專利名稱：抗炎癥藥劑的制作方法
抗炎癥藥劑發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于治療或預(yù)防人類和動物炎癥的領(lǐng)域，并涉及用于治療或預(yù)防各種炎性 病癥的藥物組合物和方法。具體來說，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療炎性病癥例如瓜氨酸相 關(guān)疾病、優(yōu)選為炎性疾病的組合物和方法。本發(fā)明提供了用于炎性病癥的治療和預(yù)防針的 對含瓜氨酸表位的特異性結(jié)合分子。
背景技術(shù)：
炎性病癥，不論其本質(zhì)是慢性還是急性的，在醫(yī)療保健行業(yè)中都是重要的難題。簡 單來說，慢性炎癥被認(rèn)為持續(xù)時間長(數(shù)周或數(shù)月)的炎癥，其中活性炎癥、組織破壞和愈 合的努力都在同時進(jìn)行之中(《RcAbins疾病病理學(xué)基礎(chǔ)》(RcAbins Pathological Basis of Disease),R. S. Cotran,V. Kumar 禾口 S. L. Robbins 主編，W. B. Saunders Co. ,p. 75,1989)。 盡管慢性炎癥可以繼發(fā)于急性炎癥發(fā)作之后，但是它也能作為隱伏過程開始，隨時間而發(fā) 展，例如作為引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)的持續(xù)性感染(例如結(jié)核病、梅毒、真菌感染)、長時間暴 露于內(nèi)源(例如升高的血脂)或外源(例如二氧化硅、石棉、香煙焦油、外科縫合線)毒素、 或抗身體自身組織的自身免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、 牛皮癬)的結(jié)果。炎性關(guān)節(jié)炎在發(fā)達(dá)國家，特別是隨著老年個體數(shù)量的增加是一種嚴(yán)重的健康問 題。例如，一種形式的炎性關(guān)節(jié)炎——類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)，是一種多系統(tǒng)、慢性、復(fù)發(fā)性、炎 性疾病，影響世界人口的1到2%。盡管可能影響許多器官，但RA基本上是嚴(yán)重形式的慢性滑膜炎，有時引起患病 關(guān)節(jié)的破壞和關(guān)節(jié)強直(((Robbins疾病病理學(xué)基礎(chǔ)》(Robbins Pathological Basis of Disease), R. S. Cotran, V. Kumar 禾口 S. L. Robbins, W. B. Saunders Co. , p. 75,1989)。在病理 上，這種疾病的特征是滑膜顯著增厚從而形成伸出到關(guān)節(jié)間隙中的絨毛狀突起、滑膜細(xì)胞 內(nèi)襯多層化(滑膜細(xì)胞增殖)、滑膜被白細(xì)胞浸潤(巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴濾 泡；被稱為“炎性滑膜炎”)，以及纖維蛋白在滑膜內(nèi)沉積并伴有細(xì)胞壞死。作為該過程的結(jié) 果而形成的組織被稱為關(guān)節(jié)翳(parmus)，并且關(guān)節(jié)翳最終生長到填滿關(guān)節(jié)間隙。關(guān)節(jié)翳通 過血管發(fā)生過程發(fā)展出大范圍的新血管網(wǎng)，這對于滑膜炎的演化是至關(guān)重要的。從關(guān)節(jié)翳 組織的細(xì)胞釋放出消化酶(基質(zhì)金屬蛋白酶(例如膠原酶、基質(zhì)溶素))和炎性過程的其他 介導(dǎo)物(例如過氧化氫、超氧化物、溶酶體酶和花生四烯酸代謝產(chǎn)物)，導(dǎo)致軟骨組織進(jìn)行 性破壞。關(guān)節(jié)翳侵入關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致軟骨組織的侵蝕和斷裂。最后，所涉及的關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨 下骨骼的侵蝕和纖維性關(guān)節(jié)強直，并最終出現(xiàn)骨性強直。一般相信，RA是一種自身免疫疾病，許多不同的關(guān)節(jié)源性刺激在免疫遺傳易感性 宿主中激活免疫應(yīng)答。外源性感染因子(Epstein-Barr病毒、風(fēng)疹病毒、細(xì)胞肥大病毒、皰 疹病毒、人類嗜T-淋巴細(xì)胞病毒、支原體等)和內(nèi)源性蛋白例如膠原蛋白、蛋白聚糖、改變 的免疫球蛋白和翻譯后修飾的蛋白例如瓜氨酸化的蛋白兩者，都已被暗示是引發(fā)不適當(dāng)?shù)?宿主免疫應(yīng)答的致病因子。無論引發(fā)因子是什么，自體免疫在疾病的發(fā)展中都發(fā)揮作用。具 體來說，相關(guān)抗原被抗原呈遞細(xì)胞(滑膜中的巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞)攝入、加工并呈遞給T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞啟動細(xì)胞免疫應(yīng)答，并刺激B淋巴細(xì)胞增殖和分化成漿細(xì)胞。最終結(jié)果 是產(chǎn)生針對宿主組織的過量的不適合的免疫應(yīng)答(例如針對II型膠原蛋白的抗體、針對自 身IgG的Fc部分的抗體(被稱為“類風(fēng)濕因子”))，以及針對不同的瓜氨酸化表位的抗體 (抗CCP抗體)。這進(jìn)一步放大了免疫應(yīng)答并加速了軟骨組織的破壞。一旦引發(fā)這種級聯(lián) 反應(yīng)，大量軟骨破壞的介導(dǎo)物造成了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。已經(jīng)證實，上面提到的抗CCP抗體對于RA高度特異。最近的證據(jù)顯示，每個對這 些抗體血清型陽性的個體要么已經(jīng)患有RA，要么將在將來發(fā)生這種疾病?？笴CP抗體的存 在(特別是當(dāng)高滴度存在時)指示了侵蝕性疾病結(jié)果(Nijenhuis等，Clin. Chim. Acta, vol 350，17-34,2004)。此外，已經(jīng)證實抗CCP抗體在炎癥位點處局部產(chǎn)生。在來自RA患者的 滑膜材料中發(fā)現(xiàn)的抗CCP抗體相對于總IgG的比例，似乎明顯高于同樣患者的血清中的比 例(Masson-Bessiere 等，Clin Exp Immunol, vol 119,544-552,2000)(Reparon-Schuijt 等，Arthritis Rheum, vol 44，41-47，2001)?；ぶ挟a(chǎn)抗CCP抗體的漿細(xì)胞的存在，表明炎癥位點處CCP特異性B細(xì)胞的抗原 驅(qū)動性成熟?？笴CP抗體一旦產(chǎn)生，與滑膜中的瓜氨酸化蛋白形成的免疫復(fù)合物可以引發(fā) 炎性過程的發(fā)展。這些以及其他數(shù)據(jù)支持了這樣一種假說，即抗CCP抗體事實上導(dǎo)致了 RA的至少一部分疾病癥狀?？笴CP抗體在RA發(fā)病機理中的作用，得到了在患有RA的患 者中進(jìn)行的B淋巴細(xì)胞消減實驗的結(jié)果的支持(Cambridge等，Arthritis Rheum, vol48, 2146-2154,2003)?