專利名稱：選擇性高親和力多齒配體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向分子的研制。更具體地，本發(fā)明涉及可以以類似于抗體和/或肽 配體的方式使用的選擇性高親和力多齒配體(SHAL)的研制，所述多齒配體作為親和試劑 或用于診斷和治療多種疾病(例如，癌癥)。
背景技術(shù)：
總體而言，已發(fā)現(xiàn)諸如化學(xué)治療劑之類的殺癌藥物對(duì)正常組織的細(xì)胞也具有毒 性。因此，這些藥物的副作用可以對(duì)患者具有幾乎如同惡性病本身一樣程度的害處。多克 隆抗體和肽配體的出現(xiàn)提供了改進(jìn)藥物特異性/選擇性的新方法。通過(guò)將例如細(xì)胞毒性劑 與針對(duì)存在于惡性細(xì)胞但不存在于正常細(xì)胞的抗原的抗體或肽配體共軛，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)于 惡性細(xì)胞的選擇性殺傷。已經(jīng)制備了許多針對(duì)多種細(xì)胞表面抗原的包含與細(xì)胞毒性劑連接 的抗體的不同免疫共軛物。用于這些免疫共軛物的細(xì)胞毒性劑包括放射性同位素、多種植物和細(xì)菌毒素(例 如，假單胞菌外毒素、白喉毒素、篦麻毒素、相思豆毒素等)、多種生長(zhǎng)因子以及最近的諸如 半胱天冬酶之類的制劑。盡管已經(jīng)取得了 一些成功，特別是在淋巴瘤和白血病方面，但是無(wú) 論是單獨(dú)使用抗體還是使用免疫共軛物的基于抗體的治療通常都沒(méi)有實(shí)現(xiàn)預(yù)期的潛力。盡管在惡性病的治療中已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但是用于大多數(shù)患者的治愈性方 案尚未被研制研究出或者與對(duì)于患者來(lái)說(shuō)無(wú)癮毒性有關(guān)。因此，需要用于治療大多數(shù)惡性 病的新策略。這些策略應(yīng)該將毒性最小化與治療作用最大化結(jié)合起來(lái)作為其目標(biāo)。一種方 法涉及使用細(xì)胞表面受體的特異性配體或惡性細(xì)胞相關(guān)抗原的特異性抗體作為將藥物或 放射性同位素靶向惡性細(xì)胞的方式。該方法對(duì)于治療許多惡性病來(lái)說(shuō)具有吸引力，這是因 為惡性細(xì)胞在其細(xì)胞表面呈現(xiàn)了多種可用于靶向的腫瘤限制的或上調(diào)的抗原和/或受體。 迄今，已發(fā)現(xiàn)抗體/抗原系統(tǒng)優(yōu)于配體受體系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈儽仁荏w更受限制并且在惡性細(xì) 胞上具有更大的豐度。盡管抗體具有這些優(yōu)點(diǎn)，但是因?yàn)樵S多原因尚未實(shí)現(xiàn)其潛力。在這些原因中，抗體 是通常不有效接近并穿透惡性腫瘤的高分子(大分子)。另外，抗體通常是大的免疫原性分 子，可誘導(dǎo)患者針對(duì)該治療劑的免疫反應(yīng)。另外，抗體通常不顯示對(duì)于靶(例如，癌癥)組 織的足夠的特異性，因此僅可用于有限的治療方案。

發(fā)明內(nèi)容
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了新型選擇性高親和力多齒配體(SHAL)，SHAL可 以以類似于抗體結(jié)合的方式起到特異性結(jié)合特定靶分子的作用。本發(fā)明描述了設(shè)計(jì)和生成 SHAL的方法以及將SHAL施用于患有感染性和/或惡性疾病的患者的方法，所述SHAL作為 用于基礎(chǔ)性研究或應(yīng)用性研究或用于診斷和治療感染性疾病和/或惡性疾病的親和試劑。SHAL通常包括兩個(gè)或兩個(gè)以上配體(結(jié)合部分(binding moiety))，各配體結(jié)合 至期望的靶上的不同區(qū)域，所述區(qū)域彼此之間直接連接或通過(guò)連接體連接。在SHAL針對(duì)癌 細(xì)胞上的標(biāo)志物的情況中，相對(duì)于正常細(xì)胞，SHAL以較大的密度(豐度)或趨近性在靶細(xì) 胞上結(jié)合。因此，SHAL具有適于診斷或治療靶細(xì)胞的選擇性。可容易地生成不同SHAL用 于不同惡性細(xì)胞和惡性疾病。SHAL表現(xiàn)了核心構(gòu)建塊(例如，靶向部分)，所述核心構(gòu)建塊 可摻入較大的分子(例如嵌合分子)以影響向靶特異性遞送效應(yīng)劑。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合靶分子的選擇性高親和 力多齒配體(SHAL)的制備方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法通常涉及下述步驟篩選第 一配體文庫(kù)以鑒定結(jié)合靶分子的第一配體；篩選第二配體文庫(kù)以鑒定結(jié)合靶分子的第二 配體，其中，第二配體不同于第一配體；使第一配體與第二配體連接以形成SHAL ；以及篩選 SHAL特異性結(jié)合靶分子的能力。在一些實(shí)施方式中，靶分子是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式 中，靶分子是癌癥標(biāo)志物(例如，Lym-I 表位、Muc-I、C-myc、p53、Ki67、Her2、Her4、BRCAl、 BRCA2、Lewis Y,CA 15-3、G250、HLA_DR 細(xì)胞表面抗原，CEA、CD20、CD22、整合素、癌胚抗原、 16、EGFr, AR、PSA以及其他生長(zhǎng)因子受體等)。所述方法還可任選地進(jìn)一步包括篩選SHAL 以鑒定以高于含有SHAL的任一配體的親和力和/或特異性結(jié)合靶的SHAL。第一配體文 庫(kù)和第二配體文庫(kù)可為相同的文庫(kù)或可為不同的文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，第一和/或第 二配體文庫(kù)是有機(jī)小分子文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，篩選第一配體文庫(kù)和/或篩選第二配 體文庫(kù)包括計(jì)算機(jī)虛擬篩選。計(jì)算機(jī)虛擬篩選可包括使用用于DOCK程序的一種或一種以 上算法篩選化合物數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，MDL Available Chemicals Directory, ChemSpider, GNU-Darwin) 0計(jì)算機(jī)虛擬篩選可包括使用DOCK程序篩選化合物數(shù)據(jù)庫(kù)。計(jì)算機(jī)虛擬篩選 可包括篩選結(jié)合蛋白質(zhì)上的“口袋(pocket)”的第一配體和/或多個(gè)配體。在一些實(shí)施方 式中，使用SPHGEN程序的算法來(lái)鑒定“口袋”。在一些實(shí)施方式中，使用SPHGEN程序來(lái)鑒定 “ 口袋”。計(jì)算機(jī)虛擬篩選可包括篩選第二配體或第三配體，與篩選第一配體文庫(kù)時(shí)鑒定的 配體相比，該第二配體或該第三配體結(jié)合靶的不同區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，篩選第一配體文庫(kù)和/或篩選第二配體文庫(kù)還包括在物理測(cè) 定中篩選計(jì)算機(jī)虛擬篩選所鑒定的一種或一種以上配體結(jié)合靶的能力。合適的物理測(cè)定包 括但不限于BIAcore測(cè)定、飽和轉(zhuǎn)移差異核磁共振光譜法、轉(zhuǎn)移核歐沃豪斯效應(yīng)(trNOE)核 磁共振光譜法、ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定、組織結(jié)合測(cè)定、活細(xì)胞結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞提取物測(cè)定等。配體的連接可包括直接連接兩個(gè)或兩個(gè)以上配體或使用連接體(例如，PEG型連 接體、肽連接體、親和素/生物素連接體、直鏈碳連接體、雜環(huán)連接體、支鏈碳連接體、樹(shù)狀 聚合物、核酸連接體、硫醇連接體、酯連接體、包含胺的連接體、包含羧基的連接體等)連接 兩個(gè)或兩個(gè)以上配體。所述連接可任選包括下述步驟使用不同長(zhǎng)度的連接體連接兩個(gè)或 兩個(gè)以上配體以產(chǎn)生具有不同長(zhǎng)度連接體的SHAL文庫(kù)；任選地，篩選具有不同長(zhǎng)度連接體的SHAL文庫(kù)以鑒定文庫(kù)中對(duì)于靶具有最高親和力和/或特異性的成員。在一些實(shí)施方式 中，所述方法還涉及包括篩選SHAL以鑒定出以高于含有SHAL的任一配體的親和力和/或 特異性結(jié)合靶的SHAL。篩選單個(gè)配體和/或二價(jià)或多價(jià)SHAL可通過(guò)多種方法中的任何 方法，所述多種方法包括但不限于=BIAcore測(cè)定、飽和轉(zhuǎn)移差異核磁共振光譜法、轉(zhuǎn)移核 歐沃豪斯效應(yīng)(trNOE)核磁共振光譜法、ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定、組織結(jié)合測(cè)定、活細(xì)胞結(jié)合測(cè) 定、細(xì)胞提取物測(cè)定等。在一些實(shí)施方式中，靶分子是蛋白質(zhì)和/或癌癥標(biāo)志物(例如，Lyml 表位、Muc-1、C-myc、p53、Ki67、Her2、Her4、BRCAl、BRCA2、Lewis Y、CA 15-3、G250、HLA-DR 細(xì)胞表面抗原等)。本發(fā)明還提供了 一種酶或其他結(jié)合蛋白或受體的抑制劑的合成方法。在一些實(shí)施 方式中，所述方法通常涉及鑒定酶或其他結(jié)合蛋白或受體中第一“ 口袋”(或“隆起”)和第 二或第三“ 口袋”(或”隆起”)，其中，第一、第二和第三“口袋”側(cè)鄰所述酶或其他結(jié)合蛋白 或受體的活性位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)側(cè)；篩選第一配體文庫(kù)以鑒定結(jié)合第一“口袋”(或” 隆起”)的第一配體；篩選第二配體文庫(kù)以鑒定結(jié)合第二“ 口袋”(或”隆起”)的第二配體； 篩選第三配體文庫(kù)以鑒定結(jié)合第三“ 口袋”(或”隆起”)的第三配體；使第一配體與第二和 第三配體連接以形成選擇性高親和力多齒配體(SHAL)；以及篩選SHAL的特異性結(jié)合并抑 制酶或其他結(jié)合蛋白的能力。在一些實(shí)施方式中，“ 口袋”或“隆起”不必須位于酶或結(jié)合蛋 白或受體的活性位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)側(cè)，而其位置僅使得SHAL的結(jié)合阻斷天然同源配 體與該位點(diǎn)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，靶分子包括選自下列的分子蛋白質(zhì)、酶、核酸、核酸 結(jié)合蛋白以及碳水化合物。在一些實(shí)施方式中，所述方法還涉及篩選SHAL以鑒定出以高于 組成SHAL的任一配體的親和力和/或特異性結(jié)合靶的SHAL。第一、第二以及第三配體文庫(kù) 可為相同的文庫(kù)或可為不同的文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，第一和/或第二和/或第三配體 文庫(kù)為有機(jī)小分子文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，篩選第一、第二和/或第三配體文庫(kù)包括計(jì)算 機(jī)虛擬篩選。計(jì)算機(jī)虛擬篩選可包括使用DOCK程序的一種或一種以上算法篩選化合物數(shù) 據(jù)庫(kù)(例如，MDL,⑧Avai lable Chemicals Directory)。