專利名稱：Opiorphin肽衍生物作為腦啡肽降解性外肽酶的有力抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為金屬外肽酶(metallo-ectop印tidase)新抑制劑的經(jīng)修飾的 opiorphin 肽。相關(guān)技術(shù)描述鋅金屬外肽酶(ectop印tidase)控制參與哺乳動(dòng)物中重要生理功能調(diào)節(jié)的神經(jīng) 性和激素性介質(zhì)的受體依賴性活性。它們位于神經(jīng)及全身組織中的細(xì)胞表面，并催化神經(jīng) 肽及調(diào)節(jié)肽的分泌后加工或代謝(Roques，BP, Noble, F，Dauge, V，F(xiàn)ournie-Zaluski, MC & Beaumont,Α. (1993)Pharmacol Rev 45,87-146. Turner, AJ,Isaac,RE & Coates，D. (2001) BioEssays 23,261-269)。在這些神經(jīng)和/或激素肽信號(hào)中突出的有P物質(zhì)(SP)和腦啡肽，其涉及對(duì)行為適 應(yīng)性應(yīng)答的受體依賴性調(diào)節(jié)，所述應(yīng)答是針對(duì)應(yīng)激性或威脅性的環(huán)境刺激。它們顯著地調(diào) 節(jié)疼痛信息和鎮(zhèn)痛機(jī)制的脊髓處理、情緒和/或動(dòng)機(jī)性應(yīng)答、焦慮，攻擊行為和神經(jīng)免疫炎 癥現(xiàn)象(Dickenson, AH. (1995) Br J Anaesth 75，193-200· Sora，I，Takahashi，N，F(xiàn)unada， Μ, Ujike, H,Revay, RS,Donovan, DM, Miner, LL & Uhl，GR. (1997)Proc Natl Acad Sci USA 94,1544-1549 ；Konig, Μ, Zimmer, AM, Steiner, H, Holmes, PV, Crawley, JN, Brownstein, MJ & Zimmer，A. (1996)Nature 383,535-538 ；Filliol, D,Ghozland, S,Chluba, J,Martin, M, Matthes, HW, Simonin, F, Befort, K, Gaveriaux-Ruff, C, Dierich, A & LeMeur, Μ, et al. (2000)Nat Genet 25，195-200)。由于鋅外肽酶在對(duì)下游神經(jīng)及激素信號(hào)潛能的調(diào)節(jié)中的生理重要性及關(guān)鍵作用， 有必要聚焦于是什么控制了它們的活性，以及作為結(jié)果，聚焦于總的調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)。因具有開(kāi)發(fā) 新候選藥物的潛力，從病理生理學(xué)及治療的角度來(lái)看，外肽酶活性上游調(diào)節(jié)物的發(fā)現(xiàn)也是 令人激動(dòng)的。基于其對(duì)諸如中性內(nèi)肽酶(NEP ；EC 3. 4. 24. 11 [EC])及氨肽酶N(AP_N ； 3.4. 11.2[EC])等的腦啡肽降解性外肽酶的抑制活性，從牛脊髓中分離及表征出稱作 spinorphin(Nishimura, K & Hazato， Τ. (1993)Biochem Biophys Res Commun 194, 713-719 ；Yamamoto, Y, 0no, H, Ueda, A, Shimamura, Μ, Nishimura, K & Hazato, Τ. (2002) Curr Protein Pept Sci 3，587-599)。此外，我們表征了大鼠 sialorphin，在大鼠 中參與對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)的肽介質(zhì)。大鼠sialorphin是內(nèi)分泌激肽信號(hào)，在雄性大鼠中， 其表達(dá)由雄激素調(diào)節(jié)所激活，并且其分泌由腎上腺激素介導(dǎo)的對(duì)環(huán)境應(yīng)激的應(yīng)答所刺激。 它是膜錨定的大鼠NEP活性的生理抑制劑以及是大鼠疼痛感覺(jué)的強(qiáng)力抑制劑(Rougeot， C， Rosinski-Chupin, I， Njamkepo， E & Rougeon, F. (1994)Eur J Biochem 219,765-773 ；Rougeot, C, Vienet, R, Cardona, A, Le Doledec, L, Grognet, JM & Rougeon, F. (1997)Am J Physiol 273，R1309-R1320. ；Rougeot, C, Rosinski-Chupin, I & Rougeon, F. (1998)in Biomedical Reviews eds. Chaldakov, GN & Mathison, R. (Bulgarian-American Center, Varna, Bulgaria, )Vol 9, pp. 17-32 ；Rosinski-Chupin, I, Huaulme, JF, Rougeot, C & Rougeon, F. (2001)Endocrinology 142,4550-4559 ；Rougeot, C, Messaoudi, M, Hermitte, V, Rigault, AG, Blisnick, T, Dugave, C, Desor, D&Rougeon, F. (2003)Proc Natl Acad Sci USA 100,8549-8554)。我們先前證明了目前首個(gè)在人中被表征的人Opiorphin天然肽^jRFSR肽)，是兩 個(gè)腦啡肽失活性外肽酶，中性內(nèi)肽酶NEP (EC 3. 4. 24. 11)及氨肽酶AP-N(EC 3. 4. 11. 2)的 有效雙重抑制劑(Wisner et al. Proc Natl Acad Sci USA, Nov. 2006,103(47) :17979-84)。Opiorphin肽衍生物先前已有描述，參見(jiàn)例如Wisner et al. Proc Natl Acad Sci USA, Nov. 2006，103(47) 17979-84，并具有基本肽序列 QRFSR。因此，此序列及由下式所定義的序列可以被修飾X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg，其中 Xl代表氫原子或Tyr氨基酸，當(dāng)Xl為氫時(shí)X2代表Gln或Glp，或者當(dāng)Xl為Tyr或Cys時(shí) X2代表Gin。優(yōu)選的是01^31 、￥01^31 、和/或001^31 ，最優(yōu)選01^31 。眾所周知，Glp是焦 谷氨酸，Tyr或Y是酪氨酸，Gln或Q是谷氨酰胺，Arg或R是精氨酸，Phe或F苯丙氨酸， Ser或S是絲氨酸，以及Cys或C是半胱氨酸。這些肽在作為W02005090386公開(kāi)的國(guó)際專 利申請(qǐng)中已有描述。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的Opiorphin衍生物以及通過(guò)使用高選擇性的生化測(cè)定法來(lái)進(jìn) 行的體外功能性表征。附圖簡(jiǎn)述

圖1-4 在存在載體(vehicle)或存在50 μ M的QRFSR肽類似物的情況下，重組 hNEP或hAP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解動(dòng)力學(xué)。每個(gè)點(diǎn)代表以RFU (相對(duì)熒光單位)表示 的信號(hào)強(qiáng)度，其作為反應(yīng)時(shí)間(min)的函數(shù)與所形成的代謝物的量成比例。圖5 由QRFSR肽類似物針對(duì)純重組人hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解所 進(jìn)行的抑制。每一條棒(bar)表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速 度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分別在有或無(wú)50 μ M的QRFSR 肽類似物的情況下測(cè)量。圖6 純重組人hNEP或AP-N的底物。每一條棒表示所回收的完整底物的百分比， 并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分 別在有或無(wú)50 μ M的QRFSR肽類似物的情況下測(cè)量。圖7-8 由QRFSR肽類似物針對(duì)純重組人hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水 解所進(jìn)行的抑制。每一條棒表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速 度-有抑制劑時(shí)的速率度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分別在有或無(wú)50 μ M的 QRFSR肽類似物的情況下測(cè)量。圖9 由CQRFSR肽針對(duì)純重組人hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解所進(jìn)行 的濃度依賴性抑制。每一點(diǎn)表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速 度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度，其分別在有或無(wú)各種以yM(iog-尺度)標(biāo)記的濃度的CRFSR肽的情況下測(cè)量。 圖10 由QRFS
R-肽針對(duì)純重組人hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物 的水解所進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每一點(diǎn)表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑 制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分別在有或無(wú)各 種以yM(log-尺度)標(biāo)記的濃度的QRFS
R-肽的情況下測(cè)量。
圖 11 由 Y (PE12) QRFSR (如 Y- [NH- (CH2) 12_C0] -QRFSR)肽針對(duì)純重組人 hNEP 或 AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解所進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每一點(diǎn)表示所回收的完整底物 百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分 比，其分別在有或無(wú)各種以logy M標(biāo)記的濃度的Y(PE12)QRFSR的情況下測(cè)量。圖12-17 在存在載體或存在1到50 μ M的CQRFSR或CQRFS