；加型砥陬愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的人具有比某些類型的癌癥更高的死亡率，因此治療方 案已經(jīng)轉(zhuǎn)向被設(shè)計用于降低不可逆關(guān)節(jié)損傷的侵占性的早期藥物療法。美國風(fēng)濕病學(xué) 會(American College of Rheumatology)最近的推薦意見(Arthritis and Rheumatism 39(5) :713-722,1996)包括對于任何具有確定診斷和進(jìn)行中的癥狀的患者早期啟動改變 疾病的抗風(fēng)濕病藥物(DMARD)療法?？拱┌Y藥物已變成用于絕大多數(shù)患者的一線療法，其 中化療藥物氨甲蝶呤是60到70%的風(fēng)濕病學(xué)家所選的藥物。疾病的嚴(yán)重性通常需要無 限期地每周使用這種藥物進(jìn)行治療，并且在盡管使用氨甲蝶呤療法但疾病仍然發(fā)展的患 者(超過50%的患者)中，經(jīng)常使用二線化療藥物例如環(huán)孢菌素和硫唑嘌呤(單獨或組合 地)。對于能夠抑制炎性疾病、特別是其中涉及滑膜的疾病和瓜氨酸相關(guān)的炎性疾病的 發(fā)病機理，用于治療或預(yù)防炎性疾病的化合物，仍存在需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于炎性疾病的治療或預(yù)防的與pl5和/或P17上的瓜氨酸化表位 特異性反應(yīng)的結(jié)合分子。本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防炎性疾病的方法，包含向需要的患者給藥治療有 效量的抗炎癥組合物的步驟，所述組合物包含與P15和/或pl7上的瓜氨酸化表位特異性 反應(yīng)的結(jié)合分子。本發(fā)明的組合物和方法包括與瓜氨酸殘基反應(yīng)的特異性結(jié)合分子的可藥用制劑。 具體來說，結(jié)合分子與本文中所鑒定的被稱為P15和pl7的兩個多肽上的瓜氨酸化表位特 異性反應(yīng)。
在參考了下面的詳細(xì)描述、圖和實施例后，本發(fā)明的這些以及其他方面將變得明 顯。此外，在本文中陳述了各種不同的參考文獻(xiàn)，它們對某些過程、裝置或組合物進(jìn)行了更 詳細(xì)描述，因此在此以其全文引為參考。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于炎性疾病的治療或預(yù)防的與pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位 特異性反應(yīng)的結(jié)合分子。在本文中使用的術(shù)語“特異性結(jié)合分子”是指能夠特異性結(jié)合的分子、優(yōu)選為小分 子。就此而言，特異性結(jié)合打算是指分子能夠與選定的靶分子結(jié)合，而它在同樣條件下將不 結(jié)合另一種不相關(guān)的靶分子。例如，當(dāng)結(jié)合分子與血清白蛋白結(jié)合并且更少或完全不與血 清中發(fā)現(xiàn)的另一種或優(yōu)選任何其他蛋白結(jié)合時，所述結(jié)合分子被稱為與血清白蛋白特異性纟口口。在本文中，術(shù)語“與瓜氨酸特異性反應(yīng)”或“與瓜氨酸化表位反應(yīng)”或“與瓜氨酸表 位反應(yīng)”，是指抗體與結(jié)構(gòu)例如含有瓜氨酸殘基的肽或肽樣分子反應(yīng)，但是抗體更少或優(yōu)選 完全不與含有精氨酸殘基代替瓜氨酸殘基的同樣結(jié)構(gòu)反應(yīng)。術(shù)語肽或肽樣分子應(yīng)該被解釋 為這樣的結(jié)構(gòu)，其能夠?qū)⒐习彼釟埢蔬f在與本文所述的特異性結(jié)合分子具有免疫反應(yīng)性 的正確情形下，優(yōu)選為其在人類或動物體內(nèi)所表現(xiàn)出的相同情形下，優(yōu)選為天然多肽的情 形下?！疤禺愋越Y(jié)合分子”可以是能夠特異性結(jié)合靶化合物的分子、優(yōu)選為小分子，由 DNA、RNA、肽、蛋白結(jié)構(gòu)域、完整蛋白或其組合或其部分構(gòu)成。特異性結(jié)合分子的優(yōu)選實例 是肽或抗體或其部分，例如單鏈可變區(qū)片段(scFv)、抗原結(jié)合區(qū)片段(Fab)、單結(jié)構(gòu)域抗體 (sdab)也稱為VHH抗體、納米抗體(nanobody)(源自于駱駝的單結(jié)構(gòu)域抗體)、或被稱為 VNAR的源自于鯊魚IgNAR的單結(jié)構(gòu)域抗體片段或其其他活性組分、Anticalin或適體(DNA 或RNA)。在優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合分子是包含抗體或適體、例如采取DNA或RNA形式 的適體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在更優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合分子包含抗體或 其衍生物，例如抗體片段、納米抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體或其活性部分。因此，本發(fā)明尤其涉及如 上所述的作為肽或抗體的特異性結(jié)合分子。術(shù)語“抗體”是指能夠特異性結(jié)合通常被稱為“抗原”的靶分子的蛋白或多肽。抗 體(也稱為免疫球蛋白)是在脊椎動物的血液或其他體液中發(fā)現(xiàn)的Y球蛋白，并被免疫系 統(tǒng)用來識別和中和外來物體例如細(xì)菌和病毒?？贵w典型地由基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，每個結(jié)構(gòu)單元具有兩條大的重鏈和兩條小的輕 鏈，以形成例如具有一個單元的單體、具有兩個單元的二聚體或具有五個單元的五聚體?？?體由一種被稱為B細(xì)胞的白細(xì)胞產(chǎn)生。存在幾種不同類型的抗體重鏈，以及幾種不同類型 的抗體，其根據(jù)它們所具有的重鏈分組成不同的同種型。在哺乳動物中已知有五種不同的 抗體同種型，它們執(zhí)行不同功能，并幫助指導(dǎo)針對它們所遇到的每種不同類型的外來物體 的適合的免疫應(yīng)答。某些動物物種例如駱駝(例如美洲駝)和鯊魚可能具有異常的抗體結(jié) 構(gòu)。盡管所有抗體的通用結(jié)構(gòu)非常相似，但是位于蛋白頂端的小區(qū)域極端可變，使數(shù) 百萬具有輕微差異的頂端結(jié)構(gòu)的抗體得以存在。該區(qū)域被稱為高變區(qū)。每個這些變體能夠 與不同的被稱為抗原的靶結(jié)合。抗體的這種巨大的多樣性允許免疫系統(tǒng)識別同樣廣泛的抗原多樣性。抗原被抗體所識別的獨特部分被稱為表位。這些表位與它們的抗體以高度特異 性的相互作用結(jié)合，這允許抗體只識別和結(jié)合它們在構(gòu)成有機體的數(shù)百萬種不同分子中的 獨特抗原?？乖豢贵w的識別使其帶上標(biāo)簽，用于被免疫系統(tǒng)的其他部分攻擊?？贵w也可 以直接中和靶，例如與病原體引起感染所需的部分結(jié)合。抗體的大量和多樣性群體，由一組編碼不同抗原結(jié)合位點(或互補位)的基因區(qū) 段的隨機組合產(chǎn)生，并繼之通過該抗體基因區(qū)域中的隨機突變產(chǎn)生進(jìn)一步的多樣性?？贵w 基因也在被稱為類別轉(zhuǎn)換的過程中重新組織，該過程將重鏈的基礎(chǔ)改變成另一種，產(chǎn)生保 留有抗原特異性可變區(qū)的不同的抗體同種型。這允許單個抗體被免疫系統(tǒng)的幾個不同部分 以幾種不同的同種型使用。