括人GM-CSF蛋白或其片段或其融合蛋白?？梢岳帽绢I域已知的各種技術來制備人單克隆抗體，所述技術包括噬菌體展示 庫(Hoogenboom & Winter，J. Mol Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al, J. Mol. Biol. 222 581(1991))。Cole等和Boerner等的技術也可以用于制備人單克隆抗體(Cole et al, Monoclonal Antibodies andCancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，p. 77 (1985) 和 Boerner et al, J. Immunol. 147(1) :86_95 (1991))。類似地，可以通過將人免疫球蛋 白基因座引入轉基因動物如小鼠制備人抗體，所述轉基因動物體內的內源性免疫球蛋白 基因已經部分或完全失活。受到激發(fā)時，觀測到人抗體的產生，其在包括基因重排、裝配 和抗體譜的各方面都與在人體內觀察到的非常相似，在美國第5，545，807 ；5, 545，806 ； 5，569, 825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5, 661, 016號專利以及在下述科學出版物中都描述了 該方法Marks et al, Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg et al, Nature368 856-859 (1994) ；Morrison, Nature 368:812-13 (1994) ；Fishwild et al, Nature Biotechnology 14:845—51(1996) ；Neuberger, NatureBiotechnology 14:826(1996)； Lonberg & Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)。在一些實施方案中，抗GM-CSF抗體是嵌合的或人源化的單克隆抗體。如上所述， 抗體的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白，其中來自人類抗體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被 來自諸如小鼠、大鼠或兔的非人類的CDR并具有所需的特異性、親和力和容量的殘基所取 代。應用于本發(fā)明的抗體可以是任何形式。例如，在一些實施方案中，抗體可以是包 括恒定區(qū)，例如人恒定區(qū)的完整抗體，或者可以是完整抗體的片段或衍生物，例如Fd、Fab、 Fab'、F(ab' )2、scFV、FV片段或諸如納米抗體(nanobody)或駱駝科動物抗體的單結構域 抗體。另外這類抗體可以是通過本領域的技術人員熟知的方法重組設計的。如上所述，可 以利用已知的技術制備這類抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，抗體被另外設計以降低免疫原性，例如，使所述抗體 適于重復給藥。產生具有降低的免疫原性的抗體的方法包括人源化(humanization)/人工 程化(humaneering)方法以及諸如去免疫的修飾技術，其中抗體被進一步設計，例如在一 個或多個框架區(qū)，以去除T細胞的抗原表位。在一些實施方案中，抗體是人工程化的(humaneered)抗體。人工程化的抗體是 具有參照抗體的結合特異性的工程化的人抗體，其通過將編碼來自例如參照抗體重鏈CDR3區(qū)的CDR的結合特異性決定簇(BSD)的DNA序列連接到人Vh節(jié)段序列以及將編碼來自參照 抗體輕鏈⑶R例如⑶R3區(qū)BSD的DNA序列連接到人\節(jié)段序列獲得。在美國第20050255552 專利申請公布和美國第20060134098專利申請公布中提供了人工程化的方法?？贵w可以進一步被去免疫以從抗體的V區(qū)去除一個或多個預期的T細胞抗原表 位。在例如WO 00/34317中描述了這類方法。在一些實施方案中，可變區(qū)包含人V-基因序列。例如，可變區(qū)序列可以與人種系 V-基因序列有至少80%的一致性，或至少85%的一致性，至少90%的一致性，至少95%的 一致性，至少96%的一致性，至少97 %的一致性，至少98%的一致性或至少99%的一致性