R Opiorphin肽類似物的情況下，由重組hNEP或hAP_N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物進(jìn)行的水解的動(dòng)力 學(xué)。每個(gè)點(diǎn)代表以RFU(相對(duì)熒光單位)表示的信號(hào)強(qiáng)度，其作為反應(yīng)時(shí)間(min)的函數(shù)與 所形成的代謝物的量成比例。圖18 由CQRFSR肽針對(duì)純重組人hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解進(jìn) 行的濃度依賴性抑制。每個(gè)點(diǎn)表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí) 的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分別在有或無(wú)各種以 μ M(log-尺度)標(biāo)記的濃度的CRFSR肽的情況下測(cè)量。圖19 由 Y [ΡΕ12] QRFSR-C00H 肽(如 Y- (-ΗΝ- (CH2) 12_C0_) -QRFSR)針對(duì)純重組人 hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每個(gè)點(diǎn)表示所回收的完整 底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得 的百分比，其分別在有或無(wú)各種以μ M (log-尺度)標(biāo)記的濃度的Y (PE12) QRFSR-C00H肽的 情況下測(cè)量。圖20 由 C [PE6] QRFSR-C00H 肽(如 C- (-HN- (CH2) 6_C0_) -QRFSR)針對(duì)純重組人 hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每個(gè)點(diǎn)表示所回收的完整 底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得 的百分比，其分別在有或無(wú)各種以yM(log-尺度)標(biāo)記的濃度的C [PE6] QRFSR-COOI^im 情況下測(cè)量。圖21 由 C (PE12) QRFSR-C00H 肽(如 C- (_HN_ (CH2) 12-C0_) -QRFSR)針對(duì)純重組人 hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每個(gè)點(diǎn)表示所回收的完整 底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得 的百分比，其分別在有或無(wú)各種以μ M (log-尺度)標(biāo)記的濃度的C (PE12) QRFSR-C00H肽的 情況下測(cè)量。圖22 由 C [PE6] QRF [S_0_ 辛?；鵠R 肽(如 C- (_HN_ (CH2) 6-C0_) -QRF-S (0-辛酰 基)-R)針對(duì)純重組人hNEP或AP-N對(duì)相應(yīng)FRET肽底物的水解進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每 個(gè)點(diǎn)表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度 /無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分別在有或無(wú)各種以μ M(log-尺度)標(biāo)記的濃度的 C [ΡΕ6] QRF [S-0-辛?；鵠R肽的情況下測(cè)量。圖23 通過(guò) C[PE6]QRF[S-0-辛?；鵠R 肽(如 C-(_HN_ (CH2) 6-C0_)-QRF-S (0_ 辛 酰基)-R)針對(duì)由培養(yǎng)中的LNCaP上皮細(xì)胞所表達(dá)的膜結(jié)合人NEP對(duì)P物質(zhì)生理NEP底物的水解進(jìn)行的濃度依賴性抑制。每個(gè)點(diǎn)表示所回收的完整底物的百分比，并計(jì)算為無(wú)抑制 劑時(shí)的速度-有抑制劑時(shí)的速度/無(wú)抑制劑時(shí)的速度所得的百分比，其分別在有或無(wú)各種 以μ M(log-尺度)標(biāo)記的濃度的C[PE6]QRF[S-0_辛?；鵠R肽的情況下測(cè)量。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明在此提供這些肽經(jīng)修飾的形式，其中組成opiorphin肽的每個(gè)氨基酸殘基 或氨基酸殘基的組合用一個(gè)或多個(gè)觀能團(tuán)來(lái)修飾。此種經(jīng)修飾的opiorphin肽的非限定性例子包括NH2-QRFSR-C0NH2 ；NH2-QRGPR-C00H ；NH2-QHNPR-C00H ；NH2-QR (4 溴 F) SR-COOH (如 NH2-QR-F [4Br] -SR-C00H,其中-F [4Br]-是苯丙氨酸，
其苯基在對(duì)位由溴原子取代，因此-打4Br]_結(jié)構(gòu)式如下N-(乙酰)QRFSR-C00H ；N- (C8-聚乙烯)QRFSR-C00H ；N-(生物素-C6) QRFSR-C00H ；NH2-dRdSdFdRdQ-C00H(逆反轉(zhuǎn)(retroinversion) D-對(duì)映異構(gòu)體)NH2-YQRFSR-C00H ；NH2-Y- (C6-聚乙烯)QRFSR-C00H ；NH2-Y- (C12-聚乙烯)QRFSR-C00H ；NH2-QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；NH2-CQRFSR-C00H ；NH2-CQRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；NH2-CQRF [S-0-C12-聚乙烯]R-C00H ；NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFSR-C00H ；NH2-C- (C12-聚乙烯)QRFSR-C00H ；NH2-C- (C8-聚乙烯)QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；NH2- [C β 2] QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；
NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFS [ β 3R] -C00H ；NH2-C [dQ] RF [S-0-C8-聚乙烯][dR] -C00H ；NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFS [dR]；NH2- [dC] QRF [S-0-C8-聚乙烯][dR] -C00H ；NH2- [C β 2] QRF [S-0-C8-聚乙烯][β 3R] -C00H ；[CQRFSR] 2作為通過(guò)二硫鍵的半胱氨酸二肽；Glp-RFSR-C00H ；NH2-QRYSR-C00H ；
NH2-QR打4F]SR-C00H，其中-打4F]-是苯丙氨酸，其苯基在對(duì)位由氟原子取代，因 此-打4F]-結(jié)構(gòu)式如下NH2-QKFSR-C00H ；NH2-QRFSK-C00H ；NH2-C- (C6-聚乙烯)QRFSR-C00H ；NH2-C- (C6-聚乙烯)-QRFS [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；NH2-C- (C12-聚乙烯)QRFS [S-0-C8-聚乙烯]R-COOH ；NH2-C[PE12]QRFS-dR-COOH ；NH2-C- (C12-聚乙烯)-QRFS [S-0-C8-聚乙烯]-β 3R-C00H ；NH2-C- (C8-聚乙烯)-QRFS [S-0-C8-聚乙烯]-β 3R-C00H，其中C β 2通過(guò)β 2-半胱氨酸替代天然半胱氨酸殘基，所述β 2-半胱氨酸在接近 半胱氨酸α羰基附近的Ca碳鄰近結(jié)合了亞甲基殘基(H2N(-CH2-SH)-CH2-CO-)；β 3R通過(guò)β 3-精氨酸替代天然精氨酸，所述β 3-精氨酸在精氨酸α氨基附近的 Ca 碳鄰近結(jié)合了亞甲基殘基(-NH-CH2-C[-(CH2)3-NH-C(NH) (NH2)J-COOH)；[S-0-C8-聚乙烯]和[S-0-辛?；鵠意指其羥基被辛?；〈慕z氨酸；[S-0-C12-聚乙烯]意指其羥基被月桂基取代的絲氨酸；C6，C8或C12-聚乙烯對(duì)映于6、8或12個(gè)乙烯碳的間隔區(qū)(分別為 (-HN- (CH2) 6-C0-, -HN- (CH2) 8_C0_ 和(-HN- (CH2) 12_C0_)。在以上肽中，NH2表示肽的終端氨基，COOH表示終端羧酸(當(dāng)終端官能團(tuán)為酰胺時(shí) 為-C0-NH2)。以上列表也可如下表示QRFSR-NH2 ；QRGPR ；QHNPR ；(乙酰)QRFSR；C- (-HN- (CH2) 8_C0_) -QRFSR ；生物素-(-HN-(CH2) 6-C0-) -QRFSR ；dR-dS-dF-dR-dQ ；YQRFSR ；Y- (-HN- (CH2) 6-C0_) -QRFSR ；Y- (-HN- (CH2) 12_C0_) -QRFSR ；QRF-S (0-辛?；?-R ；CQRFSR ；CQRF-S (0_ 辛?；?-R ；
10
CQRF-S (0_ 月桂基)-R ；C- (-HN- (CH2) 8_C0_) -QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFSR ； C- (-HN- (CH2) 8-C0-) -QRF-S (0-辛酰基)-R ；[C β 2] QRF-S (0-辛?；?-R;C- (-ΗΝ- (CH2) 8_C0_) -QRFS- [ β 3R]；C- [dQ] -RF-S (0_ 辛酰基)-[dR]；C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[dR]；[dC] -QRF-S (0_ 辛?；?-[dR]；[C β 2] -QRF-S (0_ 辛?；?_ [ β 3R]；[CQRFSR]2 ；Glp-RFSR ；QRYSR ；QR-打4F]_SR，其中-打4F]-是苯丙氨酸，其苯基在對(duì)位由氟原子取代；QR-F[4Br]_SR，其中-打4Br]_是苯丙氨酸，其苯基在對(duì)位由溴原子取代；QKFSRQRFSK ；C- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRF-S (0-辛酰基)-R ；C (-HN- (CH2) 12-C0-) QRF-S (0_ 辛?；?-R ；C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFS-dR ；C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRF-S (0_ 辛?；?_ β 3R ；C- (-ΗΝ- (CH2) 8-C0-) -QRF-S (0_ 辛酰基)-β 3R，其中，C β 2 是 H2N (-CH2-SH) -CH2-CO-；β 3R 是-NH-CH2-C [- (CH2) 3-NH_C (NH) (NH2) ] -COOH ；-S (-0-辛?；?意指其羥基被辛?；〈慕z氨酸；-S(-0-月桂基)表示其羥基被一個(gè)月桂基取代的絲氨酸。以下定義在本申請(qǐng)被始終使用。肽是指由線性排列中通過(guò)肽鍵相互連接的氨基酸殘基的線性排列所組成的分子。 此種線性排列可以任選是環(huán)狀的，即線性肽的末端或是肽內(nèi)部氨基酸側(cè)鏈可以例如經(jīng)化學(xué) 鍵而相連。此種肽可進(jìn)一步包括二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，以及與其它肽或其它非肽分子的分 子間聯(lián)系。此種分子間聯(lián)系可通過(guò)(無(wú)限制性目的)共價(jià)鍵(如通過(guò)二硫鍵)、或通過(guò)螯合、 靜電相互作用，疏水相互作用、氫鍵、離子偶極相互作用、偶極-偶極相互作用、或以上任意 的組合。以下肽的任意氨基酸可以是L構(gòu)型或D構(gòu)型。特別地，整條肽可以是L構(gòu)型或是D 構(gòu)型。與天然氨基酸相比，碳?xì)滏溈蛇M(jìn)一步含有亞甲基，從而此氨基酸也可成為β氨基酸， 更確切地說(shuō)是β 2或β 3氨基酸。例如R可以代表以下氨基酸之一 1R(即L-Arg)，dR(即 D-Arg), i3 3R或β 2R。以下肽的任意氨基酸也可以是氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸。
