專利名稱：可用作疫苗的自裝配肽納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及摻入B-細(xì)胞表位和/或T-細(xì)胞表位的自裝配肽納米顆粒。此外，本 發(fā)明涉及這樣的納米顆粒用于疫苗接種的用途。
背景技術(shù)：
適應(yīng)性免疫系統(tǒng)具有兩類不同的應(yīng)答，體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。第一類的 特征在于抗體應(yīng)答，其中這些抗體結(jié)合病原體的表面表位，而第二類的特征在于細(xì)胞毒性 的T-淋巴細(xì)胞(CTLs)，它們殺死已經(jīng)被感染的細(xì)胞。兩類免疫應(yīng)答進(jìn)一步受到T-輔助細(xì) 胞的刺激，后者會激活生產(chǎn)結(jié)合特定病原體的抗體的B-細(xì)胞或針對受感染的細(xì)胞的T-細(xì) 胞。B-細(xì)胞生產(chǎn)的抗體和病原體之間相互作用的特異性，由病原體的表面結(jié)構(gòu)(所謂 的B-細(xì)胞表位)決定，而CTLs與受感染的靶細(xì)胞的相互作用的特異性，是借助于靶細(xì)胞 的表面分子上存在的T-細(xì)胞表位，所謂的主要組織相容性復(fù)合物I類分子(MHC I)。這類 T-細(xì)胞表位(CTL-表位)是由受感染的細(xì)胞生產(chǎn)的來自病原體的蛋白的片段。最后，T-輔 助細(xì)胞與各個B-細(xì)胞或CTL的相互作用的特異性，由T-輔助細(xì)胞的受體分子與B-細(xì)胞或 CTL-細(xì)胞上的MHC II類分子(MHC II)呈遞的其它類型T-細(xì)胞表位(HTL-表位)的結(jié)合 來決定?？贵w與B-細(xì)胞表位的結(jié)合需要B-細(xì)胞表位呈現(xiàn)特定的三維結(jié)構(gòu)，該B-細(xì)胞表位 在它的天然環(huán)境中(即當(dāng)它是在病原體的表面時)具有相同的結(jié)構(gòu)。B-細(xì)胞表位可以由超 過一條肽鏈組成，它的三維結(jié)構(gòu)由蛋白支架來組織。但是，T-細(xì)胞表位不需要特定的三維結(jié)構(gòu)，各個MHC I或MHC II分子以非常特異 性的方式結(jié)合它們。為了最佳呈遞，MHC I分子把CTL表位修剪成長度為9個氨基酸的大 小，而HTL表位與MHC II分子發(fā)生類似的相互作用，但是可能比僅9個氨基酸更長。在本 發(fā)明的上下文中，重要的是，表位與MHC分子的結(jié)合，遵循非常特殊的規(guī)則，即僅具有特定 特征的肽能結(jié)合各個MHC分子，并從而用作表位。這些特征已經(jīng)得到徹底研究，且從已知的 表位知識，已經(jīng)開發(fā)出預(yù)測程序，其能高準(zhǔn)確度地預(yù)測能結(jié)合MHC分子的表位?，F(xiàn)在正在構(gòu) 建在線性肽鏈中由幾個這樣的T-細(xì)胞表位組成的肽串作為疫苗候選物。原則上，有效的疫苗應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答以及強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。已 經(jīng)證實，通過B-細(xì)胞表位的重復(fù)抗原顯示，可以實現(xiàn)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。病毒樣顆粒 (VLPs)可以用作有效的工具，以規(guī)則的、重復(fù)的和嚴(yán)格的方式呈遞B-細(xì)胞表位，因此VLPs 現(xiàn)在廣泛地用于疫苗設(shè)計。在專利EP 1 594 469 Bl中，已經(jīng)描述了重復(fù)抗原顯示的另一 個方案。在該專利中，已經(jīng)構(gòu)建出由三聚體和五聚體蛋白寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的自裝配肽納 米顆粒(SAPN)，它們在表面上重復(fù)顯示B-細(xì)胞表位。B-細(xì)胞表位結(jié)合在寡聚化結(jié)構(gòu)域的 末端，以便確保B-細(xì)胞表位以多個拷貝呈遞在納米顆粒表面。最常遇到的蛋白寡聚化基序 之一是卷曲螺旋結(jié)構(gòu)基序，該基序可以有效地用于這些SAPN的設(shè)計中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及摻入T-和/或B-細(xì)胞表位的自裝配肽納米顆粒(SAPN)。更具體地， 本發(fā)明的納米顆粒由連續(xù)肽鏈的聚集體組成，所述連續(xù)肽鏈包含通過連接區(qū)段相連的兩個 寡聚化結(jié)構(gòu)域，其中一個或兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域是在它的肽序列中摻入T-和/或B-細(xì)胞表 位的卷曲螺旋。本發(fā)明另外涉及使用這樣的摻入T-和/或B-細(xì)胞表位的自裝配肽納米顆粒免疫 接種人或非人動物的方法。


圖1 共價連接卵白蛋白肽(0VA323-339)的小鼠MHC II分子I-Ad的結(jié)構(gòu)，它是 I-Ad的HTL表位。從頂部以C-α示蹤，將MHC II蛋白顯示為灰色。形成表位結(jié)合部位的 壁的2個螺旋側(cè)接結(jié)合的肽。肽在全原子球棍模型中顯示為黑色。結(jié)合形式的肽HTL表位 是處于展開構(gòu)象中，這可以通過圖底部單獨(dú)肽的結(jié)構(gòu)更清楚地看到。圖2 分別是三聚體和五聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域[左側(cè)，A)]和三聚體和四聚體寡聚化 結(jié)構(gòu)域[右側(cè)，B)]的"均勻單元"的示意圖。單體(構(gòu)造塊)的數(shù)目由構(gòu)造塊的兩個寡 聚化結(jié)構(gòu)域Dl和D2的寡聚化狀態(tài)的最小公倍數(shù)(LCM)決定。在均勻單元中，所有構(gòu)造塊 的連接區(qū)段彼此盡可能近地排列，即盡可能接近肽納米顆粒的中心，因此均勻單元會自裝 配成球形納米顆粒。圖3 十二面體/ 二十面體的內(nèi)部對稱性元件。旋轉(zhuǎn)對稱軸(2-倍、3-倍和5-倍) 顯示為標(biāo)有2、3和5的線。在A)中，顯示了由寡聚化結(jié)構(gòu)域Dl (左邊，具有3倍對稱的卷曲 螺旋結(jié)構(gòu)域)、連接區(qū)段L (底部)和寡聚化結(jié)構(gòu)域D2 (右邊，具有5倍對稱的卷曲螺旋結(jié)構(gòu) 域)組成的單體構(gòu)造塊，使得寡聚化結(jié)構(gòu)域Dl和D2的內(nèi)部對稱性元件在多面體的對稱元 件上重疊。在B中)，顯示了完整的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域Dl和D2。由多面體的3-倍和5-倍旋 轉(zhuǎn)對稱元件產(chǎn)生的其它對稱對象顯示為圓柱體，而起始分子顯示為象在A)中一樣的螺旋。圖4 實施例1中從具有序列SEQ ID NO 8的肽制備的自裝配的肽納米顆粒的動態(tài) 光散射(DLS，A)和透射電子顯微術(shù)(TEM，B)。DLS分析顯示出平均粒徑為32. Olnm的大小分 布，多分散性指數(shù)為12.9% (A)。TEM照片⑶顯示出與通過DLS測得相同大小的納米顆粒。圖5 實施例2中從具有序列SEQ ID NO 10的肽制備的自裝配的肽納米顆粒的透 射電子顯微術(shù)(TEM)。TEM照片顯示出25nm相同大小的納米顆粒。圖6 實施例3中從具有序列SEQ ID NO 12的肽制備的自裝配的肽納米顆粒的透 射電子顯微術(shù)(TEM)。TEM照片顯示出約20至30nm大小的納米顆粒。圖7 用于人和雞流感疫苗的從分別具有序列SEQ ID NO :37(小圖A)和SEQ ID N0:38(小圖B)的肽制備的自裝配的肽納米顆粒(實施例9)的透射電子顯微術(shù)(TEM)。TEM 照片顯示出約25nm大小的納米顆粒。圖8 實施例11中從具有序列SEQ ID NO 41的肽制備的自裝配的肽納米顆粒的 透射電子顯微術(shù)(TEM)。TEM照片顯示出約25nm大小的納米顆粒。發(fā)明詳述單體構(gòu)造塊自裝配肽納米顆粒(SAPN)由多個式⑴的單體構(gòu)造塊制成，所述式⑴的單體構(gòu)造塊由包含肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D1、連接區(qū)段L和肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D2的連續(xù)鏈組成，D1-L-D2(I),其中Dl是合成的或天然的肽，其具有形成m個亞基Dl的寡聚體(Dl)mW傾向，D2 是合成的或天然的肽，其具有形成η個亞基D2的寡聚體(D2) η的傾向，m和η各自是2至10 之間的數(shù)字，條件是，m不等于n，且m不是η的倍數(shù)，且η不是m的倍數(shù)，L是鍵或選自下述 的短連接鏈任選取代的碳原子、任選取代的氮原子、氧原子、硫原子、和它們的組合；Dl或 D2中的任一個或Dl和D2兩者是在寡聚化結(jié)構(gòu)域中摻入一個或更多個T-和/或B-細(xì)胞表 位的卷曲螺旋，且其中D1、D2和L任選地被進(jìn)一步取代。肽(或多肽)是通過酰胺鍵共價連接的氨基酸的鏈或序列。肽可以是天然的、修 飾的天然的、部分合成的或完全合成的?！靶揎椀奶烊坏?、部分合成的或完全合成的”應(yīng)當(dāng) 理解為，表示不是天然存在的。術(shù)語氨基酸包括，選自20種必需的天然的α-L-氨基酸的 天然存在的氨基酸，合成的氨基酸，例如α-D-氨基酸、6-氨基己酸、正亮氨酸、高半胱氨酸 等，以及已經(jīng)以某些方式進(jìn)行修飾來改變某些性質(zhì)(例如電荷)的天然存在的氨基酸，例如 磷酸絲氨酸或磷酸酪氨酸等。在氨基酸的衍生物中，形成酰胺鍵的氨基被烷基化，或側(cè)鏈氨 基、羥基、或硫官能團(tuán)被烷基化或酰化，或側(cè)鏈羧基官能團(tuán)被酰胺化或酯化。短連接鏈L選自任選取代的碳原子、任選取代的氮原子、氧原子、硫原子、和它們 的組合，鏈中優(yōu)選1至60個原子、特別是1至20個原子。這樣的短連接鏈?zhǔn)牵缇垡蚁?氧(polyethylenoxy)鏈、糖鏈或優(yōu)選地肽鏈，例如由1至20個氨基酸、特別是1至6個氨 基酸組成的肽鏈。m和η各自是2至10之間的數(shù)字，條件是，m不等于n，且m不是η的倍數(shù)，且η不 是m的倍數(shù)。η和m的優(yōu)選組合是這樣的組合，其中m是2且η是5，或m是3且η是4或 5，或m是4且η是5。同樣地，η和m的優(yōu)選組合是這樣的組合，其中m是5且η是2，或m 是4或5且η是3，或m是5且η是4。最優(yōu)選的是這樣的組合，其中m或η是5。卷曲螺旋是肽序列，其具有間隔3和4個殘基的主要疏水的殘基的連續(xù)圖案，裝配 形成多聚體螺旋束，這將在下文中更詳細(xì)地解釋?！皳饺隩-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞表位的卷曲螺旋"是指，對應(yīng)的表位包含在寡聚化 結(jié)構(gòu)域中，從而在表位的N-末端和C-末端的氨基酸序列迫使表位適應(yīng)仍然是卷曲螺旋的 構(gòu)象，后者與包含所述表位的寡聚化結(jié)構(gòu)域的寡聚化性質(zhì)相一致。更具體地，“摻入"不 包括這樣的情況，其中所述表位結(jié)合在卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域的任一個末端。在本文件的上下文中，術(shù)語T-細(xì)胞表位用于指CTL和HTL表位。T-細(xì)胞表位會結(jié)合處于展開構(gòu)象的MHC分子(圖1)。因此，將T-細(xì)胞表位摻入 α-螺旋狀的卷曲螺旋(對比圖3Α和圖1)不是蛋白工程的日常任務(wù)。在本發(fā)明中，證實了 這些具有展開構(gòu)象的肽序列當(dāng)結(jié)合各個MHC分子時仍然可以摻入α _螺旋狀的卷曲螺旋寡 聚化結(jié)構(gòu)域。D1、D2和L的任選取代物是例如B-細(xì)胞表位、靶向物質(zhì)或增強(qiáng)納米顆粒的佐劑性 質(zhì)的取代物，例如免疫刺激的核酸，優(yōu)選含有脫氧肌苷的寡脫氧核苷酸，含有脫氧尿苷的寡 脫氧核苷酸，含有CG基序的寡脫氧核苷酸，或含有肌苷和胞苷的核酸分子。增強(qiáng)納米顆粒 的佐劑性質(zhì)的其它取代物是抗微生物的肽，例如陽離子肽，它們是一類能促進(jìn)和/或提高 適應(yīng)性免疫應(yīng)答的免疫刺激性的、帶正電荷的分子。這樣的具有免疫增強(qiáng)性質(zhì)的肽的一個實例是帶正電荷的人工的抗微生物的肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :63)，它在激發(fā)-強(qiáng)化免 疫接種后會誘導(dǎo)有效的蛋白特異性的類型_2驅(qū)動的適應(yīng)性免疫。視作取代物的特定靶向 物質(zhì)是靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號，即誘導(dǎo)蛋白或肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)運(yùn)輸?shù)男盘栯?。其它任選的取 代物是，例如，酰基，例如乙?；?，其結(jié)合游離氨基，尤其是N-末端氨基酸，或氨基，其結(jié)合 C-末端氨基酸的游離羧基，以產(chǎn)生羧酰胺官能團(tuán)。任選的取代物，例如上述的那些任選的取代物，優(yōu)選地連接接近寡聚化結(jié)構(gòu)域D1 和/或D2的游離末端的合適的氨基酸。肽納米顆粒自裝配后，這樣的取代物然后會呈現(xiàn)在 SAPN的表面。在一個最優(yōu)選的實施方案中，取代物是另一個肽序列S1和/或S2,它代表肽 鏈D1-L-D2在任一端或在兩端的簡單延伸，產(chǎn)生任一種下述形式的組合的單個肽序列 S1-D1-L-D2, D1-L-D2-S2，或S1-D1-L-D2-S2，其中S1和S2是在上文中和在下文中定義的 肽取代物。取代物S1和/或S2用于延伸SAPN的核心序列D1-L-D2。任意這樣的肽序列
51-D1-L-D2，D1-L-D2-S2，或S1-D1-L-D2-S2可以在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為一個單獨(dú) 的分子。優(yōu)選的取代物S1和/或S2是B-細(xì)胞表位?？紤]的其它B-細(xì)胞表位是半抗原分 子，例如碳水化合物或尼古丁，它們同樣結(jié)合在寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和/或D2的末端，因此會 顯示在SAPN的表面。顯然，也可能使超過一種取代物結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和/或D2。例如，考慮肽序 列S1-D1-L-D2-S2，可以將另一種取代物與它共價連接，優(yōu)選在遠(yuǎn)離連接區(qū)段L的位置，接 近D1和/或D2的末端，或在取代物S1和/或S2中的任意位置。也可能使取代物結(jié)合連接區(qū)段L。在這樣的情況下，在重新折疊SAPN后，取代物將 位于SAPN的內(nèi)腔中。形成寡聚體的傾向是指，根據(jù)條件，這樣的肽可以形成寡聚體，例如在變性條件 下，它們是單體，而在生理條件下，它們可以形成例如三聚體。在預(yù)定的條件下，它們會采 取一種單一的寡聚化狀態(tài)，后者是納米顆粒形成所必需的。但是，它們的寡聚化狀態(tài)可 以隨條件變化而變化，例如在增加鹽濃度后，從二聚體變成三聚體(Burkhard P.等人， ProteinScience 2000,9 :2294_2301)，或在降低pH后，從五聚體變成單體。根據(jù)式(I)的構(gòu)造塊結(jié)構(gòu)明顯不同于病毒衣殼蛋白。病毒衣殼由一種單一蛋白組 成，形成60或其倍數(shù)的寡聚體，例如乙型肝炎病毒顆粒(EP1 262 555，EP 0 201 416)，或 由超過一種蛋白組成，它們共裝配，形成病毒衣殼結(jié)構(gòu)，后者也可以采取除二十面體以外的 其它幾何形狀，這取決于病毒的類型(Fender P.等人，Nature Biotechnology 1997,15
