專利名稱：α5-β1抗體和它們的用途的制作方法
α5_β1抗體和它們的用途本申請(qǐng)要求對(duì)2008年2月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)案61/026，027和2008年9 月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)案61/095，429(其兩者以其全文通過引用合并入本文)的優(yōu)先權(quán)。領(lǐng)域本公開內(nèi)容涉及結(jié)合α 5β 1的抗體和其抗原結(jié)合部分。本公開內(nèi)容還涉及編碼 此類抗體和抗原結(jié)合部分的核酸分子、制備α 5β 1抗體和抗原結(jié)合部分的方法、包含此類 抗體和抗原結(jié)合部分的組合物和使用抗體、抗原結(jié)合部分和組合物的方法。背景整聯(lián)蛋白α 5β 1是結(jié)合纖連蛋白并且參與細(xì)胞附著和血管生成的異二聚體細(xì)胞 表面蛋白。該異二聚體由α 5亞基和β 1亞基組成。整聯(lián)蛋白α 5β1稱為“經(jīng)典纖連蛋 白受體”，其在基質(zhì)附著、遷移、增殖、分化和存活中起著至關(guān)重要的作用。雖然幾種整聯(lián)蛋 白結(jié)合纖連蛋白(FN)，但α 5β1對(duì)于FN具有選擇性，因?yàn)槠湫枰狥N的第9 (PHSRN)和第 10 (RGDS) III型重復(fù)上的肽序列來進(jìn)行配體識(shí)別和最佳相互作用。(Danen等人J. Biol. Chem. 270 (37) :21612_21618 (1995) ；Redick 等人 J. Cell Biol. 149(2) :521_527 (2000)； Takagi等人BMBO J. 22 :4607_4615 (2003))。整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞至FN的附著可觸發(fā)鈣流、 激活酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶以及肌醇脂質(zhì)代謝，并且調(diào)控控制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨 架和細(xì)胞周期進(jìn)程的小GTP酶的Rho家族的活性。在大多數(shù)胚胎組織中觀察到α 5β 1的表達(dá)，但水平在出生后以與終末細(xì)胞分化 一致的方式減少(Muschler & Horwitz Development 113(1) :327_337 (1991))。在野生型 成年小鼠中，表達(dá)主要存在于脈管系統(tǒng)和結(jié)締組織中，雖然低水平的受體廣泛分布。α 5β 1 和FN的表達(dá)在人腫瘤的血管上和在生長因子及細(xì)胞因子刺激的組織中得到顯著地和協(xié) 同地增強(qiáng)。血管生成細(xì)胞因子(angiogenic cytokine)例如bFGF、VEGF，IL-8，TGF-β和 TNF-α在體外和體內(nèi)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的α 5β1表達(dá)，然而此類分子在正常人血管和組織 中以最低限度表達(dá)(Kim 等人 Am. J. Path. 156(4) 1345-62 (2000) ；Enaida 等人 Fukushima J.Med· Sci 44(1) :43_52(1998) ；Klein 等人 Mol Biol. Cell4(10) :973_982 (1993))。高水平的α 5β1表達(dá)不限定于脈管系統(tǒng)中，因?yàn)樵谠S多類型的癌癥中也頻繁 觀察到腫瘤細(xì)胞表達(dá)α5β1。腫瘤缺氧與增加的腫瘤α5β1表達(dá)相關(guān)聯(lián)(Mousa等人 J. Cell. Biochem. 74 135-143 (1999))。整聯(lián)蛋白據(jù)認(rèn)為對(duì)于腫瘤內(nèi)滲入新形成的毛細(xì)血管 和外滲至遠(yuǎn)距離部位，從而導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移性疾病是非常重要的。總的說來，α5β1 的表達(dá)模式與在促進(jìn)癌癥(通過介導(dǎo)基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的活性)中的多個(gè)作用相符。多種臨 床研究已使腫瘤細(xì)胞上α 5 β 1的上調(diào)與人黑素瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌和B細(xì)胞白血病的進(jìn) Mffi^K (Jin & Varner， Br. J. Cancer 90 561-565 (2004) ；Danen ^A Histopathology 24(3) 249-256(1994) ；Shinohara 等人，Am. J. Clin. Pathol 111(1) :75_88 (1999))。概述本公開內(nèi)容提供了展示對(duì)人整聯(lián)蛋白α 5β 1的高親和力結(jié)合的分離的單克隆抗 體，特別地人單克隆抗體。本公開內(nèi)容中描述的抗體通常是人抗體，雖然在備選情況下抗體可以是鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中抗體 (a)以IxlO-7M或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白α 5β 1 ；和(b)能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。 例如，在一種情況下，抗體屬于能夠誘導(dǎo)ADCC的亞類例如IgGl或IgG3。在另一種情況下， ADCC活性是向Fc區(qū)域?qū)胩切揎椑绺淖兊奶腔Ｊ?與天然糖模式相比較)的結(jié)果。在某些情況下，抗體以5x10_8M或更小，2x10_8M或更小，1χ10_8Μ或更小，5xlO_9M或 更小，4x10_9M或更小，3x10_9M或更小，或2. 7xlO_9M或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白α 5 β 1。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中抗 體(a)以1x10_7M或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白α5β1;禾Π (b)顯示與可比較的抗體相比 增強(qiáng)的ADCC活性。例如，在一種情況下，與野生型Fc區(qū)域相比較，具有增強(qiáng)的ADCC活性的 抗體在Fc區(qū)域中包含至少一個(gè)突變，并且增強(qiáng)的ADCC活性是相對(duì)于相同的但包含野生型 Fc區(qū)域的抗體而言的。在某些實(shí)例中，抗體以5xlO_8M或更小，2xlO_8M或更小，1x10_8M或更 小，5x10_9M或更小，4x10_9M或更小，3x10_9M或更小或2. 7x10、或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白 α5β 1。在另外的實(shí)例中，相對(duì)于可比較的抗體，抗體顯示增強(qiáng)的ADCC活性，所述ADCC活 性與可比較的抗體相比，為至少1. 1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.5倍、至少2倍、至 少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、 至少200倍、至少500倍或至少1000倍，其中可比較的抗體是相同的但具有野生型Fc區(qū)域 的抗體。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中抗 體(a)以1x10_7M或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白α5β1 ；和(b)與野生型Fc區(qū)域相比較在 Fc區(qū)域中包含至少一個(gè)突變。例如，在一種情況下，抗體的亞類是IgGl并且IgGl亞類的 Fc區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸被突變。在另外的實(shí)例中，至少一個(gè)突變?cè)贗gGl亞類的Fc區(qū)域 中的位點(diǎn)絲氨酸247、丙氨酸338或異亮氨酸340上發(fā)生。在另外的實(shí)例中，至少一個(gè)突變 選自S247D、A338L和I340E。在另外的實(shí)例中，抗體包含突變S247D、A338L和I340E。本公開內(nèi)容的另外的方面是分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與 包含下列的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)或競(jìng)爭(zhēng)與人整聯(lián)蛋白α 5β 1的結(jié)合(a)重鏈可變區(qū)，其含有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或其保守修飾形式；和(b)輕鏈可變區(qū)，其含有SEQ ID NO 8的氨 基酸序列，或其保守修飾形式。本公開內(nèi)容的另外的方面是分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含作為人 Vh 4-39基因的產(chǎn)物或源自人Vh 4-39基因的重鏈可變區(qū)，其中抗體特異性結(jié)合人整聯(lián)蛋白 α 5β 1。本公開內(nèi)容的另外的方面是分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含作為 人VKL6基因的產(chǎn)物或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中抗體特異性結(jié)合人整聯(lián)蛋白 α 5β 1。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :1或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供 了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :2或其保守修飾形式的重 鏈可變區(qū)CDR2。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其 包含含有SEQ ID NO :3或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :4或其保守修飾形式 的輕鏈可變區(qū)CDR1。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部 分，其包含含有SEQ ID NO :5或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2。