專利名稱：藥物融合物和綴合物的制作方法
藥物融合物和綴合物本發(fā)明涉及血清半壽期得到改進的藥物融合物和綴合物。這些融合物和綴合物包 含免疫球蛋白(抗體)單一可變結構域(single variable domain)及GLP和/或毒蜥外 泌肽分子。本發(fā)明還涉及包含這類藥物融合物和綴合物的用途、劑型、組合物和裝置。
背景技術：
具有可用于治療和/或診斷目的活性的許多藥物的價值有限，因為當給藥后它們 快速從體內清除。例如，在治療上具有有益活性的許多多肽通過腎快速從循環(huán)中清除。因 此，必需給予大的劑量才能獲得所需要的治療效果。存在對具有改進的藥代動力學性質的 治療藥和診斷藥的需求。在機體或全身循環(huán)中，半壽期短的這類藥物之一是腸降血糖素激素例如胰高血糖 素樣肽1或YY肽以及毒蜥外泌肽，例如毒蜥外泌肽-4。胰高血糖素樣肽(GLP)-I是一種腸降血糖素激素，具有有效的葡萄糖依賴性促胰 島素作用和胰高血糖素抑制作用、對胰β細胞的營養(yǎng)作用以及對胃腸分泌和蠕動的抑制 作用，它把降低血漿葡萄糖和減少血糖波動結合在一起。此外，GLP-I通過其提高飽感的 能力而減少食物攝取，因此限制體重增加，并且甚至可引起體重減輕?？傊?，這些作用賦 予GLP-I獨特的特征，鑒于十分需要抗糖尿病藥，特別是因為其抗高血糖作用的葡萄糖依 賴性，這可使任何嚴重低血糖的風險降到最低。然而，其藥代動力學/藥效動力學特征如 此，以致天然GLP-I并非是治療有益的。因此，雖然GLP-I當連續(xù)給予時是最有效的，但 是一次皮下注射的持續(xù)作用短暫。GLP-I非常容易遭受體內酶的降解，而且與二肽基肽酶 IV(DPP-IV)的切割可能關系最大，因為這種切割快速發(fā)生，并產生非促胰島素代謝物。因此 根據對影響GLP-I代謝穩(wěn)定性和藥代動力學/藥效動力學特征的因素的理解，利用GLP-I 的治療潛力的策略已成為深入研究的焦點。已進行了廣泛的研究工作以期按減緩GLP-I降解同時又保持生物活性的方式抑 制所述肽酶或修飾GLP-I。W005/027978公開了作用特征延長的GLP-I衍生物。W002/46227 公開了包含多肽(例如白蛋白)與GLP-I或類似物(這些類似物的公開內容通過引用 作為可以用于本發(fā)明的GLP-I類似物的實例而結合到本文中)融合的異源融合蛋白。 W005/003^6、W003/060071、W003/059934 公開了氨基融合蛋白(amino fusion protein), 其中GLP-I與白蛋白融合以期延長該激素的半壽期。然而，盡管作了這些努力，但仍未生產出長效的活性GLP-1。因此，特別在糖尿病和肥胖癥領域，存在對改進的GLP-I肽或同樣具有特別適于 治療糖尿病和肥胖癥的促胰島素作用的其它肽(例如毒蜥外泌肽-4)的巨大需求。因此需 要修飾GLP-1、毒蜥外泌肽-4和其它促胰島素肽使其體內作用時間延長同時又保持低毒性 和治療益處。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種組合物，其為融合物或綴合物并且包含以下成分或由以下成分 組成(a)促胰島素藥物或分子、或者腸降血糖素藥物或分子，例如可以是毒蜥外泌肽-4 或GLP-I (例如GLP-1 (7-37)A8G突變體)，作為與(b)的融合物或綴合物存在，(b)DOM7h-14(Vk)結構域抗體(dAb)，其與血清白蛋白特異性結合(D0M幾-14的氨基酸序列見圖 1(h) =SEQ ID NO 8)。還可任選存在將促胰島素藥物或腸降血糖素藥物(例如毒蜥外泌肽-4和/或 GLP-1)與dAb (例如與DOM^1-HdAb)連接的氨基酸接頭或化學接頭。接頭可以是例如螺旋 接頭，例如圖l(k)所示的螺旋接頭序列=SEQ ID NO 11，或者可以是gly-ser接頭，例如具 有

圖1(1)所示的氨基酸序列SEQ ID NO 12。在某些實施方案中，本發(fā)明的融合物(或綴合物)可包含其它的分子，例如其它的 肽或多肽。促胰島素藥物或腸降血糖素藥物(例如毒蜥外泌肽和/或GLP-1)可作為dAb的 N端或C端的融合物(或綴合物)而存在。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含選自以下融合物分子或者由選自以下融合物 分子組成的多肽(a)2xGLP-l(7-37)A8G D0M7h_14 dAb融合物(DATO114，氨基酸序列見圖 1 (a) :SEQ ID NO 1)，(b)毒蜥外泌肽4(G4S接頭)3D0M^i-14 dAb融合物(DAT0115，氨基酸序列見圖 1(b) =SEQ ID NO 2)，(c)毒蜥外泌肽4-D0M7h-14 dAb融合物(DAT0116，氨基酸序列見圖1 (c) =SEQ ID NO 3),(d)毒蜥外泌肽4、螺旋接頭、D0M7h-14 dAb融合物(DAT0117，氨基酸序列見圖 1(d) =SEQ ID NO 4)，(e) GLP-I (7-37) A8G(G4S 接頭)3D0M7h-14 dAb 融合物(DAT0118，氨基酸序列見圖 1(e) =SEQ ID NO 5)，(f) GLP-I (7-37) A8G D0M7h_14 dAb 融合物(DAT0119，氨基酸序列見圖 1 (f) :SEQ ID NO 6)，(g)GLP-I (7-37) A8G、螺旋接頭、D0M7h_14 dAb 融合物(DAT0120，氨基酸序列見圖 1(g) =SEQ ID NO 7)。本發(fā)明還提供包含上述氨基酸序列或由上述氨基酸序列組成的綴合物分子，即具 有由SEQ ID NO 1-7所示的氨基酸序列的綴合物分子。Dom 7h_14是與血清白蛋白結合的人免疫球蛋白單一可變結構域或dAb (Vk)，其 氨基酸序列見圖 1(h) =SEQ ID NO 8。Dom7h_14 dAb 的 CDR 區(qū)在圖 1(h) :SEQ ID NO 8 所示 氨基酸序列中用下劃線表示。本文使用的“融合物”是指包含結合血清白蛋白的DOM^1-H dAb作為第一部分和 促胰島素藥物或腸降血糖素藥物作為第二部分的融合蛋白。結合血清白蛋白的dAb和所述 藥物或藥劑作為單條連續(xù)多肽鏈的離散組成部分(部分)存在。第一部分(dAb)和第二部 分(腸降血糖素藥物或促胰島素藥物)可以通過肽鍵彼此直接結合或者通過合適的氨基酸 或者肽或多肽接頭連接。適當時，可存在額外部分，例如肽或多肽(例如第三、第四肽)和 /或接頭序列。第一部分可位于相對于第二部分的N端位置、C端位置或內部。在某些實施 方案中，融合蛋白含有一個以上(例如1個-約20個)dAb部分。本文使用的“綴合物”是指包含結合血清白蛋白的、促胰島素藥物或腸降血糖素藥物與之共價或非共價結合的dAb的組合物。促胰島素藥物或腸降血糖素藥物可直接與dAb 共價結合，或者通過合適的接頭部分間接結合。藥物或藥劑可以在任何合適的位置上與dAb 結合，例如氨基端、羧基端或通過合適的氨基酸側鏈(例如賴氨酸的ε氨基或半胱氨酸的 巰基)?；蛘?，藥物或藥劑可直接與dAb非共價結合(例如靜電相互作用、疏水相互作用) 或間接結合(例如通過互補結合配偶體(例如生物素和抗生物素蛋白)的非共價結合，其 中一個配偶體與藥物或藥劑共價結合，而互補結合配偶體與dAb共價結合)。本發(fā)明還提供本發(fā)明的任何綴合物或融合物的(基本上)純的單體例如DAT0114、 DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120 的單體。在一個實施方案中，它是 至少98%、99%、99. 5%純或100%純的單體。本發(fā)明還提供編碼本文所述融合物的核酸，例如編碼DAT0114、DAT0115、DAT0116、 DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120 的核酸，以及例如其中在圖 2(SEQ ID NO 13-23)中 所示的核酸序列。本文還提供包含這些核酸的宿主細胞。