或更高。用于本發(fā)明的抗體可以包括人恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)可以是人κ或λ恒定區(qū)。 重鏈恒定區(qū)通常是Y鏈恒定區(qū)，例如Y-l，Y-2, γ-3或Υ-4恒定區(qū)。在一些實施方案中，例如，其中抗體是片段，該抗體可以與諸如聚乙二醇(聚乙 二醇化)或血清白蛋白的另一分子偶聯(lián)，例如，以在體內提供延長的半衰期。在Knight et al (2004) Platelets 15 :409 (關于阿昔單抗)；Pedley et al (1994) Br. J. Cancer 70: 1126 (關于抗-CEA 抗體)Chapman et al (1999) Nature Biotech. I7 :780 中提供了抗體片 段聚乙二醇化的實例?？贵w特異件用于本發(fā)明的抗體結合GM-CSF或GM-CSF受體?？梢杂枚喾N技術來確定抗體結合 特異性。參見，例如 Harlow & Lane，Antibodies，ALaboratory Manual (抗體，實驗室手冊) (1988)，里面描述了可以用于確定抗體的特異免疫反應性的免疫測定形式和條件。適用于本發(fā)明的示例性抗體是C19/2。在一些實施方案中，使用了單克隆抗體，其 與c 19/2競爭結合相同的抗原表位，或與c 19/2結合相同的抗原表位。特定抗體與另一抗體 識別相同的抗原表位的能力一般通過第一抗體競爭性抑制第二抗體與抗原結合的能力來 確定?？梢允褂迷S多競爭性結合測定來測量兩抗體對相同抗原的競爭。例如，三明治ELISA 測定可以用于這一目的。這通過使用捕獲抗體包被孔表面來實施。然后將亞飽和濃度的標 記的抗原加到捕獲表面。該蛋白會通過特異性抗體抗原表位相互作用與抗體結合。洗滌 后，已經共價連接到可檢測的部分(例如，HRP，標記的抗體被定義為檢測抗體)的第二抗體 添加到ELISA。如果該抗體與捕獲抗體識別相同的抗原表位，那么它不能結合到靶蛋白，因 為已經沒有用于結合的特定的抗原表位。然而，如果該第二抗體識別靶蛋白上的不同抗原 表位，它則能結合到靶蛋白，且這種結合可以通過利用相關的底物量化活性水平(由此量 化結合的抗體)來檢測。通過使用單一抗體既作為捕獲抗體又作為檢測抗體來確定背景， 而最大信號可以通過用抗原特異性抗體捕獲且用結合到抗原上的標簽的抗體檢測來確立。 通過用背景信號和最大信號作為參照，可以以配對方式評估抗體以確定抗原表位特異性。使用上述測定中的任一種，如果在第一抗體存在下，第二抗體與抗原的結合降低 了至少30 %，通常至少約40 %，50 %，60 %或75 %，且經常降低至少約90 %，則第一抗體被 認為競爭性抑制第二抗體的結合。抗原表位定位(EpitopeMapping)在本發(fā)明的一些實施方案中，使用與已知抗體如cl9/2結合相同抗原表位的抗 體。定位抗原表位的方法在本領域是熟知的。例如，人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)的功能活性區(qū)的定位方法是定位由中和性抗hGM-CSF單克隆抗體識別的 抗原表位。例如，利用通過對細菌合成的hGM-CSF的酶性消化獲得的蛋白水解片段已經 明確了 cl9/2(其與中和抗體LMM 102具有相同的可變區(qū))結合的抗原表位(Dempsey， et al, Hybridoma 9 :545_558，1990)。胰蛋白的消化產物的 RP-HPLC 分級分離(RP-HPLC fractionation)鑒定了含有66個氨基酸(該蛋白的52% )的免疫反應性“胰蛋白酶核心” 肽。該“胰蛋白酶核心”用金黃色葡萄球菌(S. aureus)V8蛋白酶的進一步消化產生了獨 特的免疫反應性hGM-CSF產物，其包含由殘基88至121之間的二硫鍵連接的兩個肽殘基 86-93和112-127。這些個別的肽不被抗體識別。測定結合親和力在一些實施方案中，適用于本發(fā)明的抗體對人GM-CSF或GM-CSF受體具有高親和 力結合。如果抗體的解離常數(shù)(Kd)小于InM，且優(yōu)選小于ΙΟΟρΜ，則抗體和抗原間存在高 親和力結合?？梢杂枚喾N方法測定抗體對其靶抗原的結合親和力，諸如表面等離子共振測 定、飽和度測定或諸如ELISA或RIA的免疫分析，這些方法為本領域技術人員所熟知。測定 結合親和力的示例性方法是通過在使用CM5傳感器芯片的BIAcore 2000儀器(Biacore AB, Freiburg, Germany)上進行表面等離子共振分析，如 Krinner et α 1. ， (2007)Mol. Immunol. Feb ；44(5) :916_25· (Epub 2006 May 11))所描述的。