在另一個(gè)方面，本公 開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :6或其保守修 飾形式的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原 結(jié)合部分，其包含(a)含有SEQ ID NO=I或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；(b)含有SEQ ID NO 2或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R2 ；(c)含有SEQ ID NO 3或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；(d)含有SEQ ID NO 4或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ；(e)含有SEQ ID NO 5或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和(f)含有SEQ ID NO 6或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R3。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :7的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)。例如，本公開內(nèi)容提供了 包含重鏈可變區(qū)的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO :7中所示的氨基 酸序列至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%或至少99%同一。 在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :8的氨基酸序列或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。例如，本公開內(nèi)容提供了包含輕 鏈可變區(qū)的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO :8中所示的氨基酸序列 至少80 %，至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一。在另外 的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO 7 的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :8的氨基酸序列或其保守 修飾形式的輕鏈可變區(qū)。例如，本公開內(nèi)容提供了包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的 單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO :7中所示的氨基酸序列至少 80%，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一，所述輕鏈可 變區(qū)與SEQ IDNO 8中所示的氨基酸序列至少80%，至少85%、至少90%、至少95%、至少 97%、至少98%或至少99%同一。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO: 13或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提 供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :14或其保守修飾形式的 重鏈可變區(qū)CDR2。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其包含含有SEQ ID NO 15或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3。在另一個(gè)方面，本公開 內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:16或其保守修飾 形式的輕鏈可變區(qū)CDR1。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分，其包含含有SEQ ID NO :17或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2。在另一個(gè)方面， 本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:18或其保 守修飾形式的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其 抗原結(jié)合部分，其包含(a)含有SEQ ID NO 13或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；
(b)含有SEQ ID NO 14或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R2 ；(c)含有SEQ ID NO 15或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；(d)含有SEQ ID NO 16或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ；(e)含有SEQ ID NO 17或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和(f)含有SEQ ID NO 18或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R3。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :19的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)。在另外的方面，本公開 內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:20的氨基酸序列 或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或 其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :19的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū) 和含有SEQ ID NO :20的氨基酸序列或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :23或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提 供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :24或其保守修飾形式的 重鏈可變區(qū)CDR2。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其包含含有SEQ ID NO :25或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3。在另一個(gè)方面，本公開 內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:26或其保守修飾 形式的輕鏈可變區(qū)CDR1。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分，其包含含有SEQ ID NO :27或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2。在另一個(gè)方面， 本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:28或其保 守修飾形式的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其 抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQ ID NO 23或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；(b)包含SEQ ID NO 24或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R2 ；(c)包含SEQ ID NO 25或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3 ；(d)包含SEQ ID NO 26或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ；(e)包含SEQ ID NO 27或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和(f)包含SEQ ID NO 28或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R3。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :29的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)。在另外的方面，本公開 內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:30的氨基酸序列 或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或 其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :29的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū) 和含有SEQ ID NO :30的氨基酸序列或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :33或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶Rl。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提 供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :34或其保守修飾形式 的重鏈可變區(qū)CDR2。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部 分，其包含含有SEQ ID NO :35或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R3。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:36或其保守修 飾形式的輕鏈可變區(qū)CDR1。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原 結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :37或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2。