52-56)。本發(fā)明的自裝配肽納米顆粒(SAPN)也明顯不同于病毒樣顆粒，因為它們(a)不 是用病毒衣殼蛋白構(gòu)建，且(b)在納米顆粒中央的空腔太小，不足以容納整個病毒基因組 的 DNA/RNA。肽寡聚化結(jié)構(gòu)域是眾所周知的(Burkhard P.等人，Trends Cell Biol2001, 11:82-88)。最簡單的寡聚化結(jié)構(gòu)域可能是卷曲螺旋折疊基序。已經(jīng)證實，該寡聚化基 序作為二聚體、三聚體、四聚體和五聚體存在。一些實例是GCN4亮氨酸拉鏈、fibritin, tetrabrachion和C0MP，分別代表二聚體、三聚體、四聚體和五聚體卷曲螺旋。一個或兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和D2彼此獨(dú)立地是卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。一個卷曲螺旋是一個肽序列，其具有間隔3和4個殘基的主要疏水的殘基的連續(xù)圖案，通常在7個氨基 酸(七肽重復(fù))或11個氨基酸(十一肽重復(fù))的序列中，它裝配(折疊)形成多聚體螺旋 束。也包括這樣的卷曲螺旋，其具有包含一些不規(guī)則分布的3和4個殘基間隔的序列。疏 水的殘基具體地是疏水的氨基酸Val，lie, Leu, Met, Tyr，Phe和Trp。主要疏水的是指，至 少50%的殘基必須選自所述的疏水氨基酸。
或D2是任意下式的肽 (Ila)， (lib), (He), (lid), (lie)，
(Ilf)， (Ilg)， 例如，在式(I)的一個優(yōu)選的單體構(gòu)造塊中，D1和
[aa (a) _aa (b) _aa (c) _aa (d) _aa (e) _aa (f) _aa (g)],[aa (b) _aa (c) -aa (d) -aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a)],[aa (c) _aa (d) -aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a) -aa (b)],[aa (d) _aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a) -aa (b) -aa (c)],[aa (e) -aa (f) -aa (g) -aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d)],[aa (f) _aa (g) -aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d) -aa (e)],[aa (g) _aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d) -aa (e) -aa (f)],其中aa 表示氨基酸或其衍生物，aa(a)，aa (b)，aa(c)，aa(d)，aa(e)，aa(f)，和 aa(g)是相同的或不同的氨基酸或其衍生物，優(yōu)選地aa(a)和aa(d)是相同的或不同的疏水 氨基酸或其衍生物；且X是2至20之間的數(shù)，優(yōu)選3，4，5或6。疏水氨基酸是Val, lie, Leu, Met, Tyr, Phe 和 Trp。七肽是式 aa (a) -aa (b) -aa (c) -aa (d) -aa (e) -aa (f) -aa (g) (Ila)或式(lib)至 (Hg)的變換之一的七肽。優(yōu)選的是式(I)的單體構(gòu)造塊，其中一個或兩個肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2是(1)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中X是3，且aa (a)和aa(d)選自20種天 然a -L-氨基酸，使得表1中對這6個氨基酸的評分總和是至少14，且這樣的肽包含最高達(dá) 17個其它的七肽；或(2)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中X是3，且aa (a)和aa(d)選自20種 天然a -L-氨基酸，使得表1中對這6個氨基酸的評分總和是至少12，條件是，一個氨基酸 aa(a)是能與鄰近七肽的氨基酸aa(d)或aa(g)形成螺旋間鹽橋的帶電荷的氨基酸，或一 個氨基酸aa(d)是能與鄰近七肽的氨基酸aa (a)或aa(e)形成螺旋間鹽橋的帶電荷的氨基 酸，且這樣的肽包含最高達(dá)2個其它的七肽。能與鄰近七肽的氨基酸形成螺旋間鹽橋的帶 電荷的氨基酸是，例如，Asp或GIu，如果其它氨基酸是Lys，Arg或His，反之亦然。表1 用于確定優(yōu)選的氨基酸評分 也優(yōu)選的是式(I)的單體構(gòu)造塊，其中一個或兩個肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2選自 下述優(yōu)選的肽(11)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中aa(a)選自Val，lie，Leu和Met，和其 衍生物，且aa(d)選自Leu，Met和lie，和其衍生物。(12)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中一個aa (a)是Asn，其它aa(a)選自 ASn，Ne和Leu，且aa(d)是Leu。這樣的肽通常是二聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 2)。(13)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中aa (a)和aa(d)都是Leu或都是lie。 這樣的肽通常是三聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 3)。(14)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中aa(a)和aa(d)都是Trp。這樣的肽 通常是五聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 5)。(15)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中aa(a)和aa(d)都是Phe。這樣的肽 通常是五聚化或四聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 4或5)。
(16)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中aa(a)和aa(d)都是Trp或Phe。這 樣的肽通常是五聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 5)。(17)式(Ila)至(Ilg)中任一個的肽，其中aa (a)是Leu或lie，且一個aa (d)是 Gln，且其它aa(d)選自Gln，Leu和Met。這樣的肽具有成為五聚化結(jié)構(gòu)域的潛力(m或n = 5)。其它優(yōu)選的肽是在上文中定義的肽(1)，(2), (11), (12)，(13)，(14)，(15)，(16) 和(17)，且其中另外(21)至少一個aa(g)選自Asp和GIu，且在下述七肽中的aa(e)是Lys，Arg或His ； 和/或(22)至少一個aa(g)選自Lys，Arg和His，且在下述七肽中的aa(e)是Asp或GIu， 和/或(23)至少一個aa(a至g)選自Lys，Arg和His，且序列中間隔3或4個氨基酸的 aa(a至g)是Asp或GIu。這樣的氨基酸aa (a至g)對是，例如aa(b)和aa(e)或aa(f)。卷曲螺旋預(yù)測程序例如COILS(http://www. ch. embnet. org/software/COILS_form. html ；Gruber M.等 人， J.Struct.Biol. 2006,155(2) 140-5)或 MULTICOIL (http://groups, csail. mit. edu/cb/ multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi)可以預(yù)測形成卷曲螺旋的肽序列。因此，在式(I)的 一個優(yōu)選的單體構(gòu)造塊中，D1和/或D2是含有至少一個長度為2個七肽重復(fù)的序列的肽， 用卷曲螺旋預(yù)測程序COILS預(yù)測，利用14、21或28的窗大小中的至少一個，所有它的氨基 酸形成卷曲螺旋的概率高于0. 9。在式(I)的一個更優(yōu)選的單體構(gòu)造塊中，D1和/或D2是含有至少一個長度為3個 七肽重復(fù)的序列的肽，用卷曲螺旋預(yù)測程序COILS預(yù)測，利用14、21或28的窗大小中的至 少一個，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋的概率高于0. 9。在式(I)的另一個更優(yōu)選的單體構(gòu)造塊中，D1和/或D2是含有至少2個分開的 長度為2個七肽重復(fù)的序列的肽，用卷曲螺旋預(yù)測程序COILS預(yù)測，利用14、21或28的窗 大小中的至少一個，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋的概率高于0.9。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2是C0MP(MalaShkeVich V.N.等人，Science 1996，274 :761_765)的五聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 5)或其衍生物。該五 聚化結(jié)構(gòu)域具有序列 LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG(SEQ ID NO :1)。 也預(yù)見到該結(jié)構(gòu)域的小修飾。這樣的修飾可以是，例如，用Cys置換在五聚體外側(cè)在位置 aa(b),aa(c)或aa (f)、優(yōu)選在位置aa (f)處的氨基酸，其目的是在鄰近的結(jié)構(gòu)域之間形成 二硫鍵。該結(jié)構(gòu)域的表面氨基酸的其它修飾可以包括氨基酸的置換，用于優(yōu)化鄰近的寡聚 化結(jié)構(gòu)域之間的界面處的相互作用，例如疏水的、親水的或離子的相互作用或共價鍵如二 硫鍵。也預(yù)見到該結(jié)構(gòu)域更短的構(gòu)建體，例如缺少C-末端CDACG基序，其中半胱氨酸在該 五聚化結(jié)構(gòu)域的C-末端形成分子間二硫鍵。也預(yù)見到影響該結(jié)構(gòu)域的寡聚化狀態(tài)的氨基 酸修飾，導(dǎo)致例如從五聚體向四聚體的轉(zhuǎn)變。該結(jié)構(gòu)域的表面氨基酸的其它修飾可以包括， 氨基酸的置換(例如置換為半胱氨酸或賴氨酸)，以產(chǎn)生官能團(tuán)的結(jié)合部位。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2是色氨酸拉鏈(Liu J等 人，Proc Natl Acad Sci U S A 2004 ； 101 (46) : 16156-61)的五聚化結(jié)構(gòu)域(m 或 n = 5)或其衍生物。該五聚化結(jié)構(gòu)域具有序列SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARW NQRWDNWAT(SEQ ID NO :2)。也預(yù)見到該結(jié)構(gòu)域的小修飾。這樣的修飾可以是，例如，用Cys 置換在五聚體外側(cè)在位置aa(b)、aa(C)或aa(f)、優(yōu)選在位置aa(f)處的氨基酸，其目的是 在鄰近的結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。該結(jié)構(gòu)域的表面氨基酸的其它修飾可以包括氨基酸的置 換，用于優(yōu)化鄰近的寡聚化結(jié)構(gòu)域之間的界面處的相互作用，例如疏水的、親水的或離子的 相互作用或共價鍵如二硫鍵。也預(yù)見到該結(jié)構(gòu)域更短的構(gòu)建體。也預(yù)見到影響該結(jié)構(gòu)域的 寡聚化狀態(tài)的氨基酸修飾，例如用Phe交換核心殘基Trp，導(dǎo)致從五聚化結(jié)構(gòu)域向四聚化結(jié) 構(gòu)域的轉(zhuǎn)變。也考慮在實施例10中的其它核心殘基突變，但是至少70%的核心位置aa (a) 和aa(d)必須是Trp或另一種芳族氨基酸。該結(jié)構(gòu)域的表面氨基酸的其它修飾可以包括， 氨基酸的置換(例如置換為半胱氨酸或賴氨酸)，以產(chǎn)生官能團(tuán)的結(jié)合部位。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2是 tetrabrachion (Stetefeld J.等人，Nature Structural Biology, 2000 ；7 (9) :772_776) 的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的四聚化結(jié)構(gòu)域(m或n = 4)或其衍生物。該四聚化結(jié)構(gòu)域具有序列I INETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLMIINDNVSTILASG(SEQ ID NO :64)。卷曲螺旋序列的 特征在于7個殘基的七肽重復(fù)，其中含有3，4-疏水的重復(fù)。在小數(shù)目的折疊(turn)后允 許殘基假定半價位置的下一個周期性是3個折疊或11個殘基?；?1-殘基重復(fù)的存在， 來自超嗜熱的古細(xì)菌Staphylothermusmarinus的表面層糖蛋白tetrabrachion的C-末端 形成右手卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。它形成長70nm的四聚體的a-螺旋狀的卷曲螺旋莖，后者在它的 C-末端錨定在細(xì)胞膜上。該四聚體卷曲螺旋含有一系列HTL表位(實施例9)，因此理想地 適合作為自裝配肽納米顆粒(SAPN)的核心寡聚體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2是噬菌體T4蛋白 fibritin(Tao, Y.等人，Structure 1997,5:789-798)的三聚化結(jié)構(gòu)域(foldon)或其衍生 物。該三聚化結(jié)構(gòu)域(m或 n = 3)具有序列 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)。也預(yù)見到該結(jié)構(gòu)域的小修飾。這樣的修飾可以是，用Cys置換Asp9，其目的是在鄰近的 結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。該結(jié)構(gòu)域的表面氨基酸的其它修飾可以包括殘基的置換，用于優(yōu) 化鄰近的寡聚化結(jié)構(gòu)域之間的界面處的相互作用，例如疏水的、親水的或離子的相互作用 或共價鍵如二硫鍵。該結(jié)構(gòu)域的表面氨基酸的其它修飾可以包括，氨基酸的置換(例如置 換為半胱氨酸或賴氨酸)，以產(chǎn)生官能團(tuán)的結(jié)合部位。最優(yōu)選的是在實施例中所述的卷曲螺旋序列和單體構(gòu)造塊。自裝配肽納米顆粒均勻單元自裝配肽納米顆粒(SAPN)由式⑴的單體構(gòu)造塊制成。如果這樣的構(gòu)造塊裝配， 它們會形成所謂的"均勻單元"。將裝配成這樣的均勻單元的單體構(gòu)造塊的數(shù)目，由最小 公倍數(shù)(LCM)決定。因此，如果例如單體構(gòu)造塊的寡聚化結(jié)構(gòu)域形成三聚體(Dl)3(m = 3) 和五聚體(02)5(11 = 5)，15個單體會形成一個均勻單元(圖2幻。