本發(fā)明另提供用于產生本發(fā)明的融合物的方法，所述方法包括在適于表達所述重 組核酸的條件下維持包含編碼本發(fā)明的融合物的重組核酸和/或構建體的宿主細胞，從而 產生融合物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的融合物或綴合物的組合物(例如藥物組合物)。本發(fā)明還提供用于治療患有疾病或病癥的個體的方法，例如本文所述疾病或病 癥，例如代謝疾病，例如高血糖癥、葡萄糖耐量減低(impaired glucose tolerance), β細 胞缺乏癥、糖尿病(例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖癥或以過食為特征的疾 病，例如它可用于例如普-威綜合征O^ader-Willi syndrome)抑制食欲，并且所述方法包 括給予所述個體治療有效量的本發(fā)明的融合物或綴合物。其它代謝紊亂包括但不限于胰島素抵抗、胰島素缺乏、高胰島素血癥、高血糖癥、 血脂異常(dyslipidemia)、高脂血癥、高酮血癥、高血壓、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、腎 衰竭、神經病(例如自主神經病、副交感神經病和多神經病)、視網膜病、白內障、代謝紊亂 (例如胰島素和/或葡萄糖代謝紊亂)、內分泌障礙、肥胖癥、體重減輕、肝臟疾病(例如肝 病、肝硬化和肝移植相關疾病)以及與這些疾病或病癥有關的病況。另外，可用本發(fā)明的化合物預防或治療的糖尿病相關病癥包括但不限于高血糖 癥、肥胖癥、糖尿病性視網膜病、單神經病、多神經病、動脈粥樣硬化、潰瘍、心臟病、中風、貧 血癥、壞疽(例如腳手壞疽)、陽萎、感染、白內障、腎功能低下、自主神經系統(tǒng)機能障礙、白 細胞功能減低、腕管綜合征、杜普伊特倫攣縮(Dupuytren' s contracture)和糖尿病酮癥 酸中毒。本發(fā)明還提供用于治療或預防與血液葡萄糖升高有關的疾病的方法，所述方法包 括給予患者或受治療者至少一劑本發(fā)明的融合物或綴合物和/或藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的綴合物或融合物調節(jié)患者對胰島素響應性的方法，以 及增加細胞攝取葡萄糖的方法，及調節(jié)細胞對胰島素的敏感性的方法。本發(fā)明還提供刺激 胰島素合成和釋放，提高脂肪、肌肉或肝組織對胰島素攝取的敏感性，刺激葡萄糖攝取，減 慢消化過程，或者阻斷患者中胰高血糖素分泌的方法，所述方法包括給予所述患者本發(fā)明 的融合物或綴合物，例如包括給予至少一劑本發(fā)明的藥物綴合物或融合物和/或藥物組合 物。7
本發(fā)明的融合物或綴合物和/或藥物組合物可以單獨給予或者與其它分子或部 分組合給予，其它分子或部分例如調節(jié)患者的胰島素敏感性、體重、心臟病、高血壓、神經 病、細胞代謝和/或葡萄糖、胰島素或其它激素水平的多肽、治療性蛋白和/或分子(例如 胰島素和/或其它蛋白質(包括抗體))、肽或小分子。在具體的實施方案中，本發(fā)明的綴合 物或融合物與胰島素(或胰島素衍生物、類似物、融合蛋白或促分泌素)組合給予。本發(fā)明還提供本發(fā)明的綴合物或融合物在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的 用途，例如上述任意一種疾病，例如代謝紊亂，例如高血糖癥、糖尿病(1型或2型糖尿病或 妊娠糖尿病)或肥胖癥。本發(fā)明還涉及本文所述的融合物或綴合物用于治療、診斷或預防中的用途。可進一步設計或格式化(formatted)本發(fā)明的融合物或綴合物(例如融合物的 dAb組分)以具有較大的流體動力學尺寸來進一步延長半壽期，例如通過連接PEG基團、血 清白蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或其至少運鐵蛋白結合的部分、抗體Fc區(qū)，或者通過與 抗體結構域綴合。例如，可將結合血清白蛋白的dAb設計成抗體的較大的抗原結合片段(例 如設計成 Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、IgG、scFv)。在本申請公開的本發(fā)明的其它實施方案中，在本發(fā)明的融合物中可以取代使用 "dAb",預期技術人員可以取代使用包含dAb的⑶R(例如Dom7h-14的OTR)的結構域，其 與血清白蛋白結合(例如⑶R嫁接在親和體(affibody)、SpA支架、LDL受體A類結構域或 EGF結構域等合適蛋白質支架或骨架上)。因此，本公開內容從整體來看可解釋為提供這類 結構域代替dAb的公開內容。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含促胰島素藥物或腸降血糖素藥物和雙特異性 配體或多特異性配體的本發(fā)明的融合物或綴合物，其包含結合血清白蛋白的本發(fā)明的第一 dAb (例如Dom7h-14)，以及具有與第一 dAb相同或不同的結合特異性的第二 dAb和任選在 多特異性配體的情況下具有更多的dAb。第二 dAb (或更多的dAb)可任選結合不同的靶標， 例如FgFr lc，或CD5靶標。因此，在一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的融合物或綴合物用于通過胃腸外給藥的 遞送，例如通過皮下、肌內或靜脈內注射、吸入、經鼻遞送、跨黏膜遞送、口服遞送、遞送到患 者的胃腸道、直腸遞送或經眼遞送。在一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的融合物或綴合物在制 備通過下列方式遞送的藥物中的用途皮下注射、吸入遞送、靜脈內遞送、經鼻遞送、跨黏膜 遞送、口服遞送、遞送到患者的胃腸道、直腸遞送或經眼遞送。在一個方面，本發(fā)明提供通過下列方式遞送藥物至患者的方法皮下注射、經肺遞 送、靜脈內遞送、經鼻遞送、跨黏膜遞送、口服遞送、遞送到患者的胃腸道、直腸遞送或經眼 遞送，其中所述方法包括給予患者藥學上有效量的本發(fā)明的融合物或綴合物。在一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的融合物或綴合物的口服劑型、注射劑型、可 吸入劑型、噴霧劑型或眼用劑型。劑型可以是片劑、丸劑、膠囊劑、液體制劑或糖漿劑。在一 個方面，組合物可以口服給予，例如飲料，例如以治療肥胖癥的減肥飲料銷售。在一個方面， 本發(fā)明提供用于直腸遞送給患者的劑型，例如可以提供作為栓劑的劑型。例如，用于胃腸外給予GLP-I化合物的組合物可按照W003/002136 (通過引用結合 到本文)中所述方法制備。例如，用于經鼻給予某些肽的組合物可按照歐洲專利號272097 (屬于Novo8Nordisk A/S)或WO 93/18785 (均通過引用結合到本文)中所述方法制備。術語“受治療者”或“個體”在本文定義為動物，例如哺乳動物，包括但不限于靈長 類(例如人)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科動物、綿羊類、馬科 動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物或鼠科動物種類。本發(fā)明還提供用于給予受治療者(例如患者)本發(fā)明的組合物(例如本發(fā)明的 綴合物或融合物)的藥盒，所述藥盒包括組合物(例如本發(fā)明的綴合物或融合物)、遞藥 裝置和任選使用說明書。組合物(例如綴合物或融合物)可以劑型(例如凍干劑型)提 供。在某些實施方案中，遞藥裝置選自注射器、吸入器、鼻內或眼內給藥裝置(例如噴霧器 (mister)、眼鼻點滴器)和無針注射裝置?？蓪⒈景l(fā)明的組合物(例如綴合物或融合物)凍干以貯存，并在臨用前用合適的 載體復溶?？梢圆捎萌魏魏线m的凍干方法(例如噴霧干燥、烘烤干燥(cake drying))和/ 或復溶技術。