在另一個(gè)方 面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:38或 其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體 或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQ ID NO :33或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)CDRl ； (b)包含SEQ ID NO 34或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； (c)包含SEQ ID NO 35或 其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQ ID NO :36或其保守修飾形式的輕鏈可 變區(qū)⑶Rl ； (e)包含SEQ ID NO 37或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和(f)包含SEQ ID NO 38或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)⑶R3。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 含有SEQ ID NO :39的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū)。在另外的方面，本公開 內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID N0:40的氨基酸序列 或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或 其抗原結(jié)合部分，其包含含有SEQ ID NO :39的氨基酸序列或其保守修飾形式的重鏈可變區(qū) 和含有SEQ ID NO :40的氨基酸序列或其保守修飾形式的輕鏈可變區(qū)。在另外的方面，提供了分離的抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合與本文中公開的任 何抗體相同的人整聯(lián)蛋白α 5β1上的表位和/或與這樣的抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人整聯(lián)蛋白α5β1 的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了以保藏號(hào)ΡΤΑ-9377保藏在ATCC的材料。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了以保藏號(hào)ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的材料。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，本公開內(nèi)容提供了包含以保藏號(hào)ΡΤΑ-9377保藏在ATCC的重鏈可變區(qū)的分離的 抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了包含以保藏號(hào)ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的輕鏈 可變區(qū)的分離的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了包含以保藏號(hào)ΡΤΑ-9377保 藏在ATCC的重鏈可變區(qū)的分離的抗體，但其中已在VH區(qū)域產(chǎn)生了種系突變I30S和N33S。 在另外的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了包含分別以保藏號(hào)ΡΤΑ-9377和ΡΤΑ-9378保藏在 ATCC的重鏈和輕鏈可變區(qū)的分離的抗體，或其中已在VH區(qū)中產(chǎn)生了種系突變I30S和N33S 的所述抗體。在另外的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了分離的抗體，所述分離的抗體包含以 保藏號(hào)ΡΤΑ-9377保藏在ATCC的重鏈可變區(qū)的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)，或當(dāng)所述重鏈可 變區(qū)包含種系突變I30S和N33S時(shí)包含所述⑶R1、⑶R2和⑶R3。在另外的實(shí)施方案中，本 公開內(nèi)容提供了分離的抗體，所述分離的抗體包含以保藏號(hào)ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的輕鏈 可變區(qū)的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了分離的抗 體，所述分離的抗體包含分別以保藏號(hào)ΡΤΑ-9377和ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的重鏈和輕鏈可 變區(qū)的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)和重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)，或當(dāng)所述重鏈可變區(qū)包含 種系突變I30S和N33S時(shí)，包含所述CDRU CDR2和CDR3區(qū)。本公開內(nèi)容的抗體可以是，例如全長抗體，例如IgGl或IgG4亞類的全長抗體。備 選地，抗體可以是抗體片段例如Fab或Fab' 2片段或單鏈抗體。在一種情況下，本公開內(nèi) 容提供了上述任何抗體，其是亞類IgGl的人全長抗體，其中IgGl亞類的Fc區(qū)域中的至少 一個(gè)氨基酸被突變。在另外的情況下，至少一個(gè)突變發(fā)生在位點(diǎn)絲氨酸247、丙氨酸338或異亮氨酸340上。在另外的情況下，至少一個(gè)突變選自S247D、A338L和I340E。在另外的 情況下，抗體包含突變S247D、A338L和I340E。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了包含SEQ ID NO 9或其保守修飾形式中顯示的 重鏈的分離的單克隆抗體。例如，抗體包含與SEQ IDNO 9中所示的氨基酸序列至少80%， 至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的重鏈。在另外的 方面，本公開內(nèi)容提供了包含SEQ ID NO :10或其保守修飾形式中顯示的輕鏈的分離的單克 隆抗體。例如，抗體包含與SEQ ID NO :10中所示的氨基酸序列至少80%，至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一的輕鏈。在另外的方面，本公開內(nèi)容 提供了包含SEQ ID NO :9或其保守修飾形式中顯示的重鏈和SEQ ID N0:10或其保守修飾 形式中顯示的輕鏈的分離的單克隆抗體。例如，抗體包含與SEQ ID NO :9中顯示的氨基酸 序列至少80 %，至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一的重 鏈和與SEQ ID NO :10中顯示的氨基酸序列至少80%，至少85%、至少90%、至少95%、至 少97%、至少98%或至少99%同一的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，所述的本公開內(nèi)容的任何抗α 5β 1抗體的重鏈的C末端賴氨 酸被切割，從而不存在。例如，在一些實(shí)施方案中本公開內(nèi)容的抗體包含SEQ ID Ν0:43中 顯示的IgGl重鏈恒定區(qū)，但其中C末端賴氨酸不存在。在多種情況下，抗α 5β 1抗體的重 鏈和輕鏈可任選地包含信號(hào)序列。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了包含本文中描述的任何抗體或其抗原結(jié)合部分 和可藥用載體的組合物。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了包含連接至治療劑的本文中描述的任何抗體或 其抗原結(jié)合部分的免疫綴合物。在一種情況下，治療劑是細(xì)胞毒素或放射性同位素。在另外 的方面，本公開內(nèi)容提供了包含本文中描述的任何免疫綴合物和可藥用載體的組合物。本 公開內(nèi)容還提供了包含連接至第二功能性部分的抗體或其抗原結(jié)合部分的雙特異性分子， 所述第二功能性部分具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。還提供了包含本公開內(nèi)容的抗體或其抗原結(jié)合部分，或免疫綴合物或雙特異性分 子以及可藥用載體的組合物。本公開內(nèi)容還包括編碼抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子以及包含此類核酸的 表達(dá)載體和包含此類表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。一個(gè)方面，例如，是包含SEQ ID Ν0:11中顯示 的序列或其保守修飾形式的分離的核酸分子，或表達(dá)載體。另外的方面是包含SEQ ID NO 12中顯示的序列或其保守修飾形式的分離的核酸分子或表達(dá)載體。另外的方面是包含選 自SEQ ID N0:21、22、31、32、41和42的序列或其保守修飾形式的分離的核酸分子或表達(dá)載 體。本公開內(nèi)容還提供了包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(其中小鼠表 達(dá)本公開內(nèi)容的抗體)以及從這樣的小鼠制備的雜交瘤(其中雜交瘤產(chǎn)生本公開內(nèi)容的抗 體)。本公開內(nèi)容還提供了包含本文中所述的任何表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了用于制備抗整聯(lián)蛋白α 5β1抗體的方法，其包 括在本文中描述的任何宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體和從宿主細(xì)胞分離抗體。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了用于抑制表達(dá)整聯(lián)蛋白α5β1的腫瘤細(xì)胞生 長的方法，所述方法包括將細(xì)胞與抗體或其抗原結(jié)合部分(其以IxlQ-7M或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白α 5β 1并且能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性)接觸。在一種情況下，抗體是全長 人抗體。在另外的情況下，抗體或其抗原結(jié)合部分經(jīng)工程改造增強(qiáng)了其誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì) 胞毒性的能力。在另外的情況下，通過Fc區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸殘基的突變來獲得增強(qiáng)。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了抑制表達(dá)整聯(lián)蛋白α 5β1的腫瘤細(xì)胞生長的 方法，包括將細(xì)胞與有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長的量的本文中所述的任何抗體或其抗原結(jié)合 部分接觸。