如果連接區(qū)段L具有適 當(dāng)?shù)拈L度，該均勻單元可以裝配成球形肽納米顆粒的形式。類似地，如果單體構(gòu)造塊的寡聚 化結(jié)構(gòu)域D1和D2形成三聚體(Dl)3(m = 3)和四聚體(D2) 4 (n = 4)，形成一個均勻單元所 需的單體的數(shù)目是12 (圖2B)。由于m和n不能彼此相同或成倍數(shù)，最小公倍數(shù)(LCM)總是大于m和n。通過僅一個或超過一個均勻單元的裝配，可以形成自裝配肽納米顆粒(SAPN)(表2)。這樣的SAPN代表拓?fù)渖戏忾]的結(jié)構(gòu)。表2 寡聚化狀態(tài)的可能組合 規(guī)則的多角體存在5種規(guī)則的多角體，四面體，立方體，八面體，十二面體和二十面體。它們具有 不同的內(nèi)部旋轉(zhuǎn)對稱元件。四面體具有1個2-倍和2個3-倍軸，立方體和八面體具有1個 2-倍、1個3-倍和1個4-倍旋轉(zhuǎn)對稱軸，十二面體和二十面體具有1個2-倍、1個3-倍和 1個5-倍旋轉(zhuǎn)對稱軸。在立方體中，這些軸的空間定向與在八面體中完全一樣，在十二面 體和二十面體中，這些軸相對于彼此的空間定向也完全一樣。因此，為了本發(fā)明的SAPN的 目的，立方體和八面體，類似地十二面體和二十面體，可以視作相同。立方體/八面體由24 個相同的三維構(gòu)造塊構(gòu)成，而十二面體/ 二十面體由60個相同的三維構(gòu)造塊構(gòu)成(表2)。 這些構(gòu)造塊是多面體的不對稱單位(AU)。它們是三錐體，每個錐體邊緣對應(yīng)著一個旋轉(zhuǎn)對 稱軸，因此這些AU會在它們的邊緣具有2-倍、3-倍和4-倍或5-倍對稱元件，這依賴于多 面體類型。如果這些對稱元件由肽寡聚化結(jié)構(gòu)域制成，這樣的AU是由上述的單體構(gòu)造塊構(gòu) 成。足以沿著AU的2個對稱軸排列兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和D2 (圖3)。如果這兩個寡聚化 結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的寡聚體，將自動產(chǎn)生沿著第三個對稱軸的對稱界面，且它可以通過優(yōu)化 沿著該界面的相互作用(例如疏水的、親水的或離子的相互作用或共價鍵例如二硫鍵)來 穩(wěn)定化。裝配具有規(guī)則多角體對稱性的自裝配肽納米顆粒(SAPN)為了生成具有規(guī)則幾何形狀(十二面體，立方體)的自裝配肽納米顆粒(SAPN)， 需要超過一個均勻單元。例如，為了用含有三聚體和五聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域的單體形成十二 面體，需要4個均勻單元，每個由15個單體構(gòu)造塊組成，即具有規(guī)則幾何形狀的肽納米顆粒 由60個單體構(gòu)造塊組成。在表2中列出了形成任意的規(guī)則多角體所需的兩個寡聚化結(jié)構(gòu) 域的寡聚化狀態(tài)的組合和均勻單元的數(shù)目。均勻單元是否能進(jìn)一步裝配形成由超過一個均勻單元組成的規(guī)則多角體，依賴于 2個寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和D2相對于彼此的幾何排列，特別是兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)對稱軸 之間的角度。這由下述因素決定i)納米顆粒中鄰近結(jié)構(gòu)域之間的界面處的相互作用，ii) 連接區(qū)段L的長度，iii)單個寡聚化結(jié)構(gòu)域的形狀。與在規(guī)則多面體中的排列相比，該角 度在均勻單元中更大。在單體構(gòu)造塊中該角度也不相同，這不同于規(guī)則的多面體。如果該
25角度限制為規(guī)則多面體(借助于疏水的、親水的或離子的相互作用，或共價二硫鍵)的更小 的值，且連接區(qū)段L足夠短，給定數(shù)目的拓?fù)渖戏忾]的均勻單元(每個含有確定數(shù)目的單體 構(gòu)造塊)將會進(jìn)一步對合，形成規(guī)則的多面體(表2)，或包圍更多單體構(gòu)造塊，形成缺乏多 面體的嚴(yán)格內(nèi)部對稱性的納米顆粒。如果兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域之間的角度足夠小(甚至小于在具有二十面體對稱性 的規(guī)則多面體中)，則大數(shù)目的(幾百)肽鏈可以裝配成肽納米顆粒。這可以如下實現(xiàn): 用小殘基丙氨酸替換位于兩個螺旋之間的界面處(如在Raman S.等人，Nanomedicine Nanotechnology, Biology, andMedicine 2006,2 95-102 的原始設(shè)計中)且形成兩個螺旋 之間的二硫鍵的2個半胱氨酸，如在序列SEQ ID N0:33中。兩個螺旋之間的角度可以更 小，結(jié)果超過60個肽鏈可以裝配進(jìn)SAPN。在這樣的設(shè)計中，SAPN具有約4MD的分子量，這 對應(yīng)著約330個肽鏈(實施例6)。T-細(xì)胞表位和B-細(xì)胞表位由于T-細(xì)胞表位(相對于B-細(xì)胞表位)不需要顯示在載體表面上來引起免疫接 種，它們可以摻入SAPN的核心支架(即寡聚化結(jié)構(gòu)域的卷曲螺旋序列)中。在本發(fā)明中， 證實了如何將T-細(xì)胞表位的MHC結(jié)合(MHC結(jié)合需要展開構(gòu)象(圖1))的特征與卷曲螺旋 形成(卷曲螺旋形成需要a-螺旋構(gòu)象)的特征相結(jié)合，使得這些表位都成為SAPN的卷曲 螺旋支架的一部分，并能結(jié)合各個MHC分子。應(yīng)當(dāng)指出，并非所有的卷曲螺旋序列都能結(jié)合 MHC分子，也并非所有的T-細(xì)胞表位都可以摻入卷曲螺旋結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明提供了一般規(guī)則， 如何選擇適當(dāng)?shù)腡-細(xì)胞表位，并描述了如何將它們摻入特定卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域，使得 這些肽會形成SAPN。通過使用這些規(guī)則，可以將許多種T-細(xì)胞表位摻入SAPN的卷曲螺旋 支架中。在本發(fā)明的另一個方面，如下將不是卷曲螺旋的B-細(xì)胞表位摻入SAPN寡聚化結(jié) 構(gòu)域的卷曲螺旋序列中通過將它們插入2串卷曲螺旋區(qū)段之間，使得該整個序列起單個 寡聚化結(jié)構(gòu)域的作用。這是特別令人感興趣的，因為卷曲螺旋支架可以提供工具，使B-細(xì) 胞表位的構(gòu)象限制為幾何與它的天然構(gòu)象相同的構(gòu)象。T-細(xì)胞表位的來源為了將T-細(xì)胞表位摻入寡聚化結(jié)構(gòu)域，最終產(chǎn)生自裝配肽納米顆粒(SAPN)，T_細(xì) 胞表位可以選自不同的來源例如，T-細(xì)胞表位可以通過文獻(xiàn)已知的實驗方法來測定，它 們可以通過基于特定病原體的現(xiàn)有蛋白序列的預(yù)測算法來預(yù)測，或它們可以是從新設(shè)計的 肽或它們的組合。在科學(xué)文獻(xiàn)中可得到已知的T-細(xì)胞表位的知識。這些T-細(xì)胞表位可以選自特定 病原體(例如在實施例12，13和14中)，選自癌癥特異性的肽序列(例如在實施例4中)， 或它們可以是具有特定特征的從新設(shè)計的肽，例如結(jié)合許多不同的MHC II分子的PADRE 肽(美國專利5，736，142)，這使它成為所謂的泛宿主性的T-細(xì)胞表位(例如在實施例1 中)。存在公眾可接近的含有數(shù)千不同T-細(xì)胞表位的數(shù)據(jù)庫，例如MHC-數(shù)據(jù)庫"MHCBN VERSION 4. 0 “ (http//www. imtech. res. in/raghava/mhcbn/index. html) ^ PDB- Wi M 庫〃 Protein Data Bank" (http://www. rcsb. org/pdb)，或其它。眾所周知且有很多文獻(xiàn)記載，將HTL表位摻入原本非免疫原性的肽序列中或使它 結(jié)合非肽抗原，可以使它們具有高得多的免疫原性。結(jié)合pan-DR的肽HTL表位PADRE已經(jīng)廣泛地用于瘧疾、阿爾茨海默氏病的疫苗設(shè)計和許多其它疫苗。根據(jù)MHCBN數(shù)據(jù)庫(同上)的定義，T_細(xì)胞表位是與對應(yīng)的MHC分子的結(jié)合親和 力(IC5Q值)小于50，OOOnM的肽。這樣的肽視作MHC結(jié)合物。根據(jù)該定義，截止2006年8 月，在MHCBN數(shù)據(jù)庫的4. 0版中，可以得到下述數(shù)據(jù)20717種MHC結(jié)合物和4022種MHC不
結(jié)合物。合適的T-細(xì)胞表位也可以使用預(yù)測算法得到。這些預(yù)測算法可以掃描來自病原 體的現(xiàn)有蛋白序列中的推定T-細(xì)胞表位，或它們可以預(yù)測，從新設(shè)計的肽是否結(jié)合特定的 MHC分子。公眾在因特網(wǎng)上可接近許多這樣的預(yù)測算法。實例是SVRMHCdb (http //svrmhc. umn. edu/SVRMHCdb ;J. Wan 等人，BMC Bioinformatics 2006,7 463)，SYFPEITHI (http:// www. syfpeithi. de) ,MHCPred(http://www. jenner. ac. uk/MHCPred),基序掃描器(http:// hcv. lanl. gov/content/immuno/motif_scan/motif_scan)或針對 MHC II 結(jié)合分子的 NetMHCIIpan (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetMHCIIpan)和針對 MHC I 結(jié)合表位的 NetMHCpan(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetMHCpan)。本文所述的和設(shè)計優(yōu)選的HTL表位是通過生物物理學(xué)方法測得或通過 NetMHCIIpan預(yù)測會以優(yōu)于500nM的結(jié)合親和力(IC5(1值)結(jié)合任意MHC II分子的肽序列。 這些被視作弱結(jié)合物。優(yōu)選地，這些表位通過生物物理學(xué)方法測得或通過NetMHCIIpan預(yù) 測會以優(yōu)于50nM的IC5(I值結(jié)合任意MHC II分子。這些被視作強(qiáng)結(jié)合物。本文所述的和設(shè)計優(yōu)選的CTL表位是通過生物物理學(xué)方法測得或通過NetMHCpan 預(yù)測會以優(yōu)于500nM的結(jié)合親和力(IC5Q值)結(jié)合任意MHC I分子的肽序列。這些被視作弱 結(jié)合物。優(yōu)選地，這些表位通過生物物理學(xué)方法測得或通過NetMHCpan預(yù)測會以優(yōu)于50nM 的IC5(I值結(jié)合任意MHC I分子。這些被視作強(qiáng)結(jié)合物。T-細(xì)胞表位的位置T-細(xì)胞表位可以摻入卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和/或D2肽序列內(nèi)的幾個位置。 為此，含有T-細(xì)胞表位的特定序列必須服從卷曲螺旋形成的規(guī)則以及MHC結(jié)合的規(guī)則。卷 曲螺旋形成的規(guī)則已經(jīng)在上面詳細(xì)描述。結(jié)合MHC分子的規(guī)則混入MHC結(jié)合預(yù)測程序中， 該程序使用復(fù)雜的算法來預(yù)測MHC結(jié)合肽。存在許多不同的HLA分子，其中在它們的序列中具有氨基酸限制的每一個會最佳 地結(jié)合它。在表3中總結(jié)了結(jié)合基序。在該表中，基序在顯示x的位置可以具有任意氨基 酸，在方括號中，氨基酸(列表)僅可以在結(jié)合基序的特定位置。表3 :HLA基因型的MHC-結(jié)合基序 1)錨殘基顯示在方括號中。在錨位置優(yōu)選的但是非優(yōu)勢的氨基酸顯示在圓括號 中。例如，基序X-[VTILF]-X-X-X-X-X-X-[YF(ML)]是指，第二個和C-末端位置是錨位置。 在第二個位置的優(yōu)勢氨基酸是V，T，I，L，F(xiàn)，在C-末端錨位置的優(yōu)勢氨基酸是Y和F，同時 M和L是優(yōu)選的，但是非優(yōu)勢的。2)Marsh2000 :Marsh S. G. E. , Parham P.和 Barber L. D.，The HLAFactsbook. Academic Press, San Diego,2000. URL :http://www.anthonynolan. com/HIG/. SYFPEITHI The SYFPEITHI Databaseof MHC Ligands, Peptide Motifs and Epitope Prediction. Jan. 2003. URL :http://www. syfpeithi. de. Luscher2001 :Luscher M. A.等人， Immunogenetics. 2001,53(1) :10-14. Yusim2004 :Yusim K.等人，Appl Bioinformatics 2005,4(4) :217-225。許多MHC分子具有非常類似的結(jié)合基序，因此它們可以分組成所謂的HLA超型。在 表4中總結(jié)了這些超型的結(jié)合基序。表4 :HLA超型的MHC-結(jié)合基序 也可以總結(jié)特定氨基酸在T-細(xì)胞表位的某個位置出現(xiàn)的頻率。對于MHC結(jié)合， T-細(xì)胞表位中的位置1、4、6和9是最關(guān)鍵的位置。在表5中列出了在這些位置最優(yōu)選的殘 基，但是，這些位置的特定氨基酸偏好在不同的MHC分子之間有很大差異。因此，如上所述， 上面列出的預(yù)測程序可以更精確地預(yù)測特定氨基酸序列與MHC分子的結(jié)合。表5 在T-細(xì)胞表位的特定位置氨基酸的總頻率(源自基序掃描器http://hcv. lanl. gov/content/immuno/motif_scan/motif_ scan) 從該表5可以容易地看出，例如，在位置1和位置4最頻繁遇到的氨基酸是在卷曲 螺旋七肽重復(fù)的核心位置處發(fā)現(xiàn)的那些(用下劃線指出)。位置1和4可以重疊在七肽重 復(fù)位置aa (a)和aa (d)。因此，在位置1具有氨基酸L和在位置4具有氨基酸V的T_細(xì)胞 表位與在七肽重復(fù)的核心位置aa (a)和aa(d)具有相同氨基酸的卷曲螺旋肽完全一致。因 此，如果肽序列服從兩項T-細(xì)胞結(jié)合基序限制以及卷曲螺旋七肽重復(fù)基序限制，可以將它 摻入SAPN的卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域中。通過調(diào)節(jié)肽序列的排列，使得T-細(xì)胞結(jié)合基序與 卷曲螺旋形成基序重疊，這可以對大量T-細(xì)胞表位實現(xiàn)。將T-細(xì)胞表位構(gòu)建進(jìn)卷曲螺旋為了構(gòu)建SAPN，其在SAPN的卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域中摻入T_細(xì)胞表位，必須 采取三步。在第一步中，必須使用來自文獻(xiàn)或來自數(shù)據(jù)庫的已知T-細(xì)胞表位或使用合適 的表位預(yù)測程序預(yù)測的T-細(xì)胞表位，選擇候選T-細(xì)胞表位。在第二步中，必須將蛋白酶 體切割位點(diǎn)插入CTL表位的C-末端。這可以如下實現(xiàn)使用蛋白酶體切割位點(diǎn)預(yù)測程 序 PAProc (http://www. paproc2. de/paproc 1/paprocl. html ；Hadeler K. P.等人，Math.