“F(X)”意指苯丙氨酸，其苯基被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代，優(yōu)選氟，優(yōu)選的F(X)
具有一個(gè)以下的結(jié)構(gòu)式
F(4Br)F(4F)OO“S(OAlk)”意指絲氨酸，其羥基被線狀或分枝的具有1-20個(gè)碳原子的烷基即 (“Alk”)取代，優(yōu)選辛?；蛟鹿鸹?。在本申請(qǐng)中，S(0-C8-聚乙烯)或S(O-CS)意指其
羥基被辛?；〈慕z氨酸。"C-[接頭]-，，意指Cys-[NH-(CH2)n-CO]-,其中η是介于1-20間的整數(shù)，優(yōu)選 介于4-15間，尤其優(yōu)選6、8或12。在本申請(qǐng)中，“C-(C6-聚乙烯)”或“C[PE6]”意指 Cys-[NH-(CH2)6_C0]- ；"C-(C8-聚乙烯)，，或 “C[PE8]，，意指 Cys-[NH-(CH2)8_C0]-；以及 “C- (Cl2-聚乙烯)，，或 “C[PE12]，，意指 Cys-[NH- (CH2) 12_C0]-?！癥-[接頭]_”意指Tyr-[NH- (CH2)n’ -CO] _，其中η’是介于1-20間的整數(shù)，優(yōu) 選介于4-15間，尤其優(yōu)選6、8或12。在本申請(qǐng)中，“Y-(C6-聚乙烯)”或“Y[PE6] ”意指 Tyr-[NH-(CH2)6-CO]- ；“Y_(C8_ 聚乙烯)”或“Y[PE8]，，意指 Tyr-[NH-(CH2)8-C0]-；以及 “Y-(Cl2-聚乙烯)”或 “Y [PE12] ”意指 Tyr-[NH-(CH2)12-CO]-.本發(fā)明中的肽衍生物對(duì)于特定肽酶的“抑制潛能”可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 評(píng)估，例如通過(guò)測(cè)量Ki值或IC5tl值。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)確定了 IC5tl值時(shí)，兩個(gè)經(jīng)修飾的opiorphin 肽的相對(duì)抑制潛能，可以通過(guò)在給定實(shí)驗(yàn)條件下(相同的緩沖液，相同濃度的肽酶和底物) 測(cè)量每個(gè)經(jīng)修飾的opiorphin肽對(duì)特定肽酶的IC5tl值來(lái)進(jìn)行比較，以及可以通過(guò)在相同實(shí) 驗(yàn)條件下，比較上述經(jīng)修飾的opiorphin肽的IC5tl值與opiorphin的IC5tl值。本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(I)的肽衍生物ζ -AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-Oh (I),其中-ζ是氫原子，酪氨酸，Y-[接頭]-或Si螯合基團(tuán)，比如半胱氨酸，C-[接頭]_， N-乙酰-半胱氨酸，N-巰基乙酰(HS-CH2-CO-),異羥肟酸(H0-NH-C0-)或任選取代的羥基 喹啉，-AA1 是 Q 或 Glp，-AA2 是 K，R 或 H，優(yōu)選 R， -AA3 是 Y，G，N，F(xiàn) 或 F (X)，優(yōu)選 F 或 F (X)，-AA4 是 P，S 或 S (OAlk)，優(yōu)選 S 或 S (OAlk)，-AA5 是 K 或 R，優(yōu)選 R，-C-[接頭]-意指Cys-[NH-(CH2)n-CO]-,其中η是介于1-20間的整數(shù)，η優(yōu)選為 6、8 或 12，-Y-[接頭]-意指Tyr-[NH-(CH2)n，-C0]-，其中η’是介于1-20間的整數(shù)，η優(yōu)選為6、8或12，-F(X)意指苯丙氨酸，其苯基被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代，-S(OAlk)意指絲氨酸，其羥基被線狀或分枝的具有1到20個(gè)碳原子的烷基取代，-所述AA1,AA2, AA3, AA4和AA5可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，并且AA1, AA2, AA3, AA4, 和AA5中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸、氮雜氨基酸或β -氮雜氨基酸；其中，如果該肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任選是二聚體，前提是該 肽不是 QRFSR、QHNPR、QRGPR、YQRFSR 或 GlpRFSR。通常，在根據(jù)本發(fā)明的肽衍生物中，AApAA2、AA3、AA4和AA5可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D 構(gòu)型，AA”AA2、AA3、AA4，和AA5中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸、氮雜氨基酸或β _氮雜氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中^~444^4^和4~中至少有一個(gè)為β氨基酸。在另一實(shí) 施方案中，441、44、4^、444和4~都是β氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，AAp AA2、AA3、AAjP AA5中至少有一個(gè)為氮雜氨基酸。在另一 實(shí)施方案中，ΑΑ1、ΑΑ2、ΑΑ3、ΑΑ4和ΑΑ5都是氮雜氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，AAp AA2、AA3、AA4和AA5中至少有一個(gè)為β-氮雜氨基酸。在 另一實(shí)施方案中，AA1, AA2, AA3> AA4和AA5都是為β -氮雜氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽衍生物包含半胱氨酸且是二聚體，其中兩個(gè)半胱氨酸的 兩個(gè)硫原子以二硫鍵相連。例如，[CQRFSR]2是肽衍生物CQRFSR的二聚體，其半胱氨酸氨基 酸由二硫鍵相連。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)ζ是羥基喹啉時(shí)，該肽衍生物有如下結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式(I)的肽衍生物是經(jīng)修飾的opiorphin肽，其有利地是具有對(duì)中性內(nèi)肽酶 NEP和/或氨肽酶AP-N的抑制潛能。結(jié)構(gòu)式(I)的優(yōu)選肽衍生物為CQRFSR,QRF (X) SR,QRGPR,QHNPR,QRFPR,QRFS (OAlk) R，優(yōu)選 QRFS (0_ 乙酰)R，C-[接頭]-QRFSR,優(yōu)選 C- [NH- (CH2) 6_C0] -QRFSR、C- [NH- (CH2) 8_C0] -QRFSR、或 C- [NH- (CH2) 12-C0] -QRFSR,QRYSR,QKFSR,QRFSK，C-[接頭]-QRFSR,優(yōu)選 C- [NH- (CH2) 6_C0] -QRFSR、C- [NH- (CH2) 8_C0] -QRFSR、或C- [NH- (CH2) 12-C0] -QRFSR,
[CQRFSR]2, C- [NH- (CH2) 6-C0] -QRFS (OAlk) R 優(yōu)選 C- [NH- (CH2) 6_C0] -QRFS (0-辛?；?R以及 Y- [NH- (CH2) 12_C0] -QRFSR。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(II)的肽衍生物ζ "-Q-AAa2-AAa3-P-R-OH(II)其中- ζ a是氫原子或Si螯合基團(tuán)，比如半胱氨酸，C-[接頭]_，N-乙酰-半胱氨酸， N-巰基乙酰(HS-CH2-CO-),異羥肟酸(H0-NH-C0-)或任選取代的羥基喹啉，-AAa2 是 R 或 H，優(yōu)選 R，-AAa3 是6、N、F 或 F(X)，優(yōu)選 F，-所述Q、AA2、AA3、P和R可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，以及Q、AA2、AA3、P和R中的 任意一個(gè)可隨意任選為β氨基酸，氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸；其中，如果肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任選是二聚體，前提是此肽 不是 QHNPR 或 QRGPR。所述結(jié)構(gòu)式(II)的肽衍生物是經(jīng)修飾的opiorphin肽，且有利地是人AP-N抑制 劑。特別是，它可以具有比其對(duì)NEP內(nèi)肽酶和/或羧基二肽酶活性的抑制潛能高的對(duì)AP-N 的抑制潛能(優(yōu)選至少6倍、8倍或10倍)。結(jié)構(gòu)式(II)的優(yōu)選肽衍生物為QRGPR,QHNPR 禾口QRFPR。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(III)的肽衍生物ζ "-AA1-AAn2-AAn3-AAn4-AAn5-OH(III)，其中，- ζ η是氫原子、酪氨酸或Υ_[接頭]_，-AA1 是 Q 或 Glp，優(yōu)選為 Q，-八八^是仄或R，優(yōu)選為R，-AAn3 是 Y、F 或 F (X)，優(yōu)選為 F 或 F (X)，-八八、是3或S(OAlk)，-六六 是仄或R，優(yōu)選為R，-所述AA1、AA2、AA3、AA4 和 AA5 可獨(dú)立地是 L 構(gòu)型或 D 構(gòu)型，AA”AA2、AA3、AA4 和 AA5 中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸，氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸；前提是此肽不是QRFSR、QHNPR、YQRFSR 或 GlpRFSR。所述結(jié)構(gòu)式(III)的肽衍生物是經(jīng)修飾的opiorphin肽，且有利地是人NEP抑制 劑。特別是，它可以具有比其對(duì)AP-N的抑制潛能高的對(duì)NEP內(nèi)肽酶和/或羧基二肽酶活性 的抑制潛能(優(yōu)選至少6倍、8倍或10倍)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(IIIa)的肽衍生物AAfR-AAn3-S(OAlk)-AAn5-OH (IIIa),
其中-AA1 是 Q 或 Glp，-AA1^F或F(X)，-六六 是仄或R，優(yōu)選為R，前提是該肽不是QRFSR、QHNPR、YQRFSR 或 GlpRFSR。結(jié)構(gòu)式(III)或(IIIa)的優(yōu)選肽衍生物為QRYSR,QRF (X) SR,QKFSR,QRFSK,QRFS (OAlk) R，優(yōu)選為 QRFS (0_ 辛?；?R 和