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了本文中描述的任何抗體或其抗原結(jié)合部分用于 制造用于治療異常細(xì)胞生長的藥劑的用途。在另外的方面，本公開內(nèi)容提供了本文中描述 的任何抗體或其抗原結(jié)合部分，其用于治療和/或診斷異常細(xì)胞生長。在該方法的一個(gè)實(shí) 施方案中，異常細(xì)胞生長是癌癥，包括，但不限于，間皮瘤、肝膽管(肝和膽管)腫瘤、原發(fā)性 或繼發(fā)性CNS腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性腦腫瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭 頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門區(qū)域癌、胃癌、胃腸(胃、結(jié)直腸和 十二指腸)癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌(carcinoma of the vulva)、何杰金氏病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎 上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血 病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫 瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、脊軸腫瘤(spinal axis tumor)、腦干神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質(zhì)癌癥、膽囊癌(gall bladder cancer)、多發(fā)性骨髓瘤、膽管癌、纖 維肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤或一種或多種上述癌癥的組合。本公開內(nèi)容還提供了基于本文中提供的抗α 5β1抗體的序列制造“第二代”抗 α5β1抗體的方法。例如，本公開內(nèi)容提供了用于制備抗α5β1抗體的方法，其包括(a) 提供⑴包含SEQ ID NO :1、13、23或33中顯示的CDRl序列、SEQ ID NO :2、14、24或34中 顯示的⑶R2序列和/或SEQ ID NO :3、15、25或35中顯示的⑶R3序列的重鏈可變區(qū)抗體 序列；和 / 或(ii)包含 SEQ ID N0:4、16、26 或 36 中顯示的 CDRl 序列、SEQ ID N0:5、17、 27或37中顯示的CDR2序列和/或SEQ ID NO :6、18、28或38中顯示的CDR3序列的輕鏈 可變區(qū)抗體序列；(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列中的至少一個(gè) 氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。根據(jù)下列不應(yīng)當(dāng)被解釋為限定的詳細(xì)描述和實(shí)施例，本公開內(nèi)容的其他特征和 有利方面將變得顯然。在整個(gè)本說明書中引用的所有參考資料、Genbank條目(Genbank entry)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容明確地通過引用合并入本文。附圖概述圖IA顯示22B5重鏈可變區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO 11)；圖IB顯示22B5重鏈可 變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :7)_⑶R區(qū)以下劃線標(biāo)示；圖IC顯示22B5輕鏈可變區(qū)的DNA 序歹丨J (SEQ ID NO 12)；圖ID顯示22B5輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID N0:8)_CDR區(qū)以 下劃線標(biāo)示；圖IE顯示24C7重鏈可變區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO 21)；圖IF顯示24C7重 鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)-CDR區(qū)以下劃線標(biāo)示；圖IG顯示24C7輕鏈可變區(qū) 的 DNA 序歹Ij (SEQ ID NO 22)；圖IH顯示24C7輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :20)-⑶R區(qū)以下劃線標(biāo)示； 圖II顯示1D9重鏈可變區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO 31)；
圖IJ顯示1D9重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :29)-⑶R區(qū)以下劃線標(biāo)示。 圖IK顯示1D9輕鏈可變區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO 32)；圖IL顯示1D9輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :30)-⑶R區(qū)以下劃線標(biāo)示； 圖IM顯示2D2重鏈可變區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO 41)；圖IN顯示2D2重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :39)-⑶R區(qū)以下劃線標(biāo)示；

圖10顯示2D2輕鏈可變區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO 42)；圖IP顯示2D2輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :40)-⑶R區(qū)以下劃線標(biāo)示； 圖IQ顯示IgGl重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，突變S247D、A338L和I340E以下劃線標(biāo)示；和圖 IR顯示IgGl輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。圖2顯示22B5重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)與相應(yīng)的種系序列的比對(duì)。還顯示的是22B5 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vk)與相應(yīng)的種系序列的比對(duì)。CDR區(qū)域以下劃線標(biāo)示，相同的殘基由虛 線表示，點(diǎn)表示缺失。圖3顯示通過在固定的22B5/DLE的上方注射不同濃度的α 5 β 1重組細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域獲得的傳感圖的疊加。在4. OmM CaCl2存在的情況下收集該數(shù)據(jù)。注射的順序是從低濃 度至高濃度。圖4顯示通過FACS獲得的22B5/DLE對(duì)HUVEC的劑量依賴性結(jié)合。圖5顯示比較人與小鼠Fcy受體的平衡解離常數(shù)，“wt 〃是指22Β5野生型 IgGl ； “ DLE"是指 22B5/DLE。圖6顯示HUVEC細(xì)胞附著阻斷測(cè)定的結(jié)果。結(jié)果顯示22B5和不同亞類的變體以及 陰性對(duì)照(BHA2 IgGl)對(duì)HUVEC附著至纖連蛋白的抑制的水平。還顯示了計(jì)算的IC5tl值。圖7顯示通過Western印跡法測(cè)量的HUVEC和20個(gè)腫瘤細(xì)胞系的人α 5表達(dá)。圖8顯示由22B5/DLE誘導(dǎo)的體外ADCC(與22B5wt IgGl相比)。圖8A顯示測(cè)量 在人PBMC存在的情況下通過22B5/DLE和22B5wt IgGl產(chǎn)生的U87MG細(xì)胞的ADCC的基于 LDH的檢測(cè)測(cè)定。圖8B顯示測(cè)量在人PBMC存在的情況下通過22B5/DLE和22B5wt IgGl產(chǎn) 生的HUVEC的ADCC的基于ToxiLight的檢測(cè)測(cè)定。圖9顯示基于LDH的檢測(cè)測(cè)定，該檢測(cè)測(cè)定顯示在廣泛的抗原表達(dá)水平上高于wt 22B5 IgGl的來自22B5/DLE的顯著的ADCC增強(qiáng)。圖10顯示A549-LUC實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型中22B5/DLE的抑制活性。圖IOA 在第8周通 過BLI測(cè)量的肺轉(zhuǎn)移體積(對(duì)于對(duì)照組η = 11，對(duì)于22Β5 IgG2組η = 14以及對(duì)于22Β5/ DLE組η = 12)。圖IOB 給藥后22B5IgG2處理組中肺腫瘤的再生長停止。相比之下，22B5/ DLE處理組幾乎不顯示再生長。圖IOC 各處理組的動(dòng)物存活率的Kaplan-Meier曲線(終點(diǎn) =BLI IxlO8個(gè)光子/秒)，p < 0. 0001，對(duì)照媒介物組與所有其他組比較，以及ρ < 0. 05， 22B5/DLE與22Β5 IgG2組之間的比較。圖 11 顯示通過 FACS 獲得的 1D9、1D9/DLE、24C7/DLE、2D2/DLE、22B5 和 22B5/DLE 對(duì)HUVEC的劑量依賴性結(jié)合。圖 12 顯示由 1D9、1D9/DLE、2D2/DLE、22B5/DLE 和 24C7/DLE 誘導(dǎo)的體外 ADCC。圖13顯示轉(zhuǎn)移性黑素瘤的同基因模型(syngeneic model)中1D9/DLE的ADCC依 賴性抗腫瘤功效。圖13A 切取自所有組的肺的大體外觀(gross appearance)。圖13B 肺 重量的定量(*P < 0. 05，1D9 IgGlDLE對(duì)1D9 IgG2)。圖13C 肺表面上可見的轉(zhuǎn)移集落的數(shù)目的定量。使用ANOVA和Bonferroni ‘ s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(*p < 0. 05，1D9 IgGl DLE 對(duì) 1D9 IgG2 ；*p < 0. 05，1D9 IgGlDLE 對(duì)抗 KLH IgG2)。詳細(xì)描述本公開內(nèi)容涉及以高和親力特異性結(jié)合α 5β1的分離的單克隆抗體，特別地人 單克隆抗體。在某些情況下，本公開內(nèi)容的抗體來源于特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或 包含特定的結(jié)構(gòu)特征例如含有特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本公開內(nèi)容提供了分離的抗體、 制備此類抗體的方法、包含此類抗體的免疫綴合物和雙特異性分子以及包含本公開內(nèi)容的 抗體、免疫綴合物或雙特異性分子的藥物組合物。本公開內(nèi)容還涉及使用抗體例如檢測(cè) α 5 β 1以及治療與α 5 β 1的表達(dá)相關(guān)的疾病例如異常細(xì)胞生長(例如癌癥)的方法。