36Biosci. 2004，188 :63_79)，并修飾緊挨在目標(biāo)切割位點(diǎn)之后的殘基。HTL表位不需要這第 二步。在第三步也是最重要的步驟中，必須將T-細(xì)胞表位序列與卷曲螺旋序列比對，使它 最佳地符合上述的卷曲螺旋形成規(guī)則。可以預(yù)測具有摻入的T-細(xì)胞表位的序列是否實 際上形成卷曲螺旋，使用可以從因特網(wǎng)上得到的卷曲螺旋預(yù)測程序s例如COILS(http:// www. ch. embnet. org/software/C0ILS_form. html ；Gruber M.等人，J. Struct. Biol. 2006, 155(2) 140-5) ^ MULTIC0IL(http://groups, csail.mit. edu/cb/multicoil/cgi-bin/ multicoil. cgi)，可以優(yōu)化T-細(xì)胞表位序列和卷曲螺旋重復(fù)序列之間的最佳比對。即使不可能發(fā)現(xiàn)合適的比對(可能因為T-細(xì)胞表位含有與卷曲螺旋結(jié)構(gòu)不相容 的一個甘氨酸或甚至一個脯氨酸)，也可以將T-細(xì)胞表位摻入寡聚化結(jié)構(gòu)域(參見實施例 3)。在該情況下，T-細(xì)胞表位必須側(cè)接相同寡聚化狀態(tài)的強(qiáng)卷曲螺旋形成序列。這將會穩(wěn) 定化卷曲螺旋結(jié)構(gòu)至足夠的程度，或者，它可以在該卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域內(nèi)產(chǎn)生環(huán)結(jié)構(gòu)。 這基本上是與下一部分關(guān)于將B-細(xì)胞表位摻入SAPN的卷曲螺旋核心序列所述相同的程 序。將B-細(xì)胞表位構(gòu)建進(jìn)卷曲螺旋核心在本發(fā)明的一個特定方面，預(yù)見到將非a -螺旋狀的小B-細(xì)胞表位摻入SAPN的 卷曲螺旋核心。這可以通過與上面關(guān)于與卷曲螺旋結(jié)構(gòu)不相容的T-細(xì)胞表位所述相同的 程序來實現(xiàn)。T4 fibritin(pdb 登記碼 laaO，http://www.rcsb.org/pdb/)的結(jié)構(gòu)在它的 卷曲螺旋內(nèi)含有2個環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)從2個螺旋回轉(zhuǎn)之間的卷曲螺旋伸出，從而不阻斷卷曲螺 旋的螺旋結(jié)構(gòu)。在fibritin中，環(huán)在卷曲螺旋的位置aa(b)離開螺旋，在卷曲螺旋序列的 位置aa(c)重新進(jìn)入螺旋。一個環(huán)是短的折疊，而另一個環(huán)是更不規(guī)則的環(huán)結(jié)構(gòu)。卷 曲螺旋中殘基aa(b)和aa(c)之間的距離理想地適合用作反向平行的折疊肽的錨點(diǎn)。 當(dāng)殘基aa(b)或aa(c)或它們二者是甘氨酸殘基時，這允許存在蛋白二級結(jié)構(gòu)所需的柔性， 并重新進(jìn)入卷曲螺旋的a-螺旋。. . VQNLQVEIGNNSAGIKGQVVALNTLVNGTNPNGSTVEERGLTNSIKANETNIASVTQEV...ad ad a d ad ad ad a(SEQ ID NO 4)在上面fibritin的序列中，用斜體顯示環(huán)結(jié)構(gòu)，用下劃線指示在aa(b)和aa(c) 位置處的殘基(這里存在2個環(huán)，并重新進(jìn)入螺旋)。這4個殘基中的3個是甘氨酸殘基。 用它作為模板，具有反向平行的0 “折疊構(gòu)象的B-細(xì)胞表位現(xiàn)在可以摻入SAPN的卷曲螺 旋核心。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)必須足夠穩(wěn)定，以允許摻入這樣的環(huán)結(jié)構(gòu)，因此它必須能在環(huán)的兩側(cè) 形成卷曲螺旋。到目前為止描述的最小的自動折疊的卷曲螺旋序列是2個七肽重復(fù)長。在 下面的序列中，將來自HIV的蛋白gpl20的V3表位的尖端(它是一種反向平行的折疊 肽)摻入設(shè)計的穩(wěn)定的卷曲螺旋的卷曲螺旋，其在兩側(cè)側(cè)接超過2個七肽重復(fù)的螺旋。這 些是源自Burkhard P.等人，JMol Biol 2002，318 :901_910的非常穩(wěn)定的卷曲螺旋片段。LEELERRLEELERRLEELERRLGSIRIGPGQTFYAGVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 5)ad ad ad adadad 核心殘基這會使卷曲螺旋內(nèi)的V3環(huán)的構(gòu)象限制為反向平行的折疊構(gòu)象，后者對應(yīng)著該 肽在蛋白上的天然構(gòu)象。優(yōu)選的設(shè)計
為了構(gòu)建用于特定用途的具有最佳免疫學(xué)性能的SAPN，必須考慮下述方面CTL表位在它們的C-末端需要蛋白酶體切割位點(diǎn)。表位應(yīng)當(dāng)不類似于人序列，以 避免自身免疫應(yīng)答，除了當(dāng)目標(biāo)是引起針對人肽的免疫應(yīng)答以外?？赡艿膶嵗菍嵤├? 的癌癥特異性的CTL表位。因此，這樣的SAPN是優(yōu)選的，其中至少一個T-細(xì)胞表位是CTL表位，且具體地，其 中所述序列在CTL表位后另外含有蛋白酶體切割位點(diǎn)。同樣優(yōu)選這樣的SAPN，其中至少一個T-細(xì)胞表位是HTL表位，具體地，結(jié)合 pan-DR的HTL表位。這樣的結(jié)合pan-DR的HTL表位會結(jié)合表3底部列出的許多MHC II類 分子，因此會在大多數(shù)健康個體中被識別，這對于好疫苗是至關(guān)重要的。也優(yōu)選這樣的SAPN，其中序列D1-L-D2含有一系列重疊的T_細(xì)胞表位，如果D1或 D2是三聚體(實施例7和8)、四聚體(實施例9)或五聚體(實施例10)。B-細(xì)胞表位需要顯示在SAPN的表面。它們可以是或不是卷曲螺旋序列的一部 分，即卷曲螺旋自身可以部分地是B-細(xì)胞表位，這取決于卷曲螺旋的該部分是否是表面 可接觸的。例如，由有包膜病毒的表面蛋白的三聚體卷曲螺旋組成的B-細(xì)胞表位可以 顯示在SAPN的表面，同時是卷曲螺旋序列的一部分。在Raman S.等人，Nanomedicine Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006 ；2 :95_102 中，顯示了這種設(shè)計的一個實 例。通常，任意寡聚化狀態(tài)的卷曲螺旋特別適合以構(gòu)象特異性的方式被SAPN呈遞。卷曲螺 旋是豐富的，不僅在有包膜病毒的表面蛋白中，而且在例如瘧疾病原體鐮狀瘧原蟲的基因 組中(Villard V 等人，PLoS ONE 2007 ；2 (7) :e645)。但是，一般而言，B_細(xì)胞表位不是卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域的一部分，或它們可以由 卷曲螺旋和另一個不是卷曲螺旋的部分組成，例如細(xì)菌的三聚體自運(yùn)載體粘連(TAA)，它們 具有卷曲螺旋莖和球形頭結(jié)構(gòu)域，例如腦膜炎萘瑟菌的TAA。特別感興趣的是蛋白作為B-細(xì)胞表位，它們自身是寡聚體的，例如三聚體血凝素 和四聚體唾液酸酶或流感的M2表面蛋白。設(shè)計針對病原體的疫苗時的考慮方面這樣的疫苗優(yōu)選含有所有3類表位、B-細(xì)胞、HTL和CTL表位。(1)優(yōu)選地，僅一 個(或非常少的)B-細(xì)胞表位應(yīng)當(dāng)位于肽鏈的任一端。在重復(fù)的抗原顯示中，這會使B-細(xì) 胞表位位于SAPN的表面。(2)HTL表位應(yīng)當(dāng)盡可能是泛宿主性的。它們不一定需要源自病 原體，但是可以是引起強(qiáng)T-輔助免疫應(yīng)答的肽。一個實例是PADRE肽。優(yōu)選地，它們是摻 入SAPN的D1-L-D2核心序列中的T-細(xì)胞表位。(3)CTL表位需要是病原體特異性的，它們 需要具有C-末端蛋白酶體切割位點(diǎn)。因為T-細(xì)胞表位不需要重復(fù)的抗原顯示，可以如下 將幾種不同的T-細(xì)胞表位摻入一個單獨(dú)的SAPN 通過共裝配不同的肽鏈，所述不同的肽鏈 都具有相同的形成納米顆粒的D1-L-D2核心，但是攜帶不作為核心形成序列的一部分因而 不會摻入卷曲螺旋序列中的不同T-細(xì)胞表位。以類似的方式，可以將攜帶靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(即信號肽，其誘導(dǎo)蛋白或肽向內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)(ER)的運(yùn)輸)的肽鏈共裝配進(jìn)同一個SAPN，以使CTL表位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，被MHC I分子 適當(dāng)呈遞，因為交叉呈遞在人中不是非常有效。但是，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號不需要在分開的 肽鏈上，它可以在與CTL表位相同的肽中。合適的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽是例如靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號 (E3/19K)MRYMILGLLALAAVCSA(SEQ ID NO :6)。
目的在于產(chǎn)生強(qiáng)抗體應(yīng)答的治療疫苗目的在于產(chǎn)生強(qiáng)抗體應(yīng)答的治療疫苗特別地用于治療阿爾茨海默病、高血壓、肥 胖癥、藥癮或炎癥。對于這樣的疫苗，優(yōu)選使用僅一個B-細(xì)胞表位。通過在SAPN中包含 一個或更多個泛宿主性的HTL表位，可以進(jìn)一步增強(qiáng)歸因于重復(fù)抗原顯示的強(qiáng)體液免疫應(yīng) 答。優(yōu)選地，它們是摻入SAPN的D1-L-D2核心序列中的T-細(xì)胞表位。此外，應(yīng)當(dāng)存在盡可 能少的和盡可能弱的結(jié)合CTL表位——特別不針對人肽，以避免自身免疫應(yīng)答。用于誘導(dǎo)CTL應(yīng)答例如針對癌癥的治療疫苗在該情況下，不必使用B-細(xì)胞表位。通過在SAPN中包含一個或更多個泛宿主性 的HTL表位，進(jìn)一步增強(qiáng)針對特定CTL表位(例如MAGE-1，2，3 ；MART-1，2，3 ；或Her-2/neu， 也參見實施例4)的免疫應(yīng)答。作為佐劑的自裝配肽納米顆粒(SAPN)由許多HTL表位組成的SAPN會誘導(dǎo)強(qiáng)T_輔助免疫應(yīng)答(參見實施例2)。如果 以與任意其它疫苗制劑相同的劑量施用，這會導(dǎo)致免疫應(yīng)答的刺激。這樣的SAPN將成為佐 劑，不需要任意CTL或B-細(xì)胞表位。但是，B-細(xì)胞和CTL表位可以與這樣的佐劑SAPN相 組合。另外，可以將特定佐劑分子共價偶聯(lián)至SAPN，作為寡聚化結(jié)構(gòu)域D1或D2的取代物， 以進(jìn)一步刺激SAPN的佐劑效應(yīng)。特別感興趣的是免疫刺激的核酸，優(yōu)選含有脫氧肌苷的寡 脫氧核苷酸，含有脫氧尿苷的寡脫氧核苷酸，含有CG基序的寡脫氧核苷酸，或含有肌苷和 胞苷的核酸分子。其它免疫刺激的分子是，例如，抗微生物的肽，例如陽離子肽，它們是一類 能促進(jìn)和/或提高適應(yīng)性免疫應(yīng)答的免疫刺激性的、帶正電荷的分子。這樣的具有免疫增 強(qiáng)性質(zhì)的肽的一個實例是帶正電荷的人工的抗微生物的肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :63)， 它在激發(fā)_強(qiáng)化免疫接種后會誘導(dǎo)有效的蛋白特異性的類型_2驅(qū)動的適應(yīng)性免疫。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗原選自(a)適合誘導(dǎo)針對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的蛋白；(b)適 合誘導(dǎo)針對感染性疾病的免疫應(yīng)答的蛋白或碳水化合物；(c)適合誘導(dǎo)針對變應(yīng)原的免疫 應(yīng)答的蛋白；(d)適合誘導(dǎo)治療人疾病的免疫應(yīng)答的肽激素；和(e)適合誘導(dǎo)治療成癮或其 它病癥的免疫應(yīng)答的半抗原分子。包含這樣的蛋白、其肽片段、肽、碳水化合物或半抗原的 肽納米顆粒，可以適合誘導(dǎo)人或畜牧動物和寵物的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，抗原或抗原決定簇是可用于預(yù)防感染性疾病 的那些。這樣的治療可用于預(yù)防影響廣范圍宿主的多種感染性疾病，例如人或非人動物，例 如牛、羊、豬、狗、貓、其它哺乳動物物種和非哺乳動物物種。具體地，本發(fā)明涉及包含下述抗原之一的SAPN
(a)適合誘導(dǎo)針對細(xì)菌的免疫應(yīng)答的抗原；
(b)適合誘導(dǎo)針對病毒的免疫應(yīng)答的抗原；
(c)適合誘導(dǎo)針對寄生蟲的免疫應(yīng)答的抗原；
(d)適合誘導(dǎo)針對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的抗原；
(e)適合誘導(dǎo)針對變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的抗原；
(f)適合誘導(dǎo)針對成癮的免疫應(yīng)答的抗原；
(g)適合誘導(dǎo)針對疾病和代謝性病癥的免疫應(yīng)答的抗原
(h)適合誘導(dǎo)畜牧動物的免疫應(yīng)答的抗原；和
(i)適合誘導(dǎo)寵物的免疫應(yīng)答的抗原。
可治療的感染性疾病是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。實例包括病毒的、細(xì)菌的或 寄生蟲的病因?qū)W感染，例如下述疾病阿米巴病，炭疽，彎曲桿菌感染，水痘，霍亂，登革，白 喉，腦炎，埃博拉，流感，日本腦炎，利什曼病，瘧疾，麻疹，腦膜炎球菌疾病，腮腺炎，醫(yī)院感 染，百日咳，肺炎球菌疾病，小兒麻痹癥(脊髓灰質(zhì)炎)，風(fēng)疹，帶狀皰疹，血吸蟲病，破傷風(fēng)， 蜱傳腦炎，滴蟲病，錐蟲病，結(jié)核病，傷寒，水痘，和黃熱病。具體地，本發(fā)明涉及包含來自下述寄生蟲的下述抗原之一的SAPN:彎曲桿菌屬， 巨細(xì)胞病毒，EB病毒，口蹄疫病毒，B型流感嗜血桿菌，幽門螺旋桿菌，乙型肝炎病毒，丙型 肝炎病毒，戊型肝炎病毒，單純皰疹病毒，人免疫缺陷病毒，人乳頭狀瘤病毒，腦膜炎萘瑟 菌，綠膿假單胞菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，呼吸道合胞病毒，輪狀病毒，蛔蟲，鉤蟲， 和西尼羅病毒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，預(yù)見到用于預(yù)防和治療瘧疾的組合物(實施例11)。 瘧疾寄生蟲的生命周期提供了幾個在這期間的干擾會導(dǎo)致感染過程停止的階段。在瘧疾寄 生蟲的生命周期中，因為雌性瘧蚊的叮咬，人受到瘧疾的感染。蚊子將它的探針插入宿主， 在這過程中，注射子孢子形式的鐮狀瘧原蟲(或間日瘧原蟲)，后者存在于蚊子的唾液中。 可能適用于設(shè)計肽疫苗的蛋白和肽序列可以含有來自下述瘧原蟲蛋白的序列MSP-1 ( — 種在寄生蟲細(xì)胞表面表達(dá)的大多形蛋白)，MSA1 (主要的裂殖子表面抗原1)，CS蛋白(天然 的環(huán)子孢子)，根據(jù)美國專利4，735，799的35KD蛋白或55KD蛋白或195KD蛋白，AMA-1 (頂 膜抗原1)，或LSA (肝階段抗原)。在一個優(yōu)選的設(shè)計中，B-細(xì)胞表位之一是8至約48個殘基的序列，其構(gòu)成環(huán)子孢 子(CS)蛋白的B細(xì)胞表位。該B-細(xì)胞表位是鐮狀瘧原蟲的氨基酸序列NANP的多余重復(fù) 區(qū)域。在一個優(yōu)選的SAPN設(shè)計中，該B細(xì)胞表位包含氨基酸殘基序列NANP或其變換ANPN、 NPNA和PNAN的2至約5個重復(fù)。間日瘧原蟲中對應(yīng)的重復(fù)區(qū)域由下述高度相似的序列中 的任一個組成表6 間日瘧原蟲CS重復(fù)B-細(xì)胞表位序列 在一個優(yōu)選的設(shè)計中，B-細(xì)胞表位之一是由這些序列中的任一個組成的8至約48 個殘基的序列。在下面的3個表中為B-細(xì)胞表位、HTL-表位和CTL-表位列出了用于設(shè)計治療瘧 疾的SAPN的具體肽序列。下面的表7列出了優(yōu)選的鐮狀瘧原蟲卷曲螺旋B-細(xì)胞表位(Villard V.等人， PLoS ONE 2007,2(7) :e645 和 Agak G. W.，Vaccine (2008) 26，1963-1971)。