Y- [NH- (CH2) 12-C0] -QRFSR。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(IV)的肽衍生物ζ ""-Q-R-AAm3-AAm4-R-OH (IV)，其中，- ζ m是氫原子，或Si螯合基團(tuán)，比如半胱氨酸，C-[接頭]_，N-乙酰-半胱氨酸， N-巰基乙酰(HS-CH2-CO-),異羥肟酸(H0-NH-C0-)或任選取代的羥基喹啉，-AAn3 是 F 或 F (X)，優(yōu)選為 F ⑴，-AAm4 是 S 或 S (OAlk)，優(yōu)選為 S 或 S (OAlk)，-所述Q、R、AA3>AA4和R可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，Q、R、AA3>AA4和R中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸，氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸；其中， 如果該肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任選是二聚體，前提是此肽不是QRFSR 或 YQRFSR。結(jié)構(gòu)式(IV)的肽衍生物是經(jīng)修飾的opiorphin肽，有利地為人NEP和人AP-N雙 重抑制劑，因其顯示出對(duì)人NEP和人AP-N的顯著抑制潛能。結(jié)構(gòu)式(IV)的優(yōu)選肽衍生物為CQRFSR,[CQRFSR] 2，C- (-HN- (CH2) 12_C0_) -QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 6_C0_) -QRFSR ；C-[接頭]-QRF-S (0_ 辛?；?-R，優(yōu)選為 C- (_HN_ (CH2) 6-C0_) -QRF-S (0_ 辛酰 基)-R, C- (-HN- (CH2) 8-C0-) -QRF-S (0-辛酰基)-R 或 C- (-HN- (CH2) 12_C0_) -QRF-S (0-辛酰 基)_R;QRF (X) SR 禾口QRFS (OAlk) R，優(yōu)選為 QRFS (0-辛?；?R。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽衍生物是經(jīng)修飾的opiorphin肽并且具有針對(duì)中性內(nèi)肽酶 NEP和/或氨肽酶AP-N的抑制潛能。最優(yōu)選地，本發(fā)明中經(jīng)修飾的肽衍生物具有對(duì)中性內(nèi) 肽酶NEP和氨肽酶AP-N的抑制潛能。根據(jù)本發(fā)明的肽衍生物可以常規(guī)的方式通過(guò)液相或固相中的肽合成來(lái)制備，所述肽合成是通過(guò)把將要結(jié)合的不同氨基酸殘基相繼連接來(lái)(在液相中從N-末端到C-末端， 或在固相中從C-末端到N-末端)，其中，N-末端和活性側(cè)鏈?zhǔn)孪扔贸Ｒ?guī)基團(tuán)阻斷。對(duì)于固相合成，具體可使用Merrifield所描述的技術(shù)?；蛘撸琀oubenweyl于1974 年描述的技術(shù)也可使用。若其由天然氨基酸組成，則根據(jù)本發(fā)明的肽衍生物也可經(jīng)由基因工程的方法獲得。Opiorphin肽的修飾包括化學(xué)的修飾(比如，含有添加的化學(xué)部分，諸如 甲基，C2、C4、C6、C8、C10, C12聚乙烯以及其聚乙二醇，和/或糖基化形式，和模擬肽類 (peptidomimetics)(比如，一個(gè)在結(jié)構(gòu)和/或功能上模擬肽的低分子量化合物(參見(jiàn) 例如 Abell, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London :JAI Press (1997) ；Gante, Peptidmimetica-massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106 :1780-1802(1994) ；and Olson et al. , J. Med. Chem. 36 :3039-3049(1993))。其它可以引入本發(fā)明肽衍生物的修飾包括使用非天然氨基酸、D型氨基酸、β 2氨 基酸、β 3氨基酸、氮雜氨基酸或β -氮雜氨基酸來(lái)替代L型氨基酸，構(gòu)象約束，等構(gòu)置換，環(huán) 化或其它修飾。其它例子有一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵被非酰胺鍵取代，以及/或一個(gè)或多個(gè)氨基 酸側(cè)鏈被不同的化學(xué)部分取代，或一個(gè)或多個(gè)N-末端、C-末端或一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈被保護(hù)基 團(tuán)保護(hù)，以及/或在氨基酸鏈中被引入雙鍵和/或環(huán)化和/或立體特異性以增強(qiáng)剛性和/ 或結(jié)合親合性。基于本發(fā)明中肽衍生物所靶向的金屬外肽酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，也可通過(guò) 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的方法獲得模擬物(Oefner et al. J. Mol. Biol. (2000)296(2) 341-9 ；Gomeni et al.Eur. J. Pharm. Sci. (2001) 13(3) :261-70 ；Kan, Curr Top Med Chem(2002),2(3) :247-69)。其它修飾還包括-通過(guò)與親脂性醇的酯化作用(C00H)或通過(guò)酰胺化作用(C00H)和/或通過(guò)乙酰 化作用(NH2)或在NH2末端添加羧烷基或芳香族疏水鏈來(lái)保護(hù)NH2和C00H親水基團(tuán)；-CO-NH酰胺鍵的逆反轉(zhuǎn)異構(gòu)體或酰胺基的甲基化(或酮亞甲基，亞甲基氧 (methyleneoxy),輕基乙烯)；-在兩個(gè)氨基酸間插入-[HN-(CH2)n-CO-]-部分，η是介于1_20間的整數(shù)，優(yōu)選6、 8 或 12。當(dāng)考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性時(shí)，核酸，又稱多核苷酸，諸如編碼肽包括含有天然氨 基酸的肽衍生物的DNA或RNA分子，如上所定義，也是本發(fā)明的一部分。所述核酸優(yōu)選包含 編碼由天然氨基酸組成的肽衍生物的序列。本發(fā)明中的核酸包含可與上述任意序列或其互補(bǔ)序列在高嚴(yán)格雜交條件下雜交 的序列，所述條件是指在68°C 0. 2X SSC中，在42°C 50%甲酰胺、4X SSC中的雜交和/或洗 滌條件，或者是能提供等同于在上述兩條件任一條件下所觀察到的雜交水平的條件。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明核酸序列的用于克隆和/或表達(dá)的載體以及涉及 包含該核酸或所述載體的宿主細(xì)胞，即其中至少轉(zhuǎn)移了這些載體中一種的宿主細(xì)胞。根據(jù) 本發(fā)明的表達(dá)載體包含核酸序列，其編碼肽，包括肽衍生物或本發(fā)明的蛋白，所述述核酸序 列可操作地與使其表達(dá)的元件相連。所述載體有利地是含有啟動(dòng)子序列、用于啟動(dòng)和終止翻譯的信號(hào)、以及用于翻譯調(diào)節(jié)的合當(dāng)?shù)膮^(qū)域。其插入宿主細(xì)胞可以是暫時(shí)的或穩(wěn)定的。所 述載體也可含有用于翻譯好的蛋白分泌的特定信號(hào)。宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的，包括但不僅限于細(xì)菌，酵母，植物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì) 胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括商業(yè)可購(gòu)得的細(xì)胞系。宿主細(xì)胞的優(yōu)選例子是C0S-1，HEK細(xì)胞，293 細(xì)胞，或CHO細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供特異性針對(duì)(即特異性識(shí)別)本文所述經(jīng)修飾的opiorphin肽 的抗體，單克隆的或多克隆的，或其片段。這類抗體可用于例如研究本發(fā)明中肽衍生物的藥 代動(dòng)力學(xué)特性。本文使用的不同語(yǔ)法形式的術(shù)語(yǔ)“抗體“指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分 子的免疫活性部分，即含有抗體結(jié)合位點(diǎn)或抗原互補(bǔ)位的分子。示例的抗體分子是完整的 免疫球蛋白分子、實(shí)質(zhì)上完整的免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的一部分，包括領(lǐng)域中 已知的為Fab、Fab'、F(ab' )2和F(v)的部分。多克隆抗體的產(chǎn)生過(guò)程也是眾所周知的。這類抗體的產(chǎn)生典型地可通過(guò)對(duì)已被事 先采血以獲得免疫前血清的新西蘭白兔進(jìn)行皮下注射本發(fā)明的肽衍生物，包括綴合的肽衍 生物?？乖稍谑畟€(gè)或至少五個(gè)不同點(diǎn)以每個(gè)位點(diǎn)總體積50 μ 1注射。繼而在初次注射后 五周對(duì)兔采血并周期性地(每六周三次)經(jīng)皮下使用同一抗原以最多比初次注射低五倍的 濃度(取決于免疫應(yīng)答的性質(zhì))來(lái)進(jìn)行加強(qiáng)。繼而在每次加強(qiáng)后10天收集血清樣本。多克 隆抗體隨后通過(guò)使用相應(yīng)抗原捕獲抗體的親和層析來(lái)從血清中進(jìn)行回收。這種及其它多克 隆抗體的產(chǎn)生過(guò)禾呈公開(kāi)于Ε. Harlow, et. al. , editors, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)。不同語(yǔ)法形式的“單克隆抗體”指的是僅含有一類能與特定表位免疫反應(yīng)的抗體 結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群體。因此，單克隆抗體典型地顯示出對(duì)于與其免疫反應(yīng)的任何表位 的單一結(jié)合親和性。所以單克隆抗體可含有具有多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，每一位點(diǎn) 對(duì)不同的抗原決定基是免疫特異的，例如雙特異單克隆抗體。制備單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)室方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見(jiàn)，例如Harlow et al.，supra)。單克隆抗體(Mab)可通過(guò)將哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、人等針對(duì)本 發(fā)明的肽衍生物包括綴合的肽衍生物進(jìn)行免疫來(lái)制備。經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物中的抗體產(chǎn)生細(xì) 胞被分離并與骨髓瘤細(xì)胞或異源骨髓瘤細(xì)胞(heteromyeloma)融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞(雜交 瘤)。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞被用作所需單克隆抗體的來(lái)源。雖然Mab可由雜交瘤培養(yǎng)產(chǎn)生，本發(fā)明并不限制為如此?？寺∽噪s交瘤的表達(dá)性 核酸所產(chǎn)生的單克隆抗體的使用也被規(guī)劃在內(nèi)。也就是說(shuō)，可將表達(dá)雜交瘤分泌分子的核 酸轉(zhuǎn)入另一細(xì)胞系以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。該轉(zhuǎn)化體在基因型上與原始的雜交瘤不同，但也能夠產(chǎn) 生本發(fā)明的抗體分子，包括整體抗體分子的免疫活性片段，相應(yīng)于雜交瘤所分泌的那些。此 外，文獻(xiàn)中提供了在基本的免疫反應(yīng)性抗體片段上產(chǎn)生嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體及 類似變異的方法。在公開(kāi)并要求保護(hù)某類和某特異性的抗體的情況下，不管本領(lǐng)域技術(shù)人 員可構(gòu)建何種確切的變體結(jié)構(gòu)，所有這些都被認(rèn)為是在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。經(jīng)修飾的opiorphin肽可結(jié)合藥學(xué)上可接受的載體而配制到藥物組合物中。例 如，該藥物組合物適合于局部、口服，舌下、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、經(jīng)皮、或眼內(nèi) 施用及其它。