計(jì)算機(jī)虛擬篩選可包括使用DOCK 程序篩選化合物數(shù)據(jù)庫(kù)。計(jì)算機(jī)虛擬篩選可涉及篩選結(jié)合蛋白質(zhì)上的“ 口袋”的第一、第二 和/或第三配體。在一些實(shí)施方式中，使用SPHGEN程序的算法鑒定“口袋”。在一些實(shí)施方 式中，使用SPHGEN程序鑒定“口袋”。計(jì)算機(jī)虛擬篩選可涉及篩選第二配體，與篩選第一配 體文庫(kù)時(shí)鑒定的配體相比，該第二配體結(jié)合靶的不同區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，篩選第一、第二或第三配體文庫(kù)和/或篩選第二配體文庫(kù)還 包括在物理測(cè)定中篩選計(jì)算機(jī)虛擬篩選所鑒定的一種或一種以上配體結(jié)合靶的能力。合適 的物理測(cè)定包括但不限于=BIAcore測(cè)定、飽和轉(zhuǎn)移差異核磁共振光譜法、轉(zhuǎn)移核歐沃豪斯 效應(yīng)(trNOE)核磁共振光譜法、ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定、組織結(jié)合測(cè)定、活細(xì)胞結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞 提取物測(cè)定等。配體的連接可涉及直接連接兩個(gè)或兩個(gè)以上配體或使用連接體(例如，PEG型連 接體、肽連接體、親和素/生物素連接體、直鏈碳連接體、雜環(huán)連接體、支鏈碳連接體、樹(shù)狀 聚合物、核酸連接體、巰基連接體、酯連接體、包含胺的連接體、包含羧基的連接體等)連接 兩個(gè)或兩個(gè)以上配體。所述連接可任選包括下述步驟使用不同長(zhǎng)度的連接體連接配體以 產(chǎn)生具有不同長(zhǎng)度連接體的SHAL文庫(kù)；以及任選地，篩選具有不同長(zhǎng)度連接體的SHAL文庫(kù) 以鑒定文庫(kù)中對(duì)于靶具有最高親和力和/或特異性的成員。
本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合期望的靶(例如，癌細(xì)胞)的選擇性高親和力多齒配 體(SHAL)。在靶是癌細(xì)胞的情況中，SHAL通常包含結(jié)合癌細(xì)胞標(biāo)志物上第一位點(diǎn)的第一 配體，該第一配體與第二或第三配體連接，所述第二或第三配體結(jié)合癌細(xì)胞相同標(biāo)志物或 不同標(biāo)志物上的第二或第三位點(diǎn)(在第一位點(diǎn)、第二位點(diǎn)以及第三位點(diǎn)是不同位點(diǎn)的情況 中)(例如，所有三種配體均能夠同時(shí)結(jié)合靶)。在一些實(shí)施方式中，第一位點(diǎn)、第二位點(diǎn)和 /或第三位點(diǎn)是標(biāo)志物上的“ 口袋”(或”隆起”)。合適的標(biāo)志物包括但不限于Lym-I表位、 Muc-I、C-myc、p53、Ki67、Her2、Her4、BRCAl、BRCA2、Lewis Y、CA 15-3, G250、HLA-DR 細(xì)胞 表面抗原、CEA、CD20、CD22、整合素、CEA、16、EGFr、AR、PSA、其他生長(zhǎng)因子受體等。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)志物是HLA-DR細(xì)胞表面抗原。在一些實(shí)施方式中， 所述三種配體結(jié)合由Lym-I或其他HLA-DR特異性抗體識(shí)別的表位中的位點(diǎn)。在一些實(shí)施方 式中，所述三種配體各自為有機(jī)小分子。在一些實(shí)施方式中，第一配體是選自表1的配體， 第二和第三配體(當(dāng)存在時(shí))獨(dú)立地選自表1、5、6、7或8中的配體。在一些實(shí)施方式中， SHAL包括選自表2、3或4的第一、第二和/或第三配體。在一些實(shí)施方式中，SHAL包括選 自表4的第一、第二和/或第三配體。所述三種配體可直接連接在一起，或者第一配體可通 過(guò)連接體(例如，PEG型連接體、肽連接體、親和素/生物素連接體、直鏈碳連接體、雜環(huán)連 接體、支鏈碳連接體、樹(shù)狀聚合物、核酸連接體、巰基連接體、酯連接體、包含胺的連接體、包 含羧基的連接體等)與第二和/或第三配體連接。在一些實(shí)施方式中，SHAL對(duì)于標(biāo)志物具 有大于約KTfiM的親和力，而組成SHAL的單個(gè)配體各自對(duì)于標(biāo)志物具有小于約KTfiM的結(jié)合 親和力。在一些實(shí)施方式中，SHAL具有本文和附圖中顯示的化學(xué)式，或是其類似物。本發(fā)明還提供了包含與效應(yīng)劑(例如，附加表位、第二 SHAL、抗體、標(biāo)記物、細(xì)胞 毒素、脂質(zhì)體、放射性核素、藥物、前藥、病毒顆粒、細(xì)胞因子以及螯合劑)連接的本發(fā)明所 述的SHAL的嵌合分子。在一些實(shí)施方式中，所述效應(yīng)劑選自親和素和生物素的附加表位。 在一些實(shí)施方式中，所述效應(yīng)劑選自下述的細(xì)胞毒素白喉毒素、假單胞菌外毒素、篦麻毒 素、相思豆毒素以及胸苷激酶。在一些實(shí)施方式中，所述效應(yīng)劑是包含選自下述金屬同位素 的螯合劑 ^TCPb^Ga^Gd、11、、113!!^、97!^、62^!、64^!、52!^、52"!!!、51^·、18^、·!^、 77AS、90Y、67CU、lfi9Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198AU、199AU、161Tb、1(l9Pd、1MDy、149fti、151Pm、153Sm、 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh 以及 mAg。在一些實(shí)施方式中，效應(yīng)劑是包含 α發(fā)射體(例如，鉍213)的螯合劑。在一些實(shí)施方式中，效應(yīng)劑是包含DOTA的螯合劑。在 一些實(shí)施方式中，效應(yīng)劑是脂質(zhì)或脂質(zhì)體(例如，含有藥物的脂質(zhì)體)。在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，所述制劑包含本發(fā)明所述的 特異性結(jié)合癌細(xì)胞的選擇性高親和力多齒配體(SHAL)和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些 實(shí)施方式中，所述制劑可作為單位劑型制劑提供。在一些實(shí)施方式中，所述制劑可作為時(shí)間 釋放制劑來(lái)提供。本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，所述制劑包含含有本發(fā)明所述的SHAL的嵌合分 子和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方式中，所述制劑可作為單位劑型制劑提供。在 一些實(shí)施方式中，所述制劑可作為時(shí)間釋放制劑來(lái)提供。本發(fā)明提供了用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法。所述方法通常包括使癌細(xì)胞 (例如，轉(zhuǎn)移細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等)與特異性結(jié)合癌細(xì)胞的選擇性高親和力多齒配體(SHAL)接 觸和/或與含有特異性結(jié)合連接至效應(yīng)劑(例如，藥物、脂質(zhì)體、細(xì)胞毒素、放射性核素或螯合劑)的癌細(xì)胞的選擇性高親和力多齒配體(SHAL)的嵌合分子接觸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合期望的靶的SHAL。所述靶可為期望 生成結(jié)合部分的任何靶。所述SHAL通常包含直接連接或通過(guò)連接體連接的兩個(gè)或兩個(gè)以 上配體，其中，在第一、第二和/或第三位點(diǎn)是不同位點(diǎn)的情況中，第一配體結(jié)合所述靶上 的第一位點(diǎn)，第二和/或第三配體結(jié)合靶上的相同靶標(biāo)志物的第二和/或第三位點(diǎn)(例如， 所有三種配體均能夠同時(shí)結(jié)合靶)。在一些實(shí)施方式中，第一、第二和/或第三位點(diǎn)是靶上 的“口袋”(或”隆起”)。在一些實(shí)施方式中，第一、第二和/或第三位點(diǎn)位于相同的靶分子 上。本發(fā)明還提供了各種檢測(cè)方法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)癌細(xì) 胞的方法。所述方法通常包括以下步驟使癌細(xì)胞與包含特異性結(jié)合連接至可檢測(cè)標(biāo)記物 (例如，Y發(fā)射體、正電子發(fā)射體、X射線發(fā)射體、α發(fā)射體、熒光發(fā)射體等)的癌細(xì)胞(例 如，結(jié)合癌癥標(biāo)志物)的SHAL的嵌合分子接觸，并檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記物是否存在。在一些實(shí)施 方式中，所述方法通常包括以下步驟使癌細(xì)胞與包含特異性結(jié)合連接至附加表位的癌細(xì) 胞(例如，結(jié)合癌癥標(biāo)志物)的SHAL的嵌合分子接觸；使所述嵌合分子與包含可檢測(cè)部分 的螯合劑接觸，由此所述螯合劑結(jié)合附加表位，從而使所述可檢測(cè)部分與所述螯合劑結(jié)合； 以及檢測(cè)所述可檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方式中，所述可檢測(cè)部分是放射性核素(例如，Y 發(fā)射體、正電子發(fā)射體、α發(fā)射體、X射線發(fā)射體等)。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)包括外 部成像和/或內(nèi)部成像。在一些實(shí)施方式中，所述可檢測(cè)部分包括選自下述的金屬同位素 99TC、2°3Pb、67Ga、68Ga、72AS、mIn、113mIn、97RU、62CU、641CU、5￥e、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77AS、90Y、 67CU、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198AU、199AU、161Tb、1(l9Pd、165Dy、149Rii、151Pm、153Sm、157Gd、1H3Gd、 166Ho,172Tm^169Yb,175Yb,177Lu^105Rh以及mAg。在一些實(shí)施方式中，所述螯合劑包括D0TA。在 一些實(shí)施方式中，所述附加表位是親和素或生物素。本發(fā)明還考慮了用于制備和/或使用本發(fā)明的SHAL和/或包含本發(fā)明的SHAL的 嵌合分子的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒包括含有本發(fā)明所述的SHAL的容器和 /或含有用于組裝成本發(fā)明所述的SHAL的配體的容器。類似物還可任選包括一種或一種以 上連接體、一種或一種以上效應(yīng)劑(螯合劑，放射性核素等)，等等。在一些實(shí)施方式中，所 述SHAL處于藥理學(xué)上可接受的賦形劑中。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明明確排除了組成SHAL的結(jié)合部分為抗體、單鏈抗體等 情況下的SHAL。在一些實(shí)施方式中，SHAL不是多價(jià)抗體或多價(jià)單鏈抗體。在一些實(shí)施方式 中，所述組成SHAL的配體不是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明明確排除了組成SHAL的 結(jié)合部分優(yōu)先和/或特異性結(jié)合核酸的情況下的SHAL。在一些實(shí)施方式中，所述組成SHAL 的配體為有機(jī)小分子。