鑒定中和抗體的細胞增殖測定在一些實施方案中，GM-CSF拮抗劑是GM-CSF或它的受體的中和抗體，其以干擾 GM-CSF結合的方式結合?？梢允褂迷u價GM-CSF功能的許多測定來鑒定中和抗體。例如， 可以便利地使用GM-CSF受體信號傳導基于細胞的測定，諸如確定GM-CSF依賴的細胞系在 應答有限量的GM-CSF時的增殖率的測定。人TF-I細胞系適合用于這類測定中。參見， Krinner et al.，(2007)Mol. Immunol。在一些實施方案中，本發(fā)明的中和抗體抑制GM-CSF 刺激的TF-I細胞增殖至少達50%，當使用的GM-CSF濃度刺激最大90%的TF-I細胞增殖 時。在其它的實施方案中，中和抗體抑制GM-CSF刺激的增殖至少達90%。適合鑒定適用于 本發(fā)明的中和抗體的另外測定為本領域技術人員所熟知。示例性抗體用于本發(fā)明的抗體在本領域是已知的，并且能夠通過常規(guī)的技術制備。描述了示 例性抗體?？梢岳斫猓纠钥贵w可以通過本領域已知的并概述于本文的方法設計以通過 化學或重組的技術來制備抗體片段、嵌合體等。適合用作GM-CSF拮抗劑的示例性嵌合抗體是C19/2。c/19/2抗體結合GM-CSF，單 價結合親和力為約10pM，如表面等離子共振分析所測定的。SEQ ID NOs 1和2顯示了 cl9/2 的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列(例如，W003/068920)。如依照Kabat定義的，其⑶Rs是CDRHl DYNIHCDRH2 YIAPYSGGTGYNQEFKNCDRH3 RDRFPYYFDYCDRLl KASQNVGSNVACDRL2 SASYRSGCDRL3 QQFNRSPLT。也可以使用本領域熟知的其它定義，如Chothia、國際ImMunoGeneTics數(shù)據庫
16(EVIGT)和 AbM 確定 CDRs。由C19/2識別的GM-CSF抗原表位已經被鑒定為具有由殘基88至121間的二硫鍵 連接的兩個肽殘基86-93和殘基112-127的產物。cl9/2抗體抑制GM-CSF依賴的人TF-I 白血病細胞系的增殖，EC50為30pM，當細胞用0. 5ng/ml GM-CSF刺激時。用于給藥的抗體，諸如C19/2，可以被另外地人工程化。例如，C19/2抗體可以進一 步被改造為包含人V基因節(jié)段。另一個示例性中和抗GM-CSF抗體是Li et al, (2006) PNAS103 (10) :3557_3562 中 描述的ElO抗體。ElO是對GM-CSF具有870pM結合親和力的IgG類抗體。如ELISA測定中 顯示的，該抗體特異性結合人GM-CSF，并且如用TFl細胞增殖測定所評估的，該抗體顯示了 強的中和活性。另外的示例性中和抗GM-CSF抗體是由Krinner et al, (MoIImmunol. 44 :916_25， 2007 ；Epub 2006 May 112006)描述的MT203抗體。MT203是與GM-CSF有皮摩爾結合親和力 的IgGl類抗體。該抗體顯示了有效的抑制活性，如由TF-I細胞增殖測定和它在U937細胞 中阻斷IL-8產生的能力所評估的。另外的GM-CSF抗體在例如Steidl等的W02006122797 中被描述。適用于本發(fā)明的其它抗體是本領域技術人員已知的。其為抗GM-CSF受體抗體的GM-CSF拮抗劑也可以用于本發(fā)明。這類GM-CSF拮抗 劑包括針對GM-CSF受體α鏈或β鏈的抗體。在一些實施方案中，用于本發(fā)明的GM-CSF 受體抗體是α鏈。應用于本發(fā)明的抗GM-CSF受體抗體可以是上文所述的任一抗體形式， 例如，完整的、嵌合的、單克隆的、多克隆的、抗體片段、人源化的、人工程化的(humaneered) 等等。適用于本發(fā)明的抗GM-CSF受體抗體的實例，例如中和性、高親和力抗體是已知的(參 見，例如 US Patent 5，747，032 和 Nicola et al, Blood 82:1724,1993)。非抗體的GM-CSF拮抗劑可以干擾GM-CSF與其受體的有效相互作用的其它蛋白包括突變的GM-CSF蛋白 和分泌的蛋白，其包括與GM-CSF結合的GM-CSF受體鏈的一條或兩條的細胞外部分的至少 部分，并競爭與細胞表面受體的結合。