因為對于 B_ 細(xì) 胞表位，僅表面可接近的殘基對于它們與B-細(xì)胞受體的相互作用和抗體的生產(chǎn)是至關(guān)重 要的，可以在一定程度上修飾非表面暴露的在aa(a)和aa(d)位置的卷曲螺旋核心殘基，而 不改變免疫原的引起中和抗體的能力。例如，用異亮氨酸交換在aa(a)位置的纈氨酸，不會 影響卷曲螺旋B-細(xì)胞表位的以便免疫學(xué)性質(zhì)。因此，通過為最好的卷曲螺旋形成和穩(wěn)定性 優(yōu)化核心殘基，可以人工地穩(wěn)定化這些卷曲螺旋序列(實施例13)，而不消除它們的免疫學(xué) 潛力。因此，也為這些B-細(xì)胞表位預(yù)見到在它們于aa (a)和/或aa(d)處的核心殘基中的 一個或更多個處修飾這些肽B-細(xì)胞表位，且保持上面詳述的形成卷曲螺旋的傾向。因而，在一個優(yōu)選的設(shè)計中，在它們的一個或更多個核心位置具有修飾的卷曲螺 旋B-細(xì)胞表位是這樣的肽，其含有至少一個長度為2個七肽重復(fù)的序列，用卷曲螺旋預(yù)測 程序COILS預(yù)測，利用14、21或28的窗大小中的至少一個，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋 的概率高于0.9。在一個更優(yōu)選的設(shè)計中，在它們的一個或更多個核心位置具有修飾的卷曲螺旋 B-細(xì)胞表位是這樣的肽，其含有至少一個長度為3個七肽重復(fù)的序列，用卷曲螺旋預(yù)測程 序COILS預(yù)測，利用14、21或28的窗大小中的至少一個，所有它的氨基酸形成卷曲螺旋的 概率高于0. 9。在另一個更優(yōu)選的設(shè)計中，在它們的一個或更多個核心位置具有修飾的卷曲螺旋 B-細(xì)胞表位是這樣的肽，其含有至少兩個分開的長度為2個七肽重復(fù)的序列，用卷曲螺旋 預(yù)測程序COILS預(yù)測，利用14、21或28的窗大小中的至少一個，所有它的氨基酸形成卷曲 螺旋的概率高于0.9。表7 鐮狀瘧原蟲卷曲螺旋B-細(xì)胞表位序列 下面的表8列出了優(yōu)選的鐮狀瘧原蟲HTL表位(Doolan，D. L.，Thejournal of Immunology, 2000,165 :1123_1137 ；美國專利 5，114，713)表8 鐮狀瘧原蟲HTL表位序列 下面的表9列出了優(yōu)選的鐮狀瘧原蟲CTL表位(美國專利5，028，425，5，972，351， 6，663，871)表9 鐮狀瘧原蟲CTL表位序列 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，預(yù)見到用于預(yù)防和治療HIV的組合物(實施例5 和12)。為了制備抗-HIV疫苗，可以使用能引起HIV-特異性的抗體的合成肽，所述合成肽 具有HIV-1的外膜或gag蛋白或gpl20或gp41的功能性的T-細(xì)胞表位或B-細(xì)胞表位的氨 基酸序列，以提供免疫應(yīng)答。特別感興趣的是在gp41或gpl20內(nèi)的序列，它們可以誘導(dǎo)構(gòu) 象特異性的能干擾融合過程的中和抗體，如已知的抗體2F5和4E10，或來自gp41或gpl20 的V3-環(huán)。這樣的序列主要位于HR1和HR2和簇I和簇II區(qū)域中或附近。結(jié)合例如gp41 的卷曲螺旋三聚體且由本發(fā)明的摻入該卷曲螺旋三聚體的肽納米顆粒引起的抗體，會抑制 發(fā)夾形成，并從而抑制病毒融合。類似地，針對埃博拉或具有類似融合過程的另一種病毒的 三聚體卷曲螺旋產(chǎn)生的抗體，會抑制這些病毒的病毒進(jìn)入。使用Letourneau S.等人，PLoS ONE 2007,10 :e984所述的高度保守的HIV蛋白序 列，使用 SVRMHCdb (http //svrmhc. umn. edu/SVRMHCdb ；Wan J.等人，BMC Bioinformatics 2006，7 :463)，預(yù)測CTL表位。這些保守的蛋白序列含有CTL表位，據(jù)預(yù)測其會結(jié)合在表10 中列出的HLA分子，且是設(shè)計SAPN-HIV疫苗的優(yōu)選CTL表位。這些肽表位含有大量重疊的 序列，它們可以組合成更長的肽序列，后者在一個單獨(dú)的連續(xù)肽串中具有多個CTL表位(表 11)。表10 預(yù)測的保守的HIV CTL表位 表11 預(yù)測的保守的組合的HIV CTL表位 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，預(yù)見到用于預(yù)防和治療流感的組合物。甲型流感 編碼完整的膜蛋白M2，它是一種同源四聚體，它的亞基具有一個23個氨基酸殘基的小外部 結(jié)構(gòu)域(M2e)。天然M2蛋白以幾個拷貝存在于病毒顆粒中，并通過大量的其它2種表面蛋白 血凝素和唾液酸酶回避免疫系統(tǒng)。另一方面，它大量存在于病毒感染的細(xì)胞的膜表面。M2e 的序列是高度保守的。已經(jīng)證實，M2e作為嵌合的GNC4-M2e蛋白中的四聚體呈遞給免疫系 統(tǒng)，產(chǎn)生高度特異性的且保護(hù)性的體液免疫應(yīng)答(DeFilette M.等人，J Biol Chem 2008 ； 283(17) 11382-11387)。對于人和禽特異性的流感株而言，M2e四聚體是高度保守的B_細(xì)胞表位(表12和 13)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)結(jié)合來自SAPN的tetrabrachion (或任意其它 四聚體卷曲螺旋)的四聚體卷曲螺旋的N-末端時，它可以顯示它的天然四聚體構(gòu)象(實施 例9)。表12 :M2e人特異性的M2e序列 表13 :M2e禽特異性的M2e序列 通過前體蛋白切割成2個分開的肽鏈，激活流感血凝素(HA) (Steinauer D. S.等 人，Virology 1999 ；258 :1_20)。需要HA前體分子HAO的切割來激活病毒感染力，激活蛋 白酶在宿主中的分布是趨向性和相應(yīng)病原性的決定因素之一。哺乳動物和非病原性的禽病 毒的HAs在細(xì)胞外切割，這會限制它們在宿主中傳播至遇到適當(dāng)?shù)鞍酌傅慕M織。另一方面， 病原性病毒的HAs在細(xì)胞內(nèi)被廣泛存在的蛋白酶切割，因此具有感染不同的細(xì)胞類型并造 成全身感染的能力。不同于M2e序列，切割肽的N-末端部分不是高度保守的(切割肽的C-末端實際 上是高度保守的)。在HA前體蛋白中，切割肽是表面暴露的，在切割位點(diǎn)周圍的6個殘基 (切割位點(diǎn)每一側(cè)3個殘基)是該肽序列的最大特征(在表14中用粗體突出顯示)。在一 個優(yōu)選的SAPN設(shè)計中，這6個殘基代表B-細(xì)胞表位，它們可以誘導(dǎo)抗體，后者在結(jié)合該肽 后，可以保護(hù)HA前體蛋白免于切割。通過共裝配具有相同的SAPN形成核心D1-L-D2、但是結(jié)合不同B-細(xì)胞表位的的 肽，可以將SAPN理想地用于顯示對不同HA類型特異性的多種不同的切割序列(表14)(實 施例15)。表14 來自甲型流感和乙型流感的血凝素切割位點(diǎn)序列
類型序列SEQ ID NO HlSIQSRGLFGA211 例如，包含H1、H2和H3切割位點(diǎn)序列(其具有插入的天冬氨酸氨基酸，使該序列更 易溶和堿性更低)的血凝素B-細(xì)胞表位串看起來象SIQSRGLFGDIESRGLFGERQTRGire (SEQ ID NO 227)。可以將具有相同核心序列、但是具有不同B-細(xì)胞表位或表位串的肽共裝配進(jìn)一 個SAPN，生成多價SAPN免疫原，其可能包括表14的所有或大部分重要的(對于人疫苗而 言，HI, H2，H3，H5，H7 和 H9)序列(實施例 15)。在一個類似的方案中，可以將由6條肽鏈組成的流感疫苗SAPN共裝配進(jìn)一個 SAPN,所述肽鏈含有相同的核心和相同的N-末端B-細(xì)胞表位M2e和約20個在C-末端的 CTL表位(每條肽鏈3個或4個)(實施例14)。在表15中，列出了來自Parida R.等人， Vaccine 2007,25 :7530_7539的優(yōu)選的保守的CTL表位。由于這6條肽鏈的核心是相同的， 這6條肽鏈共裝配進(jìn)一個SAPN，會將約20個不同的CTL表位摻入一個SAPN。
表15 來自Parida R.等人的保守的流感CTL表位 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物是免疫治療劑，其可以用于治療代 謝性病癥和疾病或成癮。最優(yōu)選的是用于治療阿爾茨海默病、高血壓、肥胖癥、尼古丁和可 卡因成癮的免疫治療劑。表16 用于SAPN疫苗的B細(xì)胞表位 Αβ-片段(Αβ)是42個氨基酸長的肽(Αβ1-42)。因為整個42個殘基長的肽 序列也含有可以造成自身免疫反應(yīng)的CTL表位，希望僅使用該肽的更短的片段用于疫苗設(shè) 計，例如A β 1-12或甚至象A β 1-6這樣的短肽(美國專利7，279，165)。同樣，全長TNFa蛋白作為免疫原具有一些限制。局部過量生成的促炎癥細(xì)胞因 子TNFa至關(guān)重要地參與幾種慢性陽性病癥的發(fā)病機(jī)理，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和 克羅恩病。用單克隆抗體(mAbs，英夫利昔單抗，阿達(dá)木單抗)或嵌合的可溶性受體(依那 西普)中和TNFa，可以有效地治療這些病癥，但是具有幾個潛在的缺點(diǎn)。它可能誘導(dǎo)同種 異型-或個體基因型特異性的抗體，后者可能限制在許多患者中的長期功效。此外，隨著 治療的患者的數(shù)目的增加，越來越明顯的是，用TNFa-拮抗劑(具體地，mAbs)進(jìn)行治療會 增加機(jī)會性感染的風(fēng)險，特別是由細(xì)胞內(nèi)病原體如結(jié)核分支桿菌、單核細(xì)胞增多性李司忒 菌或夾膜組織胞漿菌造成的那些。已經(jīng)證實，用僅包含殘基4-23的TNF α的更短片段進(jìn)行 免疫接種，會避免一些這樣的問題(G. Spohn等人，The Journal of Immunology, 2007,178 7450-7457)。因此，免疫接種TNF α 4_23是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它自身免疫病的一種新穎 的有效療法，這會為現(xiàn)有的抗-TNF α療法增加新水平的安全性。通過選擇性地僅靶向可溶 形式的TNF α和節(jié)省跨膜形式，用疫苗中和TNF α的致病效應(yīng)，同時在宿主對細(xì)胞內(nèi)病原體 的應(yīng)答中的重要功能保持完整。除了尼古丁和可卡因以外，下述化合物也可以用作半抗原分子，用于設(shè)計針對成 癮的B-細(xì)胞SAPN疫苗阿片制劑，大麻，苯異丙胺，巴比妥酸鹽，格魯米特，甲乙哌酮，水合 氯醛，甲喹酮，苯并二氮卓，LSD，抗膽堿能藥，抗精神病藥，色胺，其它精神癥狀藥物，鎮(zhèn)靜 藥，苯環(huán)利定，賽洛西賓，揮發(fā)性的亞硝酸鹽，和誘導(dǎo)軀體依賴性和/或精神依賴性的其它 藥物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物是可以用于治療變態(tài)反應(yīng)的免疫治 療劑。用于治療變態(tài)反應(yīng)的組合物和方法的抗原或抗原決定簇的選擇，是治療這樣的病癥 的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這類抗原或抗原決定簇的代表性實例包括蜂毒磷酸脂肪 酶A2，Bet ν 1(白樺花粉變應(yīng)原)，5DoI m V(白臉大黃蜂毒液變應(yīng)原)，和Der ρ I (房塵 螨變應(yīng)原)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物是可以用于治療癌癥的免疫治療 劑。靶向疫苗設(shè)計的主要癌癥如下腦癌，乳腺癌，子宮頸癌，結(jié)腸直腸癌，食管癌，成膠質(zhì)細(xì) 胞瘤，白血病(急性骨髓性和慢性髓細(xì)胞樣)，肝癌，肺癌(非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌)，淋 巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，腎癌。用于治療癌癥的組合物和方法的抗原或抗原決定簇的選擇，是治療這樣的病癥的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這類抗原或抗原決定簇的代表性實例包括下述的HER2/ neu(乳腺癌)，GD2(神經(jīng)母細(xì)胞瘤)，EGF-R (惡性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，CEA (髓樣甲狀腺癌)， ⑶52(白血病)，MUC1 (在血液惡性腫瘤中表達(dá))，gpl00蛋白，或腫瘤抑制基因WTl的產(chǎn)物。 在表17中，顯示了感興趣的癌癥特異性的T-細(xì)胞表位和相關(guān)的起源蛋白和MHC限制。表17 =SAPN疫苗的癌癥T-細(xì)胞表位 最優(yōu)選的是在實施例中所述的卷曲螺旋序列、B-細(xì)胞_、HTL-和CTL-表位、單體 構(gòu)造塊、SAPN和疫苗設(shè)計。
實施例下面的實施例用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 :PADRE(P5c-8_Mal)使用下述的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)，將含有序列AKFVAAWTLKAAA (SEQ IDNO 296)的pan_DR表 位PADRE摻入SAPN的三聚體卷曲螺旋殘基丙氨酸(A)具有形成α-螺旋的強(qiáng)傾向。排 列卷曲螺旋核心位置，使得殘基纈氨酸、色氨酸和丙氨酸位于七肽重復(fù)圖譜的aa(a)、aa(d) 和另一個aa(a)位置。設(shè)計位于HTL表位的N-末端和C-末端的三聚體卷曲螺旋的剩余部 分，使得該序列預(yù)測會形成非常強(qiáng)的卷曲螺旋。RLLARLEELERRLEELAKFVAAffTLKAAAVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO 7)d ad ad ad ad ad ad 核心殘基用預(yù)測程序COILS預(yù)測，該肽的序列(SEQ ID NO 7)會形成卷曲螺旋。使用21個 氨基酸的窗口用于卷曲螺旋預(yù)測，序列中的所有殘基形成卷曲螺旋的概率超過95% (參見 下面的表18)。因此這是預(yù)測的也含有T-細(xì)胞表位的卷曲螺旋。非常重要地認(rèn)識到，如果窗口僅包含14個氨基酸，在T-細(xì)胞表位序列內(nèi)卷曲螺旋 預(yù)測下降至小于2%概率的非常低的值。在整個序列中具有高預(yù)測卷曲螺旋傾向的21個氨 基酸的更大的窗大小顯示出在T-細(xì)胞表位的N-和C-末端的側(cè)接區(qū)域的效應(yīng)。如果它們
55是強(qiáng)烈有利于卷曲螺旋形成的序列，則可以補(bǔ)償T-細(xì)胞表位的不太有利于卷曲螺旋傾向， 且可以誘導(dǎo)整個序列形成卷曲螺旋，即使T-細(xì)胞表位不含有非常有利的卷曲螺旋序列。表18 包含PanDR表位PADRE的SEQ ID NO 7的卷曲螺旋傾向 然后將SEQ ID NO 7的該三聚體卷曲螺旋包含進(jìn)下面SEQ ID NO 8的SAPN序列 中，后者包含His-標(biāo)簽、COMP的五聚體卷曲螺旋、由包含PADRE T-細(xì)胞表位的SEQ ID NO 7序列組成的三聚體卷曲螺旋、和來自柏格鼠瘧原蟲的CS-蛋白的B-細(xì)胞表位。MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSDEMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLRALLMGGRLLARLEE
LERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGS⑶PPPPNPNDPPPPNPND(SEQ ID NO 8)在大腸桿菌中表達(dá)具有該序列的肽，并通過標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)操作，在鎳親和柱 上純化° 根據(jù) Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 95-102，進(jìn)行重新折疊。通過動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)，分析 重新折疊的SAPN的納米顆粒形成。DLS分析顯示出平均粒徑為32. Olnm的良好大小分布， 多分散性指數(shù)為12. 9% (圖4A)。TEM照片(圖4B)顯示出通過DLS測得相同大小的納米 顆粒。實施例2 :P5c-6- 一般的該卷曲螺旋序列含有4個重疊的HTL表位，各自具有序列LEELERSIW、IWMLQQAAA、 WMLQQAAAR和MLQQAAARL，它們通過算法SVRMHC預(yù)測會分別結(jié)合不同的MHC II分子 DQA1*0501、DRB1*0501、DRB5*0101 和 DRB1*0401，預(yù)測的結(jié)合親和力(pIC50 值)分別是 6. 122,8. 067,6. 682和6. 950。使這些HTL表位與卷曲螺旋七肽重復(fù)對齊，使得它們預(yù)測會 形成非常強(qiáng)的卷曲螺旋。卷曲螺旋的aa(a)和aa(d)核心位置被Leu、Leu、lie、Leu、Ala 和Leu占據(jù)，它們中的大多數(shù)對于高形成卷曲螺旋的傾向而言是非常好的殘基，僅Ala是稍 微不太有利的。RLLARLEELERSIWMLQQAAARLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO 9)d ad ad ad ad ad ad 核心殘基結(jié)果，通過預(yù)測程序COILS預(yù)測該肽的序列會形成卷曲螺旋。該序列中HTL表位 的所有殘基形成卷曲螺旋的概率超過99% (表19)。對比用于卷曲螺旋預(yù)測的小和大窗尺 寸，再次顯示出側(cè)接序列對卷曲螺旋穩(wěn)定性的影響。利用28個氨基酸的窗大小，預(yù)測完整 序列形成卷曲螺旋的概率是100%，而14個氨基酸的更小的窗大小顯示出N-末端處T-細(xì) 胞表位的更低卷曲螺旋傾向的效應(yīng)，卷曲螺旋形成具有更低的預(yù)測值。因此，對于完整序 列，預(yù)測該肽會形成包含4個不同HTL表位的穩(wěn)定卷曲螺旋。表19 包含4個不同HTL表位的SEQ ID NO 9的卷曲螺旋傾向
然后將該三聚體卷曲螺旋包含進(jìn)下面SEQ ID NO 10的SAPN序列中，后者包含 His-標(biāo)簽、COMP的五聚體卷曲螺旋、SEQ ID NO 9的三聚體卷曲螺旋、和來自柏格鼠瘧原蟲 的CS-蛋白的B-細(xì)胞表位。MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSDEMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLRALLMGGRLLARLEELERSIWMLQQAAARLERAINTVDLELAALRRRLEELARGGS⑶PPPPNPNDPPPPNPND(SEQ ID NO: 10)在大腸桿菌中表達(dá)具有該序列的肽，并通過標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)操作，在鎳親和柱上 純化。根據(jù)Raman S.等人，Nanomedicine (同上)，進(jìn)行重新折疊。通過動態(tài)光散射(DLS) 技術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)，分析重新折疊的SAPN的納米顆粒形成。DLS分析顯示出平 均粒徑為46. 96nm的良好大小分布，非常低的多分散性指數(shù)為8. 7%。TEM照片(圖5)顯 示出約30nm大小的納米顆粒。實施例3 :Tlc-7_流感該卷曲螺旋序列含有2個具有序列IRHENRMVL和YKIi7KIEKG的共有HTL表位，它 們分別來自甲型流感病毒的蛋白Ml和神經(jīng)氨酸酶。通過計算機(jī)算法SVRMHC，預(yù)測它們強(qiáng)烈 地結(jié)合MHC II分子DRB1*0405和DRB1*0401，預(yù)測的結(jié)合親和力(pIC50值)分別是8. 250 和 6. 985。此外，根據(jù) Parida R.等人，vaccine 2007，25 :7530_7539，預(yù)測第一個 T-細(xì)胞 表位IRHENRMVL也會結(jié)合許多其它的HLA分子，例如B14，B1510，B2705，B2706，B3909，DP9， DRl 1, DR12，DR17，DR53，和DRB1，即它是預(yù)測的泛宿主性的表位。下面顯示了這些HTL表位與卷曲螺旋七肽重復(fù)的最佳比對(SEQ IDN0:11)。但 是，這些表位中的第二個表位的序列含有一個不利的甘氨酸殘基，它通常作為破壞螺旋的 殘基。卷曲螺旋三聚體的側(cè)接部分是相對短的序列，但是具有強(qiáng)烈的形成卷曲螺旋的傾向。 當(dāng)在卷曲螺旋預(yù)測程序COILS中使用14個氨基酸的小窗口時，顯然為T-細(xì)胞表位的兩側(cè) 預(yù)測出卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(參見下面的表20)。因此，整個序列會再次作為單個折疊單元，并形 成具有三聚體寡聚化狀態(tài)的穩(wěn)定卷曲螺旋。RLLARLEEIRHENRMVLYKIFKIEKGINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO 11)d ad ad ad ad ad ad 核 4、殘基表20 包含2個來自甲型流感病毒的HTL-表位的SEQ ID NO 11的卷曲螺旋傾向 然后將該三聚體卷曲螺旋包含進(jìn)下面的SAPN序列SEQ ID N0:12，后者包含 His-標(biāo)簽、五聚體Trp-拉鏈卷曲螺旋、上述的三聚體卷曲螺旋和來自柏格鼠瘧原蟲的 CS-蛋白的B-細(xì)胞表位。MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSffQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEEIRHENRMVLYKIFKIEKGINTVDLELAALRRRLEELARGGS⑶PPPPNPNDPPPPNPND(SEQ ID NO: 12)在大腸桿菌中表達(dá)具有該序列的肽，并通過標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)操作，在鎳親和柱上 純化。根據(jù)Raman S.等人，Nanomedicine (同上)，進(jìn)行重新折疊。通過動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)，分析重新折疊的SAPN的納米顆粒形成。DLS分析顯示出平 均粒徑為57. 70nm的稍微更寬的大小分布，多分散性指數(shù)為21.6%。TEM照片(圖6)顯示 出約30-50nm大小的納米顆粒。它們中的一些具有粘到一起的傾向，重新折疊條件需要更 多的改進(jìn)。實施例4 癌癥CTL表位的卷曲螺旋的預(yù)測在下面的實施例中，證實了如何將癌癥特異性的T-細(xì)胞表位包含進(jìn)形成SAPN的 肽中。將19種不同的T-細(xì)胞表位構(gòu)建進(jìn)SAPN的三聚體卷曲螺旋，計算這些序列的前10 個的對應(yīng)的卷曲螺旋傾向。非常清楚地發(fā)現(xiàn)，T-細(xì)胞表位的卷曲螺旋傾向相當(dāng)?shù)停蔷?有非常高卷曲螺旋傾向的側(cè)接序列會在整個序列中補(bǔ)償和誘導(dǎo)卷曲螺旋形成，這類似于上 面實施例1-3所證實的。VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEMLLAYLYQLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO: 13)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEELLDGTATLRLAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 14)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLLIYRRRLMKLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 15)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEILTYILGYLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 16)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERELAGIGILTYELERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 17)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRMSLQRQFLRELERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 18)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEKIFGSLAFLERAINTVDLELAALRRRLEELAR (SEQ ID NO: 19)WQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALMGGRLLARLEELERRLEnMYVGILERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 20)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERLLHETDSAYEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 21)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERALFDIESKYEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 22)表21 包含癌癥CTL表位的SEQ ID NO 13至SEQ ID NO 22的卷曲螺旋傾向
64 下面的序列同樣顯示出高卷曲螺旋傾向，盡管T-細(xì)胞表位的卷曲螺旋傾向相當(dāng) 低，但是具有非常高卷曲螺旋傾向的側(cè)接序列會在整個序列中補(bǔ)償和誘導(dǎo)卷曲螺旋形成。
VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLSLFRAYITKLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 23)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERKMYELVHFLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 24)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRYLQLYFGIEYLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 25)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERAARAVFLALEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 26)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEEQDLTMKYQIFAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 27)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELEREAYGLDFYILELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 28)ffQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLSYLDSGIHFLERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 29)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELERRLEETYSEQSNYERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 30)VQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALWMGGRLLARLEELEEKLIYYLFRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 31)實施例5 :HIV-V3該卷曲螺旋序列含有反向平行的β -折疊肽，它是來自HIV的gpl20的V3環(huán)的尖 端。該肽是HIV的眾所周知的B-細(xì)胞表位。通過在卷曲螺旋的位置aa(b)和aa(c)處的 2個甘氨酸殘基，將它插入卷曲螺旋七肽重復(fù)。卷曲螺旋三聚體的側(cè)接部分是相對短的序列，但是具有強(qiáng)烈的形成卷曲螺旋的傾 向。當(dāng)在卷曲螺旋預(yù)測程序COILS中使用14個氨基酸的小窗口時，顯然為B-細(xì)胞表位的 兩側(cè)預(yù)測出卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(參見下面的表22)。因此，整個序列會作為單個折疊單元，并形 成穩(wěn)定的卷曲螺旋，其具有含有突出的折疊肽的三聚體寡聚化狀態(tài)。RLLARLEELERRLEELERRLEELERRLGSIRIGPGQTFYAGVDLELAALRRRLEELARdadadadad ad ad 核 4、殘基(SEQ ID NO 32)表22 包含HIV的2個B-細(xì)胞表位的SEQ ID NO 32的卷曲螺旋傾向?qū)嵤├? :P5c的分析超速離心使用His-標(biāo)簽親和純化方案，在標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)下述序列 (SEQ ID NO 33)的肽MGHHHHHHGDffKffDGGLVPRGSDEMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLRALLMGGRLLARLEELERRLEELERRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 33)該序列與來自實施例1和2的序列(SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 10)相關(guān)，但是沒 有C-末端B-細(xì)胞表位。形成的SAPN不具有2個螺旋之間的二硫鍵(標(biāo)下劃線的殘基55 禾口 64，與 Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology，Biology，and Medicine 2006 ；2 95-102的原始設(shè)計相比，用丙氨酸替代2個半胱氨酸)，但是具有替代的更小的氨基酸丙氨 酸，允許2個螺旋之間實現(xiàn)更小的角度，因此超過60個肽鏈被摻入SAPN中。為從單體構(gòu)造塊SEQ ID NO :33裝配納米顆粒，測試了 3種條件。通過分析超速 離心，評估 SAPN 的分子量(MW)以 0. 42mg/ml、0. 34mg/ml 和 0. 21mg/ml，將肽溶于 150mM NaCl、20mM Tris、pH 7.5。測量的分子量對應(yīng)著由約330個單體組成的SAPN，即比60個不 對稱單位的規(guī)則多面體所需單體更多的納米顆粒(表23)。兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域的2個螺旋 不是通過二硫鍵固定它們彼此的相對方位，更小的氨基酸丙氨酸允許2個螺旋更接近，因 此允許它們之間的角度更小。表23 =SEQ ID NO 33的分析超速離心 實施例7 具有一系列重疊的測量的HTL表位的三聚體卷曲螺旋(pan3m)下面是包含來自乙型肝炎病毒聚合酶的肽表位的三聚體卷曲螺旋設(shè)計的一個 實例，已經(jīng)測量了它們對不同MHCII分子的結(jié)合親和力(Mizukoshi E.等人，J Immunol 2004,173 :5863-5871)。根據(jù)該文件中所述的原理，將這些肽中的2個先后設(shè)計進(jìn)三聚體卷 曲螺旋。RLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDYSAAFRRLEELEARYM(SEQ ID NO 34)d ad ad ad ad ad ad a 核 4、殘基測量的來自乙型肝炎病毒聚合酶的序列LQSI DRBl * 0301 (62)，DRBl * 0401(10)，DRBl * 0405(17), DRBl * 0701 (173)，DRBl * 0802 親和(598)，DRBl * 0901(791)， DRBl * 1101(303),DRBl * 1201(397)，DRBl * 1302(143)，DRBl * 1501(21)， DRB3 * 0101(5)，DRB4 * 0101 (7)，通過預(yù)測程序C0ILS，預(yù)測該肽的序列會形成卷曲螺旋。序列中所有殘基形成卷曲 螺旋的概率超過98% (表24)，因此預(yù)測整個序列會形成完全折疊的卷曲螺旋。表24 =SEQ ID NO 34的卷曲螺旋傾向 實施例8 具有一系列重疊的預(yù)測的HTL表位的三聚體卷曲螺旋(pan3p)下面是三聚體卷曲螺旋設(shè)計的一個實例，其包含來自(Mizukoshi E.