定義術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”是指諸如酶/底物、受體/激動(dòng)劑、抗體/抗原以 及凝集素/碳水化合物之類的配對(duì)物之間發(fā)生的結(jié)合，所述結(jié)合可由共價(jià)和/或非共價(jià)相 互作用介導(dǎo)。當(dāng)兩種物質(zhì)的相互作用通常產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物時(shí)，所發(fā)生的結(jié)合通常為 靜電和/或氫鍵合和/或親脂相互作用的結(jié)果。因此，在產(chǎn)生結(jié)合復(fù)合物(bound complex) 的兩種物質(zhì)之間具有相互作用的情況中，物質(zhì)對(duì)之間產(chǎn)生“特異性結(jié)合”。具體地，所述特異 性結(jié)合的特征是與特定物質(zhì)所屬的化合物家族中的其他物質(zhì)的結(jié)合相比，物質(zhì)對(duì)的一個(gè)成員與該特定物質(zhì)優(yōu)先結(jié)合。因此，例如，配體可顯示對(duì)于HLA-DRlO分子上的特定“ 口袋” 的親和力比對(duì)于相同或相關(guān)蛋白質(zhì)上的不同“口袋”的親和力要大至少兩倍、優(yōu)選至少10 倍、更優(yōu)選至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“配體”或“結(jié)合部分”通常是指結(jié)合特定靶分子并形成如上所 述的結(jié)合復(fù)合物的分子。所述結(jié)合可為高度特異性結(jié)合，然而，在一些實(shí)施方式中，單個(gè)配 體與靶分子的結(jié)合可具有較低的親和力和/或特異性。配體及其相應(yīng)靶分子形成特定的結(jié) 合對(duì)。配體的實(shí)例包括但不限于有機(jī)小分子、糖、凝集素、核酸、蛋白質(zhì)、抗體、細(xì)胞因子、受 體蛋白、生長(zhǎng)因子、核酸結(jié)合蛋白等，它們特異性結(jié)合期望的靶分子、靶分子集合、靶受體、 靶細(xì)胞等。術(shù)語(yǔ)“有機(jī)小分子”是指其尺寸與通常用于藥物制劑的那些有機(jī)分子具有可比性 的分子。該術(shù)語(yǔ)排除了天然的生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸等)。優(yōu)選的有機(jī)小分子的 尺寸范圍為約5000Da，更優(yōu)選為2000Da，最優(yōu)選為約lOOODa。術(shù)語(yǔ)“配體文庫(kù)”是指配體或潛在配體的集合(例如，多個(gè))。所述配體文庫(kù)可為 配體的實(shí)際物理文庫(kù)和/或數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，包含對(duì)于多個(gè)潛在配體的說(shuō)明的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)， 例如 MDL Available Chemicals Directory，ChemSpider 等)。術(shù)語(yǔ)“SHAL”是指包含多個(gè)配體的分子，各配體結(jié)合SHAL定向的靶分子的不同區(qū) 域。所述配體直接連接在一起或通過(guò)連接體連接，形成通常顯示對(duì)靶分子高親和力的多齒 部分。在一些實(shí)施方式中，SHAL包含以低親和力結(jié)合其靶的兩個(gè)或兩個(gè)以上配體(例如， < IO-fiM和/或在數(shù)秒或更短時(shí)間內(nèi)解離)，當(dāng)所述配體偶聯(lián)在一起時(shí)形成以高親和力結(jié)合 靶的SHAL (例如，> 10、，或> 10_1或> 10、，或緩慢解離，例如數(shù)小時(shí)至數(shù)天解離)。當(dāng)用于SHAL時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多齒”表示SHAL包含兩個(gè)或兩個(gè)以上配體。所述配體通常 結(jié)合SHAL定向的靶的不同部分。當(dāng)用于SHAL時(shí)，術(shù)語(yǔ)“二齒”、“三齒”等是指由兩個(gè)配體組成的SHAL、由三個(gè)配體 組成的SHAL，等等。術(shù)語(yǔ)“多價(jià)SHAL”是指其中兩個(gè)或兩個(gè)以上SHAL連接在一起的分子(例如，兩個(gè) 或兩個(gè)以上二齒SHAL)。因此，例如二價(jià)SHAL是指其中兩個(gè)SHAL連接在一起的分子。三價(jià) SHAL是指其中三個(gè)SHAL連接在一起的分子，等等。在圖14中描述了二齒SHAL JP459B的 二價(jià)形式?！岸嗵禺愋許HAL”是指兩個(gè)或兩個(gè)以上SHAL連接在一起，其中，各個(gè)SHAL為多齒， 且任一者或兩者可為多價(jià)合成(或以其他方式生成)，這樣它們具有各個(gè)SHAL的兩個(gè)或兩 個(gè)以上靶(多聚配體集合)。例如，可使用HLA-DR的空穴(cavity)和CDXX (例如CD20或 ⑶22)或所有這三者等上的空穴的兩個(gè)或兩個(gè)以上配體來(lái)合成SHAL。另一個(gè)實(shí)例涉及連 接MUC-1SHAL和抗淋巴瘤SHAL，這是因?yàn)橐恍┝馨土鲞^(guò)表達(dá)傳統(tǒng)的HLA-DR和⑶受體以及 MUC-I (上調(diào)的)。在單價(jià)或二價(jià)SHAL靶向惡性細(xì)胞和單價(jià)或二價(jià)第二分子捕獲隨后遞送 的制劑(例如DOTA螯合的放射性金屬或前藥)期望通過(guò)第一 SHAL激活運(yùn)輸至所述惡性細(xì) 胞的藥物的情況中，使用HLA-DR的空穴和螯合劑(例如DOTA等)的空穴的兩個(gè)或兩個(gè)以 上配體來(lái)合成SHAL。當(dāng)用于例如篩選方法時(shí)，術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)虛擬”是指在不對(duì)主題部分(subject moiety)實(shí)際物理篩選的情況下實(shí)施的方法。通常，計(jì)算機(jī)虛擬篩選計(jì)算完成，例如利用特定的有關(guān)的分子模型。在一些實(shí)施方式中，所述虛擬方法可使用主題分子的物理模型和/ 或通過(guò)簡(jiǎn)單的目測(cè)觀察和操作來(lái)實(shí)施。詞語(yǔ)“SHAL的靶”是指待由二齒或多齒SHAL特異性結(jié)合的部分。詞語(yǔ)“見(jiàn)于......的算法”(例如“見(jiàn)于SPHGEN的算法”)是指由參考軟件實(shí)施
(可見(jiàn)于參考軟件)的算法。然而，所述算法可人工或通過(guò)不同于參考軟件的程序來(lái)進(jìn)行， 并且仍舊表現(xiàn)為使用見(jiàn)于參考軟件的算法。當(dāng)指蛋白質(zhì)中的“口袋”時(shí)，術(shù)語(yǔ)“ 口袋”是指由于肽鏈折疊成使得蛋白質(zhì)具有功能 性的三維結(jié)構(gòu)而在蛋白質(zhì)分子表面產(chǎn)生的空穴、凹陷或凹窩。通過(guò)觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或 通過(guò)利用可商購(gòu)獲得的建模軟件(例如，DOCK)可容易地識(shí)別“口袋”。術(shù)語(yǔ)“癌癥標(biāo)志物”是指可用于癌癥診斷和預(yù)后判斷的諸如蛋白質(zhì)之類的生物分 子。本文使用的“癌癥標(biāo)志物”包括但不限于PSA、人絨毛膜促性腺激素、α胎兒蛋白、癌胚 抗原、癌癥抗原(CA)125、CA 15-3、CD20、CDH13、CD 31、CD34、CD105、CD146、D16S422HER_2、 磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)、胰蛋白酶、與α (1)-抗胰蛋白酶復(fù)合的胰蛋白酶-1、雌 激素受體、孕酮受體、c-erbB-2、bcl_2、S期級(jí)分(SPF)、pi邪erbB_2、低親和力胰島素樣生 長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、尿組織因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞 凋亡蛋白(p53、Ki67)、因子VIII、粘附蛋白(CD-44、唾液酸化TN、A血型、細(xì)菌lacZ、人胎盤 堿性磷酸酶(ALP)、α - 二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)、胸苷磷酸化酶(dTHdPase)、血栓調(diào)節(jié)素、層 粘連蛋白受體、纖維結(jié)合素、抗細(xì)胞周期蛋白、抗細(xì)胞周期蛋白A、B或E、增殖相關(guān)核抗原、 凝集素UEA-1、CEA，16以及馮維勒布蘭德氏因子。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”以及“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。 這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一種或一種以上氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué) 類似物的氨基酸聚合物，并且適用于天然存在的氨基酸聚合物。這些術(shù)語(yǔ)還包括連接構(gòu)成 多肽的氨基酸的傳統(tǒng)肽鍵的變異體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“核酸”或“寡核苷酸”或語(yǔ)法上的等同描述是指共價(jià)連接在 一起的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸優(yōu)選是單鏈或雙鏈，通常含有磷酸二酯鍵，但是 在一些情況中(如下文所列的)，包括可具有替代骨架的核酸類似物，所述替代骨架包 含例如磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10) :1925)及其中的參考文獻(xiàn)； Letsinger(1970)J. Org. Chem. 35 :3800 ；Sprinzl 等人(1977)Eur. J. Biochem. 81 :579 ； Letsinger 等人(1986)Nucl. Acids Res. 143487 ；Sawai 等人(1984)Chem. Lett. 805， Letsinger 等人(1988) J.Am. Chem. Soc. 110 :4470 ；以及 Pauwels 等人(1986) Chemica Scripta 26:1419)、磷硫酰(Mag 等人(1991) Nucleic Acids Res. 19 :1437 ；和第 5，644，048 號(hào)美國(guó)專利)、二硫代磷酸酯(Briu 等人(1989) J.Am. Chem. Soc. Ill :2321)、 0-methylphophoroamidite linkages (JAL Eckstein, Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, Oxford University Press)以及肽核酸骨架和連接鍵(見(jiàn) Egholm(1992) J. Am. Chem. Soc. 114 :1895 ；Meier 等人，(1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31 :1008 ； Nielsen (1993)Nature，365 :566 ;Carlsson 等人，(1996)Nature 380:207)。其他核酸類 似物包括具有正性骨架(Denpcy 等人，(199 Proc. Natl. Acad. ki. USA 92 :6097)、非 離子骨架(美國(guó)專利第5，386，023號(hào)、第5，637，684號(hào)、第5，602，240號(hào)、第5，216，141 號(hào)以及第 4,469, 863 號(hào)；Angew. (1991)Chem. Intl. Ed. English 30 :423 ；Letsinger 等