本領域技術人員應當了解的是，凍干和復溶可能導致抗體活性不同程度的損 失，需要調節(jié)使用水平來彌補。在具體的實施方案中，本發(fā)明提供包含本文所述凍干(冷凍 干燥)組合物(例如藥物綴合物、藥物融合物)的組合物。優(yōu)選當再水化時，凍干(冷凍干 燥)組合物(例如藥物綴合物、藥物融合物)的活性(例如血清白蛋白的結合活性)損失 不超過約20%、或不超過約25%、或不超過約30%、或不超過約35%、或不超過約40%、或 不超過約45%、或不超過約50%。所述活性是在組合物(例如藥物綴合物、藥物融合物) 凍干之前，產生所述組合物的作用所需要的量。例如，要達到和維持所需血清濃度長達所需 的一段時間所需要的綴合物或融合物的量。在凍干前，可以采用任何合適的方法測定組合 物(例如藥物綴合物、藥物融合物)的活性，并且在再水化后采用相同方法測定活性損失的 量，來確定活性。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的融合物或綴合物的緩釋劑型，這類緩釋劑型可包含本 發(fā)明的融合物或綴合物以及例如透明質酸、微球或脂質體和其它藥學上或藥理上可接受的 載體、賦形劑和/或稀釋劑。這類緩釋劑型可為例如栓劑的形式。在一個方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的融合物或綴合物和藥學上或生理學上可接 受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。附圖簡述圖 1 圖示氨基酸序列(a) DATOl 14 (SEQ ID NO 1)，(b) DATOl 15 (SEQ ID NO 2)， (c) DATOl 16 (SEQ ID NO 3)，(d) DATOl 17 (SEQ ID NO 4)，(e) DATOl 18 (SEQ ID NO 5)，(f) DATO119(SEQ ID NO 6)(g)DATO120(SEQ ID NO 7)(h)Dom7h_14(SEQ ID NO 8) (dAb) (CDR 用下劃線表示)，(i)GLP-I 7-37A⑶G(SEQ ID NO 9)，(j)毒蜥外泌肽 _4(SEQ ID NO 10)， (k)螺旋接頭(SEQ ID NO 11) (l)Gly-ser 接頭(SEQ ID NO 12)。圖2圖示核酸序列(a) DAT0114 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 13)，(b) DAT0115 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 14)，(c) DAT0115 (優(yōu)化的大腸桿菌(E. coli)構建 體)(SEQ ID NO 15)，(d) DAT0116 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 16)，(e) DATOl 16 (優(yōu)化 的大腸桿菌構建體)(SEQ ID NO 17)，(f) DAT0117 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 18)，(g) DAT0117 (優(yōu)化的大腸桿菌構建體)(SEQ ID NO 19)，(h) DAT0118 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 20)，(i) DATOl 19 (哺乳動物構建體)(SEQID NO 21)，(j) DAT0120 (哺乳動物構建體) (SEQ ID NO 22)， (k)Dom7h_14(SEQ ID NO 23)。
圖3 (a)圖示小鼠肥胖癥模型中給予DAT0115后體重呈劑量依賴性的減輕，(b) 圖示小鼠肥胖癥模型中給予DAT0115的每日攝食量。圖 4 圖示 DAT0115 的 DSC 實線-DAT0115 跡線，虛線-與非-2-態(tài)(non-2-state) 模型擬合。圖5 圖示溶菌酶的DSC 實線-溶菌酶跡線，虛線-與非-2-態(tài)模型擬合(跡線重 疊，因此無法觀察到虛線跡線)。圖 6 圖示 DATOl 15 的 SEC MALLS0圖 7 圖示 DATOl 17 的 SEC MALLS0圖 8 圖示 DATO120 的 SEC MALLS0發(fā)明詳述在本說明書中參照實施方案，以能夠清楚明了地表達說明書的方式對本發(fā)明進行 了描述。預期并且應當理解的是，在不偏離本發(fā)明的情況下，可對實施方案進行各種合并或 分離。除非另有說明，否則本文使用的所有科技術語都具有本領域(例如細胞培養(yǎng)、分 子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員通常理解的含義。采用分子、遺 傳和生化方法(一般參見 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y.禾口Ausubel 等， Short Protocols in Molecular Biology (1999),第 4 版，John Wiley & Sons, Inc.均通 過引用結合到本文中)和化學方法的標準技術。本文使用的術語“促胰島素藥物”是指能夠刺激激素胰島素的合成或表達或者激 素胰島素的活性，或者引起對激素胰島素的合成或表達或者激素胰島素的活性的刺激的化 合物。已知促胰島素藥物的實例包括但不限于例如葡萄糖、GIP、GLP、毒蜥外泌肽(例如毒 蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-3)、PYY和0ΧΜ。本文使用的術語“腸降血糖素”是指當葡萄糖水平正常時，或者尤其當其升高時， 引起胰島素的釋放量增加的胃腸激素類型。舉例來講，它們包括GLP-1、GIP、0ΧΜ、PYY、VIP 和PP(胰多肽)。本文使用的術語“類似物”當涉及多肽時是指修飾肽，其中肽的一個或多個氨基酸 殘基被其它氨基酸殘基取代和/或其中一個或多個氨基酸殘基從肽中缺失和/或其中所述 肽的一個或多個氨基酸殘基缺失和/或其中一個或多個氨基酸殘基添加到肽中。氨基酸殘 基的這類添加或缺失可發(fā)生在肽的N端和/或肽的C端，或者它們可以在肽內。一個簡單 體系用來描述GLP-I的類似物例如GLP-I A8G(7-37氨基酸)表示這樣的GLP-I類似物 其中天然存在的位置8上的丙氨酸被甘氨酸殘基取代。按照IUPAC-IUB命名法所采用的標 準氨基酸單字母縮寫詞描述肽類似物及其衍生物的化學式。本文使用的“片段”當提及多肽時，是指多肽具有與完整天然存在的多肽的氨基酸 序列的部分相同并非完全相同的氨基酸序列。片段可以是“獨立的(free-standing) ”或包 含在較大的多肽內，它們在單一較大的多肽中作為一個連續(xù)區(qū)段構成一個部分或區(qū)域。舉 例來說，天然存在的GLP-I的片段可以包括天然存在的氨基酸1-36中的氨基酸7-36。此 外，多肽的片段還可以是天然存在的部分序列的變體。例如，包含天然存在的GLP-I的氨基 酸7-30的GLP-I片段還可以是在其部分序列中具有氨基酸取代的變體。10