例如，可以通過將sGM-CSFRa的編碼區(qū)與鼠IgG2a 的CH2-CH3區(qū)融合來制備可溶性GM-CSF受體拮抗劑。Raines et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88 :8203 描述了示例性可溶性 GM-CSF 受體。例如，在 Brown et al (1995) Blood 85 1488 ；Monfardiniet al, J. Biol. Chem 273 :7657_7667，1998 ；和 Sayani et al, Blood95 =461-469,2000中提供了 GM-CSFRα-Fc融合蛋白的實例。在一些實施方案中，這 類融合的Fc組分可以被設計為調節(jié)與Fc受體的結合，例如，增加與Fc受體的結合。其它GM-CSF拮抗劑包括GM-CSF突變體。例如，GM-CSF的21位氨基酸殘基突變 為精氨酸或賴氨酸(E21R 或 Ε221Κ)的 GM-CSF (如 Hercus et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 :5838，1994描述的)已經顯示出具有阻止GM-CSF依賴的白血病細胞在小鼠異種移植模 型中播散的體內活性(Iversen et al. Blood 90:4910,1997)。正如由本領域技術人員所 理解的，這種拮抗劑可以包括具有取代如21位氨基酸的取代的保守性修飾的GM-CSF變異 體，或GM-CSF變異體，其具有例如氨基酸類似物以延長半衰期。其他GM-CSF肽抑制劑也是已知的，例如環(huán)肽，例如，Monfardini, et al, J.Biol. Chem. 271 :1966_1971，1996。
在其它的實施方案中，GM-CSF拮抗劑是以與抗體相似的方式靶向和結合抗原的 “抗體模擬物”。這些“抗體模擬物”的某些利用非免疫球蛋白支架作為抗體可變區(qū)的可選 擇的蛋白框架。例如，Ku 等(Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92(14) :6552_6556 (1995))公開了 基于細胞色素b562的抗體的替代物，其中細胞色素b562的兩個環(huán)是隨機的并基于與牛血 清白蛋白的結合被選擇。這些個別的突變體被發(fā)現(xiàn)選擇性與BSA結合，與抗BSA抗體結合 類似。美國第6，818，418和7，115，396號專利公開了抗體模擬物，其以纖連蛋白或纖連 蛋白樣蛋白支架和至少一個可變環(huán)為特征。如已知的Adnectins，這些基于纖連蛋白的抗 體模擬物表現(xiàn)出天然或設計的抗體的許多相同特征，包括對任一靶配體的高親和力和特異 性。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構與IgG重鏈可變區(qū)的結構相似。因此，這些模 擬物顯示了與那些天然抗體本質上相似的抗原結合特性和親和力。此外，這些基于纖連蛋 白的抗體模擬物表現(xiàn)出某些優(yōu)于抗體和抗體片段的益處。例如，這些抗體模擬物的天然折 疊穩(wěn)定性不依賴于二硫鍵，并且因此在正常會降解抗體的條件下是穩(wěn)定的。此外，因為這些 基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構與IgG重鏈的結構相似，可以在體外應用環(huán)隨機化和改 組(shuffling)的方法，其與體內的抗體親和力成熟方法相似。Beste 等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (5) 1898-1903 (1999))公開了基于脂 質運載蛋白支架的抗體模擬物(Anticalin )。脂質運載蛋白包含在蛋白的末端的具有4個 高變環(huán)的β-桶(β-barrel)。將這些環(huán)進行隨機誘變并基于與例如熒光素的結合進行選 擇。三個變異體表現(xiàn)出與熒光素的特異結合，一個變異體顯示了與抗熒光素抗體的結合相 似的結合。進一步的分析表明所有的隨機的位置都是可變的，指示Anticalin .適合用作 抗體的替代物。因此，Anticalins 是小的單鏈肽，一般是160至180個殘基，其提供了優(yōu) 于抗體的幾個優(yōu)勢，包括降低的生產成本、增加的保存穩(wěn)定性和降低的免疫學反應。美國第5，770，380號專利公開了合成的抗體模擬物，其使用杯芳烴的剛性的非肽 有機支架，與作為結合位點的多個可變肽環(huán)連接。