因 此，本公開內(nèi)容還提供了使用抗α 5β1抗體或其抗原結(jié)合部分治療各種類型的異常細(xì)胞 生長例如癌癥的方法。為了可以更容易地理解本公開內(nèi)容，首先定義某些術(shù)語。另外的定義示于整個(gè)詳 細(xì)描述中。除非在本文中另外定義，否則與本公開內(nèi)容結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有本 領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的意義。此外，除非上下文另外要求，否則單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)并 且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。一般地，結(jié)合本文中描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、 微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和雜交使用的命名和技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，且 常用于本領(lǐng)域。除非另外指出，否則通常按照本領(lǐng)域內(nèi)熟知的和在整個(gè)本說明書中引用和論述的 各種一般和更特別的參考資料中描述的方法進(jìn)行本公開內(nèi)容的方法和技術(shù)。此類參考資 料包括，例如，Sambrook 禾口 Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Approach. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY(2001)，Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular BiologyiJohn Wiley & Sons，NY(2002)，以及 Harlow 禾口 Lane Antibodies A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY(1990)。如在本領(lǐng)域通常進(jìn)行的或如本文中描述的，按照廠商的說明書進(jìn)行酶促反應(yīng)和 純化技術(shù)。結(jié)合本文中描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的命名以 及實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，且常用于本領(lǐng)域。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分 析、藥物制備、配制和遞送以及患者的治療。如本文中所使用的，每一個(gè)下列術(shù)語在該部分具有與其相關(guān)的意義。冠詞“a”和“an”在本文中用于指一個(gè)或多于一個(gè)(即，至少一個(gè))冠詞的語法對(duì) 象。例如，“an element”是指一個(gè)元素或多于一個(gè)元素。如本文中所使用的，20個(gè)常規(guī)氨基酸和它們的縮寫遵從習(xí)慣用法。參見 Immunology-Α Synthesis (第 2 版，E. S. Golub and D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。術(shù)語“α 5β1”和“整聯(lián)蛋白a 5 β 1 ”可互換使用，并且包括人α5β1的變體、同 種型和物種同源物。天然人α5β1，例如，由a 5亞基(其來源于隨后切割成通過二硫鍵 連接的兩條鏈的前體序列)(Genbank登錄號(hào)P08648)和β 1亞基(其來源于隨后加工成成 熟形式的前體序列)(Genbank登錄號(hào)Ρ05556-1)組成。β 1亞基已知以通過選擇性剪接產(chǎn) 生的數(shù)個(gè)同種型的形式存在(參見，例如，Genbank登錄號(hào)Ρ05556-2，Ρ05556-3, Ρ05556-4和P05556-5)。本公開內(nèi)容的人α5β 1抗體可以，在某些情況下，與來自除人以外的物種的 α5β1交叉反應(yīng)。在其他情況下，抗體可以完全特異于人α 5β1，且可以不展示物種或其 他類型的交叉反應(yīng)性?！懊庖邞?yīng)答”，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，包括，但不限于，任何可檢測(cè)的輔助T細(xì) 胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的抗原特異性或同種異體(allogenic)激活、抗體的產(chǎn)生、T細(xì)胞 介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)的激活等。該術(shù)語包括例如，淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和 由上述細(xì)胞或肝產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，所述作用導(dǎo)致 對(duì)侵入的病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌性細(xì)胞或在自身免疫或病理性炎癥的情 況下正常人細(xì)胞或組織的選擇性損傷、破壞或從人體清除?！靶盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”是指在信號(hào)從細(xì)胞的一個(gè)部分傳遞至細(xì)胞的另一部分中起作用 的許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生物化學(xué)關(guān)系。如本文中所使用的，短語“細(xì)胞表面受體”包括， 例如，能夠接收信號(hào)并且將這樣的信號(hào)傳遞穿過細(xì)胞質(zhì)膜的分子和復(fù)合物。本公開內(nèi)容的 “細(xì)胞表面受體”的實(shí)例是α5β1整聯(lián)蛋白。術(shù)語“抗體”，如本文中提及的，包括完整抗體和其任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié) 合部分”)或單鏈?！翱贵w”是指包含通過二硫鍵鏈間連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L) 鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。各重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū) 組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和Ch3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫 為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由1個(gè)結(jié)構(gòu)域Q組成。V1^nt區(qū)還可進(jìn)一步細(xì)分 成與較保守的區(qū)域(稱為構(gòu)架區(qū)(FR))相間的稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)。各Vh* Vl由3個(gè)CDR和4個(gè)FR組成，其以下列順序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基 端至羧基端排列。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū) 可介導(dǎo)免疫球蛋白對(duì)宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典 補(bǔ)體系統(tǒng)的第一補(bǔ)體(Clq))的結(jié)合。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12個(gè)或 更多個(gè)氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包括大約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。一般參見， Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul，W.，ed.，第 2 片反· Raven Press，N. Y. (1989))。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”)，如本文中所使用的，是指保留 特異性結(jié)合抗原(例如，α5β1)的能力的一個(gè)或多個(gè)抗體片段。已顯示可通過全長抗體 的片段來進(jìn)行抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”包括的結(jié)合片段的實(shí)例 包括(i)Fab片段，由Vl、VH、Cl和Chi結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通 過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的2個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(iii)Fd片段，其由Vh和Cm結(jié)構(gòu)域 組成；(iv)Fv段，其由抗體的單臂的八和Vh結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(Ward等人，(1989) Nature341 :544_546)，其由Vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管 Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域\和Vh由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過合成的連接體將 它們連接起來，所述合成的連接體使得它們能夠形成其中\(zhòng)和Vh部分配對(duì)形成單價(jià)分子的 單個(gè)蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意欲包 括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。這些抗體片段可使用任何合適的技術(shù)，包括本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且可以以與對(duì)于完整抗體所進(jìn)行的相同的方式就效用篩選 片段。
“分離的抗體”，如本文中所使用的，意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他 抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合α 5β1的分離的抗體基本上不含特異性結(jié)合除了 α5β1 外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合α 5β1的分離的抗體可以具有與其他抗原例如來自 其他物種的α 5β1分子的交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細(xì)胞材料和