本發(fā)明合適的促胰島素藥物的實例包括GLP-1、GLP-I衍生物、GLP-I類似物或 GLP-I類似物的衍生物。此外，它們包括毒蜥外泌肽_4、毒蜥外泌肽-4類似物和毒蜥外泌 肽-4衍生物或片段及毒蜥外泌肽_3、毒蜥外泌肽-3衍生物和毒蜥外泌肽-3類似物。本文使用的術語“GLP-1 ” 是指 GLP-I (7-37)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-35)、 GLP-I (7-38)、GLP-I (7-39)、GLP-1 (7-40)、GLP-1 (7-41) ,GLP-I 類似物、GLP-1 肽、GLP-1 衍 生物或突變體或片段或GLP-I類似物的衍生物。這類肽、突變體、類似物和衍生物是促胰島 素藥物。例如GLP-I可以是GLP-I (7-37)A8G突變體，其氨基酸序列見圖l(i) :SEQ ID NO 9。更多的GLP-1類似物參見國際專利申請?zhí)?0/11296 (The General Hospital Corporation)，其涉及包含GLP-1 (7-36)及其功能衍生物的肽片段，具有的促胰島素活性 超過GLP-I (1-36)或GLP-I (1-37)的促胰島素活性，并且涉及其作為促胰島素藥物的用途 (通過引用結合到本文中，特別是通過藥物的實例用于本發(fā)明)。國際專利申請?zhí)?WO 91/11457 (Buckley 等)公開了活性 GLP-1 肽 7-；34、7-35、7_36 和7-37的類似物，其還可用作本發(fā)明的GLP-I藥物(通過引用結合到本文中，特別是通過 藥物或藥劑的實例用于本發(fā)明)。本文使用的術語“毒蜥外泌肽-4肽”是指毒蜥外泌肽-4 (1-39)、毒蜥外泌肽_4類 似物、毒蜥外泌肽-4肽的片段、毒蜥外泌肽-4衍生物或毒蜥外泌肽-4類似物的衍生物。 這類肽、片段、類似物和衍生物是促胰島素藥物。毒蜥外泌肽-4(1-39)的氨基酸序列見圖 l(j) :SEQ ID NO 10。可用于本發(fā)明的更多的毒蜥外泌肽類似物參見PCT專利公布號WO 99/25728 (Beeley 等)、WO 99/25727 (Beeley 等)、WO 98/05351 (Young 等)、WO 99/40788 (Young 等)、WO 99/07404 (Beeley 等)和 WO 99/43708 (Knudsen 等)(均通過弓 | 用結合到本文中，特別是通過藥物的實例用于本發(fā)明)。本文使用的“肽”是指約2-約50個氨基酸通過肽鍵連接在一起。本文使用的“多肽”是指至少約50個氨基酸通過肽鍵連接在一起。多肽一般包含 三級結構并折疊成為功能結構域。本文使用的“展示系統(tǒng)”是指其中根據所需特征(例如物理、化學或功能特征)易 于選擇一批多肽或肽的系統(tǒng)。展示系統(tǒng)可以是合適的多肽庫或肽庫(例如在溶液中、固定 在合適的支持體上)。展示系統(tǒng)也可以是采用細胞表達系統(tǒng)(例如在轉化、感染、轉染或轉 導細胞中表達核酸文庫，并且在細胞表面展示編碼多肽)或非細胞表達系統(tǒng)(例如乳液區(qū) 室化與展示)的系統(tǒng)。示例性的展示系統(tǒng)將核酸的編碼功能與由所述核酸編碼的多肽或肽 的物理、化學和/或功能特性聯(lián)系起來。當采用這類展示系統(tǒng)時，可以選出具有所需要的 物理、化學和/或功能特性的多肽或肽，并且可容易地分離或回收編碼選定多肽或肽的核 酸。將核酸的編碼功能與多肽或肽的物理、化學和/或功能特性聯(lián)系起來的多個展示系統(tǒng) 是本領域已知的，例如噬菌體展示(bacteriophage display/phage display，例如噬菌粒 展示)、核糖體展示、乳液區(qū)室化與展示、酵母展示、嘌羅霉素展示、細菌展示、質粒上展示、 共價展示等。(參見例如EP 0436597 (Dyax)、美國專利號6，172，197 (McCafferty等)、美國 專利號 6，489，103 (Griffiths 等))。11
本文使用的“功能(性)，，是指具有生物活性(例如特異性結合活性)的多肽或 肽。例如，術語“功能性多肽”包括通過抗體的抗原結合部位結合靶抗原的抗體或其抗原結 合片段。本文使用的“靶配體”是指被多肽或肽特異性或選擇性結合的配體。例如，當多肽 為抗體或其抗原結合片段時，靶配體可以是任何所需要的抗原或表位。與靶抗原的結合取 決于具有功能性的多肽或肽。本文使用的抗體是指IgG, IgM, IgA, IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab，)2、Fv、 二硫鍵連接的Fv、SCFv、致密構象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙鏈抗體)，不論是來 源于任何物種天然產生的抗體，還是由重組DNA技術產生；不論是從血清、B細胞、雜交瘤、 轉染瘤、酵母分離，還是從細菌分離。本文使用的“抗體形式(antibody format) ”是指任何合適的多肽結構，其中可 摻入一個或多個抗體可變結構域，從而賦予該結構對抗原的結合特異性。多種合適的抗體 形式是本領域已知的，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體 重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、前述任一種的抗原結合片段 (例如Fv片段(例如單鏈Fv(ScFv)、二硫鍵結合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片 段)、單一抗體可變結構域(例如dAb、VH、VHH、Vl)以及前述任一種的修飾形式(例如通過 聚乙二醇共價連接的修飾或其它合適的多聚體或人源化Vhh)。表述“免疫球蛋白單一可變結構域”是指獨立于其它V區(qū)或結構域而特異性結合 抗原或表位的抗體可變結構域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白單一可變結構域存在形式之一可以 具有其它可變區(qū)或可變結構域(例如同多聚體或雜多聚體)，其中所述其它區(qū)或結構域不 是單一免疫球蛋白可變結構域結合抗原所必需的(即免疫球蛋白單一可變結構域獨立于 其它可變區(qū)結合抗原)?！敖Y構域抗體”或“dAb”與本文使用的術語“免疫球蛋白單一可變 結構域”相同?！皢我幻庖咔虻鞍卓勺兘Y構域”與本文使用的術語“免疫球蛋白單一可變結 構域”相同?！皢我豢贵w可變結構域”與本文使用的術語“免疫球蛋白單一可變結構域”相 同。在一個實施方案中，免疫球蛋白單一可變結構域是人抗體可變結構域，但是還包括得自 其它物種的單一抗體可變結構域，例如嚙齒動物(例如參見WO 00Λ9004，其內容通過整體 引用結合到本文中)、大斑貓鯊和駝類(Camelid) Vhh dAb。駝類Vra是免疫球蛋白單一可變 結構域多肽，得自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駝和栗色羊駝在內的物種，其產生天然缺乏 輕鏈的重鏈抗體。Vhh可以是人源化的?！敖Y構域”是折疊的蛋白質結構，具有獨立于蛋白質其余部分的三級結構。結構域 一般負責蛋白質的分立的功能性質，在許多情況下可以添加、剔除或轉移到其它蛋白質上 而又不喪失蛋白質和/或結構域的其余部分的功能?！皢我豢贵w可變結構域”是折疊的多肽 結構域，包含特有的抗體可變結構域序列。因此它包括整個抗體可變結構域和修飾可變結 構域，例如，其中一個或多個環(huán)被不是抗體可變結構域所特有的序列置換，或者被截短或包 含N端突出端或C端突出端的抗體可變結構域，以及可變結構域的折疊片段，其至少保持結 合活性和全長結構域的特異性。術語“文庫”是指異源多肽或核酸的混合物。文庫由多個成員組成，每個成員都具 有單一的多肽序列或核酸序列。就此而言，“文庫”與“庫”是同義的。文庫成員之間的序列 差異負責文庫中存在的多樣性。文庫可呈多肽或核酸的簡單混合物的形式，或者可以呈用12核酸文庫轉化的生物體或細胞的形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等。在一個實施方 案中，每個生物體或細胞只含有一個或有限數(shù)目的文庫成員。在一個實施方案中，核酸被摻 入表達載體，以供由核酸編碼的多肽的表達。因此，在一個方面，文庫可以呈一群宿主生物 體的形式，每個生物體含有一個或多個拷貝的表達載體，所述載體含有文庫的核酸形式的 一個成員，可被表達產生其相應的多肽成員。因此，宿主生物體群具有編碼大量不同多肽庫 的潛力。本文使用的術語“劑量”是指全部一次(單位劑量)或者在規(guī)定時間間隔內分兩次 或更多次給予受治療者的融合物或綴合物的量。