在幾何學上，所述肽環(huán)都從杯芳烴的同一 側突出，彼此不相鄰。因為這種幾何構像，所有環(huán)都可以用于結合，增加了對配體的結合親 和力。然而，與其它抗體模擬物比較，基于杯芳烴的抗體模擬物并不是僅由肽組成，因此它 較不易受蛋白酶的降解。支架也不是完全由肽、DNA或RNA組成，這意味著該抗體模擬物在 極端環(huán)境條件下相對穩(wěn)定，半衰期長。此外，既然基于杯芳烴的抗體模擬物相對較小，它較 不可能產生免疫源性應答。Murali 等(Cell Mol Biol 49 (2) :209_216 (2003))描述了將抗體變?yōu)檩^小的模 擬肽(ρ印tidomimetics)的方法，它們稱為“抗體樣結合模擬肽”(ABiP)，其也可以用作抗 體的替代物。除了非免疫球蛋白框架外，在包含RNA分子和非天然的低聚物的化合物(例如，蛋 白酶抑制劑、苯二氮平類藥物、嘌呤衍生物和β轉角模擬物)中也已經模擬了抗體特性。因 此，非抗體GM-CSF拮抗劑也可以包括這類化合物。IV.治療性給藥本發(fā)明的方法包括以治療有效量給予患者作為藥物組合物的GM-CSF拮抗劑(例 如，抗GM-CSF抗體)，所述患者的骨密度降低，例如患骨質疏松癥的患者，所述方法使用適 用于治療所述疾病的給藥方案?？梢耘渲朴糜诙喾N藥物遞送系統(tǒng)的組合物。一種或多種生理學上可接受的賦性劑或載體也可以包括在用于合適制劑的組合物中。用于本發(fā)明的 合適的制劑見于Remington' sP harmaceutical Sciences (雷明頓氏藥物科學)，Mack Publishing Company,Philadelphia,PA, 17th ed. (1985)。對于藥物遞送方法的簡要綜述， 參見 Langer, Science 249 1527-1533 (1990)。用于本發(fā)明方法中的GM-CSF拮抗劑提供在適于注射入患者的溶液中，諸如注射 用無菌等滲水溶液。GM-CSF拮抗劑以合適的濃度溶解或懸浮在可接受的載體中。在一些實 施方案中，所述載體是水性的，例如，水、鹽水、磷酸緩沖鹽等。組合物可以包含接近生理條 件所需的輔助性藥用物質，諸如PH調節(jié)劑和緩沖劑、張力調節(jié)劑等。給予骨質流失的患者本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑藥物組合物，所述組合物的量足以 至少部分抑制骨質流失或骨質流失和其并發(fā)癥的癥狀。足以實現(xiàn)這一目的的量定義為“治 療有效劑量”。通過監(jiān)測患者對治療的反應確定治療有效劑量。例如，與沒有治療骨質減少 癥的患者相比，骨質流失或骨質流失速率的下降是典型的參考標準(benchmark)。用于這一 用途的有效量取決于疾病的嚴重程度以及患者總體健康狀況，包括諸如年齡、體重、性別、 給藥途徑等其他因素。當單獨給藥或與另一種治療劑聯(lián)合給藥時，優(yōu)選GM-CSF拮抗劑的給 藥量不誘發(fā)嗜中性白血球減少癥。取決于所需的以及患者所耐受的劑量和頻率，拮抗劑可 以單次給藥或多次給藥。無論如何，所述方法提供了足夠量的GM-CSF拮抗劑以有效地治療
^^ ο在本發(fā)明的一些實施方案中，用于治療顯示出骨密度降低的患者的GM-CSF拮抗 劑被提供在與另一種藥劑的聯(lián)合療法中，所述另一種藥劑諸如雙磷酸鹽或如氟化物或鈣的 骨增強礦物質、降鈣素、激素替代療法或用于治療骨質流失的其他治療劑。其他治療劑包括 諸如骨保護素(OPG)(其是一種天然的RANKL拮抗劑)的RANKL拮抗劑，例如OPG-Fc融合 蛋白，以及包括RANKL抗體，例如denosumab?；颊呖梢越邮蹽M-CSF拮抗劑與一種或幾種另外的其他治療劑的協(xié)同治療或相繼 治療。在一些實施方案中，患者可以開始用例如雙磷酸鹽的藥劑進行治療，然后在雙磷酸鹽 的治療停止后接受GM-CSF拮抗劑的治療。在一些實施方案中，與通常給予患者的治療劑如 雙磷酸鹽的量相比，當患者還在經歷GM-CSF拮抗劑如GM-CSF抗體的治療時，可以使用較低 劑量和/或較少頻率的另外治療劑如雙磷酸鹽的給藥。如本領域所理解的，當與用于骨質 流失的另外的治療劑聯(lián)用時，還可以調整GM-CSF拮抗劑的劑量和給藥頻率。A.給藥在一些實施方案中，GM-CSF拮抗劑是抗體，其經由任一合適的途徑包括但不限于 靜脈內、皮下、肌內或腹腔內途徑，通過注射或輸注給藥。