/或化學(xué)藥品。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”，如本文中所使用的，是指單分子組成 的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示對(duì)于特定表位的單結(jié)合特異性和親和力。術(shù)語“人抗體”或“完全人抗體”，如本文中所使用的，意在包括具有其中構(gòu)架區(qū)和 CDR區(qū)都來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，則恒 定區(qū)也來源于人種系免疫球蛋白序列。本公開內(nèi)容的人抗體或其抗原結(jié)合部分可包括不由 人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，由體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或由體內(nèi)體細(xì)胞 突變導(dǎo)入的突變)。然而，術(shù)語“人抗體”，如本文中所使用的，不希望包括其中已將來源于 另一哺乳動(dòng)物物種例如小鼠的種系的CDR序列移植至人構(gòu)架序列的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”或“完全人單克隆體”是指展示單結(jié)合特異性的抗體，所述 抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案 中，人單克隆抗體由包含從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠(其具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和 輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組)獲得的B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生，其中B細(xì)胞被融合至永生化細(xì)胞。術(shù)語“重組人抗體”，如本文中所使用的，包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分 離的所有人抗體，例如(a)從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如小鼠)或 由其制備的雜交瘤(在下文中進(jìn)一步描述)分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主 細(xì)胞，例如從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)通過任何 其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，所述方法牽涉人免疫球蛋白基因序列與其他DNA 序列的拼接。此類重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)來源于人種系免疫球蛋白序列的 可變區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，可使此類重組人抗體經(jīng)歷體外誘變(或，當(dāng)使用人Ig序 列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，從而重組抗體的Vh和\區(qū)的氨基酸序列是這樣的 序列，其來源于人種系Vh和\序列且與其相關(guān)，但可能不天然地存在于體內(nèi)人抗體種系庫 (repertoire)中。如本文中所使用的，“同種型”或“類型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型 (例如，IgM或IgG)。抗體的恒定結(jié)構(gòu)域不參與對(duì)抗原的結(jié)合，但展示不同的效應(yīng)子功能。 取決于重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將給定的人抗體或免疫球蛋白分配至5個(gè)主要類型的 免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的一個(gè)類型。不同類型的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和三 維構(gòu)型是熟知的。在各種人免疫球蛋白類型中，只有人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM已知 活化補(bǔ)體。人IgGl和IgG3已知介導(dǎo)人中的ADCC。如本文中所使用的，“亞類”是指重鏈恒定區(qū)基因的同種型中的進(jìn)一步分類，例如， IgG同種型中的IgGU IgG2、IgG3或IgG4亞類。如本文中所使用的，術(shù)語“化合物”或“藥物化合物”包括抗體、其抗原結(jié)合部分、 免疫綴合物和雙特異性分子。短語“識(shí)別抗原的抗體”和“特異于抗原的抗體”在本文中可以與術(shù)語“特異性結(jié) 合抗原的抗體”互換使用。
術(shù)語“抗體依賴性細(xì)胞毒性”或“ADCC”是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中非特異性細(xì)胞 毒性細(xì)胞(例如NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，然后引起 靶細(xì)胞裂解。介導(dǎo)ADCC的此類細(xì)胞毒性細(xì)胞通常表達(dá)Fc受體(FcR)。介導(dǎo)ADCC的原代細(xì) 胞(NK細(xì)胞)表達(dá)Fc y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fc y RI,Fc γ RII、Fc γ RIII和/或Fc γ RIV0 造血細(xì)胞上的 FcR 表達(dá)概述于 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol.，9 :457_92 (1991)中。 為了估計(jì)分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定，例如美國專利5，500，362或5，821，337 中描述的測(cè)定。用于此類測(cè)定的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷 (NK)細(xì)胞。備選地或另外地，可以例如在動(dòng)物模型例如Clynes等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95 =652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性。術(shù)語“Fe受體”或“FcR”用于描述結(jié)合抗體的Fc區(qū)域的受體，其中Fc區(qū)域包含 重鏈的鉸鏈區(qū)和Ch2及Ch3結(jié)構(gòu)域。例如FcR可以是天然序列人FcR。FcR可以是結(jié)合IgG 抗體的FcR( γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII、Fc γ RIII和Fc γ RIV亞類的受體，包括此類 受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。Fc γ RII受體包括Fc γ RIIA( “活化受體”)和 Fc y RIIB( “抑制受體”)，其兩者具有主要不同在于其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相似的氨基酸序列。 活化受體Fc γ RIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑 制受體Fc y RIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參 見，Daeron, Annu. Rev. Immunol.，15 :203_234 (1997))。 FcR 綜述于 Ravetch 禾口 Kinet， Annu. Rev. Immunol, 9 457-92 (1991) ；Capel 等人，Immunomethods，4 :25_34 (1994)；禾口 de Haas 等人，J. Lab. Clin. Med.，126 330-41 (1995)中。其他 FcR，包括將來鑒定的 FcR，由本 文中的術(shù)語“FcR”包括。該術(shù)語還包括新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)將母源IgG轉(zhuǎn)移至胎兒 (Guyer 等人，Immunol，117 587(1976)和 Kim 等人，J. Immunol, 24 :249(1994))。免疫球蛋 白Fc片段上的主要FcR結(jié)合部位存在于ChI與CH2結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)中。該鉸鏈區(qū)與 各種白細(xì)胞上的FcRl-3相互作用并且觸發(fā)此類細(xì)胞攻擊靶(Wines等人，J. Immunol, 164 5313-5318(2000))。鉸鏈區(qū)包括，但不限于，美國專利6，165,476中描述的序列。術(shù)語“能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性”是指試劑例如抗體展現(xiàn)ADCC的能力，如通 過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測(cè)定法測(cè)量的。這樣的活性通常特征在于Fc區(qū)域與不同F(xiàn)cR的 結(jié)合。不受任何特定機(jī)制的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，抗體顯示ADCC的能力可以例 如，通過其亞類(例如IgGl或IgG3)，通過導(dǎo)入Fc區(qū)域的突變或通過對(duì)抗體的Fc區(qū)域中的 糖模式的修飾來獲得。此類修飾描述于例如美國專利申請(qǐng)案2007-0092521中。術(shù)語“人抗體衍生物”是指人抗體的任何修飾形式，例如，抗體與另一種試劑或抗 體的綴合物。術(shù)語“人源化的抗體”意指其中已將來源于另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種例如小鼠的種系 的CDR序列移植至人構(gòu)架序列上的抗體?？稍谌藰?gòu)架序列中進(jìn)行另外的構(gòu)架區(qū)修飾。術(shù)語“嵌合抗體”意指其中可變區(qū)序列來源于一個(gè)物種并且恒定區(qū)序列來源于另 一個(gè)物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體并且恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗 體。短語“特異性結(jié)合”，如本文中所使用的，意指識(shí)別并且結(jié)合特定分子但基本上不 識(shí)別或結(jié)合相同樣品中的其他分子的化合物，例如，蛋白質(zhì)、核酸、抗體等。例如，抗體或肽 抑制劑(例如，與相關(guān)抗原α 5 β 1結(jié)合的抗α 5 β 1抗體)識(shí)別和結(jié)合樣品中的相關(guān)配體