本文中使用的術(shù)語“抗體”包括單鏈抗體、抗原結(jié)合區(qū)片段、重組產(chǎn)生的抗體、單克 隆抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體等。在抗體或其他特異性結(jié)合分子的情形下，術(shù)語“或其部分”是指抗體或特異性結(jié)合 分子，其構(gòu)成抗體或特異性結(jié)合分子的特異性結(jié)合位點的部分，并可以被解釋為是抗體或 特異性結(jié)合分子仍然能夠與整個抗體或特異性結(jié)合分子所反應(yīng)的相同表位進(jìn)行反應(yīng)的部 分。在本發(fā)明中可以使用所有種類的特異性結(jié)合分子及其衍生物，例如抗體、包含抗 體的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、適體、抗體片段、單結(jié)構(gòu)域抗體片段、其他蛋白類結(jié)合 結(jié)構(gòu)域例如anticalin，以及特異性結(jié)合瓜氨酸化表位的小分子。但是，人類抗體或其片段 是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。優(yōu)選使用具有IgGl重鏈和λ輕鏈的IgGl (例如IgGlX)抗 體。但是，其他人類抗體同種型也被本發(fā)明所涵蓋，包括與κ或λ輕鏈組合的IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgAU IgA2、IgAsec、IgD和IgE0此外，所有源自動物的各種不同同種型的抗體 也可用于本發(fā)明?？贵w可以是全尺寸抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，包括Fab、F(ab’)2、單鏈 Fv片段或單結(jié)構(gòu)域VHH、VH或VL單結(jié)構(gòu)域?！芭c瓜氨酸化表位反應(yīng)的特異性結(jié)合分子”應(yīng)該被解釋為是在較大結(jié)構(gòu)例如肽或 肽核酸或適體或肽模擬結(jié)構(gòu)的情形下，與瓜氨酸殘基特異性反應(yīng)的特異性結(jié)合分子。瓜氨酸是在翻譯過程中不摻入到蛋白質(zhì)中的一種氨基酸，但是，它可以通過精氨 酸殘基被肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD)的翻譯后修飾所產(chǎn)生。瓜氨酸化是由肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD)催化的精氨酸殘基向瓜氨酸殘基的翻 譯后轉(zhuǎn)化。肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD;EC 3.5.3. 1 催化蛋白中精氨酸殘基向瓜氨酸殘 基的轉(zhuǎn)化。對于瓜氨酸來說不存在tRNA，蛋白中瓜氨酸殘基的存在完全是翻譯后修飾的結(jié) 果。在哺乳動物(人類、小鼠和大鼠)中已經(jīng)鑒定到5種PAD同種型(PAD1-PAD6 ;“PAD4” 和“PAD5”被用于同一個同種型)，各由不同基因編碼(Vossenaar等，Bioessays 25， 1106-1118，2003)。所有這些酶的活性強烈地依賴于Ca2+的存在，并且不能將游離L-精氨 酸轉(zhuǎn)變成游離L-瓜氨酸。游離L-精氨酸可以被真核生物中的氧化氮合酶(EC 1. 14. 13. 39) 或細(xì)菌中的精氨酸脫亞氨酶(EC 3. 5. 3. 6)轉(zhuǎn)化成游離L-瓜氨酸。這些酶不是Ca2+依賴 性的。高度同源的PAD酶之間的最顯著差異是它們的組織特異性表達(dá)。在表皮中， PADl (異名PAD I、I型PAD)在角質(zhì)細(xì)胞分化的最后階段中參與角蛋白絲的瓜氨酸化， 其對于角質(zhì)化包膜的重新組織是重要的。表皮中的另一個瓜氨酸化位點是毛囊，其含有PAD3(異名為PAD III、III型PAD)及其天然底物毛透明蛋白(THH)。THH是毛囊的內(nèi)根鞘 細(xì)胞和髓質(zhì)層以及較低程度上其他特化表皮的主要結(jié)構(gòu)蛋白。最近鑒定到的PAD同種型 PAD6(異名ePAD)被發(fā)現(xiàn)在小鼠卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)片層中，其在早期胚胎發(fā)生中發(fā)揮重要 作用。其人類直系同源物的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)僅限于卵巢、睪丸和外周血白細(xì)胞(Chavanas等， Gene vol 330 ； 19-27, 2004)。最初，這種PAD同種型被命名為ePAD，但是根據(jù)其他PAD的 系統(tǒng)編號，這種同種型被重新命名為PAD6 (Vossenaar等，Bioessays vol 25 1106-1118， 2003)。最廣泛表達(dá)的同種型PAD2(異名PAD II、II型PAD、PAD_H19)存在于許多不同組織， 例如骨骼肌、腦、脾、分泌腺和巨噬細(xì)胞中。盡管具有這種廣泛的表達(dá)樣式，但鑒定到的天然 底物只有髓鞘堿性蛋白(MBP)和波形蛋白。在多發(fā)性硬化(MS)中，患者發(fā)生針對MBP的自 身免疫應(yīng)答。MBP是髓鞘的一種豐富蛋白，其瓜氨酸化發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中。 在鈣離子載體誘導(dǎo)的人類和小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡過程中，觀察到了波形蛋白的瓜氨酸化， 并且如上所述，已顯示瓜氨酸化的波形蛋白是RA特異性抗Μ自身抗體的靶。與上面討論 的都主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)中的PAD相反，PAD4同種型(異名PAD IV、IV型PAD、HL_60PAD、 PAD V、V型PAD、PADI4)定位于核中。在PAD4蛋白的N-末端區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了 PAD4的核定位 信號。PAD4主要表達(dá)在外周血粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中。PAD4在核中的底物是組蛋白核心蛋 白(H2A、H3和H4)和核仁磷酸蛋白/B23，一種在核糖體組裝、核細(xì)胞質(zhì)運輸和中心體復(fù)制 中發(fā)揮作用的核仁蛋白。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子針對pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位，這兩種多肽的 特征為其分子量分別為15kDa和17kDa。已發(fā)現(xiàn)這種特異性結(jié)合分子特別適合于炎性疾病的治療或預(yù)防。本文中使用的“炎性病癥”或“炎性疾病”是指眾多病癥或疾病中的任一種，其特 征在于血管性變化浮腫和嗜中性細(xì)胞浸潤(例如急性炎性反應(yīng))；組織被單核細(xì)胞浸潤； 組織被炎性細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞及其細(xì)胞產(chǎn)物破壞；以及嘗試通過結(jié)締組織替換進(jìn)行修復(fù) (例如慢性炎性反應(yīng))。這種病癥的代表性實例包括與瓜氨酸相關(guān)的炎性疾病和自身免疫疾病。