等人，J Immunol 2004,173:5863-5871)的 SEQ ID NO :34 的 HTL 表位的小部分以及作為 PADRE HTL 表位序列的小部分的序列。RLLARLEELERRLEELARFYAAffTLKYREVERELSffLSLDYSAAFR(SEQ ID NO 35)d ad ad ad ad ad ad 核心殘基下面是通過算法NetMHCII預(yù)測的序列ARFVAAWTLKVREVERELSWLSLDVSAAF中含有 的表位對下述不同MHCII分子的結(jié)合親和力(括號中是結(jié)合親和力，按nM計算)DRBl * 0101(23)， DRBl * 0401(72)，DRBl * 0405(37), DRBl * 0701 (164)，DRBl * 0802 (462)，DRBl * 0901(440)，DRBl * 1101 (271)，DRBl * 1302 (303)，DRBl * 1501(16), DRB3 * 0101(60)， DRB4 * 0101(51).該序列在有些部分含有與序列pan3m(SEQ ID NO :34)相同的表位，它們實際上已經(jīng)表現(xiàn)出比NetMHCII程序預(yù)測更強(qiáng)的對MHCII分子的結(jié)合力(Mizukoshi E.等人，J Immunol 2004，173 :5863_5871)。通過預(yù)測程序COILS預(yù)測，該肽的序列會形成卷曲螺旋。除了最后8個殘基以外， 序列中的所有殘基(表25)形成卷曲螺旋的概率超過80%，因此預(yù)測該序列形成完全折疊 的卷曲螺旋，C-末端擾亂(fray) —部分距離，這不會妨礙SAPN形成，因為在N-末端的大 部分序列形成卷曲螺旋。表25 =SEQ ID NO 35的卷曲螺旋傾向 實施例9 具有一系列部分重疊的預(yù)測的HTL表位的四聚體卷曲螺旋(BN5c_M2eN)tetrabrachion(Stetefeld J. ^X, Nature Structural Biology 2000, 7(9) 772-776)的四聚體卷曲螺旋序列的特征在于十一肽卷曲螺旋重復(fù)，而不是七肽重 復(fù)。下面是源自該四聚體卷曲螺旋的輕微修飾的序列。LYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLM(SEQ ID NO 36)efghi jkabcdefghi jkabcdefghi jkabcdefghi jkab 核jI^殘基該四聚體卷曲螺旋特別適合作為SAPN的核心卷曲螺旋，因為它含有一系列重疊 的預(yù)測的 HTL 表位。通過算法 NetMHCII 預(yù)測，表位 YRLTVIIDD、LKNLITLRA、LITLRADRL、 IINDNVSTLR、INDNVSTLRA和VSTLRALLM的序列會分別結(jié)合不同的MHC II分子DRBl * 0101，DRBl * 0401，DRBl * 0404，DRBl * 0405，DRBl * 0701，DRBl * 1101，DRBl * 1302 JPDRBl * 1501預(yù)測的結(jié)合親和力(nM)分別是3、48、78、162、243、478、12和420。該四聚體卷曲螺旋也特別適合呈遞四聚體B-細(xì)胞表位，例如來自流感的M2e肽， 這已經(jīng)在具有下面的序列(SEQ ID NO 37)的人疫苗SAPN設(shè)計中實現(xiàn)MGHHHHHHASLVPRGSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELERRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 37)該肽(SEQ ID NO :37)含有，從N-末端開始His-標(biāo)簽，來自人特異性的流感株 的M2e B-細(xì)胞表位，具有HTL表位的四聚體卷曲螺旋，連接物，和三聚體卷曲螺旋。在大腸 桿菌中表達(dá)具有該序列的肽，并通過標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)操作，在鎳親和柱上純化。根據(jù)Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006 ;2 :95_102，進(jìn)行重 新折疊。通過透射電子顯微術(shù)(TEM)，分析重新折疊的SAPN的納米顆粒形成。TEM照片(圖 7A)顯示出約30nm相同大小的納米顆粒。來自流感的雞特異性的M2e肽也可以以它的天然寡聚化狀態(tài)和構(gòu)象顯示，作為 tetrabrachion的四聚體卷曲螺旋上的四聚體，這已經(jīng)在具有下面的序列(SEQ ID NO 38) 的動物疫苗SAPN設(shè)計中實現(xiàn)MGHHHHHHASLVPRGSLLTEVETPTRNGWECKCSDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELERRLEELERAINTVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 38)
在大腸桿菌中表達(dá)具有該序列(SEQ ID NO 38)的肽，并通過標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)操 作，在鎳親和柱上純化。它含有，從N-末端開始His-標(biāo)簽，來自雞特異性的流感株的M2e B-細(xì)胞表位，具有HTL表位的四聚體卷曲螺旋，連接物，和三聚體卷曲螺旋。根據(jù)Raman S.等人，Nanomedicine :Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006 ;2 :95_102,進(jìn)行重 新折疊，緩沖液為20mM Tris-HCl pH 7. 5、150mM NaCl和5%甘油。通過動態(tài)光散射(DLS) 技術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)，分析重新折疊的SAPN的納米顆粒形成。DLS分析顯示出平 均粒徑為45nm的大小分布，多分散性指數(shù)為8. 9%。TEM照片(圖7B)顯示出約30nm相同 大小的納米顆粒。實施例10 具有一系列重疊的預(yù)測的HTL表位的五聚體卷曲螺旋根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測程序PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/-The PSIPRED Protein StructurePrediction Server)，預(yù)測該序列高概率地(大部分最高評分9)形成α-螺 旋(H)。由于卷曲螺旋的七肽重復(fù)的核心位置aa (a)和aa(d)大部分是色氨酸殘基，預(yù) 測該序列會形成五聚體卷曲螺旋(Liu J等人，Proc Natl AcadSci USA 2004 ； 101 (46) 16156-61)。ERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWM(SEQ ID NO 39)ad ad ad ad a卷曲螺旋核心殘基567899998899899999999999999999994 二級結(jié)構(gòu)的評分HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH 二級結(jié)構(gòu)的類型該五聚體卷曲螺旋序列含有部分重疊的HTL表位，具有序列FVAAWTLKV、 WKIffKSLffK和KSLWKAWRL，通過算法NetMHCII預(yù)測它們會分別結(jié)合不同的MHC II分子DRBl * 0101，DRBl * 0401， DRBl 女 0405,DRBl 女 0701,DRBl 女 0801,DRBl 女 0901,DRBl 女 1101,DRBl 女 1501，和 DRB5 * 0101，預(yù)測的結(jié)合親和力(nM)分別是24、73、13、120、42、596、396、6 和 13。實施例11 具有鐮狀瘧原蟲HTL表位的三聚體卷曲螺旋(t811c-9-pf)下面是三聚體卷曲螺旋設(shè)計的一個實例，其包含來自鐮狀瘧原蟲的結(jié)合pan DR的 表位。該序列對應(yīng)著17個C-末端氨基酸，2個半胱氨酸被丙氨酸替換，也稱作來自環(huán)子孢 子蛋白 CS 的 CS. T3 肽(SEQ IDNO 40)。RLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELAR(SEQ ID NO 40)d ad ad ad ad ad ad 核心殘基在細(xì)胞增殖試驗中已經(jīng)證實，該CS. T3肽具有pan DR活性，且對于DR1、DR2、DR4、 DR5、DRw6、DR7和DR9分子是刺激性的(美國專利5，114，713)。通過預(yù)測程序C0ILS，預(yù)測該肽的序列會形成卷曲螺旋。除了最后2個氨基酸以 外，序列中所有殘基形成卷曲螺旋的概率超過99% (表26)。因此，預(yù)測整個序列會形成完 全折疊的卷曲螺旋。表26 =SEQ ID NO 40的卷曲螺旋傾向
77 該卷曲螺旋(SEQ ID NO 40)已經(jīng)用于設(shè)計具有下述序列(SEQ IDNO 41)的 SAPN MGHHHHHHASWKffDGGLVPRGSffQTffNAKffDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDWAFffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO 41)該序列(SEQ ID NO 41)含有his-標(biāo)簽、五聚體卷曲螺旋色氨酸拉鏈、連接物、三 聚體卷曲螺旋SEQ ID NO :40、和鐮狀瘧原蟲B-細(xì)胞表位，它是相同環(huán)子孢子蛋白CS的重 復(fù)序列的的四肽重復(fù)(NANP)。在大腸桿菌中表達(dá)具有該序列的肽，并通過標(biāo)準(zhǔn)的生物技術(shù)操作，在鎳親和柱上 純化。根據(jù)Raman S.等人，Nanomedicine (同上)，進(jìn)行重新折疊。通過動態(tài)光散射(DLS) 技術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)，分析重新折疊的SAPN的納米顆粒形成。在pH 6. 5的DLS分 析顯示出粒徑為44. 6nm的大小分布，多分散性指數(shù)為19.6%。TEM照片(圖8)顯示出約 30nm大小的納米顆粒。實施例12 =HIV疫苗HTL、CTL、B-細(xì)胞共裝配下面是HIV疫苗設(shè)計的一個實例。它們是保守的蛋白序列，含有預(yù)測會結(jié)合在表 10中列出的HLA分子的CTL表位。ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARPLDEGFRKYTAFTIPSINNE(SEQ ID NO 42)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSYFNYYLAALRRRLEELARKGPAKLLffKGEGAYFIHNFKRKGGIGG(SEQ ID NO 43)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPV(SEQ ID NO 44)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKlAKMEKASSYFNYYLAALRRRLEELARDFffEYQLGIPHPAGLKKKKSY(SEQ ID NO 45)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARLTEEAELELAENREILKDPVHGV(SEQ ID NO 46)ELDKffASLffNffFNITNffLffYIRSffQTffNAKffDQffAKFIAAffTLKYAAffKDDffARffRALWMGGRLLLRLEELERRLEELEKKIAKMEKASSVFNVVLAALRRRLEELARLVSQGIRKVLFLDGIDK(SEQ ID NO:47)將表10的前7個CTL表位串構(gòu)建在具有相同核心和相同N-末端B-細(xì)胞表位的 6個肽鏈的C-末端，從而共裝配進(jìn)單個SAPN。
核心含有與實施例11相同的三聚體，具有泛宿主性的鐮狀瘧原蟲HTL表位，其連 接含有PADRE HTL表位的Trp-拉鏈五聚體卷曲螺旋。B-細(xì)胞表位是GP41的膜近側(cè)區(qū)，通過單克隆中和抗體2F5和4E10的結(jié)合，證實它 具有中和潛力。該表位在溶液中是α-螺旋狀，通過部分地構(gòu)建進(jìn)五聚體卷曲螺旋，保持處 于α-螺旋構(gòu)象。在該設(shè)計中，表面可接近的殘基(即不是卷曲螺旋核心殘基的殘基)是 被抗體4Ε10結(jié)合的那些。實施例13 瘧疾疫苗=HTL-CTL-B-細(xì)胞-核心、B-細(xì)胞、CTL共裝配下面是6個肽鏈組成的瘧疾疫苗SAPN的一個實例，所述肽鏈具有相同的核心和相 同的C-末端B-細(xì)胞表位和在N-末端的約18個CTL表位(每條肽鏈3個)，共裝配進(jìn)單個 SAPN。KPNDKSLYKPKDELDYEAKPIVQYDNFMNGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO 48)ASKNKEKALIIAAGIAGGLALLRSLLMDCSGSIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMG
GRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:49)MNPNDPNRNVQQMPNDPNRNVQQKSLYDEHIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:50)MlNAYLDKLRAlSKYEDEIFAHLGNYKYLYGSERFYAAffTLKYAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:51)ENDIEKKIAKMEKASKSLYDEHILLMDCSGSIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:52)KSKDELDYEAIPSLALMLIMPLETQLAIGSERFVAAffTLKVAEffEEKffKIffKSLffKAffRLLWMGGRLLLRLEELMEKLKELEKKLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELTRGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO 53)核心(標(biāo)有下劃線)是含有CTL表位MEKLKELEK和修飾的B-細(xì)胞表位 KLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELT(在Villard V.等人，PLoS ONE 2007,2(7) :e645 中的序列 27)的三聚體卷曲螺旋和在實施例10中證實具有優(yōu)良的panDR結(jié)合性質(zhì)的五聚體的組合。 在C-末端，所有6個肽鏈具有相同的B-細(xì)胞表位，它是來自鐮狀瘧原蟲的環(huán)子孢子蛋白 CS的重復(fù)序列的四肽重復(fù)(NANP)。在N-末端是約18個不同的鐮狀瘧原蟲CTL表位(美 國專利5，028，425，5，972，351，6，663，871)，每條鏈3個不同的表位。CTL-表位被優(yōu)化的蛋 白酶體切割位點(diǎn)隔開(http://www.paproc2.de/paprocl/paprocLhtml ；Hadeler K. P.等 人，Math. Biosci. 2004，188 :63_79)。由于這6條肽鏈的核心是相同的，將這6條肽鏈共裝 配進(jìn)一個單獨(dú)的SAPN，允許將約18個不同的CTL表位摻入一個單獨(dú)的SAPN。實施例14 流感疫苗HTL-核心、B-細(xì)胞四聚體、CTL共裝配下面是6個肽鏈組成的流感疫苗SAPN的一個實例，所述肽鏈具有相同的核心和相