例如，劑量可以是指在一天( 小時)(日 劑量)、2天、1周、2周、3周或者一個月或更多個月的進程中給予受治療者的融合物或綴合 物的量(例如通過一次給藥，或者通過兩次或更多次給藥)。劑量之間的間隔可以是任何需 要的時間量。表述“半壽期”是指例如由于天然機制引起的體內降解和/或清除或螯合所致，融 合物或綴合物的血清或血漿濃度降至50%的時間。本發(fā)明的融合物或綴合物在體內是穩(wěn) 定的，且其半壽期通過與抵抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白分子(例如人血清白蛋 白(HSA))結合而延長。這些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白質，其本身在體內的半壽期 長。對延長半壽期的分子非特異性的類似分子相比，如果某一分子的功能活性在體內持續(xù) 時間更長，則該分子的半壽期延長。例如，將包含對人血清白蛋白(HSA)有特異性的dAb和 腸降血糖素藥物或促胰島素藥物(例如GLP-I或毒蜥外泌肽)的本發(fā)明的融合物或綴合物 與其中不存在對HSA的特異性(也就是不結合HSA但結合其它分子)的相同配體進行比較。 例如，它可能結合細胞上的第三靶標。本發(fā)明的融合物或綴合物的半壽期通常增加10%、 20%、30%、40%、50% 以上。半壽期延長&、31、乜、51、1(^、2(^、3(^、4(^、5(^是可能的。或 者，半壽期延長高達 30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x 是可能的。本文使用的“流體動力學尺寸”是指基于分子通過水溶液擴散的分子(例如蛋白 質分子、配體)的表觀尺寸?？蓪Φ鞍踪|通過溶液的擴散或運動進行處理來推導蛋白質的 表觀尺寸，其中尺寸用蛋白質顆粒的“斯托克斯半徑(Stokes radius)”或“液體動力學半 徑”給出。蛋白質的“流體動力學尺寸”取決于質量和形狀(構象)兩者，使得具有相同分 子量的兩種蛋白質可能根據蛋白質的總體構象而具有不同的流體動力學尺寸。兩個序列之間“同源性”或“同一性”或“相似性”(有關術語在本文中互換使用) 的計算如下進行。對序列進行比對用于最佳比較目的(例如可以在第一和第二氨基酸或核 酸序列的一個或兩個中引入空位用于最佳比對，出于比較目的可以忽略非同源序列)。在一 個實施方案中，出于比較目的比對的參比序列的長度是該參比序列長度的至少30%、或至 少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、80%、90%、100%。然后對在相應氨基酸 位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。如果第一序列中某一位置由第二序 列相應位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據，則所述分子在該位置上是相同的(本文使用 的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)?？紤]兩個序列最佳比對需要引 入的空位的數(shù)目和各個空位的長度，兩個序列之間的百分比同一性是所述序列共有的相同 位置數(shù)的函數(shù)。應用算法BLAST2SeqUences，采用默認參數(shù)，來準備并確定本文定義的氨基 酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性(Tatusova，T.A.等，F(xiàn)EMSMicrobiol Lett, 174 :187-188(1999))。
核酸、宿主細胞本發(fā)明涉及編碼本文所述的本發(fā)明的融合物(例如由SEQ ID NO 13_23編碼的融 合物)的分離和/或重組核酸。本文所稱的“分離(的)”核酸是與其原有環(huán)境中(例如在細胞中或在核酸的混合 物中，例如文庫)的其它物質(例如其它核酸，例如基因組DNA、cDNA和/或RNA)分離的核 酸。分離核酸可以作為載體的組成部分(例如質粒)而被分離。
本文所稱的“重組”核酸是通過重組DNA方法產生的核酸，包括依靠人工重組的方 法，例如采用限制性內切酶、同源重組、病毒等方法，例如克隆至載體或染色體中；以及采用 聚合酶鏈式反應(PCR)制備的核酸。本發(fā)明還涉及包含(一個或多個)重組核酸或表達構建體的重組宿主細胞，例如 哺乳動物或微生物，所述重組核酸或表達構建體包含編碼本文所述的本發(fā)明的融合物的核 酸。本文還提供制備本文所述的本發(fā)明的融合物的方法，所述方法包括在適于表達融合物 多肽的條件下維持本發(fā)明的重組宿主細胞，例如哺乳動物或微生物。如有需要，所述方法可 另包括分離或回收融合物的步驟。例如，可以采用適于選定的宿主細胞的任何方法(例如轉化、轉染、電穿孔、感 染)，將編碼本發(fā)明的融合物多肽的核酸分子(即一個或多個核酸分子)，或者包含這類核 酸分子的表達構建體(即一個或多個構建體)導入合適的宿主細胞中產生重組宿主細胞， 使得核酸分子與一個或多個表達控制元件有效連接(例如在載體中、在通過細胞內加工所 產生的構建體中、整合到宿主細胞基因組)。可以將所得到的重組宿主細胞維持在適于表達 的條件(例如在誘導物存在下、在合適的動物中、在補充了適當鹽分、生長因子、抗生素、營 養(yǎng)補充劑等的合適培養(yǎng)基中)下，從而產生編碼的肽或多肽。如有需要，可以分離或回收編 碼的肽或多肽(例如從動物、宿主細胞、培養(yǎng)基、乳汁分離或回收)。該方法包括在轉基因動 物的宿主細胞中表達(參見例如WO 92/03918，GenPharm International)。本文所述的本發(fā)明的融合物多肽還可以在合適的體外表達系統(tǒng)中產生，例如通過 化學合成或通過任何其它合適的方法。如本文所描述和舉例說明的一樣，本發(fā)明的融合物或綴合物一般以高親和力結合 血清白蛋白。例如，本發(fā)明的融合物或綴合物可以約5微摩爾-約ΙΟΟρΜ，例如約1微摩爾-約 ΙΟΟρΜ，例如400-800nm，例如約600nm的親和力(KD ；KD = Koff (kd) /Kon(ka)[通過表面等離 子共振測定)結合人血清白蛋白。本發(fā)明的融合物或綴合物可以在大腸桿菌中或在畢赤酵母(Pichia)菌種(例如 巴斯德畢赤酵母(P.pastoris))中表達。在一個實施方案中，當在大腸桿菌或畢赤酵母菌 種(例如巴斯德畢赤酵母)、或在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中(例如CH0，或HEK 293細胞)表 達時，以至少約0. 5mg/L的量分泌融合物。雖然當本文所述的融合物或綴合物在大腸桿菌 或畢赤酵母菌種或哺乳動物細胞中表達時是可分泌的，但是它們可采用任何合適的方法制 備，例如合成化學方法或不使用大腸桿菌或畢赤酵母菌種的生物生產方法。在某些實施方案中，本發(fā)明的融合物和綴合物當給予有效量時，在動物模型中是 有效的，例如WO 2006/059106中披露的動物模型(例如公布的WO 2006/059106第104-105 頁)或本文實施例中描述的動物模型。有效量一般為約0. OOOlmg/kg-約10mg/kg(例如約140. OOlmg/kg-約 10mg/kg、例如約 0. OOlmg/kg-約 lmg/kg、例如約 0. Olmg/kg-約 lmg/kg、例 如約0. Olmg/kg-約0. lmg/kg)。疾病模型是本領域技術人員公認的，用于預測在人體中的 治療功效。一般來講，本發(fā)明的融合物和綴合物可以純的形式與藥學上或生理學上合適的 載體一起使用。這些載體通常可包括任何包括鹽水和/或緩沖介質在內的水溶液或含 醇/水溶液、乳液或懸浮液。胃腸外溶媒可包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖(Ringer' s dextrose)、葡萄糖和氯化鈉及乳酸鹽化林格氏液。