專(zhuān)利名稱(chēng)：微生物感染的治療的制作方法
微生物感染的治療前言本發(fā)明涉及改進(jìn)的微生物抗原疫苗、藥物組合物、免疫原性組合物和抗體及其在 治療微生物感染，特別是細(xì)菌來(lái)源的，包括葡萄球菌(Staphylococcal)來(lái)源的微生物感染 中的用途。多重耐藥性(MDR)是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌尤其是醫(yī)院中的日益嚴(yán)重的問(wèn)題。抗生素和 其它治療細(xì)菌感染的試劑的廣泛使用已經(jīng)引起細(xì)菌迅速產(chǎn)生針對(duì)所述試劑的抗性，很多細(xì) 菌具有多重耐藥性。因此，目前需要提供改進(jìn)的處理這樣的耐藥性感染的治療。葡萄球菌是球形的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其通常按照葡萄樣不規(guī)則成簇排列。有一些 是人類(lèi)皮膚和粘膜的正常菌叢(flora)的成員，其它的則引起化膿、膿腫形成、多種化膿性 感染，甚至是致命的敗血病。致病性葡萄球菌通常引發(fā)溶血、使血漿凝固并產(chǎn)生多種細(xì)胞外 酶類(lèi)和毒素。葡萄球菌屬中有至少30個(gè)種。具有臨床重要性的三個(gè)主要種是金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)禾口腐生葡萄球 菌(Staphylococcus saprophyticus) 0金黃色葡萄球菌是凝固酶陽(yáng)性的，這將其與其它的 種區(qū)分開(kāi)。金黃色葡萄球菌是對(duì)于人類(lèi)的主要病原體。幾乎每個(gè)人在其一生中都具有一 些類(lèi)型的金黃色葡萄球菌感染，從食物中毒的嚴(yán)重性或輕微皮膚感染到嚴(yán)重的威脅生命的 感染。凝固酶陰性的葡萄球菌是正常的人類(lèi)菌叢，其有時(shí)引起感染，通常與移植裝置相關(guān)， 特別是在非常年幼的、年老的和免疫缺陷的患者中。大約75%的由凝固酶陰性的葡萄球 菌引起的感染都是由表皮葡萄球菌引起的。由沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri), 人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和其它種引起的感染較不常見(jiàn)。腐生葡萄球菌 是年輕婦女中尿道感染的相對(duì)常見(jiàn)的誘因。葡萄球菌產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，這將其與鏈球菌 (streptococci)區(qū)別開(kāi)來(lái)。路鄧葡萄球菌(S. lugdunensis)也是臨床相關(guān)的，其存在于大 約5-10%的感染性心內(nèi)膜炎的病例中。在關(guān)節(jié)空間內(nèi)，金黃色葡萄球菌在主要成分為膠原的關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的定殖似乎是促 成膿毒性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生的重要因素。造血性獲得的細(xì)菌性關(guān)節(jié)炎仍然是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。這 種迅速進(jìn)展和高度破壞性的關(guān)節(jié)病難以根除。通常而言，不產(chǎn)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)損傷的話(huà)，有 50%以下的感染患者難以恢復(fù)。金黃色葡萄球菌是從具有造血性和繼發(fā)性骨髓炎的成年患 者中分離而來(lái)的主要病原體。在住院患者中，葡萄球菌例如金黃色葡萄球菌是主要的感染誘因。傷口或留置的 醫(yī)療器械的最初局部感染能夠?qū)е赂鼑?yán)重的侵入性感染例如敗血病、骨髓炎、乳腺炎和心 內(nèi)膜炎。在與醫(yī)療器械有關(guān)的感染中，在移植之后較短時(shí)間內(nèi)塑料和金屬表面被宿主血漿 和基質(zhì)蛋白例如纖維蛋白原和纖連蛋白包被。金黃色葡萄球菌和其它葡萄球菌粘附到這些 蛋白上的這種能力對(duì)于感染的起始是必不可少的。血管移植物、靜脈內(nèi)導(dǎo)管、動(dòng)脈心瓣膜和 心臟輔助裝置是血栓形成性的，易于細(xì)菌的群集。一般而言，在葡萄球菌中，金黃色葡萄球 菌是這些感染中最具破壞性的病原體。在世界范圍內(nèi)的醫(yī)院中已經(jīng)觀(guān)察到了對(duì)目前可用的治療感染的多數(shù)抗生素呈現(xiàn)抗性的金黃色葡萄球菌分離體的顯著增加。抵抗金黃色葡萄球菌的青霉素的開(kāi)發(fā)是感染 控制和治療中的一大進(jìn)步。不幸的是，青霉素抗性的生物迅速出現(xiàn)，迫切需要新的抗生 素。隨著每種新的抗生素的引進(jìn)，金黃色葡萄球菌能夠?qū)箖?nèi)酰胺酶——改變的青霉 素結(jié)合蛋白，以及允許細(xì)菌存在的突變的細(xì)胞膜蛋白。因此，出現(xiàn)了甲氧苯青霉素抗性的 金黃色葡萄球菌(MRSA)和多重耐藥的生物并且在全世界的醫(yī)院和療養(yǎng)院留下了主要足跡 (Chambers,H. F. ,Clin Microbiol Rev, 1 :173，1988 ；和 Mulligan，M. Ε·等人，AmJ Med,94 313，1993)。