15但基本上不識(shí)別或結(jié)合樣品中的其他分子。因此，在指定的測(cè)定條件下，指定的結(jié)合部分 (例如抗體或其抗原結(jié)合部分)優(yōu)先結(jié)合特定靶分子例如α 5β1，并且不以顯著的量結(jié)合 存在于測(cè)試樣品中的其他成分?？墒褂迷S多種測(cè)定形式來選擇特異性結(jié)合目的分子的抗 體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定、免疫沉淀、BIAcore、FACS和Western印跡分析是可用于鑒 定與α 5β1特異性反應(yīng)的抗體的測(cè)定。通常，特異性或選擇性反應(yīng)為背景信號(hào)或噪聲的至 少2倍，并且更常見地是背景的10倍以上，甚至更特別地，當(dāng)平衡解離常數(shù)(Kd) < 1 μ Μ，例 如彡IOOnM和另外地例如彡IOnM時(shí)，抗體被認(rèn)為“特異性”結(jié)合抗原。如本文中所使用的，“特異性結(jié)合人整聯(lián)蛋白α5β1”的抗體意指以1χ10_7Μ或更 小，5χ10_8Μ或更小，3Χ10_8Μ或更小，1Χ10_8Μ或更小或5χ10_9Μ或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白 α 5β 1的抗體。術(shù)語“k。n”，如本文中所使用的，意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率 (on-rate)或締合速率(association rate)，而術(shù)語“k。ff”，如本文中使用的，意指特定抗 體-抗原相互作用的解離速率(off-rate)或分解速率。術(shù)語“KD”，如本文中所使用的，意 指解離常數(shù)，其獲自k。fjik。n的比(即k。ff/k。n)并且以摩爾濃度(M)表示。可使用本領(lǐng)域 內(nèi)良好建立的方法測(cè)定抗體的Kd值。用于測(cè)定抗體的Kd的一個(gè)方法是使用表面等離子共 振術(shù)，通常使用生物傳感器系統(tǒng)例如Biacore 系統(tǒng)。如本文中所使用的，術(shù)語IgG抗體的“高親和力”是指對(duì)于靶抗原具有IxlO-7M或 更小，5xlO_8M或更小，或5xlO_9M或更小的Kd的抗體。然而，對(duì)于其他抗體同種型，“高親力” 結(jié)合可變化。例如，IgM同種型的“高親和力”結(jié)合是指具有10、或更小，IO-7M或更小，或 10_8M或更小的Kd的抗體.如本文中所使用的，關(guān)于抗體的術(shù)語“競(jìng)爭(zhēng)”，是指第一抗體或其抗原結(jié)合部分與 第二抗體或其抗原結(jié)合部分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，其中與在第二抗體不存在的情況下第一抗體的結(jié)合 相比較，第一抗體與其關(guān)聯(lián)表位的結(jié)合在第二抗體存在的情況下發(fā)生可檢測(cè)的減少。其中 第二抗體對(duì)其表位的結(jié)合在第一抗體存在的情況下也可檢測(cè)地減少的備選情況可以存在 但不是必須存在。即，第一抗體可抑制第二抗體對(duì)其表位的結(jié)合，而該第二抗體沒有抑制第 一抗體對(duì)其各自表位的結(jié)合。然而，在各抗體可檢測(cè)地抑制其他抗體與其關(guān)聯(lián)表位或配體 的結(jié)合的情況下，不論達(dá)到相同、更大或更小的程度，抗體都被認(rèn)為彼此之間“交叉競(jìng)爭(zhēng)”對(duì) 它們各自表位的結(jié)合。例如，交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體可結(jié)合本文中公開的抗體所結(jié)合的表位或表位 的部分。競(jìng)爭(zhēng)和交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體的用途包括在本公開內(nèi)容中。無論此類競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)籍以 發(fā)生的機(jī)制是什么(例如，位阻、構(gòu)象變化或?qū)餐砦换蚱洳糠值慕Y(jié)合等)，本領(lǐng)域技術(shù) 人員基于本文中提供的教導(dǎo)將理解，這樣的競(jìng)爭(zhēng)和/或交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體包括在并且可用于本 文中公開的方法中。術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的任何蛋白質(zhì)決定簇。 表位決定簇(Epitopic determinant)通常由分子的化學(xué)上活躍的表面基團(tuán)例如氨基酸或 糖側(cè)鏈組成并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位 的區(qū)別在于對(duì)前者(而非后者)的結(jié)合在變性溶劑存在的情況下喪失?！疤切巍笔侵赴喾N糖單位的連接的復(fù)雜低聚糖結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)描述于例如， Essentials of Glycobiology Varki 等人，eds·，ColdSpring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，NY(1999)(其還提供了標(biāo)準(zhǔn)糖生物學(xué)命名法的綜述)中。此類糖形頁
包括但不限于G2、Gl、GO、G-I和G-2(參見，例如，國際專利公開案WO 99/22764)?！疤腔Ｊ健倍x為共價(jià)連接至蛋白質(zhì)的糖單位(例如，糖形)的模式以及糖形 共價(jià)連接至蛋白質(zhì)(更特別地免疫球蛋白)的肽主鏈的位點(diǎn)的模式。由不同細(xì)胞系或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)的抗體彼此相比，可能將具有不同的糖形和 /或糖基化模式。然而，無論此類抗體的糖基化如何，由本文中提供的核酸分子編碼的或包 含本文中提供的氨基酸序列的所有抗體是本公開內(nèi)容的一部分。如本文中所使用的，術(shù)語“受試者”包括任何人或非人動(dòng)物。術(shù)語“非人動(dòng)物”包括 所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、 兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。如本文中所使用的，“治療”是指減少患者經(jīng)歷疾病癥狀(即，腫瘤生長和/或轉(zhuǎn) 移，或由免疫細(xì)胞的數(shù)量和/或活性等介導(dǎo)的其他效應(yīng))的頻率。該術(shù)語包括施用本公開內(nèi) 容的化合物或試劑以預(yù)防或延遲疾病的癥狀、并發(fā)癥或生物化學(xué)指標(biāo)(indicia)的發(fā)作， 減輕疾病、病狀或病癥的癥狀或阻止或抑制疾病、病狀或病癥的進(jìn)一步發(fā)展。治療可以是預(yù) 防性的(以預(yù)防或延遲疾病的發(fā)作或預(yù)防其臨床或亞臨床癥狀的表現(xiàn))或治療性抑制或減 輕疾病表現(xiàn)后的病狀。在下列小部分更詳細(xì)地描述本公開內(nèi)容的各個(gè)方面?？功?5 β 1 抗體本公開內(nèi)容的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或性質(zhì)。例如，抗體特異性結(jié) 合人α 5β 1。優(yōu)選，本公開內(nèi)容的抗體以高親和力例如以IxlO-7M或更小的Kd結(jié)合α 5β 1。優(yōu)選，抗體以5χ10_8Μ或更小，2Χ10_8Μ或更小，5Χ10_9Μ或更小，4Χ10_9Μ或更小， 3x1 O^9M或更小或2. 7χ10_9Μ或更小的Kd結(jié)合人α 5 β 1。估計(jì)抗體對(duì)α 5 β 1的結(jié)合能力的 測(cè)定在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括例如，ELISA、Western印跡法、RIA和流式細(xì)胞術(shù)分析。合 適的測(cè)定法詳細(xì)地描述于實(shí)施例中。抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如，結(jié)合親和力)還可通過本 領(lǐng)域內(nèi)已知的測(cè)定法例如通過Biacore分析來估計(jì)。本公開內(nèi)容的抗α 5 β 1抗體還能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。例如，可以 通過使用特定亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3)(包括可進(jìn)一步增強(qiáng)抗體的ADCC活性水平的對(duì) Fc結(jié)構(gòu)域的突變)來獲得這樣的功能性。此類突變和測(cè)量ADCC的方法進(jìn)一步描述于實(shí)施 例中。單克隆抗體22B5本公開內(nèi)容的一個(gè)舉例說明性抗體是人單克隆抗體22B5，如實(shí)施例1和2中所描 述的。22B5 氨基酸序列示于圖IB中以及示于SEQID NO :7中。22B5的八氨基酸序列 示于圖ID中以及示于SEQ ID N0:8中。如圖IB和圖2中所示，22B5的重鏈可變區(qū)包含回 復(fù)至人種系基因序列的兩個(gè)突變。即，22B5包含一個(gè)在氨基酸殘基編號(hào)30上從異亮氨酸至 絲氨酸的突變(I30S)和在氨基酸殘基編號(hào)33上從天冬酰胺至絲氨酸的突變(N33S)。如本 文中所使用的，“22B5”是指其中已產(chǎn)生所述I30S和N33S重鏈可變區(qū)種系突變的抗體。鑒于22B5可結(jié)合α 5 β 1，可將Vh和\序列與其他抗α 5 β 1抗體“混合和匹配” 以產(chǎn)生本公開內(nèi)容的另外的抗α 5β 1結(jié)合分子?？墒褂蒙鲜龊蛯?shí)施例中的結(jié)合測(cè)定法(例 如，ELISA)檢測(cè)此類“混合和匹配的”抗體的α 5 β 1結(jié)合。在一種情況下，當(dāng)將Vh和\鏈 混合和匹配時(shí)，用結(jié)構(gòu)上相似的Vh序列置換來自特定配對(duì)的Vh序列。同樣地，在另一