如果需要將多肽復合物保持在懸浮液 中，則可從羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽等增稠劑選擇合適的生理學上可 接受的輔助劑。靜脈用溶媒包括液體及營養(yǎng)補充物和電解質補充物，例如林格氏葡萄糖型補 充物。還可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體 (Mack(1982)Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版)?？梢允褂枚喾N合適的 劑型，包括緩釋劑型。本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領域普通技術人員通常已知的任何給 藥途徑。對于療法，可以根據標準技術，給予任何患者本發(fā)明的藥物融合物或綴合物?？梢酝ㄟ^任何合適的方式給藥，包括胃腸外、靜脈內、肌內、腹膜內、口服、經皮、經 由肺途徑，或者適當時，用導管直接輸注。劑量和給藥頻率將取決于患者的年齡、性別和健 康狀況、同時給予的其它藥物、禁忌癥和臨床工作人員要考慮的其它參數(shù)。根據適應情況， 給藥可以是局部性的或是全身性的。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于遞送至肺部的經肺劑型，其包含(a)本發(fā)明 的綴合物和融合物，和(b)藥學上可接受的緩沖劑，且其中所述組合物包含液滴，且組合 物中存在約40%以上(例如50%以上)的液滴，其大小范圍為小于約6微米，例如約1微 米-約6微米，例如小于約5微米，例如約1-約5微米。例如這些組合物尤其適于通過直 接性局部經肺遞送而給予受治療者。例如，這些組合物可以直接給予肺部，例如通過吸入 法，例如通過使用噴霧器裝置。經肺遞送的這些組合物可包含生理學上可接受的緩沖液， 其PH范圍介于約4-約8之間，例如約7-約7. 5，且粘度約等于含有1. 2% (w/v)蔗糖的約 2% -約10% PEG 1000的50mM磷酸緩沖液的溶液粘度?？蓪⒈景l(fā)明的融合物或綴合物凍干以貯存，并且在臨用前用合適的載體復溶。已 經證實該技術對于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，可以采用現(xiàn)有技術已知的凍干和復溶技術。 本領域技術人員應當了解的是，凍干和復溶可能導致抗體活性不同程度的損失(例如對于 常規(guī)免疫球蛋白，比起IgG抗體，IgM抗體的活性損失往往較大)，必需調節(jié)升高使用水平予 以彌補。對于預防運用，例如當給予患有前驅糖尿病或胰島素抵抗的個體時，還可以相似 或略為較低的劑量給予含有本發(fā)明的融合物或綴合物的組合物來預防、抑制或延遲疾病的 發(fā)生(例如保持緩解或靜止，或防止急性期)。臨床技術人員將能夠確定治療、抑制或防止 疾病的適當?shù)慕o藥間隔。當給予本發(fā)明的融合物或綴合物治療、抑制或防止疾病時，可以給 予多達每天四次、每周兩次、每周一次、每兩周一次、一月一次或每兩月一次，劑量為例如約 0. 000lmg/kg-約 10mg/kg(例如約 0. OOlmg/kg-約 10mg/kg、例如約 0. OOlmg/kg-約 Img/ kg、例如約 0. 01mg/kg-約 lmg/kg、例如約 0. 01mg/kg-約 0. lmg/kg)。15
與治療前的這類癥狀相比，或者與未用這類組合物或其它適當對照治療的個體 (人或模型動物)的這類癥狀相比，如果一種或多種癥狀減輕(例如達至少10%或臨床評 價量表中的至少一分)，則使用本文所述組合物進行的治療或療法被視為“有效”。癥狀顯 然將隨所靶定的疾病或病癥的確切性質而改變，但是普通臨床工作人員或技術人員仍可測定。同樣，與未用組合物治療的相似個體(人或動物模型)的這類癥狀相比，如果一種 或多種癥狀的發(fā)生或嚴重程度延遲、減輕或消除，則使用本文所述組合物進行的預防是“有 效的”。本發(fā)明的融合物和綴合物可以作為單獨給予的組合物使用，或者可與其它治療劑 或活性劑(例如其它多肽或肽或小分子)聯(lián)用。這些其它的藥劑可包括各種藥物，例如二 甲雙胍、胰島素、格列酮類(例如羅格列酮(rosaglitazone))、免疫抑制劑、免疫刺激劑。本發(fā)明的融合物和綴合物與一種或多種其它治療劑/活性劑一起給予和/或配制 在一起。當本發(fā)明的融合物或綴合物與其它治療劑一起給予時，融合物或綴合物可在其它 治療劑給藥之前、同時、一起或之后給予。本發(fā)明的融合物或綴合物和其它治療劑一般以提 供重疊的治療效果的方式給予。半壽期延長促胰島素藥物或腸降血糖素藥物(例如GLP-I或毒蜥外泌肽配體)的半壽期 對于體內應用是有益的。本發(fā)明通過提供體內半壽期延長的促胰島素藥物或腸降血糖素藥 物(例如GLP和毒蜥外泌肽)并且這些分子的功能活性因此在機體內有較長的持續(xù)時間， 從而解決了這個問題。如本文所述，與單獨的促胰島素藥物或腸降血糖素藥物相比，本發(fā)明的組合物 (即包含本文所述的融合物或綴合物)可顯著地延長體內血清或血漿半壽期和/或增加 AUC和/或延長平均駐留時間(MRT)。另外，促胰島素藥物或腸降血糖素藥物的活性在本發(fā) 明的組合物(例如綴合物或融合物)中一般來說基本上不改變。然而，本發(fā)明組合物的活 性與單獨的促胰島素藥物或腸降血糖素藥物相比的某些改變是可接受的，并且一般通過改 進本發(fā)明的綴合物或融合物的藥代動力學性質而得到彌補。例如，本發(fā)明的藥物綴合物或 融合物以比單獨的藥物低的親和力結合藥物靶，但是由于藥物組合物的藥代動力學性質得 到改進(例如延長的體內血清半壽期、較大的AUC)，因此與單獨的藥物相比時，具有大致相 等或較好的功效。另外，由于本發(fā)明的綴合物或融合物的半壽期延長，與單獨的促胰島素藥 物或腸降血糖素藥物相比，它們可以較低頻率給藥，例如將它們以一月一次或一周一次給 予患者，并且與僅給予促胰島素藥物或腸降血糖素藥物相比，它們還在血液中保持較恒定 的促胰島素藥物或腸降血糖素藥物水平，從而達到所需要的治療或預防效果。藥代動力學分析和配體半壽期測定方法為本領域技術人員所熟知。有關詳 情可參見 Kenneth, A 等Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Peters 等，Pharmacokinetc analysis :A Practical Approach(1996)。還 可參照"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi 禾口 D Perron, Marcel Dekker 出版，第 2 版，前版本 修訂版(1982)，其中披露了藥代動力學參數(shù)，例如t α和ti3半壽期及曲線下面積(AUC)。半壽期(tl/2a和tl/2i3)及AUC和MRT可以從配體的血漿或血清濃度相對于時 間的曲線確定。可以運用WinNonlin分析包(可獲自Pharsight Corp.，Mountain View,CN 102046207 A說明書13/25頁 CA94040，USA)，例如制作曲線模型。在第一期(α期)，配體主要在患者體內進行分布，其 中一些排除。第二期(β期)是末期，此時配體已經完成分布，并且血清濃度隨配體從患者 體內清除而下降。ta半壽期是第一期的半壽期，ti3半壽期是第二期的半壽期。此外，還 可應用本領域眾所周知的非區(qū)室擬合模型來測定半壽期。在一個實施方案中，本發(fā)明提供清除半壽期(例如在人體內)的范圍約12小時以 上、例如約12小時-約21天、例如約M小時-約21天、例如約2-8天、例如約3-4天的本 發(fā)明的融合物或綴合物。還可將本發(fā)明的融合物或綴合物進一步設計或格式化成具有較大的流體動力學 尺寸，例如通過與PEG基團、血清白蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或至少其運鐵蛋白結合 部分、抗體Fc區(qū)連接，或者通過與抗體結構域綴合。