13人(1988)J.Am· Chem. Soc. 110 :4470 ;Letsinger 等人(1994)Nucleoside & Nucleotide 13 1597 ；ASC Symposium Series 580, “ Carbohydrate Modifications in Antisense Research “，Ed. Y. S. Sanghui 和 P. Dan Cook,第 2 章和第 3 章；Mesmaeker 等人(1994)， Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4 :395 Jeffs 等人(1994) J. Biomolecular NMR 34 17 ；Tetrahedron Lett. 37 :743 (1996))以及非核糖骨架(包括美國(guó)專利第5，235，033號(hào) 和第 5，034，506 號(hào)中以及 ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghui 和 P. Dan Cook 第 6 章和第 7 章描述的那些)的那 些。含有一個(gè)或一個(gè)以上碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義中(見(jiàn)，Jenkins等人，(1995)， Chem. Soc. Rev.第 169-176 頁(yè))。在"Rawls，C & E News June 2，1997，第；35 頁(yè)，，中描述了 幾種核酸類似物?？蓪?duì)磷酸核糖骨架進(jìn)行這些改變以促進(jìn)添加諸如標(biāo)記物之類的另外的部 分，或增加這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。術(shù)語(yǔ)“生物素”是指能夠結(jié)合親和素或各種親和素類似物的生物素和修飾的生物 素或生物素類似物。尤其可通過(guò)添加一種或一種以上附加物來(lái)修飾“生物素”，通常通過(guò)其 游離羧基殘基添加。有用的生物素衍生物包括但不限于與所添加的化合物或聚合物上的諸 如胺、?；蛲榛?、羰基、烷基鹵或邁克爾型受體之類的互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)的活性酯、胺、胼 以及巰基。通常可見(jiàn)于蛋清中的親和素對(duì)生物素(一種B族復(fù)合維生素)具有非常高的結(jié)合 親和力(Wilcheck等人(1988)Anal. Biochem，171 1)。衍生自阿維丁鏈霉菌(Streptomyces avidinii)的鏈霉親和素與親和素相似，但具有較低的非特異性組織結(jié)合，因此常替代親和 素使用。本文使用的“親和素”包括其天然狀態(tài)或修飾形式的生物形式。例如，被處理以去 除蛋白質(zhì)的碳水化合物殘基(“去糖基化親和素”)和/或其高堿性電荷(“中性親和素”) 的親和素的修飾形式也可用于本發(fā)明。本文使用的術(shù)語(yǔ)“殘基”是指天然、合成或修飾的氨基酸。本文使用的“抗體”是指實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼 的一種或一種以上多肽所構(gòu)成的蛋白質(zhì)。被識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、 ε以及μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為 Y、μ、δ或ε (又分別定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE)。已知典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括四聚體。各四聚體由兩個(gè)相同的多 肽鏈對(duì)組成，各對(duì)多肽鏈具有一個(gè)“輕”鏈(約25kD)和一個(gè)“重”鏈(約50-70kD)。各鏈 的N端定義主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的具有約100至110或更多氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“輕鏈可 變區(qū)”和“重鏈可變區(qū)”(Vh)分別是指這些輕鏈和重鏈?？贵w作為完整的免疫球蛋白存在或作為使用多種肽酶消化而產(chǎn)生的許多良好表 征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在絞鏈區(qū)的二硫鍵下消化抗體而產(chǎn)生F(ab)' 2—— Fab (自身是通過(guò)二硫鍵與Vh-ChI連接的輕鏈)二聚體?？稍跍睾蜅l件下還原F(ab)' 2 以破壞絞鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將(Fab' )2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab'單體。Fab'單體基本上 是具有絞鏈區(qū)部分的Fab(對(duì)于其他抗體片段的詳細(xì)描述見(jiàn)，F(xiàn)undamental Immunology, W. Ε. Paul編輯，Raven Press, N. Y. (1993))。盡管根據(jù)對(duì)于完整抗體的消化定義了多種抗 體片段，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這些Fab'片段可化學(xué)合成或通過(guò)利用DNA重組方法來(lái)從 頭合成。因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括通過(guò)對(duì)完整抗體進(jìn)行修飾而產(chǎn)生的抗體片段或使用DNA重組方法從頭合成的抗體片段。優(yōu)選的抗體包括單鏈抗體(作為單鏈多肽存在 的抗體)，更優(yōu)選其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接在一起(直接連接或通過(guò)肽連接體連 接)而形成連續(xù)多肽的單鏈Fv抗體(sFv或scFv)。單鏈Fv抗體為共價(jià)連接的異源 二聚體，可由包括直接連接或通過(guò)肽編碼連接體連接的Vh和\編碼序列的核酸表達(dá)而來(lái)。 Huston 等人(1988)Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85 :5879_5883。在 Vh 和 Vl 各自作為單鏈多 肽彼此連接時(shí)，Vh和\結(jié)構(gòu)域非共價(jià)結(jié)合。在絲狀噬菌體表面表達(dá)的第一功能性抗體分 子為單鏈Fv(SCFv)，然而，可選的表達(dá)策略也是成功的。例如，如果其中一個(gè)鏈(重鏈或輕 鏈)與g3衣殼蛋白和作為可溶性分子輸出至周質(zhì)的互補(bǔ)鏈融合，F(xiàn)ab分子可展示于噬菌體 上?？稍谙嗤虿煌瑥?fù)制子上編碼兩條鏈，重點(diǎn)是各Fab分子中的兩條抗體鏈翻譯后組裝， 并且該二聚體通過(guò)其中一條鏈與例如g3p鍵合而摻入至噬菌體顆粒中(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利 第5733743號(hào))。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知scFv抗體和許多其他結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)是將天然聚集 的但從抗體可變區(qū)(V區(qū))化學(xué)分離的輕鏈和重鏈多肽轉(zhuǎn)化為折疊成基本與抗原結(jié)合位點(diǎn) 的結(jié)構(gòu)相似的三維結(jié)構(gòu)的分子(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第5，091，513號(hào)、第5，132，405號(hào)以及 第4，956，778號(hào))。特別優(yōu)選的抗體應(yīng)包括展示于噬菌體或酵母菌上的所有抗體(例如， scFv、Fv、Fab 以及二硫鍵連接的 Fv (Reiter 等人(1995)Protein Eng. 8 :1323-1331)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”，當(dāng)涉及SHAL或生物分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸、抗 體等)時(shí)，是指對(duì)異源群體分子(例如，蛋白質(zhì)和其他生物制劑)中的SHAL或生物分子的 存在具有決定性的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定條件下(例如，SHAL情況的結(jié)合測(cè)定條件或核 酸情況的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件)，特定配體或SHAL優(yōu)先結(jié)合其特定“靶”分子且不優(yōu)先以顯著量結(jié) 合樣品中存在的其他分子?！靶?yīng)劑”是指其活性為對(duì)于遞送至和/或定位于靶(例如，在展示特征性標(biāo)志物 的細(xì)胞)所需的任何分子或分子的組合。效應(yīng)劑包括但不限于標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、酶、生長(zhǎng) 因子、轉(zhuǎn)錄因子、藥物、脂質(zhì)、脂質(zhì)體等?！皥?bào)告劑”是提供可檢測(cè)信號(hào)的效應(yīng)劑(例如，是可檢測(cè)的標(biāo)記物)。在一些實(shí)施方 式中，報(bào)告劑自身不需要提供可檢測(cè)的信號(hào)，但可僅提供隨后可結(jié)合可檢查標(biāo)記物的部分。術(shù)語(yǔ)“保守性取代”用于蛋白質(zhì)或肽以反映基本不改變?cè)摲肿拥幕钚?特異性或 結(jié)合親和力)的氨基酸取代。通常，保守性氨基酸取代涉及一種氨基酸取代另一種具有相 似化學(xué)特性(例如，電荷或疏水性)的氨基酸。下列六組各自包含典型的相互保守性取代 的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T) ；2)天門冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天門 冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨 酸(M)、纈氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸，(Y)、色氨酸(W)。術(shù)語(yǔ)“附加表位”或“親和標(biāo)簽”在本文中可互換使用，通常是指由抗體或其他結(jié) 合配偶體特異性識(shí)別的分子或分子的結(jié)構(gòu)域。該術(shù)語(yǔ)還指結(jié)合配偶體復(fù)合物。因此，例如， 將生物素或生物素/親和素復(fù)合物均視為親和標(biāo)簽。除了在表位/抗體相互作用中識(shí)別的 表位外，親和標(biāo)簽還包括由其他結(jié)合分子識(shí)別的“表位”(例如，受體結(jié)合的配體)，其他配 體結(jié)合以形成異源二聚體或同源二聚體的配體，Ni-NTA結(jié)合的His6,親和素、鏈霉親和素結(jié) 合的生物素，或抗生物素抗體等。附加表位為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。另外，許多種附加表位的特異性抗體可商購(gòu)獲 得。這些包括但不限于針對(duì)DYKDDDDK(SEQ ID NO :1)表位的抗體，c_myc抗體(可獲自Sigma, St. Louis)，HNK-I碳水化合物表位，HA表位，HSV表位，His表位特異性抗體(見(jiàn)，例 如Qiagen)識(shí)別的His4、Hk5以及Hk6表位等。另外，表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)的載體可商購(gòu)獲 得。因此，例如，pCMV-Tagl載體是一種被設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的表位標(biāo)記 載體。插入pCMV-Tagl載體中的靶基因可使用FLAG 表位(N末端、C末端或內(nèi)部標(biāo)記)、 c-myc表位(C末端)來(lái)標(biāo)記或同時(shí)使用FLAG表位(N未端)和c-myc表位(C末端)兩者 來(lái)標(biāo)記。PEG型連接體是指包含聚乙二醇(PEG)的連接體。