17個(gè)情況下，用結(jié)構(gòu)上相似的\序列置換來自特定的VH/\配對(duì)的\序列。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了包含22B5的重鏈和輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的 抗體。22B5的Vh⑶Rl的氨基酸序列示于SEQ ID NO :1。22B5的Vh⑶R2的氨基酸序列示 于SEQ ID NO :2。22B5的Vh CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO :3。22B5的\ CDRl的氨 基酸序列示于SEQ ID NO :4ο 22Β5的Vl CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO :5。22Β5的Vl CDR3 的氨基酸序列示于 SEQ ID NO :6。使用 Kabat 系統(tǒng)(Kabat，Ε. Α.，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)描繪 CDR 區(qū)。鑒于22B5結(jié)合α5β 1以及該抗原-結(jié)合特異性主要由⑶Rl、⑶R2和⑶R3區(qū)域提 供，因此可將Vh CDR1、CDR2和CDR3序列和Vl CDR1、CDR2和CDR3序列“混合和匹配”(即， 可將來自不同α 5β 1抗體的⑶R混合和匹配，雖然各抗體通常將包含乂11⑶R1、⑶R2和⑶R3 以及Vl⑶R1、⑶R2和⑶R3)以產(chǎn)生本公開內(nèi)容的另外的抗α5β1結(jié)合分子?？墒褂蒙鲜?和實(shí)施例中的結(jié)合測(cè)定法(例如，ELISA,Biacore分析)來檢測(cè)此類“混合和匹配的”抗體 的α5β1結(jié)合。在一種情況下，當(dāng)將Vh⑶R序列混合和匹配時(shí)，用結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列 置換來自特定Vh序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列。同樣，當(dāng)將Vl⑶R序列混合和匹配 時(shí)，通常用結(jié)構(gòu)上相似的⑶R序列置換來自特定\序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列。對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，可通過用結(jié)構(gòu)上相似的序列(其來自本文中公開的 ⑶R序列)置換一個(gè)或多個(gè)Vh和/或\⑶R區(qū)序列來產(chǎn)生新型Vh和\序列。因此，在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其 包含(a)含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶Rl ； (b)含有SEQ ID NO 2的 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R2 ； (c)含有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R3 ； (d)含有SEQID NO 4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶Rl ； (e)含有SEQ ID NO 5的氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和/或(f)含有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其 中抗體特異性結(jié)合α 5β 1，優(yōu)選人α 5β 1。單克隆抗體2D2、24C7和1D9本公開內(nèi)容的另一個(gè)舉例說明性抗體是實(shí)施例1和8中描述的人單克隆抗體2D2。 2D2的Vh氨基酸序列示于SEQ ID NO 39中。2D2的Vl氨基酸序列示于SEQ ID NO 40中。本公開內(nèi)容的另一個(gè)舉例說明性抗體是實(shí)施例1和8中描述的人單克隆抗體 24C7。24C7的￥11氨基酸序列示于SEQ ID N0:19中。24C7的Vl氨基酸序列示于SEQ ID NO 20 中。本公開內(nèi)容的另一個(gè)舉例說明性抗體是實(shí)施例1和8中描述的人單克隆抗體1D9。 1D9的Vh氨基酸序列示于SEQ ID NO 29中。1D9的Vl氨基酸序列示于SEQ ID NO 30中。鑒于2D2、24C7和1D9可結(jié)合α 5 β 1，因此可將此類抗體的Vh和\序列與其他抗 α 5β1抗體“混合和匹配”以產(chǎn)生本公開內(nèi)容的另外的抗α5β1結(jié)合分子?？墒褂蒙衔?和實(shí)施例中描述的結(jié)合測(cè)定法(例如，ELISA)檢測(cè)此類“混合和匹配的”抗體的α5β1結(jié) 合。在一種情況下，當(dāng)將Vh和\鏈混合和匹配時(shí)，用結(jié)構(gòu)上相似的Vh序列置換來自特定Vh/ Vl配對(duì)的Vh序列。同樣地，在另一個(gè)情況下，用結(jié)構(gòu)上相似的\序列置換來自特定的VH/VL 配對(duì)的\序列。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了包含2D2、24C7和1D9的重鏈和輕鏈⑶Rl、⑶R權(quán)利要求
分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其(a)以1x10 7M或更小的KD結(jié)合人整聯(lián)蛋白α5β1；和(b)能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其是亞類IgGl的全長人抗體。
3.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分以5xlO_8M或 更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白α5β1。
4.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其以IxlO-7M或更小的Kd結(jié)合人整聯(lián)蛋白 α 5β 1，并且包含與SEQ ID NO 7中所示的氨基酸序列至少90%同一的重鏈可變區(qū)。
5.權(quán)利要求4的抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包含與SEQID NO :8中所示的氨基酸序 列至少90%同一的輕鏈可變區(qū)。
6.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)含有SEQID NO 1的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)含有SEQID NO 2的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)含有SEQID NO 3的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)含有SEQID NO 4的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)含有SEQID NO 5的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和(f)含有SEQID NO 6的輕鏈可變區(qū)CDR3。
7.權(quán)利要求6的抗體或抗原結(jié)合部分，其包含(a)含有SEQID NO 7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)含有SEQID NO 8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
8.權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是人全長IgGl抗體，并且其中所述 抗體的Fc區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸被突變，并且其中所述抗體與其中所述至少一個(gè)氨基酸 未突變的相同抗體相比，展示更大的ADCC。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述至少一個(gè)突變?cè)诎被嵛稽c(diǎn)絲氨酸247、丙氨酸338或 異亮氨酸340上發(fā)生。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中所述至少一個(gè)突變選自絲氨酸247至天冬氨酸的突變 (S247D)、丙氨酸338至亮氨酸的突變(A338L)以及異亮氨酸340至谷氨酸的突變(I340E)。
11.權(quán)利要求10的抗體，其中所述抗體包含突變S247D、A338L和I340E。
12.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體包含與SEQID NO :9中所示的氨基酸序列至少 90%同一的重鏈氨基酸序列。
13.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體包含與SEQID NO: 10中所示的氨基酸序列至少 90%同一的輕鏈氨基酸序列。
14.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體包含與SEQID NO :9中所示的氨基酸序列至少 90%同一的重鏈氨基酸序列以及與SEQ ID NO :10中所示的氨基酸序列至少90%同一的輕 鏈氨基酸序列。
15.組合物，其包含權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合部分以及可藥用的載體。
16.分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的任何抗體的重鏈和/或輕鏈， 或其抗原結(jié)合部分。
17.包含權(quán)利要求16的核酸分子的表達(dá)載體。
18.包含權(quán)利要求17的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
19.用于制備抗α5β 1抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，其包括在權(quán)利要求18的宿主細(xì) 胞中表達(dá)所述抗體或抗原結(jié)合部分。
20.抑制表達(dá)整聯(lián)蛋白α5β1的腫瘤細(xì)胞的生長的方法，其包括將細(xì)胞與以有效抑制 腫瘤細(xì)胞生長的量存在的權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸。
全文摘要
本公開內(nèi)容提供了以高和親力特異性結(jié)合整聯(lián)蛋白α5β1的分離的單克隆抗體，特別地人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分。還提供了編碼本公開內(nèi)容的抗體的核酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和用于表達(dá)本公開內(nèi)容的抗體的方法。還提供了包含抗體或其抗原結(jié)合部分的免疫綴合物、雙特異性分子和藥物組合物。本公開內(nèi)容還提供了使用本文中描述的抗α5β1抗體或其抗原結(jié)合部分治療各種癌癥的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101970006SQ200980108185
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月5日
發(fā)明者B·德沃克斯, D·D·胡-洛維, D·M·棚町, G·F·卡斯佩森, G·維克曼, K·托伊, M·A·諾斯, M·山中, P·布拉姆斯, S·L·本德, T·W·斯普勞爾, 揚(yáng)嵐, 李剛, 王建英, 蔣欣, 陳海濱, 黃海春 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司;輝瑞大藥廠