81同的N-末端B-細(xì)胞表位M2e和在C-末端的約20個CTL表位(每條肽鏈3個或4個)， 共裝配進(jìn)單個SAPN。核心(標(biāo)有下劃線)是實施例7的三聚體和實施例9的具有優(yōu)良的 panDR結(jié)合性質(zhì)的四聚體的組合。四聚體N-末端B-細(xì)胞表位與在實施例9中相同。來自 Parida R.等人，Vaccine 2007，25 :7530_7539 保守的 CTL 表位(表 15)放置在 C-末端。 由于這6條肽鏈的核心是相同的，將這6條肽鏈共裝配進(jìn)一個單獨(dú)的SAPN，允許將約20個 不同的CTL表位摻入一個單獨(dú)的SAPN。SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVIRHENRMVLQAYQKRMGVLKMPASRYLSRYLTDMTL(SEQ ID NO 54)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVFMLMPKQKVMRMGDFHSLYLLAffKQVL(SEQ ID NO 55)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVAPIEHIASMRRNYFTAEVIQMCTELKL(SEQ ID NO 56)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDYSAAFRRLEELEARYAAGAAYKGYYGTMYMELINPTLLFLKV(SEQ ID NO 57)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDVSAAFRRLEELEARVRLIDFLKDVMQIRGFVYFIMFSNKMARL(SEQ ID NO 58)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELQSLTNLLSSNLSffLSLDYSAAFRRLEELEARYERNEQGQTLYAYMLERELLRHFQKDAKVRDQRGNVL(SEQ ID NO 59)實施例15 流感疫苗HTL_核心、B-細(xì)胞四聚體、切割肽共裝配下面是3個肽鏈組成的流感疫苗SAPN的一個實例，所述肽鏈具有相同的核心和相 同的N-末端B-細(xì)胞表位M2e和在C-末端的9個B-細(xì)胞表位(每條肽鏈3個)，共裝配進(jìn) 單個SAPN0SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELAKFYAAffTLKYREYERELSffLSLDYSAAFLERKKRGLFGDIQSRGLFGDERQTRGIFG(SEQ ID NO 60)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELAKFYAAffTLKYREYERELSffLSLDVSAAFLERKTRGLFGDPKGRGLFGDQIESRGLFG(SEQ ID NO 61)SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSGSLYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTLRALLMGGRLLARLEELERRLEELAKFYAAffTLKYREYERELSffLSLDVSAAFLEKKGRGLFGDASYRGLFGDKREKRGLFG(SEQ ID NO 62)核心(標(biāo)有下劃線)是實施例8的三聚體和實施例9的具有優(yōu)良的panDR結(jié)合性 質(zhì)的四聚體的組合。四聚體N-末端B-細(xì)胞表位與在實施例9中相同。C-末端B-細(xì)胞表位來自表8，H1、H2、H3、H5共有1、H5共有2、H7共有1、H7共有2、H7共有3、H9在表位之 間帶有負(fù)電荷，使B-細(xì)胞表位串帶更少的正電荷。
權(quán)利要求
由多個式(I)構(gòu)造塊的聚集體組成的自裝配肽納米顆粒，所述式(I)構(gòu)造塊由包含肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D1、連接區(qū)段L和肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D2的連續(xù)鏈組成，D1 L D2 (I)，其中D1是其具有形成m個亞基D1的寡聚體(D1)m的傾向的肽，D2是具有形成n個亞基D2的寡聚體(D2)n的傾向的肽，m和n各自是2至10之間的數(shù)字，條件是，m不等于n，且m不是n的倍數(shù)，且n不是m的倍數(shù)，L是鍵或短連接區(qū)段，D1或D2中的任一個或D1和D2兩者是在寡聚化結(jié)構(gòu)域中摻入一個或更多個T 和/或B 細(xì)胞表位的卷曲螺旋，且其中D1、D2和L任選地被進(jìn)一步取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽納米顆粒，其中所述卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域由七肽和/或十一 肽重復(fù)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽納米顆粒，其中D1肽鏈在它的N-末端和/或D2肽鏈在它 的C-末端被一個或更多個另外的T-和/或B-細(xì)胞表位、一個或更多個其它的功能性肽或 蛋白、或一個或更多個另外的半抗原或其它功能性分子取代。
4.式S1-D1-L-D2、D1-L-D2-S2或S1-D1-L-D2-S2的根據(jù)權(quán)利要求3的肽納米顆粒，其 中S1和S2是肽取代物。
5.由相同構(gòu)造塊D1-L-D2組成的根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的肽納米顆粒，其中至少 一個相同的構(gòu)造塊在D1的N-末端和/或D2的C-末端攜帶一個或更多個不同的取代物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的肽納米顆粒，其中寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和D2之一是色氨 酸拉鏈的五聚化結(jié)構(gòu)域或其衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的肽納米顆粒，其中寡聚化結(jié)構(gòu)域D1和D2之一是 tetrabrachion的四聚化結(jié)構(gòu)域或其衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的肽納米顆粒，其中至少一個表位是CTL表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的肽納米顆粒，其中至少一個表位是HTL表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的肽納米顆粒，其中至少一個表位是B-細(xì)胞表位。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項的肽納米顆粒，其中所述序列D1-L-D2包含一系列任 選重疊的T-和/或B-細(xì)胞表位。
12.—種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的肽納米顆粒。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-或T-細(xì)胞表位選自(a)適合誘導(dǎo)針對細(xì)菌的免疫應(yīng)答的抗原；(b)適合誘導(dǎo)針對病毒的免疫應(yīng)答的抗原；(c)適合誘導(dǎo)針對寄生蟲的免疫應(yīng)答的抗原；(d)適合誘導(dǎo)針對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的抗原；(e)適合誘導(dǎo)針對變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的抗原；(f)適合誘導(dǎo)針對成癮的免疫應(yīng)答的抗原；(g)適合誘導(dǎo)針對疾病和代謝性病癥的免疫應(yīng)答的抗原；(h)適合誘導(dǎo)畜牧動物的免疫應(yīng)答的抗原；和(i)適合誘導(dǎo)寵物的免疫應(yīng)答的抗原。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-或T-細(xì)胞表位選自造成選自下述的疾病 的病原體的蛋白阿米巴病，炭疽，彎曲桿菌感染，水痘，霍亂，登革，白喉，腦炎，埃博拉，流感，日本腦炎，利什曼病，瘧疾，麻疹，腦膜炎球菌疾病，腮腺炎，醫(yī)院感染，百日咳，肺炎球菌 疾病，小兒麻痹癥(脊髓灰質(zhì)炎)，風(fēng)疹，帶狀皰疹，血吸蟲病，破傷風(fēng)，蜱傳腦炎，滴蟲病，錐 蟲病，結(jié)核病，傷寒，水痘，和黃熱病。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-或T-細(xì)胞表位選自下述的病原體的蛋白 彎曲桿菌屬，巨細(xì)胞病毒，EB病毒，口蹄疫病毒，B型流感嗜血桿菌，幽門螺旋桿菌.乙型肝 炎病毒，丙型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，單純皰疹病毒，人免疫缺陷病毒，人乳頭狀瘤病毒， 腦膜炎萘瑟菌，綠膿假單胞菌，金黃色葡萄球菌.肺炎鏈球菌，呼吸道合胞病毒，輪狀病毒， 蛔蟲，鉤蟲，和西尼羅病毒。
16.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-或T-細(xì)胞表位選自流感蛋白血凝素和/ 或M2。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述M2B-細(xì)胞表位是該蛋白M2e的胞外部分的四聚體 形式，其結(jié)合在四聚體卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域D1的N-末端。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述四聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域D1是tetrabrachion的四聚 體卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域或其衍生物。
19.權(quán)利要求12-18中任一項的組合物，其中至少一個T-細(xì)胞表位選自下述流感肽
20.權(quán)利要求12-19中任一項的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位選自下述流感肽 和其片段，其至少包含從SEQ ID N0:211-226的第三個氨基酸開始的6個氨基酸的序列。
21.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是8至48個殘基的序列，其構(gòu)成 鐮狀瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白的B細(xì)胞表位，所述B細(xì)胞表位包含2至約12個氨基酸殘 基序列Asn-Ala-Asn-Pro重復(fù)或其變換。
22.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是8至48個殘基的序列，其構(gòu)成 間日瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白的B細(xì)胞表位，所述B細(xì)胞表位包含1至約6個下述任意氨 基酸殘基序列的重復(fù)
23.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位選自下述瘧疾肽 或其在一個或更多個核心位置aa(a)和/或aa(d)處的修飾。
24.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個HTL表位選自下述瘧疾肽
25.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個CTL表位選自下述瘧疾肽SEQ ID NO KPNDKSLY112KPKDELDY113KPIVQYDNF114ASKNKEKALII115GIAGGLALL116MNPNDPNRNV117MINAYLDKL118ISKYEDEI119HLGNVKYLV120
26.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是選自蛋白gp41、gpl20或gpl60 的HIV蛋白。
27.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是選自gp41與中和抗體2F5和 /或4E10的結(jié)合部位的HIV肽。
28.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是選自HIV的gpl20的V3-環(huán)的 HIV 肽。
29.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個T-細(xì)胞表位選自下述HIV肽
30.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個T-細(xì)胞表位選自下述HIV肽
31.權(quán)利要求12的組合物，其中所述B-細(xì)胞表位是適合誘導(dǎo)針對選自下述成癮的免疫 應(yīng)答的抗原阿片制劑，大麻，苯異丙胺，可卡因，巴比妥酸鹽，格魯米特，甲乙哌酮，水合氯 醛，甲喹酮，苯并二氮卓，LSD，尼古丁，抗膽堿能藥，抗精神病藥，色胺，其它精神癥狀藥物， 鎮(zhèn)靜藥，苯環(huán)利定，賽洛西賓，揮發(fā)性的亞硝酸鹽，和誘導(dǎo)軀體依賴性和/或精神依賴性的 其它藥物。
32.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是尼古丁。
33.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是可卡因。
34.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-或T-細(xì)胞表位選自適合誘導(dǎo)針對選自下 述癌癥類型的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的抗原腦癌，乳腺癌，子宮頸癌，結(jié)腸直腸癌，食管癌，成 膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病(急性骨髓性和慢性髓細(xì)胞樣)，肝癌，肺癌(非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺 癌)，淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，和腎癌。
35.權(quán)利要求12的組合物，其包含選自下述的序列
36.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-或T-細(xì)胞表位選自下述抗原A0 —片段(A0)血管緊張素I/II(ATII//I)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)
37.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是A0-肽或其片段，其至少包含 從N-末端氨基酸開始6個氨基酸的序列。
38.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是血管緊張素I或血管緊張素II。
39.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是grehlin。
40.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一個B-細(xì)胞表位是TNFa或其片段，其至少包含 從TNF a的第四個N-末端氨基酸開始20個氨基酸的序列。
41.給人或非人動物免疫接種的方法，其包含，給需要這種免疫接種的受試者施用有效 量的根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的肽納米顆粒或根據(jù)權(quán)利要求12-39中任一項的組合物。
42.式(I)的單體構(gòu)造塊，其由包含肽寡聚化結(jié)構(gòu)域D1、連接區(qū)段L和肽寡聚化結(jié)構(gòu)域 D2的連續(xù)鏈組成，D1-L-D2(I)，其中D1是其具有形成m個亞基D1的寡聚體(Dl)m的傾向的肽，D2是具有形成n個亞 基D2的寡聚體(D2)n的傾向的肽，m和n各自是2至10之間的數(shù)字，條件是，m不等于n， 且m不是n的倍數(shù)，且n不是m的倍數(shù)，L是鍵或短連接區(qū)段，D1或D2中的任一個或D1和 D2兩者是在寡聚化結(jié)構(gòu)域中摻入一個或更多個T-和/或B-細(xì)胞表位的卷曲螺旋，且其中Dl、D2和L任選地被進(jìn)一步取代。
全文摘要
描述了摻入T-和/或B-細(xì)胞表位的自裝配肽納米顆粒(SAPN)。本發(fā)明的納米顆粒由連續(xù)肽鏈的聚集體組成，所述連續(xù)肽鏈包含通過連接區(qū)段相連的兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域，其中一個或兩個寡聚化結(jié)構(gòu)域在它們的肽序列中摻入T-和/或B-細(xì)胞表位。這些納米顆?？捎米饕呙绲暮妥魟?。
文檔編號C07K14/00GK101932594SQ200980103767
公開日2010年12月29日 申請日期2009年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日
發(fā)明者P·布克哈德 申請人:阿爾法-O肽股份公司