以上所述的經(jīng)修飾的opiorphin肽在疾病或病癥的治療中有用，其中尋求對(duì)膜金 屬外肽酶的活性的調(diào)節(jié)，更具體而言是對(duì)膜鋅金屬肽酶，如NEP和AP-N。天然NEP的底物主要是肽激素腦啡肽，P物質(zhì)，緩激肽，血管緊張素II及心房利 尿鈉肽，其在控制中樞及外周疼痛感知，炎癥現(xiàn)象，礦物質(zhì)交換和/或動(dòng)脈節(jié)律(arterial tone)中起關(guān)鍵作用(Roques et al. , Pharmacol Rev. 1993 ；45(1) :87-146)。更具體而言，中性內(nèi)肽酶，NEP 24-11在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)和周圍組織中均有分布， 并且在外周其在腎臟和胎盤中尤為豐富。在這些組織中，該細(xì)胞表面金屬肽酶NEP參與神 經(jīng)肽、全身免疫調(diào)節(jié)肽和肽激素的分泌后處理和代謝。NEP通過(guò)控制循環(huán)或分泌的調(diào)節(jié)肽 的活性程度來(lái)調(diào)節(jié)其生理受體介導(dǎo)的活動(dòng)。因此，膜錨定的NEP參與調(diào)節(jié)以下的活性有力 的血管活性肽，如P物質(zhì)，緩激肽(BK)，心房利尿鈉肽(ANP)和血管緊張素II(AII)；有力的 炎癥/免疫調(diào)節(jié)肽，如P物質(zhì)和BK及fMet-Leu-Phe (fMLP)；有力的阿片樣物質(zhì)神經(jīng)肽，如 Met和Leu-腦啡肽(Enk)以及有力的礦物質(zhì)交換及體液穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)肽，如ANP，C型利尿鈉肽 (CNP)，和B型利尿鈉肽(BNP)。然而這些肽的水平只有在其緊張性(tonically)釋放或受 刺激而引發(fā)釋放的區(qū)域才通過(guò)NEP誘導(dǎo)的形成/降解而改變。從綜合的角度來(lái)看，NEP的生物活性是控制肽能信號(hào)的活性水平，所述肽能信號(hào) 涉及動(dòng)脈壓調(diào)節(jié)、炎癥現(xiàn)象、情緒狀態(tài)和水-礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)、以及涉及疼痛處理的控制。從臨 床角度來(lái)看，這證實(shí)了 NEP在各種疾病狀態(tài)中是重要的藥物靶點(diǎn)這一事實(shí)。例如，通過(guò)抑 制NEP和APN，由此提高了中樞或外周的內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)的水平和活動(dòng)持續(xù)時(shí)間，可獲得 鎮(zhèn)痛效果或抗鎮(zhèn)靜劑或精神振奮劑效果。通過(guò)使用NEP和/或AP-N抑制劑來(lái)更改內(nèi)源性 調(diào)節(jié)肽濃度的主要優(yōu)勢(shì)是，藥理學(xué)作用只在由天然配體激活的受體位點(diǎn)被誘導(dǎo)，且嚴(yán)重依 賴于其在特定環(huán)境的、行為的和生理病理的壓力情況下所發(fā)生的緊張性或刺激誘發(fā)性釋放 (Roques et al，1993)。哺乳動(dòng)物膜金屬肽的例子除NEP外還有NEP2、ECE (內(nèi)皮肽轉(zhuǎn)變酶)，尤其是ECEl 和ECE2、紅細(xì)胞表面抗原KELL和與X-連鎖低磷酸性佝僂病(X-linked hypophosphatemic rickets)相關(guān)聯(lián)的PEX基因產(chǎn)物、以及AP-N(氨肽酶N)。NEP2特定地分布于神經(jīng)系統(tǒng)和生殖組織中。AP-N是在各種人體器官、組織和細(xì)胞類型(內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、白 細(xì)胞)中普遍存在的酶，且在腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中尤為豐富。經(jīng)鑒定的底物包括血管緊 張素III (Ang III)；神經(jīng)肽，包括腦啡肽和內(nèi)啡肽；和激素，包括胰激肽(kallidan)和促生 長(zhǎng)素抑制素。AP-N是多功能酶，與腫瘤發(fā)生、免疫系統(tǒng)、疼痛、動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)等相關(guān)。AP-N 也參與抗原修剪(trimming)和抗原遞呈過(guò)程。這些功能促使生物活性肽應(yīng)答的調(diào)節(jié)(疼 痛處理、血管升壓素的釋放)及影響免疫功能和主要生物學(xué)事件(細(xì)胞增殖、分泌、侵入、血 管生成)由此向多種疾病提供治療選擇。ECE的抑制在高血壓的治療和動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療中有著重要應(yīng)用。AP-N的抑制協(xié)同NEP在疼痛和抑郁、焦慮、鎮(zhèn)靜和社會(huì)-性別情緒病癥的治療中有
著重要應(yīng)用。相關(guān)膜金屬肽酶的抑制在腫瘤，即卵巢癌、結(jié)直腸癌、腦癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和 黑色素瘤的治療中有治療效果，并能降低轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化和/或高血壓的發(fā)病率。相關(guān)膜金屬肽酶的抑制在減輕疼痛中有作用。這種對(duì)急性疼痛的抗傷害作用是鎮(zhèn)痛作用，但也是對(duì)慢性炎癥疼痛如關(guān)節(jié)炎或炎性腸疾病、術(shù)后損傷及與癌癥和/或癌癥治 療相關(guān)或不相關(guān)的神經(jīng)嚴(yán)重性疼痛的作用。此外，細(xì)菌或病毒金屬肽酶的抑制預(yù)期具有抗感染作用。金屬肽酶在病原體宿主組織侵入和免疫及炎癥過(guò)程中起著重要作用，例如化膿鏈 球菌(Strptococcus pyogenes)，綠月農(nóng)桿菌(Pseudomonas aeruginosa)，牙銀口卜啉單胞菌 (Porphyromonas gingivalis)禾口嗜月市軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)白勺男|3些。此外，細(xì)菌金屬肽酶，特別是鋅金屬肽酶在由蛋白水解毒素所導(dǎo)致的疾病中起 著重要作用，如炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)的毒素(炭疽致死因子)和破傷風(fēng)梭菌 (C. tetanum)及肉毒梭菌(C. botulinum)的神經(jīng)毒素。其它金屬肽酶在各種感染如由HIV導(dǎo)致的感染中起重要作用(FR 2 707169)。在細(xì)菌性或病毒性疾病的治療中，蛋白酶抑制劑的重要性可見(jiàn)J. Potempa和 J. Travis。金屬肽酶的不同作用在Turner et al,2001 ；Kenny et al, 1977 ；Kenny et al, 1987 ；Beaumont et al，1996 中有公開(kāi)。本發(fā)明的目的之一是提供用經(jīng)修飾的opiorphin肽的鎮(zhèn)痛或抗鎮(zhèn)靜劑療法，所述 經(jīng)修飾的opiorphin肽通過(guò)在外周、脊柱和/或脊椎上水平抑制NEP和AP-N并從而增加中 樞或外周內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)包括腦啡肽的水平和活動(dòng)持續(xù)時(shí)間來(lái)發(fā)揮作用。規(guī)劃了疼痛的治療，特別是急性和慢性疼痛，內(nèi)臟的炎癥性和神經(jīng)性疼痛。任何水-礦物質(zhì)失衡的治療也是本發(fā)明的目的。在目標(biāo)病癥中，可舉出由水-礦 物質(zhì)失衡所導(dǎo)致的骨，牙齒，腎臟，甲狀旁腺，胰腺，腸，胃粘膜，前列腺和唾液腺的病癥。這些病癥特別可以是選自甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)或減退、骨質(zhì)疏松，胰腺炎，下頌下腺 結(jié)石，腎結(jié)石和骨營(yíng)養(yǎng)不良。進(jìn)一步感興趣的是受損的人際間和行為上病癥的治療。各種精神病癥在WO 02/051434中有描述。本發(fā)明尤其著眼于選自以下所組成的組的任何病癥回避障礙(avoidance disorder)、意識(shí)減退癥(decreased awareness disorder)、孤獨(dú)癥、注意力缺陷多動(dòng)癥，覺(jué) 醒障礙(arousal disorder)，入院就醫(yī)癖，對(duì)外界的人際功能和與關(guān)系受損、精神分裂樣人 格障石導(dǎo)(schizoid personality disorder)、精神分裂癥，抑郁癥(depressive disorder)、 對(duì)環(huán)境興趣減退、與性相關(guān)的社會(huì)活動(dòng)受損、以及性行為受損包括早泄、性亢進(jìn)和勃起功能 障礙。本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的肽或肽衍生物作為作為精神振奮劑的用途。相應(yīng)地是 對(duì)發(fā)作性睡眠、睡眠過(guò)度、強(qiáng)迫癥(obsessional compulsive troubles)、心境障礙諸如抑 郁癥或重癥抑郁癥(major depressive disorder)-重癥抑郁癥個(gè)別發(fā)作或重癥抑郁癥復(fù) 發(fā)、I型或II型雙相性精神障礙、情緒惡劣癥和循環(huán)性情緒障礙的預(yù)防和治療。其中尋求膜金屬肽酶的調(diào)節(jié)的疾病還包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤，炎性關(guān)節(jié) 炎和腸疾病。所涵蓋的還有感染的治療。特別是用于治療細(xì)菌性或病毒性疾病的蛋白酶抑制劑 的重要性可見(jiàn)J. Potempa和Travis。以上所述的經(jīng)修飾的opiorphin肽在控制免疫炎癥應(yīng)答中也有用。