流體動力學尺寸可采用本領域眾所周知的方法測定。例如，凝膠過濾層析法可以 用來測定配體的流體動力學尺寸。用于測定配體的流體動力學尺寸的合適的凝膠過濾基質 (例如交聯(lián)瓊脂糖基質)是眾所周知且易獲得的。本發(fā)明的組合物，即包含本文所述的融合物和綴合物的組合物，提供若干進一步 的優(yōu)勢。結構域抗體組分是非常穩(wěn)定的，較抗體和抗體的其它抗原結合片段小，通過在大腸 桿菌或酵母(例如巴斯德畢赤酵母)中表達可以高收率產生，且結合血清白蛋白的抗體的 抗原結合片段可容易地從來源于人的文庫或從任何理想的物種中選擇。因此，與一般在哺 乳動物細胞(例如人、人源化或嵌合抗體)中產生的治療劑相比，包含結合血清白蛋白的 dAb的本發(fā)明的組合物可更容易地產生，并且可以使用無免疫原性的dAb (例如人dAb可用 于治療或診斷人的疾病)。當促胰島素藥物或腸降血糖素藥物是含有dAb結合血清白蛋白的藥物組合物的 組成部分時，促胰島素藥物或腸降血糖素藥物的免疫原性可降低。因此，本發(fā)明提供融合 物或綴合物組合物，其可具有較少免疫原性(與例如單獨的促胰島素藥物或腸降血糖素相 比)或在含有結合血清白蛋白的dAb的藥物組合物的情況下可基本上無免疫原性。因此， 可以隨時間推移重復給予受治療者這類組合物，同時由受治療者免疫系統(tǒng)產生的抗藥抗體 所致的功效損失最小。另外，與單獨的促胰島素藥物或腸降血糖素相比，本文所述綴合物或融合物組合 物的安全特性可能提高，副作用降低。例如，由于dAb的血清白蛋白結合活性所致，本發(fā)明 的融合物和綴合物在血管循環(huán)中的停留時間延長。另外，本發(fā)明的融合物和綴合物在全身 給藥(例如血管內給藥)后，基本上不能夠穿越血腦屏障并在中樞神經系統(tǒng)中蓄積。因此， 與單獨的促胰島素藥物或腸降血糖素藥物相比，給予本發(fā)明的融合物或綴合物具有較大安 全性且副作用降低。同樣，與單獨的所述藥物相比，融合物或綴合物對特定器官(例如腎或 肝)的毒性降低。實施例實施例1 :GLP-1 (A8G)或毒蜥外泌肽_4和D0M^-14 AlbudAb的遺傳融合物的表 達將在位置8的丙氨酸被甘氨酸置換的毒蜥外泌肽-4或GLP-I (7-37) ([Gly8] GLP-1)作為與D0M^!-14(—種結合血清白蛋白的結構域抗體(dAb) (albudab)，其氨基酸序 列見下文)的融合物克隆至PTT-5載體(可獲自CNRC，Canada)中。在每種情況下，GLP-I或17毒蜥外泌肽-4位于構建體的5’端，dAb位于3’端。用圖I(A-G)中所示氨基酸序列制備了 總共 7 個構建體(DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119、DAT0120)。不存 在接頭、或者存在gly-ser接頭(G4S)或螺旋接頭(Arai,R.，H』eda等(2001)?！?Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein(設計有效分離雙功能融合蛋白的結構域的接頭)."Protein Eng 14(8) 529-32. 456)或有由在GLP-I或毒蜥外泌肽_4和dAb之間的第二 GLP-I部分組成的接頭。所 包括的接頭作為間隔基，將GLP-I或毒蜥外泌肽-4在空間上與dAb分隔開以防止在GLP-I 或毒蜥外泌肽-4與GLP-I受體之間的結合出現(xiàn)位阻現(xiàn)象。構建體的序列見圖1 (A-G)。采用堿性裂解在大腸桿菌中制備無內毒素的DNA(使用無內毒素的質粒Giga試劑 盒，可獲自Qiagen CA)，并用來轉染HEK293E細胞(可獲自CNRC，Canada)。使用每培養(yǎng)瓶 333 μ 1 293fectin (Invotrogen)和 250 μ g DNA,以 1. 75xl06 個細胞 /ml，轉染至 250ml/ 培 養(yǎng)瓶的HEK293E細胞中，并且于30°C表達5天。離心收獲上清液后，通過親和純化法在蛋白 質L上進行純化。蛋白質成批與裝填在柱中的樹脂結合，用10柱體積的PBS洗滌。蛋白質 用50ml 0. IM甘氨酸(pH 2)洗脫，用Tris (pH 8)中和。用SDS-PAGE凝膠鑒定預期大小的 蛋白質，大小見下表1。表1 :DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119、DAT0120 構建體的分子量融合蛋白預期分子量DATOl1418256DATOl1516896DATOl1615950DAT011719798DAT011815936DAT011915318DATO12018895實施例2 表示結合血清白蛋白的GLP-I和毒蜥外泌肽_4 AlbudAb融合物通過表面等離子共振(Biacore AB，可獲自GE Healthcare)對GLP-1和毒蜥外泌 肽-4 AlbudAb融合物進行了分析，獲得有關親和力的信息。使用用血清白蛋白包被的CM5 Biacore芯片(羧甲基化葡聚糖基質)進行了分析。將約1000共振單位(resonance unit, RU)的每種待測血清白蛋白(人、大鼠和小鼠血清白蛋白)在乙酸緩沖液(PH 5.5)中固 定。Biocore AB的流動吸收池1是未包被、封閉的陰性對照，流動吸收池2用人血清白蛋白18(HSA) (815RU)包被，流動吸收池3用大鼠血清白蛋白(RSA) (826RU)包被，流動吸收池4用 小鼠血清白蛋白(MSA) (938RU)包被。使各種受測融合物分子在如上述實施例中所述的哺 乳動物組織培養(yǎng)物中表達。通過稀釋至BIACORE HBS-EP 緩沖液(0. OlM HEPES(pH 7. 4)、0· 15M NaCl、3mM EDTA、0.005(%表面活性劑P20)并且流經BIACORE芯片來制備各種濃度的融合物分子(以 16ηΜ-2μΜ 的范圍)。將結合速率和解離速率曲線擬合至KD區(qū)域中由dAb的濃度所產生的跡線，由 BIACORE跡線計算親和力(KD)。將親和力(KD)概括于下表2中表2 與人、大鼠和小鼠血清白蛋白結合的GLP-I和毒蜥外泌肽_4AlbudAb
權利要求
1.一種融合物或綴合物組合物，其包含以下成分或由以下成分組成(a)促胰島素藥 物或腸降血糖素藥物，其作為與(b)的融合物或綴合物存在，(b)DOM 7h-14結構域抗體 (dAb)，其結合血清白蛋白并且其氨基酸序列如圖1(h) (SEQ ID NO 8)中所示。
2.權利要求1的融合物或綴合物，其中所述藥物是毒蜥外泌肽-4或GLP-I分子。
3.權利要求1或2的融合物或綴合物，其中所述藥物選自(a)GLP-l(7-37)A8G突變型， 其氨基酸序列如圖l(i) (SEQ ID NO 9)所示，或(b)毒蜥外泌肽_4分子，其氨基酸序列如 圖 l(j) (SEQ ID NO 10)所示。
4.前述權利要求中任一項的融合物或綴合物，其包含連接所述藥物和dAb的氨基酸接 頭或化學接頭。
5.權利要求4的融合物或綴合物，其中所述氨基酸接頭是具有圖l(k)(SEQ ID NO 11) 所示氨基酸序列的螺旋接頭，或具有圖1(1) (SEQID NO 12)所示氨基酸序列的gly-ser接 頭。
6.前述權利要求中任一項的融合物，其中所述促胰島素藥物或腸降血糖素藥物作為融 合物的組成部分存在于dAb的N端或C端。