在一些實施方案中，可以將拮抗 劑，例如GM-CSF抗體直接施用到局部骨質流失的部位，例如施用到下頌骨或牙齦部位，其 中牙周疾病導致部位特異性的骨質流失。在示例性實施方案中，將抗體以10mg/ml在4°C儲存于注射用無菌等滲鹽水溶液 中，并在給予患者前，將該抗體稀釋于IOOml或200ml注射用0. 9%氯化鈉中。通過靜脈輸 注1小時的時程以0. 2至10mg/kg的劑量給予抗體。在其他實施方案中，通過靜脈輸注15 分鐘至2小時的時間段給予抗體。在其它的實施方案中，給藥操作是經由皮下彈丸注射。B.劑量給藥選擇拮抗劑的劑量以便為患者提供有效的治療。劑量一般為小于0. lmg/kg體重至25mg/kg體重，或為每一患者Img至2g。優(yōu)選地，所述劑量為l-10mg/kg或者是每一患者 約50mg-1000mg?？梢砸赃m當?shù)念l率重復給藥，所述頻率可以是一天一次至每三個月一次， 這取決于拮抗劑的藥動學(如抗體在循環(huán)中的半衰期)和藥效反應(例如，抗體治療效應 的持續(xù)時間)。在一些實施方案中，其中拮抗劑是抗體或修飾的抗體片段，其體內的半衰期 是約7至約25天，抗體劑量給藥重復為一周一次至每3月一次。在其它實施方案中，約每 月一次給予抗體。
實施例_仿丨丨IGM-CSF秘膽膽幡_、鼠綱白憤艦在小鼠模型中檢測了中和GM-CSF的小鼠抗GM-CSF抗體對骨質疏松癥的影響。通 過C3H小鼠中的卵巢切除誘導實驗性骨質疏松癥。在臨床疾病進程的早期對四組小鼠(每 組8只)進行評價。圖1顯示了這四組小鼠。組3對應于接受抗GM-CSF抗體的組。在組 2和3中，治療從手術后4天開始，一周3次用0. 3mg抗GM-CSF或0. lmg/kg阿侖膦酸鈉治 療，進行8周。圖2顯示了骨松質密度的組織形態(tài)計量學(histomorphometric)分析的結果。相 比于接受磷酸緩沖鹽的組I對照卵巢切除的動物，組3中的動物(用抗GM-CSF抗體治療) 顯示了更高的骨密度。圖3顯示了脫鈣脛骨的骺Epiphyseal)區(qū)的切片的顯微照片。圖面1_4分別顯 示了來自組1-4的脛骨。組3的動物相比于組1的動物表現(xiàn)出骨小梁體積、數(shù)目和密度的 增加。圖4顯示了各組的成骨細胞和破骨細胞的形態(tài)以及活性。在組4中，其中動物進 行了假手術，破骨細胞的數(shù)目和活性是正常的。用GM-CSF抗體治療的組3動物看起來具有 顯著較少的破骨細胞，其在組織學上顯示出無活性的形態(tài)。在組2中，破骨細胞的數(shù)目豐富 并且表現(xiàn)出高活性。在組1中，破骨細胞的數(shù)目看起來減少并且破骨細胞看起來活性稍降 低。血液學測量、臨床化學、器官重量、用體重標準化的器官重量以及用腦重量標準化 的器官重量在治療組間基本上沒有差異。圖5顯示了血液學數(shù)據。值得注意的是，GM-CSF 抗體的給藥沒有導致嗜中性粒細胞數(shù)目的減少。實施例2示例性GM-CSF的人工程化的抗體如美國專利申請20060134098中所述的，從抗原表位集中的人V-節(jié)段庫中制備了 一組具有cl9/2特異性的人工程化的Fab'分子。從在2xYT培養(yǎng)基中生長到0D600為0. 6的大腸桿菌細胞中表達Fab ‘片段。在 33°C下使用IPTG 3小時誘導表達。從周質組分中獲得組裝的Fab'，并依照標準方法，通 過使用鏈球菌G蛋白的親和層析(HiTrap G蛋白HP柱；GE Healthcare)來純化Fab'。在 PH 2. 0的緩沖液中洗脫Fab'，隨即調整到pH 7. 0，并用pH 7. 4的PBS透析。通過Biacore 3000表面等離子共振技術(SPR)分析結合動力學。重組的人GM-CSF 抗原被生物素化并固定在鏈霉抗生物素CM5傳感器芯片上。將Fab樣品稀釋到3nM的起始 濃度，并做 3 倍系列稀釋。在 IOmM HEPESU50mM NaCl,0. lmg/mL BSA 和 0. 005% p20 中在 PH 7. 4時于37°C下進行分析。每一濃度測試兩次。在提供兩重數(shù)據組的兩種抗原密度表面上進行Fab'結合測定。6個人工程化的抗GM-CSFFab克隆中的每一個的平均親和力(Kd) 顯示于表1中，所述親和力使用1 ILangmuir結合模型計算。使用TF-I細胞增殖測定檢測Fabs對GM-CSF的中和。用0. 5ng/mlGM_CSF孵育 4天后，利用MTS測定(Cell titer 96，Promega)測量了人TF-1細胞的GM-CSF依賴性增 殖，以確定活細胞。在該測定中，所有的Fabs都抑制細胞增殖，指示這些都是中和抗體。抗 GM-CSF Fabs的相對親和力與基于細胞的測定中的EC5tl有良好的相關性。抗GM-CSF抗體 的單價親和力為18pM-104pM，表明該抗體在基于細胞的測定中，有效中和GM-CSF。表1 通過表面等離子共振分析確定的抗GM-CSF Fabs的親和力與在GM-CSF依賴 性TF-I細胞增殖測定中的活性(EC5tl)的比較