目前，引起醫(yī)院中的感染的葡萄球菌菌株中幾乎有一半對(duì)于除了萬(wàn)古霉素以外 的所有抗生素都是抗性的，似乎萬(wàn)古霉素變得無(wú)效也只是時(shí)間的問(wèn)題。因此，迫切且日益需要用于治療葡萄球菌例如金黃色葡萄球菌感染的治療劑，所 述治療劑有效抵抗那些抗生素抗性的細(xì)菌菌株。在革蘭氏陽(yáng)性病原體例如葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌中，被稱(chēng)為粘附素(adhesin) 的蛋白通過(guò)例如促進(jìn)群集、附著至血液凝塊和使組織受損而介導(dǎo)這樣的感染。這些特異性 微生物表面粘附素被稱(chēng)為MSCRAMM(微生物表面成分識(shí)別性粘附基質(zhì)分子)(Patti，J.等 人，Ann Rev Microbiol,48 585-617,1994 ；Patti,J.and Hook,Μ. ,Cur Opin Cell Biol., 6:752-758,1994)。MSCRAMM特異性識(shí)別并結(jié)合至細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，例如纖連蛋白、 纖維蛋白原、膠原和彈性蛋白。在很多革蘭氏陽(yáng)性病原體中發(fā)現(xiàn)了這些MSCRAMM，其氨基酸 序列是相關(guān)的，它們具有相似的模塊(modular)設(shè)計(jì)和共同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域組構(gòu)。細(xì)菌細(xì)胞表面上的MSCRAMM和宿主組織內(nèi)的配體以鎖鑰模式相互作用，從而導(dǎo)致 細(xì)菌粘附至宿主。細(xì)菌生存通常需要粘附，其幫助細(xì)菌規(guī)避宿主的防御機(jī)制和抗生素的挑 戰(zhàn)。一旦細(xì)菌成功粘附并群集在宿主組織中，其生理即被顯著改變，并且分泌破壞性成分例 如毒素和酶。此外，粘附細(xì)菌通常產(chǎn)生生物膜并迅速對(duì)多數(shù)抗生素的殺滅效應(yīng)產(chǎn)生抗性。細(xì)菌能夠表達(dá)識(shí)別多種基質(zhì)蛋白的MSCRAMM。MSCRAMM中的配體結(jié)合位點(diǎn)似乎是 由氨基酸序列的相對(duì)較短的連續(xù)區(qū)段(基序)決定的。因?yàn)樵趲追N不同的細(xì)菌物種中可 以發(fā)現(xiàn)相似的基序，所以這些功能性基序似乎會(huì)進(jìn)行種間轉(zhuǎn)移(Patti and Hook,Cur Opin Cell Biol，6 :752-758，1994)。另外，有時(shí)單一的MSCRAMM能夠結(jié)合數(shù)個(gè)ECM配體。MSCRAMM能夠通過(guò)與包括纖維蛋白原(Fg)和/或纖連蛋白(Fn)等的蛋白結(jié)合而 介導(dǎo)感染。纖維蛋白原和纖連蛋白是在血漿中發(fā)現(xiàn)的蛋白，其在止血和凝固中發(fā)揮重要作 用。纖維蛋白原由6條多肽鏈組成2條Aa、2條Ββ和2條Y-鏈。Y-鏈的C末端 部分在生物學(xué)上是重要的，并且在血小板吸附和聚集中與血小板整聯(lián)蛋白相互作用。該區(qū) 域也是金黃色葡萄球菌靶定的，導(dǎo)致纖維蛋白原依賴(lài)性的細(xì)胞聚集和組織吸附。金黃色葡萄球菌具有數(shù)個(gè)表面表達(dá)的蛋白，其刺激血小板激活和聚集。金黃色葡 萄球菌的MSCRAMM蛋白包括但不限于下列蛋白-纖維蛋白原結(jié)合蛋白聚集因子A(ClfA)；-纖維蛋白原結(jié)合蛋白聚集因子B(ClfB)；-纖連蛋白-纖維蛋白原結(jié)合蛋白A(FnBPA)；-纖連蛋白-纖維蛋白原結(jié)合蛋白B(FnBPB)；和-金黃色葡萄球菌表面蛋白SasA、SasG,SasK等。下表1列舉了各種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁錨定表面蛋白的選集
表1
表面蛋白aa°配體6基序c分選醉 (sortase) d蛋白A (Spa)508免疫球蛋白、 von Willebrand 因子、TNFReLPETGA纖連蛋白結(jié)合蛋白A (FnbpA)1,018纖連蛋白、纖維 蛋白原、彈性蛋 白LPETGA纖連蛋白結(jié)合蛋白B (FnbpB)914纖連蛋白、纖維 蛋白原、彈性蛋 白LPETGA聚集因子A(ClfA)933纖維蛋白原、補(bǔ) 體因子ILPDTGA聚集因子B (ClfB)913纖維蛋白原、細(xì) 胞角蛋白10LPETGA膠原粘附CCna)1,183股原LPKTGASdrC947未知LPETGASdrD1,315未知LPETGASdrE1,166未知LPETGAPls1,637未知LPDTGASasA2,261未知LPDTGASasB937未知LPDTGASasC2,186未知LPNTGASasD241未知LPAAGASasE/IsdA354血紅素fLPKTGASasF637未知LPKAGA
權(quán)利要求
與其宿主配體的結(jié)合減少的重組葡萄球菌MSCRAMM蛋白或MSCRAMM樣蛋白或其片段，其包含至少一部分配體結(jié)合區(qū)域，用于治療。
2.權(quán)利要求1的重組MSCRAMM或MSCRAMM樣蛋白或其片段，其具有減少的或不具有與 其宿主配體非共價(jià)結(jié)合的能力，用于治療。