7.權利要求6的融合物，所述融合物包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基 酸序列組成(a)2xGLP-l A8G D0M7h_14 融合物(DAT0114) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQ AAKEFIAWLVKGRDIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQWIGSQLS WYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED FATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 1)(b)毒蜥外泌肽4、(G4S)3接頭、DOM^i-14融合物(DAT0115) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQffIGSQLSffYQQK PGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CAQGAALPRTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO 2)(c)毒蜥外泌肽4D0M^i-14融合物(DAT0116) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGDIQMTQSP SSLSASV⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTK VEIKR(SEQ ID NO 3)(d)毒蜥外泌肽4、螺旋接頭、DOM^i-14融合物(DAT0117) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGKEAAAKE AAAKEAAAKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAADIQMTQSPSSLS ASV⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEI KR(SEQ ID NO 4)(e)GLP-I A8G、(G4S) 3 接頭、D0M7h_14 融合物(DAT0118) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGGGSGGGGSGGGGSD IQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLI MWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPR TFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 5)(f)GLP-I A8G、PSS 接頭、D0M7h-14 融合物(DAT0119) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGPSSDIQMTQSPSSLSAS V⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFSTYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO 6)(g)GLP-I A8G、螺旋接頭、D0M7h-14 融合物(DAT0120) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRGKEAAAKEAAAKEAA AKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAADIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 7)。
8.前述權利要求中任一項的融合物或綴合物，其中所述dAb進一步格式化以增加其流 體動力學大小，所述格式化的方法為將選自以下的分子與所述dAb連接PEG基團、血清白 蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或至少其運鐵蛋白結合部分、抗體Fc區(qū)；或者將抗體結構域 綴合到所述dAb。
9.前述權利要求中任一項的融合物或綴合物，其包含進一步的肽或多肽部分。
10.前述權利要求中任一項的融合物或綴合物，其包含具有與Dom7h-14dAb相同或不 同的結合特異性的另外的dAb部分。
11.前述權利要求中任一項的融合物或綴合物，其在人體內的清除半壽期為12小時以 上，例如12-21天。
12.前述權利要求中任一項的融合物或綴合物，其與人血清白蛋白結合的KD范圍為約 5微摩爾-約1微微摩爾。
13.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含前述權利要求中任一項的融合物或綴合物 以及藥學上或生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
14.權利要求13的藥物組合物，所述藥物組合物包含其它治療劑/活性劑。
15.一種組合物，所述組合物包含(a)權利要求1-12中任一項的融合物或綴合物，和 (b)其它治療劑/活性劑，其用于單獨、序貫或同時給予受治療者。
16.用于治療或預防代謝疾病和紊亂的前述權利要求中任一項的組合物。
17.權利要求16的組合物，其中所述疾病和紊亂選自高血糖癥、葡萄糖耐量減低、β 細胞缺乏癥、糖尿病(I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)、肥胖癥、以過食為特征的疾病。
18.權利要求1-15中任一項的組合物在制備治療或預防代謝疾病和紊亂的藥物中的 用途。
19.權利要求1-15中任一項的組合物在制備用于通過皮下、靜脈內或肌內注射遞送給受治療者的藥物中的用途。
20.權利要求1-15中任一項的組合物在制備用于胃腸外、口服、直腸、經黏膜、眼、肺或 胃腸道遞送的藥物中的用途。
21.一種用于治療或預防代謝疾病的方法，所述方法包括給予患者治療或預防有效量 的權利要求1-15中任一項的組合物。
22.—種口服劑型、注射劑型、吸入劑型或噴霧劑型，所述劑型包含權利要求1-15中任 一項的組合物。
23.一種緩釋劑型，例如栓劑形式的緩釋劑型，所述緩釋劑型包含權利要求1-15中任 一項的組合物。
24.—種凍干劑型，所述凍干劑型包含權利要求1-15中任一項的組合物。
25.一種遞藥裝置，所述遞藥裝置裝有權利要求1-15中任一項的組合物。
26.一種分離或重組核酸，所述核酸編碼權利要求1-7中任一種融合物。
27.一種核酸，所述核酸編碼權利要求7的融合物。
28.—種載體，所述載體包含權利要求沈或27的核酸。
29.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求沈或27的核酸或者權利要求觀的載體。
30.一種產生融合多肽的方法，所述多肽包含以下成分或由以下成分組成(a)促胰島 素藥物或腸降血糖素藥物，作為與(b)的融合物存在，(b)DOM 7h-14結構域抗體(dAb)，其 結合血清白蛋白并且具有圖1(h)所示氨基酸序列，所述方法包括在適于所述核酸或載體 表達的條件下培養(yǎng)權利要求四的宿主細胞，從而產生融合多肽。
31.一種治療或預防患者例如病人的血液葡萄糖升高相關疾病或病癥的方法，所述方 法包括給予所述患者治療或預防有效量的權利要求1-15中任一項的組合物。
32.—種刺激患者例如病人的胰島素產生和/或增加胰島素敏感性的方法，所述方法 包括給予所述患者至少一劑權利要求1-15中任一項的組合物。b
全文摘要
本發(fā)明涉及血清半壽期改進的藥物融合物。這樣的融合物和綴合物包含多肽、免疫球蛋白(抗體)單一可變結構域及GLP和/或毒蜥外泌肽分子。本發(fā)明還涉及包含這類藥物融合物和綴合物的用途、制劑、組合物和裝置。
文檔編號C07K16/46GK102046207SQ200980121191
公開日2011年5月4日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權日2008年3月31日
發(fā)明者C·赫林, L·J·霍爾特, L·耶斯佩斯 申請人:葛蘭素集團有限公司