在本文 中，與瓜氨酸相關(guān)的炎性疾病被定義為其中瓜氨酸化在疾病的發(fā)病機理中發(fā)揮作用的疾 病。瓜氨酸化在疾病的發(fā)病機理中是否發(fā)揮作用，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本技術(shù)領(lǐng)域 中可用的常規(guī)測試容易地確定。例如，這些疾病的特征可能是在受影響或患病的相關(guān)組織 中存在異常水平的瓜氨酸化蛋白。這可以通過在其中使用患病組織作為抗原的免疫測試?yán)?如western印跡或ELISA來完成，并且抗原的瓜氨酸化可以使用本文所述的抗瓜氨酸化抗 體來檢測?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用例如質(zhì)譜分析來比較來自患病患 者的患病和健康組織的瓜氨酸化水平和類型。疾病也可以通過針對含瓜氨酸的肽或蛋白的免疫應(yīng)答的存在來定性。這可以是體 液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，例如由T-細(xì)胞或B-細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。用于檢測抗瓜氨酸抗體的測試 在本技術(shù)領(lǐng)域中已被描述并可商購。因此，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防與瓜氨酸相關(guān)的炎性疾病的特異性結(jié)合分子。這樣的疾病是例如炎性關(guān)節(jié)炎包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮 癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、阿茨海默氏病、自體免疫性肝炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、唐氏綜合征、多系統(tǒng)萎縮癥、帕金森氏癥和路易體癡呆癥。因此，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防 疾病的特異性結(jié)合分子，所述疾病選自關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮 癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、阿茨海默氏病、自體免疫性肝炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、唐 氏綜合征、多系統(tǒng)萎縮癥、帕金森氏癥和路易體癡呆癥。具體來說，本發(fā)明涉及用于自身免疫疾病、更具體為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的 治療或預(yù)防的特異性結(jié)合分子。多發(fā)性硬化或MS是CNS的慢性炎性病癥，其特征為自體免疫介導(dǎo)的髓鞘的破壞。 髓鞘的細(xì)胞在軸突周圍形成由比例約為31的脂類-蛋白復(fù)合物構(gòu)成的多個雙層結(jié)構(gòu)。 兩種主要蛋白MBP和蛋白脂質(zhì)蛋白，占蛋白部分的85%。MBP是高度陽離子性蛋白，能夠 與帶負(fù)電荷的磷脂例如磷脂酰絲氨酸形成強的相互作用。在健康成年人的約18%的MBP 分子中，(19個中的)6個精氨酸被瓜氨酸化(Wood等，J Biol Chem，vol264，5121-5127， 1989，Wood 等，Ann Neurol，vol40，18-24，1996)。剩余的 MBP 分子不含瓜氨酸。在 MS 患者 中，MBP-cit6的比例增加到總MBP的45%。MBP_cit6的凈正電荷減少引起MBP分子的部 分解折疊，并減弱了它們與磷脂的相互作用(Boggs等，J Neurosci Res, vol57，529-535， 1999，Pritzker 等，Biochemistry, vol39，5374-5381，2000)。盡管 MBP_cit6 與未瓜氨酸 化的MBP相比能夠更快地形成脂類復(fù)合物，但形成的復(fù)合物不像未瓜氨酸化的MBP所形成 的復(fù)合物那樣緊密堆積(Boggs 等，J Neurosci Res, vol57, 529-535,1999, Beniac 等，J Struct Biol, voll29，80-95，2000)。與未瓜氨酸化的MBP相比，MBP_cit6被組織蛋白酶 D降解的速度快4倍(Cao等，Biochemistry, vol38，6157-6163，1999)。在罕見的急性爆 發(fā)性MS (Marburg型)病例中，80%的MBP蛋白被嚴(yán)重瓜氨酸化(MBPcitl8) (Wood等，Ann Neurol, vol40,18-24，1996)。嚴(yán)重解折疊的MBP_citl8與正常MBP相比被組織蛋白酶D降 解的速度快45倍(Cao等，Biochemistry, vol38，6157-6163，1999)。使用抗癌藥物紫杉醇 (taxol)的活性成分多西紫杉醇(paclitaxel)的臨床試驗正在進(jìn)行之中(0’ Cormor等， Ann Neurol, vol46,470,1999)。低劑量的多西紫杉醇能夠在體外抑制MBP被PAD2的瓜氨 酸化(Pritzker 等，Biochim Biophys Acta, voll388，154-160，1998)。用多西紫杉醇治 療減弱了臨床癥狀，并誘導(dǎo)受損髓鞘的髓鞘重新形成(Moscarello等，Mult Scler, vol8, 130138，2002)，強調(diào)了 PAD作為脫髓鞘疾病中的候選因子的可能的重要性(Moscarello等， JNeurochem, vol81，335-343，2002)。在牛皮癬中，角質(zhì)細(xì)胞非?？斓卦鲋?，并在僅僅約4天內(nèi)就從基底層轉(zhuǎn)移到表面。 皮膚不能足夠快地脫去這些細(xì)胞，因此它們積累成厚的、干燥的碎片或斑點。在正常的角質(zhì) 細(xì)胞中，角蛋白Kl在終端分化過程中被PADl瓜氨酸化。該過程導(dǎo)致角蛋白絲變得更加緊 湊，這對于表皮的正常角質(zhì)化過程是必需的。在牛皮癬過度增殖性斑中的角質(zhì)細(xì)胞不含瓜 氨酸化的角蛋白 Kl (Ishida-Yamamoto 等，J Invest Dermatol，vol 1 14，701-705，2000)。 還不清楚是增加的細(xì)胞增殖阻止了被PAD充分地瓜氨酸化，還是PAD的失活允許角質(zhì)細(xì)胞 過度增殖和積累。盡管機制還不了解，但牛皮癬表皮中異常的瓜氨酸化顯然與PADl相關(guān)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物所采用的形式選自水性溶液、凝膠、水凝膠、 薄膜、糊劑、霜劑、噴劑、軟膏或包扎物。在其他實施方案中，上述方法被用于通過選自關(guān)節(jié) 內(nèi)、腹膜內(nèi)、表面、直腸、靜脈內(nèi)、口腔、眼部或腫瘤的切除邊緣的途徑給藥本文所述的組合 物。