FabSPR確定的單價結合 親和力(pM)TF-I細^^增殖測定 中的 EC50(PM)9418165104192397729404925853942104320044817000實施例3遞送抗GM-CSF抗體的臨床方案抗GM-CSF抗體于4°C以10mg/ml儲存在注射用無菌等滲鹽水溶液中，并在給予患 者前，稀釋于IOOml或200ml 0.9%注射用氯化鈉中。將抗體以0. 2至10mg/kg的劑量通過 一個小時的靜脈輸注給予骨質疏松癥患者。提供的上述實施例僅用于說明，而非限制。本領域的技術人員可以很容易地認識 到多種非關鍵參數(shù)可以被改變或修飾，以產生本質上相似的結果。本說明書中引用的所有出版物、專利申請、登錄號和其他參考文獻都通過引用的 方式并入本文，如同每一單獨的出版物或專利申請被特別單獨地指明通過引用的方式并入
本文。
示例性序列
SEQID NO 1鼠 19/2 ；重鏈可變區(qū)的氨基I酸序列
MetGluLeulieMetLeuPheLeuLeuSerGlyThrAlaGlyValHis
SerGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGly
AlaSerValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsp
TyrAsnlieHisTrpValLysGlnSerHisGlyLysSerLeuAspTrp
IleGlyTyrlieAlaProTyrSerGlyGlyThrGlyTyrAsnGlnGlu
PheLysAsnArgAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAla
TyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerAspAspSerAlaValTyrTyr
CysAlaArgArgAspArgPheProTyrTyrPheAspTyrTrpGlyGln Gly
ThrThrLeuArgValSerSerValSerGlySer
SEQID NO 2鼠19/2輕鏈可變區(qū)的氨基I酸序列
MetGly PheLys Met Glu Ser GlnlieGlnValPheValTyrMetLeu
21
LeuTrpLeuSerGlyValAsp
LysPheValSerThrSerVal
AlaSerGlnAsnValGly Ser
GlyGlnSerProLysThrLeu
ArgValProAspArgPheThr
LeuThrlieThrThrValGln
GlnGlnPheAsnArgSerPro
GluLeuLysArgAlaAspAla
SerSerLysGlyGluPhe
Gly Asp lie Val Met lie Gln Ser Gln Gly Asp Arg Val Asn lie Thr Cys Lys Asn Val Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro lie Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe lie Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro
權利要求
治療患骨質流失病癥的患者的方法，所述方法包括以足以減輕骨質流失癥狀的量給予患者治療有效量的GM CSF拮抗劑。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述骨質流失病癥是骨質減少癥。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述骨質減少癥由雌激素缺乏導致。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述GM-CSF拮抗劑是抗-GM-CSF抗體。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。