圖1描述了一種生成SHAL的方法，該方法通過(guò)如下步驟進(jìn)行鑒定結(jié)合靶(例如， 包含Lym-I表位(紅色、綠色、黃色氨基酸)的HLA-DR10)表面上的兩個(gè)獨(dú)特位點(diǎn)的單個(gè)配 體(藍(lán)色)并將它們合成性連接在一起以產(chǎn)生結(jié)合所述兩個(gè)位點(diǎn)的分子。圖2描述了含有例如大量正常組織和淋巴細(xì)胞新生物之類的組織微點(diǎn)陣的使用。 這些組織可使用生物素標(biāo)記的SHAL來(lái)處理，使用若丹明標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行漂洗，并通 過(guò)熒光顯微術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)SHAL的結(jié)合。圖3描述了包括蘇木素和伊紅染色、福爾馬林固定、石蠟包埋組織核心的人組織 微點(diǎn)陣。所有四個(gè)小圖均來(lái)自單個(gè)的kar^cope數(shù)字化圖像。這描述了所記錄的圖像的高 分辨率。可捕獲免疫組織化學(xué)或SHAL結(jié)合研究的相似圖像。以該方式，使用點(diǎn)陣的研究者 具有所有適用于點(diǎn)陣的研究的容易的共享途徑。圖4A描述了正常MUC-I的結(jié)構(gòu)。異常MUCl (也是良好的靶)較少糖基化，具有 暴露的 VNTR，和串聯(lián)重復(fù)單元20aa GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH(SEQ ID NO :2)。圖 4B 描述 了 MUC-I的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的保守性結(jié)構(gòu)特征。這些特征包括由跨越串聯(lián)重復(fù)界面(殘基 17-27,37-47)的連續(xù)回折構(gòu)成的重復(fù)突出把手樣結(jié)構(gòu)，和由聚脯氨酸II和β鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)成 的擴(kuò)展區(qū)(殘基10-15、30-35、50-55)。由于缺乏鄰接的串聯(lián)重復(fù)，N末端和C末端2_3個(gè) 殘基是無(wú)序的。圖5描述了由抗muc-1單克隆抗體染色的前列腺癌組織點(diǎn)陣。圖6顯示了前列腺癌具有與分級(jí)和分期相關(guān)的MUC-I肽染色增加。圖7顯示了在4級(jí)前列腺癌中表現(xiàn)靶表位的抗MUCl肽核心MoAb BrE_3。在不同 分級(jí)的前列腺癌中MUC-I上的“把手”不同。因此，可將SHAL設(shè)計(jì)成結(jié)合“把手”和可用于 對(duì)惡性組織進(jìn)行分級(jí)。圖8描述了 HLA-DR分子與已知的晶體結(jié)構(gòu)的氨基酸序列比對(duì)。PDB密碼子鑒定 HLA-DRl (Iaqd)、HLA-DR2 (lbx2)、HLA-DR3 (la6a)以及 HLA-DR4 分子(ldm5)序列。li3r 是 同源性 MHC 融合蛋白。Hla_DR10 (SEQ ID NO 3)，laqd_B (SEQ ID NO 4)，ld5m_B (SEQ ID NO 5)，lbx2_B (SEQ ID NO 6)，la6a_B (SEQ ID NO 7)，li3r_B (SEQ ID NO 8)。圖9是顯示兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的HLA-DRlO的β亞單位的同源性模型(見(jiàn)附錄顏色)。圖10顯示了 HLA-DR3晶體結(jié)構(gòu)(淡藍(lán)色，透明原子)和HLA-DRlO的同源性模型 (深藍(lán)色，實(shí)心原子)的重疊，顯示在包含Lym-I表位的β亞單位區(qū)域中的結(jié)構(gòu)相似性。對(duì) 于Lym-I結(jié)合來(lái)說(shuō)關(guān)鍵的氨基酸殘基顯示為空間填充原子。圖11顯示了 HLA-DRlO和HLA-DR3的β亞單位的表面圖，顯示在包含Lym-I表位的蛋白質(zhì)的區(qū)域中“ 口袋”結(jié)構(gòu)的差異。電荷分布顯示為深藍(lán)色(陽(yáng)性或堿性)、紅色(陰 性或酸性)以及淡藍(lán)色(中性或疏水性)。半胱氨酸中的硫原子以黃色顯示。圖12描述了定義為位點(diǎn)1 (紅色)和位點(diǎn)2 (藍(lán)色)的兩個(gè)“ 口袋”的位置，它們 圍繞在對(duì)于HLA-DRlO的β亞單位上的Lym-I結(jié)合(黃色)而言關(guān)鍵的氨基酸周圍。這兩 個(gè)位點(diǎn)被靶向用以配體結(jié)合，并用于計(jì)算對(duì)接研究。圖13Α和1 描述了通過(guò)將被鑒定結(jié)合HLA-DRlO的單個(gè)配體的合適配對(duì)進(jìn)行組 合而合成的二齒SHAL。圖13A描述了三種分子。圖1 描述了通過(guò)將脫氧膽酸和5-亮 氨酸-腦啡肽連接在一起而合成的兩種SHAL，這兩種SHAL顯示以nM親和力結(jié)合分離的 HLA-DRlO0紅色部分是一種配體(脫氧膽酸)，綠色是另一種配體(例如，5-亮氨酸-腦啡 肽)，藍(lán)色是用于形成最短連接體的賴氨酸，黑色是下列物質(zhì)的組合用于使兩種配體之間 的連接體較長(zhǎng)的PEG分子，和與SHAL連接用于檢測(cè)目的的生物素分子。圖14描述了 JP459B的二價(jià)形式的結(jié)構(gòu)。紅色為脫氧膽酸，綠色是5_亮氨酸-腦 啡肽，藍(lán)色是賴氨酸連接體，黑色是PEG連接體和生物素。圖15顯示了描述基于同源性的蛋白質(zhì)建模的主要步驟的流程圖。圖16描述了 DOCK算法。(1) “負(fù)像”通過(guò)使用球體填充“口袋”而生成。(2)候 選配體通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到。( 在亞組球體中心和配體原子之間對(duì)內(nèi)部距離進(jìn)行匹配 (通常選擇3至8個(gè)中心)。(4)使配體朝向活性位點(diǎn)。( 通過(guò)評(píng)分函數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)該朝向的 相互作用；對(duì)于新的朝向重復(fù)該過(guò)程——通常每個(gè)配體產(chǎn)生10，000個(gè)朝向。保留最高評(píng)分 的朝向。對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)中的新配體重復(fù)該過(guò)程。圖17A和圖17B描述了 SHAL JP459B與展示HLA-DRlO的細(xì)胞的結(jié)合。圖17A描述 了與小細(xì)胞淋巴瘤相比在大細(xì)胞淋巴瘤上SHAL JP459B和Lym-IMAb (單克隆抗體)結(jié)合增 加(小圖A-D)，并且在使用鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶(SHRP)和生物素化SHAL包被的培 養(yǎng)板上SHAL JP459B選擇性結(jié)合活Raji細(xì)胞(結(jié)晶紫染色)，但不結(jié)合其他細(xì)胞類型(小 圖E-H)。(小圖A-D)將SHAL與SAHRP —起預(yù)孵育并通過(guò)DAB試劑進(jìn)行檢測(cè)。使用生物素 化抗小鼠MAb檢測(cè)Lym-I結(jié)合，之后使用SAHRP和DAB檢測(cè)Lym-I結(jié)合。小圖A)大細(xì)胞淋 巴瘤上的SHAL ；小圖B)小細(xì)胞淋巴瘤上的SHAL ；小圖C)大細(xì)胞淋巴瘤上的Lym-IMAb ；小 圖D)小細(xì)胞淋巴瘤上的Lym-IMAb。(小圖E-H)圖像顯示了 SHAL JP459B與活feiji細(xì)胞 的選擇性結(jié)合(小圖E)，但不與非淋巴瘤LnCAP (小圖F)、22RV(小圖G)或DU145(小圖H) 細(xì)胞系結(jié)合。圖17B顯示SHAL JP459B僅與含有HLA-DRlO的活培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞結(jié)合，使用鏈 霉親和素過(guò)夜包被培養(yǎng)板，洗滌培養(yǎng)板并然后添加SHAL，孵育2小時(shí)，之后再洗滌以去除未 結(jié)合的SHAL。然后，添加細(xì)胞。洗滌細(xì)胞并使用甲酚紫染色。圖18顯示了非何杰金氏淋巴瘤的組織切片，描述了淋巴瘤細(xì)胞的JP459B染色定 位于細(xì)胞膜。圖 19 描述了 Raji 腫瘤小鼠中的 mh-D0TA[SHAL 070804(LeacPLD)2LPDo]的生物 分布。圖20描述了在存在和不存在Lym-I抗體的情況中，單價(jià)二齒SHAL和二價(jià)二齒 SHAL 070804LeacPLDB 與 Raji 細(xì)胞的結(jié)合。圖21描述了多種類型的SHAL靶。圖22描述了與DOTA連接的SHAL。紅色部分是一種配體(脫氧膽酸)，綠色是另一種配體(5-亮氨酸-腦啡肽)，藍(lán)色是用于形成最短連接體的賴氨酸，黑色是下列物質(zhì)的 組合用于使兩種配體之間的連接體較長(zhǎng)的PEG分子，與用以結(jié)合放射性金屬的SHAL連接 的DOTA環(huán)。圖23顯示了 JP7001. 2和三碘甲狀腺原氨酸-脫氧膽酸SHAL的化學(xué)式。圖24A和24B顯示了下列物質(zhì)的二維化學(xué)結(jié)構(gòu)和首字母縮略詞三齒SHAL(圖 24A) DvLPLLCtPCbPLDo ；具有Ct配體的(4- 二甲氨基偶氮苯_4 ‘-磺?；?L-纈氨酸PEG 賴氨酸賴氨酸342-([3_氯-5-三氟甲基)-2-吡啶基]氧)_苯胺基)-3-氧丙酸PEG 444-(4-氯芐基)哌嗪并]-3-硝基苯甲酸賴氨酸-DOTA(圖24A插圖)；以及二聚體三 齒SHAL (圖MB) (DvLPLLCtPCbPPP) 2LLDo ； ((4- 二甲氨基偶氮苯_4 ‘-磺?；?L-纈氨酸 PEG賴氨酸賴氨酸3- (2- ([3-氯-5-三氟甲基)-2-吡啶基]氧)-苯胺基)-3-氧丙酸PEG 4-W-(4-氯芐基)哌嗪并]-3-硝基苯甲酸PEG PEG PEG) 2賴氨酸賴氨酸-DOTA。在多種 實(shí)施方式中，生物素化SHAL類似物僅僅在生物素取代DOTA螯合劑方面不同，各SHAL的右 上方。圖25A和圖25B描述了 二聚體SHAL (DvLPBaPPP) 2LLDo (圖25A)和六精氨酸類似 物(DvLPBaPPP) 2LArg6AcLLDo (圖 25B)的結(jié)構(gòu)。圖沈描述了 111L放射性標(biāo)記的SHAL (DvLPBaPPP) 2LLDo與其六精氨酸類 似物(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo與Raji細(xì)胞的結(jié)合。與Raji細(xì)胞(未洗滌)結(jié)合 的總111In-(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo,實(shí)心方塊；與Raji細(xì)胞(未洗滌)結(jié)合的總 111In-(DvLPBaPPP)2LLDo,空心方塊。