以上所定義的經(jīng)修飾的opiorphin肽作為排鈉利尿劑或利尿劑也有用。因此，本發(fā)明有利地是提供了上述定義的肽衍生物用于治療選自由以下疾病或病 癥組成的組疼痛、抑郁癥，性相關(guān)的社會(huì)活動(dòng)受損和性行為受損。本發(fā)明的另一目的是以上所述的肽衍生物或核酸在藥物濫用特別是在嗎啡藥物 濫用的治療中作為替代物的用途。的確，研究表明，對(duì)藥物濫用的易受損性(vulnerability)和回饋(reward)及藥 物依賴的發(fā)展至少部分地是內(nèi)源阿片樣物質(zhì)系統(tǒng)中預(yù)先存在的或誘導(dǎo)修飾和/或缺陷的 結(jié)果。在這一點(diǎn)上，使用經(jīng)修飾的opiorphin肽或核酸來(lái)增強(qiáng)內(nèi)源性腦啡肽的作用將會(huì)減 少由中斷慢性嗎啡或海洛因施用而產(chǎn)生的各種副作用(停藥的體征(somatic signs of withdrawal))0可用本發(fā)明的肽衍生物治療的優(yōu)選疾病或病癥包括疼痛、抑郁癥、性相關(guān)的社會(huì) 活動(dòng)受損和性行為受損。本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥劑(agent)的使用，所述藥劑調(diào)節(jié)內(nèi)源性BPLP蛋白或成熟產(chǎn) 物，例如天然opiorphin QRFSR，與膜金屬肽之間的相互作用來(lái)用于治療性藥物組合物的制 備，該組合物是用于預(yù)防或治療其中尋求對(duì)所述膜金屬肽的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的疾病。本發(fā)明提供了依其結(jié)合BPLP蛋白或QRFSR肽的NEP和/或APN結(jié)合位點(diǎn)的能 力對(duì)化合物進(jìn)行篩選的體外方法。此過(guò)程的細(xì)節(jié)在2006年9月15日提交的美國(guó)申請(qǐng) 系列號(hào)為10/593,071有描述，其也作為WO 2005/090386公開(kāi)，以及國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/ EP2009/050567中有描述，其內(nèi)容援引加入本文。本發(fā)明的另一目的是用于確定經(jīng)修飾的opiorphin肽相對(duì)親和力的過(guò)程，所述經(jīng) 修飾的opiorphin肽特異地結(jié)合BPLP蛋白或成熟產(chǎn)物的NEP和/或AP-N結(jié)合位點(diǎn)(或是 保留BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理活性的肽)，如在2006年9月15日提交 的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)為10/593,071中所述，其內(nèi)容援引加入本文。
實(shí)施例實(shí)施例1 用于生化測(cè)定的方法對(duì)每個(gè)測(cè)定用特定底物水解的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來(lái)進(jìn)行正式的動(dòng)力學(xué)分析。對(duì)每個(gè)96孔 適應(yīng)熒光計(jì)模型(adapted fluorimetric model)，所有可分析人NEP和人AP-N酶活性的參 數(shù)都是在的初始速度測(cè)量的條件下定義的。1-人外肽酶hNEP和hAP-N的來(lái)源購(gòu)自R&D Systems的重組人NEP和重組人AP_N(缺乏它們各自的N-端細(xì)胞溶質(zhì) 和跨膜區(qū)段)，被用作純肽的來(lái)源。2-底物和合成抑制劑在體外的氨基_，羧基二 -和內(nèi)-肽酶的活性是通過(guò)測(cè)量以下合成選擇性底物的分 解來(lái)測(cè)定的特異于NEP-內(nèi)肽酶活性的內(nèi)部淬滅(quenching)的熒光底物-Abz-dR-G-L-EDDnp FRET-肽，由 Thermo-Fisher Scientif ic (德國(guó))合成。特異于NEP-羧基二肽酶活性的內(nèi)部淬滅的熒光底物-Abz-R-G-F-K-DnpOH FRET-肽，由 Thermo-Fisher Scientif ic (德國(guó))合成。
結(jié)構(gòu)上與緩激肽相關(guān)的分子內(nèi)淬滅的熒光肽-Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K- (Dnp) -OH FRET-肽(Mca-BK2)，其是一個(gè)測(cè)量NEP和ECE活性的選擇性底物，購(gòu)自R&D System。FRET是從供體熒光團(tuán)(Abz =鄰-氨基苯基或Mca = 7_甲氧基香豆素_4_基-乙 ?；?到受體熒光團(tuán)(DnpOH = 2,4- 二硝基苯基或EDDnp = 2,4- 二硝基苯基乙二胺)的 距離依賴性能量轉(zhuǎn)移。-L-丙氨酸-Mca，Ala-Mca，用于測(cè)量氨肽酶活性的熒光底物，購(gòu)自Sigma。在存在和缺少不同可用的選擇性合成肽酶抑制劑的情況下，用可溶性外肽酶對(duì)這 些底物水解率的測(cè)量可評(píng)估每種酶的特異性-Thiorphan (NEP抑制劑)(Bachem)，-苯丁抑 制素(Bestatin) (AP 抑制劑)(Calbiochem)。3-使用適合96孔適應(yīng)熒光計(jì)測(cè)定來(lái)測(cè)量肽酶活性依照初始速度測(cè)量的條件來(lái)對(duì)每個(gè)測(cè)定的時(shí)間、PH和溫育溫度以及酶和底物的 濃度進(jìn)行定義。底物的水解是在存在和缺少所測(cè)試的抑制化合物(濃度范圍從1到50 μ Μ) 的情況下，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)它們由兩種肽酶的代謝率來(lái)測(cè)量。將這些加入到預(yù)溫育的培養(yǎng)基 中。代表缺少酶時(shí)所得到的熒光信號(hào)的底物自溶的背景率被扣除，來(lái)計(jì)算以RFU(相對(duì)熒光 單位)/min表示的初始速度。用FRET特異的肽底物，Abz-dR-G-L-EDDnp，來(lái)測(cè)量NEP-內(nèi)肽酶活性。使用黑色半 區(qū)(half area) 96孔微平板，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)由在pH 7的IOOmM Tris-HCL中的酶(12. 5ng)含有 200mM NaCl組成(終體積100 μ 1)。在預(yù)溫育10分鐘后加入底物(終濃度15 μ M)， 直接在通過(guò)使用熒光計(jì)微瓶板讀數(shù)器(單色！^finite 200-Tecan單色儀)分別在 320nm和420nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)熒光信號(hào)(RFU)出峰(appearance)的動(dòng)力學(xué)分析40 分鐘(2. 3min-間隔連續(xù)測(cè)量)。在初始速度測(cè)量條件下，信號(hào)強(qiáng)度直接與反應(yīng)的20-40分鐘時(shí)間段形成的代謝物 量成比例。因此，在缺少抑制劑時(shí)，rhNEP介導(dǎo)的對(duì)Abz-dR-G-L-EDDnp的特異內(nèi)切酶解的初 始速度，由線性回歸(斜率=存在載體時(shí)NEP的活性/溫育時(shí)間)計(jì)算為8218±^78RFU/ min/ μ g rhNEP, η = 3 獨(dú)立測(cè)定。用FRET特異性肽底物Abz-R-G-F-K-DnpOH來(lái)測(cè)量NEP-羧基二肽酶的活性。使用 黑色半?yún)^(qū)96孔微平板，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)由在pH 6. 5的IOOmM Tris-HCL中的酶(2. 5ng)含有50mM NaCl組成(終體積100 μ 1)。在預(yù)溫育10分鐘后加入底物(終濃度4 μ Μ)，直接在通 過(guò)使用熒光計(jì)讀數(shù)器，在320nm激發(fā)波長(zhǎng)和420nm發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)熒光信號(hào)(RFU)出峰的動(dòng) 力學(xué)分析40分鐘(2. 3min間隔連續(xù)測(cè)量)。在初始速度測(cè)量的這些條件下，人NEP介導(dǎo)的 對(duì) Abz-R-G-F-K-DnpOH 的特異水解被評(píng)估為 59796 士 18685RFU/min/μ grhNEP，η = 4 獨(dú)立 測(cè)定。在圖5-8中，使用底物Abz-R-G-F-K-DnpOH所測(cè)定的NEP羧基二肽酶的活性被稱為 “ NEP-CDPl 活性”。此外，在與后面所述相同的實(shí)驗(yàn)條件下，將分子內(nèi)淬滅熒光肽MCa-BK2(10yM)交 由5ng rhNEP水解。在這些條件下，hNEP酶主要作為優(yōu)選切割A(yù)-F鍵的羧基二肽酶但也作 為切割G-F鍵的內(nèi)肽酶來(lái)作用于Mca-R-P-P-^zE-S-AzE-K- (Dnp) -OH0在初始速度測(cè)量的條 件下，人NEP介導(dǎo)的對(duì)Mca-BK2的特異水解被評(píng)估為121910 ±M755RFU/min/μ g rhNEP, η =3獨(dú)立測(cè)定。在圖5-8中，使用底物Abz-R-G-F-K-DnpOH所測(cè)定的NEP羧基二肽酶的活 性被稱為“NEP-CDP2活性”。
用底物Ala-Mac測(cè)量AP-N外肽酶活性。使用黑色半?yún)^(qū)96孔微平板，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)由 在pH 7的IOOmM Tris-HCL中的酶Gng)組成。在預(yù)溫育10分鐘后加入Ala-Mac底 物(終濃度25 μ M)，直接在通過(guò)使用熒光計(jì)讀數(shù)器，在380nm激發(fā)波長(zhǎng)和460nm發(fā)射 波長(zhǎng)，對(duì)信號(hào)出峰的動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)40分鐘。信號(hào)強(qiáng)度直接與反應(yīng)的10-40分鐘時(shí)間段所形成 的代謝物量成比例。在初始速度測(cè)量的這些條件下，人AP-N介導(dǎo)的對(duì)Ala-Mac的氨基蛋白 水解直接(由斜率缺少抑制劑時(shí)AP-N活性作為溫育時(shí)間的函數(shù))計(jì)算為147042士44657 RFU/min/ μ g rhAP-N，η = 3 獨(dú)立測(cè)定。其它用來(lái)測(cè)定NEP羧基二肽酶活性的FRET肽底物在Barros et al. Biol. Chem.， 2007，388 :447-455 中已有描述。實(shí)施例2 ?；瘻y(cè)定的結(jié)果1-在hNEP和hAP-N上篩選opiorphin肽衍生物化合物以50 μ M終濃度做三重測(cè)試。圖1-9顯示的是用本發(fā)明的各種肽衍生物對(duì)NEP內(nèi)肽酶和羧基二肽酶活性及AP-N 活性的生化測(cè)定結(jié)果。通過(guò)使用基于熒光的選擇性酶測(cè)定即先前在實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證的基于FRET 的酶體外模型(2009年1月18日提交的PCT申請(qǐng)，援引加入本文)，來(lái)測(cè)試各種opiorphin 肽類似物對(duì)兩種膜錨定的外酶，即NEP (特異性內(nèi)肽酶和羧基二肽酶活性)和APN的抑制潛 能。對(duì)以下化合物作了分析。在以下化合物中，NH2-表示肽的末端氨基而C00H表示 肽的末端羧酸。-NH2-QRFSR-C0NH2 (Opiorphin) ；NH2-QRGPR-C00H ；NH2-QHNPR-C00H ；NH2-QR (4 溴 F) SR-C00H (即 QRF (4Br) SR) ；NH2-QRFPR-C00H 它們顯示出對(duì)人 AP-N 的抑制偏好及對(duì)人NEP的弱抑制潛能。-N-(乙酰)QRFSR-C00H ；N- (C8-聚乙烯)QRFSR-C00H ；N-(生物素-C6-聚乙烯) QRFSR-C00H 它們顯示出對(duì)人AP-N和NEP的弱抑制潛能，具有對(duì)NEP內(nèi)肽酶活性的偏好。-NH2-dRdSdFdRdQ-C00H (逆反轉(zhuǎn)D-對(duì)映異構(gòu)體)它沒(méi)有顯示出具有AP-N活性偏 好的對(duì)人AP-N和NEP的顯著抑制活性。-NH2-YQRFSR-C00H ；NH2-Y- (C6-聚乙烯)QRFSR_C00H ；NH2-Y- (C12-聚乙烯) QRFSR-C00H 它們顯示出對(duì)人NEP內(nèi)肽酶活性的抑制偏好尤其是Y_(C12_聚乙烯)QRFSR。-NH2-QRF[S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；NH2-CQRFSR-C00H 它們是人 NEP(特異性內(nèi) 肽酶和羧基二肽酶)及AP-N的有力雙重抑制劑。其它經(jīng)修飾的opiorphin肽有NH2-CQRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；NH2-CQRF[S-0-C12-聚乙烯]R-C00H
NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFSR-C00H ；NH2-C- (C12-聚乙烯)QRFSR-C00HNH2-C- (C8-聚乙烯)QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00HNH2- [C β 2] QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00HNH2-C- (C8-聚乙烯)QRFS [ β 3R] -C00H
NH2-C [dQ] RF [S-0-C8-聚乙烯][dR] -COOHNH2-C- (C8-聚乙烯)QRFS [dR]NH2- [dC] QRF [S-0-C8-聚乙烯][dR] -COOHNH2- [C β 2] QRF [S-0-C8-聚乙烯][β 3R] -COOH[CQRFSR]2作為通過(guò)二硫鍵的半胱氨酸二肽。 2-選擇的opiorphin肽衍生物對(duì)hNEP和hAP_N的濃度依賴性抑制CQRFSR-C00H 肽(圖 9 禾口 18)CQRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo)的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 97，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 7 士 3 μ Μ。CQRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 99，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 6 士 1 μ Μ。CQRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的Ala-AMC切割r2 =0. 99，η = 30 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 0. 8士0. 1 μ Μ。CQRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca_BK2)切割r2 = 0. 99,η = 16個(gè)測(cè)定點(diǎn)， IC50 為 17士2μΜ。因此，通過(guò)與半胱氨酸氨基酸(硫醇官能團(tuán)是強(qiáng)的Si螯合基團(tuán))形成酰胺鍵來(lái)對(duì) M2zQRFSR肽的N末端位置進(jìn)行的修飾導(dǎo)致了化合物(GQRFSR肽)，其顯示出加強(qiáng)了的對(duì) hAP-N(與QRFSR天然肽相比強(qiáng)10倍)和hNEP(5倍)的抑制潛能。QRF [S-0-辛?；鵠R 肽(圖 10)QRF [S-0-C8] R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo)的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 98，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 2. 8士0. 2 μ Μ。QRF[S-0-C8]R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 99，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 12 士 5 μ Μ。QRF[S-0-C8]R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的Ala-AMC切割r2 =0. 99，η = 20 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 10 士 ΙμΜ。QRF[S-0-C8]R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca_BK2)切割r2 = 0. 99,η = 18個(gè)測(cè)定點(diǎn)， IC50 為 14士4μΜ。Υ-[氨基-十二烷-酸間隔區(qū)J-QRFSRli (圖11和19)Y (PE12) QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo)的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 98，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 10士 1 μ Μ。Y (ΡΕ 12) QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 99，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 24士2 μ Μ。Y (ΡΕ 12) QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的Ala-AMC切 割:r2 = 0. 99, η = 20 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 122士20 μ M。Y (ΡΕ 12) QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca_BK2)切割r2 = 0. 99,η = 18個(gè)測(cè)定點(diǎn)， IC50 為 31 士2μΜ。
所以，證實(shí)了 Y-(C12_聚乙烯)QRFSR對(duì)人NEP內(nèi)肽酶活性的抑制偏好。C [PE6] QRFSR 肽(PE6 =氨基己酸)(圖 20)C [PE6] QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo)的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 98，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 40 士 5 μ Μ。C[PE6]QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 99，η = 18 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 約為 217。C[PE6]QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的Ala-AMC切 割:r2 = 0. 99，η = 20 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 0. 8士0. 1 μ Μ。C[PE6]QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca_BK2)切割r2 = 0. 99,η = 18個(gè)測(cè)定點(diǎn)， IC50 約為 227 μ M0C-[氨基-十二烷-酸間隔區(qū)]_QRFSR肽(圖21)C [PE12] QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo)的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 96，η = 24 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 5. 7士0. 5 μ Μ。C[PE12]QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 97，η = 30 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 19 士 2 μ Μ。C [ΡΕ12] QRFSR-C00H肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的Ala-AMC切 割:r2 = 0. 98，η = 27 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 0. 8士0. 1 μ Μ。C-[氨基己-酸間隔區(qū)]-QRFS
R肽(圖22)C[PE6]QRF[S-0-辛?；鵠R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo) 的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 99，η = 27 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 759士56ηΜ。C [ΡΕ6] QRF [S_0_辛酰基]R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的 Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 99，η = 27 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 848 士 58ηΜ。 C [ΡΕ6] QRF [S_0_辛?；鵠R肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的 Ala-AMC 切割r2 = 0. 99，η = 24 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 1. 7士0. 1 μ Μ。在生物學(xué)相關(guān)的體外測(cè)定中，使用P物質(zhì)生理NEP底物和人細(xì)胞膜作為hNEP的來(lái) 源，C[PE6]QRF[S-0-辛?；鵠R衍生肽以濃度依賴性的方式阻止由膜結(jié)合的hNEP內(nèi)肽酶活 性介導(dǎo)的P物質(zhì)切割:r2 = 0.95，η = 13個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50為1.6±0.4μΜ(比同一測(cè)試中 的opiorphin天然肽，抑制潛能至少增加了 5倍)(圖23)。[CQRFSR] 二肽([CQRFSI ] 2)[CQRFSR] 二肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP內(nèi)肽酶活性介導(dǎo)的 Abz-dR-G-L-EDDnp 切割:r2 = 0. 87，η = 24 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 1. 4士0. 5 μ Μ。[CQRFSR] 二肽以濃度依賴性的方式阻止由rhNEP活性介導(dǎo)的Abz-R-G-F-K-DnpOH 切割:r2 = 0. 99, η = 27 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 3. 3士0. 2 μ M。[CQRFSR] 二肽以濃度依賴性的方式阻止由rhAP_N活性介導(dǎo)的Ala-AMC切割r2 = 0. 99，η = 24 個(gè)測(cè)定點(diǎn)，IC50 為 0. 8士0. 1 μ Μ。表1 各種肽和肽衍生物對(duì)NEP和AP-N活性的IC50值的總結(jié)