6.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
7.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體是抗體片段，所述抗體片段為Fab，F(xiàn)ab'， F(ab' )2，scFv 或 dAB。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述抗體片段與聚乙二醇偶聯(lián)
9.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體具有約5pM至約50pM的親和力。
10.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體是中和抗體。
11.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體是重組的或嵌合的抗體。
12.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體是人抗體。
13.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體包含人可變區(qū)。
14.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體包含人輕鏈恒定區(qū)。
15.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)。
16.如權利要求4所述的方法，其中所述人重鏈恒定區(qū)是γ鏈。
17.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體與嵌合的19/2結合相同的抗原表位。
18.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體包含嵌合的19/2的V1^n八區(qū)。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述人重鏈恒定區(qū)是γ區(qū)。
21.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體包含嵌合的19/2的Vh區(qū)和\區(qū)的CDR1， CDR2 和 CDR3。
22.如權利要求4所述的方法，其中所述抗體包含嵌合的19/2的Vh區(qū)的CDR3和\區(qū) 的 CDR3。
23.如權利要求1所述的方法，其還包括給予選自雙磷酸鹽、雷洛昔芬、特立帕肽和雷 奈酸鍶，RANKL拮抗劑以及骨保護素(OPG)-Fc融合蛋白的治療劑。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述雙磷酸鹽選自阿侖膦酸鈉、依替膦酸鈉、利塞 膦酸鈉和伊班膦酸。
25.如權利要求1所述的方法，其中所述GM-CSF拮抗劑選自抗GM-CSF受體抗體、可溶 性GM-CSF受體、突變GM-CSF肽、環(huán)GM-CSF肽、細胞色素b562抗體模擬物、adnectin、脂質 運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物和抗體樣結合模擬肽。
26.治療患骨質減少癥的患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的抗GM-CSF抗 體，其中所述抗GM-CSF抗體包含具有嵌合的19/2結合特異性的人工程化的Fab'以及具有 約5pM至約50pM的親和力。
27.如權利要求26所述的方法，其中所述骨質減少癥由雌激素缺乏導致。
全文摘要
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)GM-CSF拮抗劑能夠用于治療骨質流失病癥，諸如骨質減少癥(osteopenia)。因此，本發(fā)明提供了給予患有骨質流失病癥的患者GM-CSF拮抗劑，例如GM-CSF抗體的方法，以及包含這種拮抗劑的藥物組合物。
文檔編號C07K16/24GK101932603SQ200980103300
公開日2010年12月29日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權日2008年1月15日
發(fā)明者克里斯托弗·R·貝炳東, 杰弗里·T·亞蘭東 申請人:卡羅拜奧斯制藥公司