在某些實施方案中，可藥用載體包含至少一種選自下列的載體助溶劑溶液、脂 質(zhì)體、膠團(tuán)、膠束、納晶、納粒、乳液、微粒、微球、納球、納膠囊、聚合物或聚合載體、表面活性 劑、懸浮劑、絡(luò)合劑例如環(huán)糊精或吸附性分子例如白蛋白、表面活性粒子和螯合劑。在其他 實施方案中，多糖包含透明質(zhì)酸及其衍生物、葡聚糖及其衍生物、纖維素及其衍生物(例如 甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、醋 酸琥珀酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素)、殼聚糖及其衍生物、 β -葡聚糖、阿糖基木聚糖、卡拉膠、果膠、糖原、巖藻聚糖(fucoidan)、軟骨素、皮膚素、乙 酰肝素、肝素、戊聚糖、角質(zhì)素、藻酸鹽、環(huán)糊精及其鹽和衍生物，包括其酯和硫酸鹽。另一方面，本發(fā)明的方法包含將本發(fā)明的組合物投送到靶位點、尤其是滑膜關(guān)節(jié)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，特異性結(jié)合分子與單克隆抗體MimAb2. 102、 RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 禾口 RhmAb2. 107競爭與pl5和/或pl7的結(jié)合。單克隆抗體RhmAb2. 101、RhmAb2. 103 和 RhmAb2. 104、RmmAbL 101、RmmAbL 103 和 RmmAbl. 104的可變區(qū)的一級mRNA序列已經(jīng)公開，并在表1中所示的登記號下保存在EMBL 數(shù)據(jù)庫中。單克隆抗體RhmAb2. 102,RmmAbl. 102、RhmAb2. 105和RhmAb2. 107的可變區(qū)的一 級序列在本文中公開在 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41 和 SEQ ID NO :42 中。因此，本發(fā)明涉及包含 SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 17,SEQ ID N0: 19,SEQ ID NO 39,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41 和 SEQ ID NO 42 的可變區(qū)重鏈或輕鏈的 多肽。本發(fā)明還涉及 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 39, SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO 42 的多肽的編碼核酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合分子是選自單克隆抗體RhmAb2. 102、 RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 禾口 RhmAb2. 107 的抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合分子包含源自于抗體的VH和/或VL結(jié) 構(gòu)域，所述抗體選自單克隆抗體 RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、 RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子基本上可以通過兩種方式產(chǎn)生。首先，它們可以源自于 本文提出的抗體及其序列。甚至可以通過定點突變、鏈改組、有性PCR(sexUal PCR)或通過 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于抗體衍生和最適化的其他手段，來增加抗體的反應(yīng)性?；蛘?， 特異性結(jié)合分子、特別是抗體，可以通過使用任何本文所述的特異反應(yīng)性表位、特別是PAD4 處理的組蛋白2AJil(SEQ ID N0:21)和其他特定的反應(yīng)性肽進(jìn)行淘選來獲得。
就此而言，術(shù)語“衍生”是指鑒定到特定抗體中造成VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的特異性 結(jié)合性質(zhì)的必需殘基，然后將這些必需殘基轉(zhuǎn)移到另一個肽的背景中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本文描述的序列克隆或產(chǎn)生cDNA或基因組序 列，例如在下面的實施例中所描述的。將這些序列克隆在適合的真核表達(dá)系統(tǒng)例如 pcDNA3 (InVitrogen)或其衍生物中，然后與含有適合的輕鏈和重鏈的載體相組合雙重轉(zhuǎn)染 哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)，將導(dǎo)致所列抗體RhmAb2. 101,2. 102,2. 103,2. 104,2. 105 和 / 或 2. 107 以及 RmmAbl. 101、1. 102、1. 103、1. 104 的表達(dá)和分泌。
通過使用抗體序列的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域并將它們表達(dá)在不同背景例如多肽、例如 融合蛋白中，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以制造本文所描述的特異性結(jié)合分子的類似物。這在本 技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。重組的人類和小鼠單克隆抗瓜氨酸抗體按照實施例1和15中的描述獲得。獲得 的單克隆抗體具有人類 IgGl Fc 區(qū)(RhmAb2. 101、RhmAb2. 102、RhmAb2. 103、RhmAb2. 104、 RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107)和小鼠 IgG2a Fc 區(qū)(RmmAbl· 101、RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和 RmmAbl. 104)。人類和小鼠重組抗體對(RhmAb2. 101 與 RmmAbl. 102，RhmAb2. 102 與 RmmAbl. 102,RhmAb2. 103 與 RmmAbl. 103，以及 RhmAb2. 104 與 RmmAbl. 104)含有一致的 VH和 VL結(jié)構(gòu)域，但是分別含有人類IgGl (SEQ ID NO 14)或小鼠IgG2a Fc結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 20)。在western印跡上對三對小鼠和人類單克隆抗體進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)每對抗體對它們 相應(yīng)的抗原都具有相同的特異性。小鼠單克隆抗瓜氨酸肽抗體RmmAbl3. 101、RmmAb 13. 102和RmmAbl3. 103從商 業(yè)來源獲得(ModiQuest Research BV Nijmegen,荷蘭；目錄號 MQ13. 101、MQ13. 102 和 MQ13. 103)?？构习彼峥贵w在實驗?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行測試，在該模型中通過將抗膠原蛋白抗體注 入小鼠誘導(dǎo)了炎癥。該模型被稱為膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CAIA) (Nandakumar和 Holmdahl, J Immunol Methods，vol304，126-136，2005)?？