將含有IO6個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞沉淀重懸浮于含有0-25ng的 111In標(biāo)記SHAL的150 μ 1 5% BSA/PBS緩沖液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。對(duì)樣品進(jìn)行離 心，以將細(xì)胞與上清液分離，在校準(zhǔn)Y井式計(jì)數(shù)器中對(duì)兩者進(jìn)行計(jì)數(shù)以對(duì)結(jié)合的SHAL和未 結(jié)合的SHAL進(jìn)行定量。對(duì)于各數(shù)據(jù)點(diǎn)包括誤差條，但在大多數(shù)情況中，誤差小于數(shù)據(jù)點(diǎn)且 誤差條是不可見(jiàn)的。圖27顯示了與其六精氨酸類似物(DvLPBaPPP)2LArg6ACLLD0 (中行)相比母體 SHAL(DvLPBaPPP)2LLDo (上行)與活Raji細(xì)胞結(jié)合的熒光三維共聚焦顯微圖像。顯示了 Raji細(xì)胞中的兩個(gè)中間細(xì)胞焦平面(左向右)。使用(DvLPBaPPP)2LArg6AcLLDo處理的 Jurkat細(xì)胞(左小圖，底行)顯示了 SHAL攝取最少。Lym-I (右小圖，底行)主要表現(xiàn)了與 Raji細(xì)胞的細(xì)胞表面膜結(jié)合。母體SHAL顯示了細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，而六精氨酸類似物不僅表現(xiàn)了 顯著的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合還表現(xiàn)了核內(nèi)靶向。在這些合并的連續(xù)激光圖像中，DAPI用作核染劑， AlexaFlor 610 顯示了 SHAL 的位置。圖觀顯示了含有Ct配體的三齒SHAL的結(jié)構(gòu)的二維示意分子結(jié)構(gòu)(上 圖)和三維空間填充分子結(jié)構(gòu)(下圖)。用于產(chǎn)生該SHAL的配體為4-二甲氨基偶氮 苯-4'-磺酰基-L-纈氨酸(Dv)，4-[4-(4-氯芐基)哌嗪并]-3-硝基苯甲酸(Cb)和 (3- (2- ([3-氯-5-三氟甲基)-2-吡啶基]氧)-苯胺基)-3-氧丙酸)(Ct)。第一賴氨酸 殘基提供了用于諸如金屬結(jié)合大環(huán)和生物素之類的部分的共價(jià)結(jié)合的游離胺。另外的賴氨 酸殘基用于生成連接體中的分枝點(diǎn)，PEG單體用于提供配體之間合適的距離。通過(guò)將三種 配體與HLA-DRlO的β亞單位中的空穴(側(cè)鄰顯示對(duì)于Lym-I結(jié)合和細(xì)胞毒性來(lái)說(shuō)關(guān)鍵的 精氨酸70)對(duì)接來(lái)鑒定這三種配體。可通過(guò)嵌入另外的賴氨酸殘基并將它們與原賴氨酸的 游離ε胺連接而在沿連接體的特定位置摻入功能性分子。
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圖四表達(dá)人HLA-DRlO的Raji淋巴瘤細(xì)胞中SHAL細(xì)胞毒活性的滴定。在以所示 的濃度添加SHAL之后1、2或3天觀察無(wú)活力的細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。在第2天分別測(cè)定SHAL 閾值和IC50濃度為0. 7和2. 5nM(pm/ml培養(yǎng)基)(平均值士 SD)。圖30是帶有Raji異種移植物的小鼠中治愈的攝影證據(jù)在SHAL處理前(上圖)， 在初始和第二次的IOOng SHAL劑量腹腔內(nèi)注射之后一周。在初始劑量之后3周，異種移植 物完全消退，并在持續(xù)小鼠觀察期內(nèi)表現(xiàn)了治愈(> 84天，下圖)。圖31顯示了 SHAL對(duì)于帶有建立的Raji或Jurkat淋巴瘤異種移植物的小鼠總存 活期影響。每周一次使用IOOng SHAL腹腔內(nèi)注射來(lái)處理每只帶有Raji或Jurkat異種移 植物的小鼠，連續(xù)3周，或不處理。帶有處理的Raji異種移植物的小鼠(黑圓)具有最長(zhǎng) 的存活期，而帶有處理的Jurkat異種移植物的小鼠(方框)存活不超過(guò)56天。帶有擴(kuò)大 異種移植物的兩只未處理的小鼠(空心環(huán))存活84天。圖32從未處理的小鼠和在SHAL處理后M小時(shí)的小鼠移除的Raji異種移植物的 電子顯微鏡照片。未受處理(左圖)的侵襲性異種移植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，而SHAL處理的 異種移植物中的細(xì)胞顯示染色質(zhì)濃集和斷裂以及與自體吞噬死亡一致的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)喪失 (右圖)(刻度條，5μπι)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及研制一類可用于特異性結(jié)合幾乎任何靶分子的新型結(jié)合分子。該類 結(jié)合分子在本文被稱為選擇性高親和力配體或“SHAL”。SHAL可以以類似于抗體的方式用 于許多種情況，所述情況包括但不限于在親和柱中用于純化生物物質(zhì)或其他物質(zhì)的捕獲試 劑、生物傳感器中的結(jié)合劑、用于組裝納米顆?；蚣{米儀器的制劑、診斷制劑以及治療劑。SHAL還可用于檢測(cè)可區(qū)分多種病原體類型或株系的分子標(biāo)志物。SHAL還用于生 物防御用途，用于檢測(cè)存在于毒素中和病原生物表面的獨(dú)特蛋白標(biāo)志物，并將這些生物威 脅因子與天然存在的無(wú)害物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。因?yàn)楫?dāng)SHAL暴露于環(huán)境時(shí)可相對(duì)穩(wěn)定，它們尤其 特別適用于生物防御的生物傳感器、診斷以及其他應(yīng)用。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，SHAL用于癌癥診斷和/或治療。在這些實(shí)施方式中， 將SHAL定向癌癥(例如，多種惡性細(xì)胞)表面的獨(dú)特和/或特異性位點(diǎn)(例如，癌癥特異 性標(biāo)志物)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)以其自身進(jìn)行給藥時(shí)(例如，以類似于抗體治療劑 Herceptin 的方式)，SHAL可具有治療作用。SHAL，與抗體類似，可對(duì)惡性細(xì)胞具有導(dǎo)致細(xì) 胞死亡的直接作用，這是因?yàn)镾HAL用作針對(duì)正常途徑的激動(dòng)劑，從而啟動(dòng)或阻斷關(guān)鍵的細(xì) 胞功能并導(dǎo)致惡性細(xì)胞死亡。SHAL還可用作疫苗，這是因?yàn)樗憩F(xiàn)了畸變細(xì)胞表面標(biāo)志物 或增強(qiáng)常見(jiàn)的惡性細(xì)胞標(biāo)志物而提供了惡性細(xì)胞識(shí)別。另外(或可選地)，SHAL可用作靶(當(dāng)與靶細(xì)胞結(jié)合時(shí))，或用作其他效應(yīng)劑的運(yùn) 載體(靶向部分)，所述效應(yīng)劑包括但不限于諸如細(xì)胞毒性劑、免疫系統(tǒng)識(shí)別的標(biāo)志物、可 檢測(cè)標(biāo)記物(用于成像)等之類的試劑。放射性同位素是細(xì)胞毒性效應(yīng)劑的有吸引力的實(shí)例，所述細(xì)胞毒性效應(yīng)劑可連接 至載體SHAL以選擇性遞送放射性治療劑至惡性細(xì)胞。該治療劑可作為單劑型治療劑給藥， 或與骨髓重建聯(lián)合給藥以實(shí)現(xiàn)較大的劑量強(qiáng)度，或與可增強(qiáng)對(duì)惡性病的輻射效應(yīng)的其他藥物聯(lián)合給藥。盡管具有許多可與SHAL聯(lián)合的不同藥物(化療制劑、生物制劑以及其他種 類)，紫杉烷是具有吸引力的一個(gè)實(shí)例。細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括放射性同位素、免疫毒素、化療制劑、酶抑制劑、生物制劑 等。令人感興趣的實(shí)例包括細(xì)胞凋亡信號(hào)和諸如半胱天冬酶之類的酶。放射性同位素表現(xiàn) 為令人感興趣的細(xì)胞毒性劑，已顯示與抗體-抗原和配體-受體系統(tǒng)聯(lián)合有效。根據(jù)本發(fā) 明，對(duì)于治療目的而言，我們認(rèn)為在一些實(shí)施方式中優(yōu)選使用諸如β _、β + (正電子)之類的 顆粒發(fā)射體來(lái)標(biāo)記。在一些情況中，使用α發(fā)射體或俄歇電子(Auger-electron)發(fā)射體 來(lái)標(biāo)記是合適的。治療性放射性同位素具有許多實(shí)例，包括目前相當(dāng)令人感興趣的釔-90 或碘-131。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于一些成像目的而言，我們認(rèn)為锝-99、銦-111、碘-123或碘-131 對(duì)于單光子成像具有吸引力，諸如銅-64、釔-86、鎵-68等之類的β+(正電子)發(fā)射體尤 其當(dāng)與SHAL連接用于診斷目的時(shí)可能非常具有吸引力。SHAL由兩個(gè)或兩個(gè)以上配體(也稱為結(jié)合部分)直接連接在一起或通過(guò)連接體 連接在一起生成核心“多齒”分子(SHAL)而構(gòu)成，所述核心“多齒”分子被設(shè)計(jì)成特異性結(jié) 合基本上任何期望的靶(例如，期望的靶惡性細(xì)胞表面分子上的獨(dú)特或特異性位點(diǎn)(“口 袋”))。組成SHAL的配體(結(jié)合部分)可包括能夠結(jié)合靶上的位點(diǎn)的基本上任何部分。 這樣的結(jié)合部分可包括但不限于多種化學(xué)物質(zhì)(例如，有機(jī)小分子)、蛋白質(zhì)、糖、碳水化合 物、凝集素、脂質(zhì)、金屬、核酸、肽以及核酸類似物等。盡管不是必需的，組成SHAL的單個(gè)配體常常對(duì)于靶具有較低的親和力(例如，小 于約10_6Μ)。相比之下，多齒SHAL(包含多個(gè)配體)通常顯示較高的親和力(例如，大于約 10_6Μ，優(yōu)選大于約10_8或10_9或ΙΟ,Μ，還大于約IO-11M,最優(yōu)選大于約I(T12M)。在一些實(shí)施方式中，在SHAL定向的靶是蛋白質(zhì)的情況中，可選擇組成SHAL的配體 來(lái)結(jié)合蛋白質(zhì)上一些非功能性位點(diǎn)。蛋白質(zhì)常常具有許多(少數(shù)達(dá)到>50)跨越其表面分 布的“口袋”或空穴。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)鏈被折疊成三維結(jié)構(gòu)使得蛋白質(zhì)具有功能，從而產(chǎn)生了這 些空穴。該觀察結(jié)果使得考慮設(shè)計(jì)表現(xiàn)出對(duì)于給定蛋白質(zhì)比先前可能的具有大得多的結(jié)合 特異性的SHAL成為可能。通過(guò)將僅以微摩爾親和力與蛋白質(zhì)表面上的獨(dú)特“ 口袋”結(jié)合的 兩個(gè)部分連接在一起，可以設(shè)計(jì)以納摩爾至皮摩爾親和力結(jié)合并具有高選擇性且與其他功 能性相關(guān)分子無(wú)交叉反應(yīng)的多齒分子(SHAL)。對(duì)于具有已知或預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而言，可 使用計(jì)算方法生成分子表面的三維圖譜并鑒定對(duì)于本文所述的蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)獨(dú)特性的 合適尺寸的“口袋”。可使用“對(duì)接”程序來(lái)篩選含有已知小分子的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合靶蛋白上的“口 袋”的能力。然后可使用本文所述的多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)高級(jí)候選物，以鑒定與蛋白質(zhì)實(shí) 際結(jié)合的分子以及結(jié)合正確位點(diǎn)的那些分子。然后，可使用固相或液相化學(xué)方法將二聯(lián)體 或三聯(lián)體配體(例如，各組一個(gè))與合適長(zhǎng)度連接體的相對(duì)端連接，以生成二齒SHAL(圖 1)或三齒SHAL。之后，可通過(guò)進(jìn)行傳統(tǒng)的結(jié)合研究來(lái)鑒定具有最高親和力和最大選擇性的 SHAL。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，將微弱結(jié)合靶(例如，蛋白質(zhì))并表現(xiàn)選擇性很小(或不足)的 兩個(gè)或兩個(gè)以上小配體連接在一起可導(dǎo)致產(chǎn)生以高出三至六個(gè)或更高數(shù)量級(jí)的緊密度和 以高選擇性結(jié)合其期望的靶(例如，靶蛋白)。