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式(I)的肽衍生物ζ -AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-Oh (I)， 其中-ζ是氫原子，酪氨酸，Y-[接頭]-或ai螯合基團(tuán)，諸如半胱氨酸，c-[接頭]-，N-乙 酰-半胱氨酸，N-巰基乙酰(HS-CH2-CO-)，異羥肟酸(H0-NH-C0-)或任選經(jīng)取代的羥基喹 啉，-AA1 是 Q 或 Glp，-AA2是K、R或H，優(yōu)選R，-AA3 是 Y、G、N、F 或 F(X)，優(yōu)選 F 或 F(X)，-AA4 是 P、S 或 S (OAlk)，優(yōu)選 S 或 S (OAlk)，-AA5是K或R，優(yōu)選R，-C-[接頭]-意指Cys-[NH-(CH2)n-CO]-,其中η是1-20間的整數(shù)， -Υ-[接頭]-意指Tyr-[H-(CH2)n, -C0]-，其中η，是1-20間的整數(shù)， -F(X)意指苯丙氨酸，其苯基被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代， -S(OAlk)意指絲氨酸，其羥基被線狀或分枝的具有1到20個(gè)碳原子的烷基取代， -所述AA1. AA2、AA3> AA4和AA5可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，并且AA1、AA2、AA3> AA4,和 AA5中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸、氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸；其中，如果肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任選是二聚體，前提是該肽不是 QRFSR、QHNPR、QRGPR、YQRFSR 或 GlpRFSR。
2.結(jié)構(gòu)式(II)的根據(jù)權(quán)利要求1的肽衍生物 ζ a-Q-AAa2-AAa3-P-R-0H (II)其中-ζ a是氫原子，或Si螯合基團(tuán)，諸如半胱氨酸，C-[接頭]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巰 基乙酰(HS-CH2-CO-),異羥肟酸(H0-NH-C0-)或任選經(jīng)取代的羥基喹啉， -AAa2是R或H，優(yōu)選R， -AAa3 是6、N、F 或 F(X)，優(yōu)選 F， -C-[接頭]_、F(X)和S(OAlk)如權(quán)利要求1所定義，-所述Q、AA2、AA3、P和R可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，并且Q、AA2、AA3、P和R中的任意 一個(gè)可任選為β氨基酸、氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸；其中，如果肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任選是二聚體，前提是該肽不是 QHNPR 或 QRGPR。
3.結(jié)構(gòu)式(III)的根據(jù)權(quán)利要求1的肽衍生物 ζ "-AA1-AAn2-AAn3-AAn4-AAn5-OH(III)，其中，-ζ η是氫原子、酪氨酸或Υ_[接頭]-， -AA1是Q或Glp，優(yōu)選Q， -八八^是冗或R，優(yōu)選R， -AAn3 是 Y、F 或 F(X)，優(yōu)選 F 或 F(X)， -AAn4 是 S 或 S (OAlk)，-八八 是冗或R，優(yōu)選R，-Y-[接頭]_、F(X)和S(OAlk)如權(quán)利要求1所定義，-上述AA” AA2, AA3> AA4和AA5可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，并且AA” AA2, AA3> AA4和 AA5中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸、氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸； 前提是此肽不是 QRFSR、QHNPR、YQRFSR 或 GlpRFSR。
4.結(jié)構(gòu)式(IV)的根據(jù)權(quán)利要求1的肽衍生物 ζ "-Q-R-AAm3-AAm4-R-OH (IV)，其中，-ζ m是氫原子，或Si螯合基團(tuán)，諸如半胱氨酸，C-[接頭]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巰 基乙酰(HS-CH2-CO-),異羥肟酸(H0-NH-C0-)或任選經(jīng)取代的羥基喹啉， -八八-3是？或F(X)，優(yōu)選F(X)， -AAm4 是 S 或 S (OAlk)，優(yōu)選 S 或 S (OAlk)， -C-[接頭]_、F(X)和S(OAlk)如權(quán)利要求1所定義， -所述Q、R、AA3> AA4和R可獨(dú)立地是L構(gòu)型或D構(gòu)型，并且Q、R、AA3, AA4和R中的任意一個(gè)可任選為β氨基酸、氮雜氨基酸或β-氮雜氨基酸；其中，如 果該肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任選是二聚體，前提是此肽不是QRFSR或 YQRFSR0
5.權(quán)利要求1的肽衍生物，其是 QRFSR-NH2 ；QR-F[4Br]-SR，其中-打4Br]_是苯丙氨酸，其苯基在對(duì)位被溴原子取代； QRFPR ；(乙酰)-QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 8-C0-) -QRFSR ；生物素-(-HN- (CH2) 6-C0-) -QRFSR ；dR-dS-dF-dR-dQ ；Y- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRFSR ；Y- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFSR ；QRF-S (0-辛?；?-R;CQRFSR ；CQRF-S (0-辛?；?-R;CQRF-S (0-月桂基)-R;C- (-HN- (CH2) 8-C0-) -QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 8-C0-) -QRF-S (0-辛酰基)-R ；[C β 2] QRF-S (0-辛?；?-R;C- (-ΗΝ- (CH2) 8-C0-) -QRFS- [ β 3R]；0[(10]-1^-5(0-辛?；?-[(1幻；C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[dR]；[dC] -QRF-S (0-辛?；?-[dR]；[C β 2] -QRF-S (0-辛?；?-[β 3R]；[cqrfsr]2 ；QRYSR ；QR-打4F]-SR，其中-打4F]-是苯丙氨酸，其苯基在對(duì)位被氟原子取代； QR-F[4Br]-SR，其中-打4Br]_是苯丙氨酸，其苯基在對(duì)位被溴原子取代； QKFSR ； QRFSK ；C- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRFSR ；C- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRF-S (0-辛?；?-R ；C (-HN- (CH2) 12-C0-) QRF-S (0-辛酰基)-R ；C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFS-dR ；C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRF-S (0-辛?；?-β 3R ；C- (-ΗΝ- (CH2) 8-C0-) -QRF-S (0-辛?；?-β 3R ；其中c β 2 是 h2n (-ch2-sh) -ch2-co-； β 3r 是-nh-ch2-c [- (ch2) 3-nh_c (nh) (nh2) ] -cooh ； -S (-0-辛酰基)意指絲氨酸，其羥基被辛?；〈?， -s(-o-月桂基)意指絲氨酸，其羥基被月桂基取代。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的肽衍生物，其具有對(duì)中性內(nèi)肽酶NEP和/或氨肽酶AP-N的 抑制潛能。
7.權(quán)利要求2的肽衍生物，其具有對(duì)人AP-N的抑制潛能。
8.權(quán)利要求3的肽衍生物，其具有對(duì)人NEP的抑制潛能。
9.權(quán)利要求4的肽衍生物，其是中性內(nèi)肽酶NEP和氨肽酶AP-N的雙重抑制劑。
10.一種組合物，包含至少一種權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的肽衍生物和藥學(xué)上可接受的載體。
11.一種對(duì)需要治療的對(duì)象的疾病或病癥進(jìn)行治療的方法，其中尋求對(duì)膜金屬外肽酶 活性的調(diào)節(jié)，該方法包含以一定劑量向該對(duì)象施用權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的一種或多種 肽衍生物以治療所述疾病或病癥。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述膜金屬外肽酶是膜鋅金屬肽酶。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述膜金屬外肽酶是NEP和/或AP-N。
14.權(quán)利要求11到13任一項(xiàng)的方法，用于治療選自以下所組成的組的疾病或病癥疼 痛、抑郁癥、與性相關(guān)的社會(huì)活動(dòng)受損和性行為受損。
15.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)所定義的肽衍生物，用于其中尋求膜金屬外肽酶活性調(diào)節(jié)的 疾病或病癥的治療。
16.權(quán)利要求15的肽衍生物，其中所述膜金屬外肽酶是膜鋅金屬肽酶。
17.權(quán)利要求15或16的肽衍生物，其中所述膜金屬外肽酶是NEP和/或AP-N。
18.權(quán)利要求15到17任一項(xiàng)的肽衍生物，用于治療選自以下所組成的組的疾病或病 癥疼痛、抑郁癥、與性相關(guān)的社會(huì)活動(dòng)受損和性行為受損。
19.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的肽衍生物的序列，其中所述肽衍生物由天然氨基酸組成。
20. 一種針對(duì)權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)所定義的肽衍生物的抗體。
全文摘要
現(xiàn)有發(fā)明涉及作為金屬外肽酶新抑制劑的經(jīng)修飾的opiorphin肽。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102083851SQ200980121293
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者C·魯若 申請(qǐng)人:巴斯德研究院