鼓z原蛋白抗體從商業(yè)來源獲得 (ModiQuest Research BV Ni jmegen，荷蘭；目錄號 MQ18. 101)。小鼠單克隆抗瓜氨酸抗體RmmAbl3. 101、RmmAb 13. 102和RmmAbl3. 103被證實增 加了膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性，正如也被Kuhn等(J.Clin. Invest, volll6, 961-871,2006)和 Hill 等(J Exp Med, vol 205，967-979，2008)所描述的。這顯示在圖 Ia 和Ib中。此外，在人類患者中進(jìn)行了幾項研究表明，針對瓜氨酸化表位的抗體增加了 RA的 病理發(fā)生(Masson-Bessiere 等，J. Immunol, vol 166，4177-4184，2001 ；Vossenaar 禾口 van Venrooij,Arthritis Res Ther，vol6，107-111，2004)。這顯示在圖 Ia 和 b 中，其分別顯示 了同一個實驗的“平均關(guān)節(jié)炎分值”和“關(guān)節(jié)炎發(fā)生率”。但是，令人吃驚的是，人類單克隆抗體RhmAb2. 104和RhmAb2. 105在實驗CAIA模 型中減輕了關(guān)節(jié)炎的臨床征兆，而RhmAb2. 103、RhmAb2. 102和RhmAb2. 107在實驗CAIA模 型中甚至消除了關(guān)節(jié)炎的臨床征兆。RhmAb2. 103和RhmAb2. 102的表現(xiàn)相同，只有使用RhmAb2. 102獲得的結(jié)果顯示在 圖Ic和Id中。使用RhmAb2. 105和RhmAb2. 107獲得的結(jié)果顯示在

圖10中。人類單克隆抗體RhmAb2. 101在所使用劑量下對關(guān)節(jié)炎的臨床征兆完全沒有影 響。在該實驗中，使用可商購抗體RhmAb2. 201作為無關(guān)的抗體對照(ModiQuest Research B. V.，目錄號MQR2. 201)。該抗體不識別瓜氨酸化的表位。也使用等價的小鼠Fc IgG2a 單克隆抗體 RmmAbl. 101、RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和RmmAbl. 104進(jìn)行了同樣的實驗，這些抗體含有與它們的人類對應(yīng)物相同的VH和VL結(jié) 構(gòu)域，并且也識別與它們的人類對應(yīng)物相同的表位。獲得了與它們的人類對應(yīng)物相同的 結(jié)果。RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和 RmmAbl. 104 消除(RmmAbl. 102、RmmAbl. 103)或減輕 (RmmAbl. 104)關(guān)節(jié)炎的臨床征兆，而RmmAbl. 101完全沒有影響。
圖Ie和If顯示了獨立的CAIA實驗，在其中對RhmAb2. 102的臨床劑量進(jìn)行了評 估。提供最大抑制的最低劑量是0. 5mg Ab/小鼠，其對應(yīng)于IP注射時^mg/kg。從這些實驗可以得出結(jié)論，被選自RhmAb2. 102、RhmAb2. 103、RhmAb2. 104、 RmmAbl. 102、RmmAbl. 103、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的單克隆抗體所識別的特異性表位，在炎性疾病的治療或預(yù)防中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步分析這些單克隆抗體所識別的抗原或多種抗原，測試了它們對實施 例3中所描述的使用肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD酶)脫亞氨的細(xì)胞提取物的反應(yīng)性。將含 有裂解后脫亞氨的hPAD2或hPAD4轉(zhuǎn)染的C0S-1裂解物的Wfestern印跡，與單克隆抗體 RhmAb2. 101、RhmAb2. 102、RhmAb2. 103 和 RhmAb2. 104 溫育。觀察到只有與 RhmAb2. 102、 RhmAb2. 103和RhmAb2. 104溫育的條板，才顯示出與分子量約為15和17千道爾頓的雙重蛋 白的反應(yīng)性。WO 2004/078098公開了對瓜氨酸化肽/11類MHC復(fù)合物特異的抗體，用于抑制T 細(xì)胞活化。這些抗體不結(jié)合單獨的肽或II類MHC分子，而是只結(jié)合肽與II類MHC分子的 復(fù)合物。本文公開的抗體與W02004/078098中公開的抗體不同，因為正如本文中所公開， 它們識別單獨的肽和蛋白。此外，抗體識別western印跡中可能不是肽與II類MHC分子 之間的復(fù)合物的多肽，因為MHC分子與瓜氨酸化肽之間的復(fù)合物在免疫印跡過程中使用 的SDS凝膠的還原性條件下永遠(yuǎn)不能殘存。因此，本文公開的結(jié)合分子所識別的表位與WO 2004/078098中公開的抗體不同。此外，本文公開的抗體不與肽和II類MHC分子的復(fù)合物 特異性反應(yīng)。上面描述的實驗和考慮引導(dǎo)我們得出結(jié)論，在預(yù)防炎性疾病的臨床征兆的能力和 與pl5和pl7上瓜氨酸化表位的反應(yīng)性之間，存在明顯的相關(guān)性。當(dāng)在免疫沉淀實驗中使用人類單克隆抗體RhmAb2. 101、RhmAb2. 102、RhmAb2. 103 和 RhmAb2. 104 以及小鼠單克隆抗體 RmmAbl. 101、RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和 RmmAbl. 104時獲得了類似的數(shù)據(jù)，正如在實施例5中詳細(xì)描述的。使用RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103 和 RmmAbl. 103 在人類 PAD2 和 PAD4 脫亞氨的C0S-1裂解物上進(jìn)行的免疫沉淀顯示出了明顯的P15和P17蛋白條帶。當(dāng)使用 RhmAb2. 104和RmmAbl. 104進(jìn)行免疫沉淀時，這些條帶的顯著性略微降低。因此，識別pl5和pl7蛋白的強度似乎與這些抗體的治療性質(zhì)很好地相關(guān)(圖 la-d) ο抗體與pl5或pl7是否反應(yīng)，可以通過如實施例4和5中所詳述的進(jìn)行免疫沉淀 或western印跡分析容易地確定。或者，可以使用如實施例6中所述的含有脫亞氨的C0S-1 裂解物的Western印跡或純化的脫亞氨pl5和/或pl7蛋白，在^festern印跡或ELISA中 進(jìn)行與 RhmAb2. 102、RhmAb2. 103 或 RhmAb2. 104 的競爭實驗。正如在實施例7中詳述的，通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)對蛋白pl5和pl7進(jìn)行了進(jìn)一步表征。因為非洲綠猴的基因組還沒有完全 測序，因此我們篩選了所有其他哺乳動物基因組尋找與使用MALDI-TOF MS所發(fā)現(xiàn)的肽的同 源性。所發(fā)現(xiàn)的具有高度同源性的蛋白被證明是組蛋白。這顯示在表3(實施例7)中。因此，本發(fā)明還涉及與組蛋白上的瓜氨酸化表位特異性反應(yīng)的結(jié)合分子，用于炎 性疾病的治療或預(yù)防。