3.權(quán)利要求2的重組MSCRAMM或MSCRAMM樣蛋白或其片段，其中MSCRAMM或MSCRAMM 樣蛋白與其配體通過(guò)塢、鎖和鎖閉發(fā)生的非共價(jià)結(jié)合被減少或阻止。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組MSCRAMM或MSCRAMM樣蛋白或其片段，其中所述配體是 血紅素、血紅蛋白、膠原或纖維蛋白原。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的重組MSCRAMM蛋白或MSCRAMM樣蛋白或其片段，其為a.纖維蛋白原結(jié)合蛋白；b.SdrD, SdrE, SdrG, SdrF ；或c.IsdB 和 / 或 IsdH0
6.權(quán)利要求5的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白或其包含至少一部分纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域 的片段，具有減少的或不具有與纖維蛋白原非共價(jià)結(jié)合的能力。
7.權(quán)利要求6的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其包含兩個(gè)形成疏水袋的DeV-IgG結(jié)構(gòu)域， 其中兩個(gè)Dev-IgG結(jié)構(gòu)域之間形成的疏水袋被改變以減少或阻止纖維蛋白原結(jié)合；或纖維蛋白原結(jié)合蛋白包含覆蓋疏水溝中的纖維蛋白原的鎖閉肽并且所述鎖閉肽被改 變或刪除以減少或阻止纖維蛋白原結(jié)合。
8.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中所述纖維蛋白原結(jié)合蛋白 僅包含纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域或其片段。
9.權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其源自金黃色葡萄球菌、表皮葡 萄球菌和/或路鄧葡萄球菌。
10.權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中所述纖維蛋白原結(jié)合蛋白 選自下列中的一項(xiàng)a.FbI、SdrF 和 / 或 SdrG ；b.纖維蛋白原結(jié)合蛋白聚集因子A(ClfA)和/或纖維蛋白原結(jié)合蛋白聚集因子 B(ClfB)；c.IsdA ；或d.FnBPA 和 / 或 FnBPB。
11.權(quán)利要求5至10任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其在纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域中 包含至少一個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的取代、插入、刪除或添加以產(chǎn)生沒(méi)有減少的或不具有 與纖維蛋白原非共價(jià)結(jié)合能力的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白。
12.權(quán)利要求11的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其包含纖維蛋白原結(jié)合蛋白的纖維蛋白 原結(jié)合區(qū)域A，其中核苷酸或氨基酸的取代、插入、刪除或添加降低與纖維蛋白原的非共價(jià) 相互作用，優(yōu)選通過(guò)阻止或減少配體與疏水袋的結(jié)合，所述疏水袋分隔纖維蛋白原結(jié)合蛋 白的區(qū)域A的亞區(qū)域N2和N3。
13.權(quán)利要求5至12任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其包含不具有鎖閉肽氨基酸 殘基的纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域，從而產(chǎn)生具有減少的或不具有與纖維蛋白原非共價(jià)結(jié)合能力的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白。
14.權(quán)利要求5至13任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中所述重組蛋白是ClfA。
15.權(quán)利要求14的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中ClfAA纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域(區(qū)域 A)的疏水性殘基發(fā)生至少一個(gè)或多個(gè)核酸或氨基酸的取代、插入、刪除或添加。
16.權(quán)利要求14或15的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中氨基酸殘基Ala254、Tyr256、 Pro336、Tyr338、Ile387、Lys389、Glu526 和 / 或 Val527 被 Ala 或 Ser 取代。
17.權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中ClfA纖維蛋白原結(jié) 合區(qū)域(區(qū)域A)的殘基P336和/或Y338被絲氨酸或丙氨酸取代以產(chǎn)生rClfAP336S Y338A或 rClfAP336A Y338S0