不受特定理論的限制，認(rèn)為盡管SHAL中兩個(gè)或兩個(gè)以上配體的存在預(yù)期會(huì)增加 該分子可結(jié)合更多種蛋白質(zhì)的幾率，但我們觀察到，該非特異性結(jié)合是微弱的(大約與游 離配體相同)，且僅通過(guò)其中一個(gè)配體與非靶蛋白連接的那些分子不會(huì)保留長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。當(dāng) 二齒SHAL中的兩個(gè)配體或所有組成多齒SHAL的配體均結(jié)合其各自的靶(例如，靶蛋白上 的“口袋”)時(shí)所觀察到的親和力和選擇性提高源于下列與SHAL-靶相互作用性質(zhì)相關(guān)的 三種因素首先，連接體的存在防止與其靶解離的組成SHAL的單個(gè)配體從靶表面擴(kuò)散，顯 著增加游離配體再結(jié)合的速率；其次，下述事實(shí)說(shuō)明了二齒或多齒SHAL釋放速率下降即， 組成SHAL的兩個(gè)(或所有)配體同時(shí)從其靶釋放的概率顯著低于任一配體釋放的概率；組 成SHAL的配體之間的距離(通過(guò)連接化學(xué)方法(例如，連接體)測(cè)定)使得組成SHAL的 配體同時(shí)與其靶結(jié)合，只要配體由正確的距離分開(kāi)。如果SHAL中的任一配體獨(dú)立地與另一 靶結(jié)合，其低親和力(對(duì)于我們鑒定的配體，通常為1-10微摩爾親和力)會(huì)導(dǎo)致配體迅速 解離(解離速率高)。因此，其中二齒或多齒SHAL與期望的靶緊密結(jié)合(納摩爾親和力或 更高)的情形僅為組成SHAL的兩個(gè)配體均同時(shí)與靶分子(例如，靶蛋白)結(jié)合。一旦兩個(gè) 或所有配體均被結(jié)合，整個(gè)分子(SHAL)的解離速率顯著降低。如果配體結(jié)合位點(diǎn)選擇合適 (例如，通過(guò)在蛋白靶的情況中氨基酸序列或結(jié)構(gòu)不同的靶向區(qū)域)，在由相同距離分開(kāi)的 另一靶上可見(jiàn)相同位點(diǎn)變得可能性極低。如果該極不可能的事件發(fā)生，則可鑒定另外的配 體結(jié)合位點(diǎn)(例如，近鄰位點(diǎn)1和位點(diǎn)2的第三結(jié)合位點(diǎn))，且另外的配體可摻入SHAL (例 如，生成三齒、四齒等的SHAL)。SHAL相對(duì)于抗體具有一些優(yōu)點(diǎn)，特別是在治療和/或診斷用途中。通常，SHAL比 抗體小得多。因此，它們能夠?qū)崿F(xiàn)較大的腫瘤穿透。在一些實(shí)施方式中，它們還能夠跨越血 腦屏障，例如，用于治療腦腫瘤。我們相信SHAL還常常比抗體的免疫原性低，且常常較慢從 循環(huán)中清除。在一些實(shí)施方式中，本文描述的SHAL通常是多齒，S卩，SHAL包含兩個(gè)或兩個(gè)以上 配體，所述配體直接連接在一起或通過(guò)一個(gè)或一個(gè)以上連接體連接在一起。在一些實(shí)施方 式中，配體結(jié)合SHAL所定向的靶的不同部分(例如，單個(gè)蛋白質(zhì)上的不同表位)。在一些實(shí) 施方式中，配體結(jié)合不同分子，例如，癌細(xì)胞上的不同癌癥標(biāo)志物，包含受體的不同蛋白質(zhì)， 等等。在一些實(shí)施方式中，多特異性SHAL可用于交聯(lián)相同細(xì)胞上的相同或不同抗原，從而 增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或用于預(yù)靶向，例如，其中，一個(gè)SHAL被設(shè)計(jì)成靶向惡性細(xì)胞并與被設(shè)計(jì)成 “捕獲”繼后給藥的細(xì)胞毒性劑的載體(例如，螯合的放射性金屬等)的其他SHAL連接，募 集免疫原性活性細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等)至位點(diǎn)、激活靶向SHAL上的前藥，等等。在一些實(shí)施方式中，該“多特異性”是通過(guò)使用多價(jià)SHAL來(lái)實(shí)現(xiàn)。多價(jià)SHAL為其 中兩個(gè)或兩個(gè)以上SHAL(例如，兩個(gè)或兩個(gè)以上二齒SHAL)連接在一起的分子。組成多價(jià) SHAL的不同SHAL可定向至相同或不同的靶，例如，如上所述的靶。I. SHAL 的構(gòu)建本發(fā)明的SHAL通過(guò)鑒定結(jié)合(在一些實(shí)施方式中特異性(或優(yōu)先)結(jié)合)靶分 子或分子的不同區(qū)域的配體(結(jié)合部分)來(lái)生成。然后將結(jié)合靶分子不同區(qū)域的配體直接 連接或通過(guò)連接體連接，以產(chǎn)生包含兩個(gè)不同結(jié)合部分的二齒SHAL或包含兩個(gè)或兩個(gè)以 上不同結(jié)合部分的多齒SHAL。然后可對(duì)SHAL篩選其結(jié)合期望的靶的能力。結(jié)合靶的不同區(qū)域的配體的初始鑒定可使用計(jì)算機(jī)虛擬方法(例如，計(jì)算方法)和/或經(jīng)驗(yàn)方法(例如，如本文所述)來(lái)實(shí)現(xiàn)。一旦鑒定了兩個(gè)或兩個(gè)以上合適的配體(結(jié)合部分)，則可任選地篩選(有效) 它們?cè)诓煌稽c(diǎn)結(jié)合靶的能力。然后，可將合適的結(jié)合配體直接偶聯(lián)在一起或通過(guò)連接體 偶聯(lián)在一起，以形成二齒或多齒SHAL，之后可任選地篩選所述二齒或多齒SHAL結(jié)合靶的能 力。A)靶詵擇實(shí)際上，任何分子、受體、分子的組合可用作SHAL的靶(見(jiàn)，例如圖21)。通過(guò)SHAL 的預(yù)期用途來(lái)確定靶選擇。因此，例如，在SHAL有待摻入親和柱(例如，用以純化蛋白質(zhì)或 核酸)的情況中，所述靶是有待使用包含SHAL的親和柱純化的分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸
寸J ο在SHAL用于治療和/或診斷癌癥的情況中，所述靶通常為分子、分子集合、受體、 酶或其他癌癥特征性結(jié)構(gòu)(例如，相對(duì)于正常健康細(xì)胞，允許SHAL優(yōu)先結(jié)合癌細(xì)胞的結(jié) 構(gòu))。許多癌癥特異性標(biāo)志物為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。這樣的標(biāo)志物包括但不限于 Lym-I 表位、Muc-l、C-myc、p53、Ki67、erbB-2、Her2、Her4、BRCAl、BRCA2、Lewis Y,CA 15-3, G250、HLA-DR 細(xì)胞表面抗原、CD2、CD3、CD7、CD19、CD20、CD22、整合素、EGFr、AR、PSA、癌胚抗 原(CEA)、L6 細(xì)胞表面抗原(見(jiàn)，例如，Tuscano 等人 Q003) Neoplasia，3641-3647 ；Howe 11 等人(1995Πη J Biol Markers 10 1洸_13 ;Marken 等人(1992) Proc. Natl. Acad, ki. U. S. Α. 89 :3503-3507,1992)、生長(zhǎng)因子受體和/或多種細(xì)胞內(nèi)靶(例如，受體、核酸、磷酸激
醇寸J ι寸寸。在一些實(shí)施方式中，可將SHAL生成用于細(xì)胞表面膜靶蛋白，所述細(xì)胞表面膜靶蛋 白影響細(xì)胞內(nèi)功能，從而通過(guò)阻斷其他分子結(jié)合或?qū)е乱种菩约?xì)胞內(nèi)信號(hào)或增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi) 信號(hào)(例如磷酸激酶信號(hào)傳導(dǎo))來(lái)促進(jìn)這些功能(激動(dòng)劑)或抑制這些功能(拮抗劑)。 可將SHAL生成用于可被內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)的諸如抗原和抗體之類的細(xì)胞表面膜靶蛋白。與靶 向內(nèi)化抗原的抗體和靶向內(nèi)化受體的肽配體相同，這些SHAL將被內(nèi)化，并位于細(xì)胞中，在 細(xì)胞中因?yàn)樗鼈兊募?dòng)劑或拮抗劑功能或因?yàn)樗鼈冞f送毒素或放射性同位素有效載荷，它 們可對(duì)關(guān)鍵的細(xì)胞功能(例如，原癌基因、磷酸激酶、溶酶體以及DNA/RNA/mRNA)具有激動(dòng) 劑或拮抗劑作用。SHAL相對(duì)于抗體和肽配體具有幾種優(yōu)點(diǎn)。它們包括尺寸小，以及當(dāng)細(xì)胞 內(nèi)分子為原始靶時(shí)可用于允許自由移動(dòng)至細(xì)胞內(nèi)并位于細(xì)胞內(nèi)的電荷范圍。SHAL可通過(guò)其膜靶用于優(yōu)先選擇特異性細(xì)胞，當(dāng)從靶細(xì)胞表面膜解離時(shí)，可自由 穿過(guò)細(xì)胞表面膜移動(dòng)而達(dá)到細(xì)胞內(nèi)?？蓪HAL制備成具有多特異性，使得當(dāng)其被內(nèi)化時(shí)或 當(dāng)其從細(xì)胞表面膜解離并穿透細(xì)胞表面膜時(shí)，第二特異性可允許靶向內(nèi)部的細(xì)胞分子，例 如，磷酸激酶、溶酶體酶、激素受體、基因和原癌基因蛋白產(chǎn)物、DNA/RNA/mRNA,等等。在一些 實(shí)施方式中，可生成下述非特異性但多價(jià)SHAL，即，兩者均靶向細(xì)胞表面分子，并與這些分 子交聯(lián)，導(dǎo)致生物效應(yīng)(已對(duì)于交聯(lián)的抗體-抗原系統(tǒng)作過(guò)描述)提高。與通常不能直接并容易地穿透細(xì)胞表面膜的抗體和肽配體相比，由于SHAL尺寸 小并且具有選擇SHAL的疏水或親水特性的能力，可生成能夠穿透細(xì)胞膜和多種細(xì)胞內(nèi)腔 室的SHAL。這使得可以出于靶向?qū)τ诩?xì)胞功能(例如原癌基因、磷酸激酶、溶酶體酶和其他 酶、DNA/RNA/mRNA等)來(lái)說(shuō)重要的細(xì)胞內(nèi)分子的目的來(lái)生成SHAL。該能力使得靶向?qū)τ诩?xì)