通過PAD的酶學(xué)作用使組蛋白瓜氨酸化已被證實，因此可以在體外非常好地生 產(chǎn)瓜氨酸化組蛋白。然后可以將這些瓜氨酸化組蛋白在酶結(jié)合測定法中用作底物，以篩 選和選擇其他與瓜氨酸化P15和pl7、即組蛋白上的表位反應(yīng)的特異性結(jié)合分子，例如肽 和抗體。優(yōu)選情況下，選擇與抗體 RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、 RhmAb2. 104,RmmAbl. 104 和 RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 競爭與 pl5 和 / 或 pl7 結(jié)合的特異 性結(jié)合分子。在本文件及其權(quán)利要求書中，動詞“包含”及其各個變化形式以其非限制性的意義 使用，意味著包括了該詞之后的條目，但是并不排除沒有具體提到的條目。此外，由單數(shù)形 式指稱的要素不排除存在一個以上要素的可能性，除非上下文明確要求存在一個并且只有 一個要素。因此，單數(shù)形式的指稱通常意味著“至少一個”。為了進(jìn)一步分析哪種或哪些脫亞氨組蛋白參與RhmAb2. 102和RhmAb2. 104的治療 作用，使用人類肽酰精氨酸脫亞氨酶(PAD，EC3. 5. 3. 15) (huPAD2或huPAD4)對可商購的組 蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4)進(jìn)行了脫亞氨。將脫亞氨以及未脫亞氨的組蛋白包被在96孔 ELISA板上，并與連續(xù)稀釋的RhmAb2. 101、RhmAb2. 102和RhmAb2. 104溫育。結(jié)果顯示在表 6和圖2中。從圖2中顯示的結(jié)果可以明顯看出，huPAD4脫亞氨的組蛋白2A(H2A/p4)被治療 性抗體RhmAb2. 102和RhmAb2. 104最好地識別，但是不被RhmAb2. 101識別(圖2a、2b和 2c)。此外，如果與RhmAb2. 104相比，RhmAb2. 102對H2A/p4具有較高親和性(圖沘和 2c)。這些數(shù)據(jù)與這些抗體在實驗CAIA模型中對關(guān)節(jié)炎的臨床征兆的影響關(guān)聯(lián)性良好，其 中RhmAb2. 102消除、RhmAb2. 104減輕了關(guān)節(jié)炎的臨床征兆，而RhmAb2. 101對其沒有影響 (圖 Ic 和 Id)。因此，我們顯示，H2A/p4上的脫亞氨表位或其結(jié)構(gòu)模擬物在RA炎性級聯(lián)反應(yīng)中發(fā) 揮關(guān)鍵作用。對于H3/p2、H4/p2和H4/p4上的脫亞氨表位也同樣如此，因為RhmAb2. 102與 RhmAb2. 104和RhmAb2. 101相比，顯示出對這些組蛋白的更高的親和性(圖2a、2b和2c)。模擬物是例如具有可接受水平的等效活性的分子，所述等效活性在這種情況下包 括以與RhmAb2. 104和RhmAb2. 101相比更高的親和性被RhmAb2. 102識別。因此，本發(fā)明涉及如上所述的特異性結(jié)合分子，其與人類PAD4脫亞氨化的人類組 蛋白2A或組蛋白4或人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4或組蛋白H3上的瓜氨酸化表位 反應(yīng)。為了進(jìn)一步精確定位H2A上被RhmAb2. 102和RhmAb2. 104識別的精確瓜氨酸化 表位，合成了含有所有13種可能的組蛋白2A脫亞氨位點的生物素標(biāo)記的肽(表4)。將這 些肽包被在96孔中性鏈親和素-ELISA板上，并與連續(xù)稀釋的RhmAb2. 101、RhmAb2. 102和 RhmAb2. 104溫育。結(jié)果顯示在圖3中。
權(quán)利要求
1.與pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位特異性反應(yīng)的結(jié)合分子，其用于炎性疾病的預(yù) 防或治療。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其與人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白2A或組蛋白4、或人 類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4或組蛋白H3上的瓜氨酸化表位特異性反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的結(jié)合分子，其與選自SEQID N0:21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :37和SEQ ID NO 38的肽特異性反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1-3的結(jié)合分子，其用于治療或預(yù)防與瓜氨酸相關(guān)的炎性疾病。
5.權(quán)利要求1-4的結(jié)合分子，其用于預(yù)防或治療選自下列的疾病自身免疫疾病、關(guān)節(jié) 炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、阿茨海默氏病、自體免 疫性肝炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、唐氏綜合征、多系統(tǒng)萎縮癥、帕金森氏癥和路易 體癡呆癥、克羅恩病和格林巴利綜合征。
6.權(quán)利要求1-5的結(jié)合分子，其用于預(yù)防或治療自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
7.權(quán)利要求1-6的結(jié)合分子，其是抗體或肽。
8.權(quán)利要求7的結(jié)合分子，其是選自單克隆抗體RhmAb2.102、RmmAbl. 102、 RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的抗體。
9.權(quán)利要求1-7的結(jié)合分子，其與選自RhmAb2.102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、 RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的單克隆抗體競爭與選 自pl5、pl7的分子，人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人類PAD4脫 亞氨化的人類組蛋白4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4、人類PAD2脫亞氨化的人類組 蛋白H3上的瓜氨酸化表位，選自表7的名單的蛋白和SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的肽結(jié)合。
10.權(quán)利要求1-7的結(jié)合分子，其包含源自于抗體的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗體選自 單克隆抗體 RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、 RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107。
11.權(quán)利要求10的結(jié)合分子，其是抗體或多肽。
12.權(quán)利要求11的結(jié)合分子，其是重組肽或單鏈抗體。