18.權(quán)利要求14至17任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中重組葡萄球菌纖維蛋白 原結(jié)合蛋白具有根據(jù)任意SEQ ID NO :1至3的氨基酸序列或其片段，其中殘基P336和/或 Y338被絲氨酸和/或丙氨酸取代。
19.權(quán)利要求14至18任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其包含纖維蛋白原結(jié)合蛋 白、纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域、最小纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域和/或其片段。
20.權(quán)利要求14至19任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其中所述片段包含至少一部 分纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域以產(chǎn)生具有減少的或不具有與纖維蛋白原非共價(jià)結(jié)合能力的纖維 蛋白原結(jié)合蛋白的重組片段。
21.權(quán)利要求14至20任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其包含a.亞區(qū)域N123，跨越纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域(區(qū)域Α)的氨基酸殘基40-559；b.亞區(qū)域N23，跨越ClfA纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域(區(qū)域A)的氨基酸殘基221-559；和/或c.纖維蛋白原結(jié)合區(qū)域(區(qū)域A)的氨基酸殘基221-531。
22.權(quán)利要求14至21任一項(xiàng)的重組纖維蛋白原結(jié)合蛋白，其包含根據(jù)任意SEQID NO 4-14的氨基酸序列。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組MSCRAMM或MSCRAMM樣蛋白或其片段，用于治療或 預(yù)防微生物感染，包括膿毒癥、膿毒性關(guān)節(jié)炎和/或心內(nèi)膜炎，優(yōu)選是由葡萄球菌引起的。
24.權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重組蛋白或其片段在制備用于治療或預(yù)防微生物感染的 藥物中的用途，所述微生物感染優(yōu)選由葡萄球菌引起。
25.—種在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括給予所述個(gè)體根據(jù)權(quán)利要求1至22任一 項(xiàng)的重組蛋白或其片段。
26.一種治療患有微生物感染的患者的方法，包括以根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重 組蛋白或其片段或者包含根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重組蛋白或其片段的疫苗治療所 述患者，從而治療所述微生物感染。
27.表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重組蛋白或其片段的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體或 宿主細(xì)胞。
28.包含根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重組蛋白或其片段的疫苗。
29.針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重組蛋白或其片段產(chǎn)生的抗體，優(yōu)選為超免疫 血清的形式。
30.包含根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的重組蛋白或其片段以及藥學(xué)上可接受的佐劑的免疫原性藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)的微生物抗原疫苗、藥物組合物、免疫原性組合物和抗體及其在治療微生物感染特別是細(xì)菌來(lái)源包括葡萄球菌來(lái)源的微生物感染中的用途。理想地，本發(fā)明涉及用于治療的對(duì)其宿主配體的結(jié)合減少的重組葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM樣蛋白或其片段。
文檔編號(hào)C07K14/31GK101983067SQ200980112527
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2009年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者A·塔羅夫斯基, E·約瑟夫森, J·喬格赫岡, J·希金斯, T·福斯特 申請(qǐng)人:近都柏林之伊麗莎白皇后神圣及不可分割的三位一體學(xué)院之教務(wù)長(zhǎng),研究員和學(xué)者