13.權(quán)利要求10-12的結(jié)合分子，其包含單鏈可變區(qū)片段(scFv)、抗原結(jié)合區(qū)片段 (Fab)、單結(jié)構(gòu)域抗體(sdab)或VHH抗體或納米抗體(nanobody)，例如源自于駱駝的單結(jié)構(gòu) 域抗體或源自于鯊魚IgNAR的單結(jié)構(gòu)域抗體片段(VNAR)、Anticalin或適體。
14.一種用于預(yù)防或治療炎性疾病的方法，包括向需要的患者給藥治療有效量的抗炎 癥組合物，所述組合物包含結(jié)合分子，所述結(jié)合分子與選自Pl5、pl7分子上的瓜氨酸化表 位，人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人類PAD4脫亞氨化的人類組 蛋白4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H3上的瓜 氨酸化表位，以及 SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38的肽特異性反應(yīng)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中結(jié)合分子與選自RhmAb2.102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、 RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的單克隆抗體競爭與選 自pl5、pl7的分子，人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人類PAD4脫 亞氨化的人類組蛋白4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H3上的瓜氨酸化表位，選自表7的名單的蛋白和SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的肽結(jié)合。
16.一種多肽，其包含SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID N0:17、EQ ID NO :19、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO 41 和 SEQ ID NO 42 所示的可變重鏈或可變輕鏈。
17.編碼權(quán)利要求16的多肽的核酸。
18.—種通過引發(fā)體內(nèi)免疫應(yīng)答來預(yù)防或治療炎性疾病的方法，其中產(chǎn)生了與選自下 列的表位反應(yīng)的特異性結(jié)合分子pl5、pl7上的瓜氨酸化表位，人類PAD4脫亞氨化的人類 組蛋白2A、人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4、人類 PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :37 和 SEQ ID NO 38 的月太。
19.權(quán)利要求18的方法，其中向需要的患者給藥組合物，所述組合物包含選自下列的 活性成分pl5，pl7上的瓜氨酸化表位，人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白2A、人類PAD4脫 亞氨化的人類組蛋白4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4、人類PAD2脫亞氨化的人類組 蛋白 H3 上的瓜氨酸化表位，以及 SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 24, SEQ ID N026、SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO :38 的肽。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中炎性疾病選自自身免疫疾病、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、阿茨海默氏病、自體免疫性肝炎、幼年 特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、唐氏綜合征、多系統(tǒng)萎縮癥、帕金森氏癥和路易體癡呆癥。
21.權(quán)利要求20的方法，其中炎性疾病是自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
22.權(quán)利要求18-21的方法，其中特異性結(jié)合分子是抗體。
23.一種用于炎性疾病的治療或預(yù)防的組合物，其能夠在體內(nèi)引起針對選自下列的瓜 氨酸化表位的特異性免疫應(yīng)答pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位，人類PAD4脫亞氨化的 人類組蛋白2A、人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H4、 人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的月太。
24.權(quán)利要求23的組合物，其包含選自下列的活性成分pl5，pl7上的瓜氨酸化表位， 人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白2A、人類PAD4脫亞氨化的人類組蛋白4、人類PAD2脫亞氨 化的人類組蛋白H4、人類PAD2脫亞氨化的人類組蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的月太。
25.權(quán)利要求23或?qū)Φ慕M合物，其中炎性疾病選自自身免疫疾病、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、阿茨海默氏病、自體免疫性肝炎、幼年 特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、唐氏綜合征、多系統(tǒng)萎縮癥、帕金森氏癥和路易體癡呆癥。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中炎性疾病是自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
27.權(quán)利要求23-26的組合物，其中特異性結(jié)合分子是抗體。
28.與pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位特異性反應(yīng)的結(jié)合分子，其用于預(yù)防或治療關(guān) 節(jié)損傷。
29.權(quán)利要求觀的結(jié)合分子，與炎癥抑制劑聯(lián)合給藥。
全文摘要
本發(fā)明屬于治療或預(yù)防人類和動物炎癥的領(lǐng)域，并涉及用于治療或預(yù)防各種炎性病癥的藥物組合物和方法。具體來說，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療炎性病癥例如瓜氨酸相關(guān)的炎性疾病的組合物和方法。本發(fā)明提供了用于炎性病癥的治療和預(yù)防的針對含瓜氨酸表位的特異性結(jié)合分子。
文檔編號C07K16/18GK102056944SQ200980121091
公開日2011年5月11日 申請日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日
發(fā)明者約瑟夫·瑪利亞·亨德里克·拉茨, 雷納多·杰勒杜斯·希爾瓦諾·齊爾里維 申請人:莫蒂克斯特私人有限公司