22胞功能來(lái)說(shuō)極其重要的細(xì)胞內(nèi)分子的全部類型成為可能，而這是先前通過(guò)特異性靶向分子 不能實(shí)現(xiàn)的能力。除了這些SHAL的直接作用以外，它們還可用作有效載荷的載體(如本文 所述)。原癌基因產(chǎn)物提供了一類可由SHAL靶向并在癌癥治療中產(chǎn)生有用效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi) 靶的實(shí)例。注意到，原癌基因編碼的Ras蛋白在體外被注射至細(xì)胞中的抗體靶向，該阻斷導(dǎo) 致細(xì)胞不再分裂。突變與這些產(chǎn)物的調(diào)控活性受損有關(guān)。許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑易受SHAL對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子的一步靶向(直接細(xì)胞內(nèi))或兩步靶 向(膜靶向，然后內(nèi)化)的干擾。這些包括但不限于如下關(guān)鍵途徑，例如，“G”蛋白信號(hào)傳 導(dǎo)，酪氨酸特異性蛋白激酶活性，例如EGFR、Neu等。多種激素受體干擾也可被SHAL靶向而 產(chǎn)生細(xì)胞功能和/或細(xì)胞生長(zhǎng)的變化。激素或酶靶可被結(jié)合并且其功能被阻斷?？捎杏玫?激素受體阻斷包括使用SHAL來(lái)阻斷雌激素樣分子與ER (雌激素受體)結(jié)合并對(duì)AR (雄激 素受體)具有相似效應(yīng)。這繼而干擾該復(fù)合物的DNA結(jié)合，導(dǎo)致干擾激素敏感性腫瘤細(xì)胞 生長(zhǎng)和活力。本發(fā)明還考慮了使用SHAL來(lái)治療感染性疾病(例如，AID、流行性感冒等)，這是 通過(guò)SHAL主要結(jié)合感染原和/或阻斷細(xì)胞侵襲和/或通過(guò)SHAL阻斷對(duì)于所述感染原的增 殖關(guān)鍵的代謝途徑(例如，通過(guò)阻斷CCR5來(lái)防止細(xì)胞的HIV感染)而進(jìn)行的。 在SHAL所定向的靶包括蛋白質(zhì)的情況中，在一些實(shí)施方式中，組成SHAL的至少一 個(gè)配體(結(jié)合部分)與蛋白質(zhì)中的“口袋”結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，在組成SHAL的至少兩 個(gè)結(jié)合部分與蛋白質(zhì)的“ 口袋”結(jié)合的情況中，這兩個(gè)配體結(jié)合不同“口袋”。在一些實(shí)施方 式中，組成SHAL的所有配體均與靶蛋白中的“ 口袋”結(jié)合。這并非表明，所有組成SHAL的 配體均必須與蛋白質(zhì)“ 口袋”結(jié)合。本發(fā)明考慮了其中一個(gè)配體結(jié)合“ 口袋”而另一個(gè)配體 結(jié)合非“ 口袋”的區(qū)域或其中無(wú)一配體結(jié)合“口袋”的一些實(shí)施方式。當(dāng)不能獲得特定靶(例如，癌癥標(biāo)志物或癌癥標(biāo)志物中的結(jié)構(gòu)域或表位)的結(jié)構(gòu) 信息時(shí)，可將靶或靶中的結(jié)構(gòu)域建模成鑒定用于設(shè)計(jì)用以該特異性靶的SHAL的配體結(jié)合 位點(diǎn)。如果已經(jīng)對(duì)靶進(jìn)行了結(jié)構(gòu)上的表征，則可以以該方式使用相關(guān)分子的晶體結(jié)構(gòu)或核 磁共振結(jié)構(gòu)。在不能獲得信息的情況(較不常見(jiàn)的情況)中，則可使用經(jīng)驗(yàn)方法來(lái)鑒定用 于構(gòu)建本文所述的SHAL的合適配體。本文所述的經(jīng)驗(yàn)方法還可用于加速SHAL研制的進(jìn)程。在該情況中，可在本文所述 的SHAL的經(jīng)驗(yàn)研制之后進(jìn)行建模和其他分析性步驟，以更好地理解SHAL和/或指導(dǎo)隨后 階段的SHAL研制。盡管實(shí)施例描述了下述一種優(yōu)選實(shí)施方式即，其中預(yù)期SHAL作為成像和治療性 的放射性同位素(例如，銦-111和釔-90)的載體用于診斷和治療以及期望的靶是可見(jiàn)于 惡性和正常B淋巴細(xì)胞上的HLA-DR細(xì)胞表面分子，因此可用于大多數(shù)淋巴瘤和白血病的實(shí) 施方式，但是應(yīng)該強(qiáng)調(diào)這僅僅是許多實(shí)施方式中的一種，即使在B細(xì)胞淋巴瘤和白血病中 也是如此。例如，已知抗體用以鑒定已知對(duì)于B細(xì)胞淋巴瘤和白血病的抗體靶向具有吸引 力的許多其他細(xì)胞表面抗原。這些還可出于與HLA-DR相同的目的和與其相同的方式來(lái)使 用。另外令人感興趣的是，由所設(shè)計(jì)的用于靶向HLA-DR的SHAL靶向的區(qū)域是已知對(duì)于免 疫識(shí)別和免疫排斥重要的肽呈遞的“凹坑”。甚至更重要的是，抗原和表位已經(jīng)被表征，顯示 對(duì)于所有類型的腺癌的抗體靶向重要，包括乳腺癌、前列腺癌以及結(jié)腸惡性病。腺癌的異常粘蛋白和可豐富見(jiàn)于許多腺癌的CEA也提供了已相當(dāng)良好表征的具有吸引力的靶。在一些實(shí)施方式中，我們相信粘蛋白(MUCl)的核心串聯(lián)重復(fù)蛋白(見(jiàn)，例如，圖4) 提供了用以癌癥定向的SHAL的良好靶。已顯示在上皮癌上調(diào)和容易獲得MUC-I，所述上皮 癌例如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌以及卵巢癌(見(jiàn)，例如，圖5、6以及7)。使用位于多種單克隆抗體(mAb，包括針對(duì)MUC-I的那些抗體)上的Y_90的放射免 疫療法(RIT)已顯示在患者的臨床前研究和試驗(yàn)中的前景。這些研究已顯示可使用放射性 標(biāo)記的mAb有效靶向上皮癌，MUC-I是較有吸引力的靶之一。然而，全部抗體均不容易在實(shí) 體癌中濃集，且通常不穿透實(shí)體癌。因此，這些部分的治療指數(shù)顯示較低。然而，預(yù)期針對(duì)MUCl的蛋白核心串聯(lián)重復(fù)(在患者的臨床前研究和RIT試驗(yàn)中顯 示為在上皮癌上調(diào)的獨(dú)特的抗原表位的一種表位)的MUCl定向的SHAL(例如，根據(jù)本文所 述方法制備的)非常有效。SHAL (選擇性高親和力配體)相對(duì)于完整抗體(大約150，000D)、 甚至單鏈可變區(qū)片段(大約25，000D)要小得多(大約2000D)，以致SHAL容易穿透惡性腫 瘤并在惡性腫瘤中濃集，或容易被腎臟清除或分泌。在一些實(shí)施方式中，除了被選擇用于令人感興趣的表位區(qū)域中的對(duì)接位點(diǎn)的一種 或一種以上配體之外，另外的配體被選擇用于靶上令人感興趣的區(qū)域外的對(duì)接位點(diǎn)。這提 供了較大的選擇性和“有效的”親和力。在多聚體靶(例如，HLA-DR)的情況中，可使另外的 配體定向靶的相同亞單位或不同亞單位。具體地，在HLA-DR的情況中，可使一種或兩種配 體定向表位區(qū)域中已知的對(duì)接位點(diǎn)(因?yàn)長(zhǎng)ym-I單克隆抗體反應(yīng)性而定義的)，并且可選擇 另外的配體用于相同或不同多聚體中的對(duì)接位點(diǎn)，例如，HLA-DR的β亞單位或α亞單位。其他實(shí)例是具有被選擇與粘蛋白(例如上述MUC-1)的串聯(lián)重復(fù)反應(yīng)的配體的 SHAL0在該情況中，核心蛋白以IOmer的間距重復(fù)，使得具有相似或相同性質(zhì)的SHAL可被連 接，從而向相同或相似但不同的重復(fù)的已知(或未知)距離提供多價(jià)化學(xué)鍵?？蛇x地，SHAL 可具有第三配體，該第三配體與初始配體之一相同但以一定距離與MUC-I的核心串聯(lián)重復(fù) 的遠(yuǎn)區(qū)的對(duì)接位點(diǎn)連接。另外，除了空穴以外，對(duì)接位點(diǎn)還可為突起(protrusion)，但空穴由于較多接觸相 互作用的潛能而可能賦予更大的親和力。B)待篩詵的化合物(推定的配體/結(jié)合部分)實(shí)質(zhì)上，根據(jù)本發(fā)明的方法可以篩選任何制劑的結(jié)合靶的能力和因此摻入SHAL 的適合度。這樣的制劑包括但不限于核酸、蛋白質(zhì)/肽、核酸或肽類似物、金屬、糖、多糖、糖 蛋白、脂質(zhì)、凝集素、有機(jī)大分子和有機(jī)小分子、抗體CDR等。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，高流通量篩選方法涉及提供含有大量潛在配體(結(jié)合 部分)的組合性化學(xué)文庫(kù)。然后，如本文所述地，以一種或一種以上測(cè)定篩選這樣的“組合 性化學(xué)文庫(kù)”以鑒定表現(xiàn)所需結(jié)合活性的那些文庫(kù)成員(特定的化學(xué)物質(zhì)或其亞類)。因 此所鑒定的化合物可用作SHAL的組分。組合性化學(xué)文庫(kù)是通過(guò)將多種化學(xué)“基礎(chǔ)材料”(例如試劑)組合的化學(xué)合成或生 物合成而生成的不同化學(xué)化合物的集合。例如，諸如多肽(例如，突變蛋白)之類的線性組 合性化學(xué)文庫(kù)是通過(guò)將一組被稱為氨基酸的化學(xué)基礎(chǔ)材料基礎(chǔ)材料以用于給定的化合物 長(zhǎng)度(即，多肽化合物中氨基酸的數(shù)量)的每一種可能方式組合而形成的。數(shù)百萬(wàn)化學(xué)化 合物可通過(guò)這樣的對(duì)化學(xué)基礎(chǔ)材料的組合性混合而合成。例如，一位評(píng)論者發(fā)現(xiàn)，100種可互換的化學(xué)基礎(chǔ)材料的組合性混合導(dǎo)致理論上合成1億種四聚體化合物或100億種五聚體 化合物(Gallop 等人(1994) J. Med. Chem. ,37(9) :1233-1250)。組合性化學(xué)文庫(kù)的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。這樣的組合性化學(xué)文庫(kù)包括但不 限于肽文庫(kù)(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第 5，010，175 號(hào)；Furka(1991) Int. J. Pept. Prot. Res. ,37 487-493 ；Houghton等人(1991) Nature，3 :84-88)。肽合成決非本發(fā)明想象和預(yù)期的唯一 方法。也可以使用其他用于生成化學(xué)物質(zhì)多樣性文庫(kù)的化學(xué)方法。這樣的化學(xué)方法包括但 不限于類肽(PCT公布第W091/19735號(hào))，編碼肽(PCT公布第WO 93/20242號(hào))，隨機(jī)生物 寡聚物(PCT公布第WO 92/0009 1號(hào))，苯并二氮卓(美國(guó)專利第5，觀8，514號(hào))，諸如海因 (hydantoin)、苯并二氮卓以及二肽之類的 diversomer (Hobbs 等人(1993)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 :6909-6913)，乙烯多肽(Hagihara 等人(1992) J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568)， 具有β -D-葡萄糖支架的非肽肽模擬物(Hirschmarm等人(1992) J. Amer. Chem. Soc. 114 9217-9218)，小化合物文庫(kù)的類似有機(jī)合成(Chen等人(1994) J. Amer. Chem. Soc. 116 2661)，寡氨基甲酸酯(Cho等人(1993) Science 261 :1303)，和/或肽基磷酸酯(Campbell 等人(1994) J. Org. Chem. 59 :658)。通常見(jiàn) Gordon 等人(1994) J. Med. Chem. 37 1385，核酸 文庫(kù)(見(jiàn)，例如，Strategene，Corp.)，肽核酸文庫(kù)(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第5，539，083號(hào))， 抗體文庫(kù)(見(jiàn)，例如，Vaughn 等人(I996)Nature Biotechnology, 14(3) =3O9-3H)，和 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文庫(kù)(見(jiàn)，例如，Liang 等人(1996) Science, 274 1520-1522，和 美國(guó)專利5，593，853)，以及有機(jī)小分子文庫(kù)(見(jiàn)，例如，苯并二氮卓，Baum(1993)C&EN, Jan 18，第33頁(yè)，異戊間二烯，美國(guó)專利5，569，588，噻唑烷酮和間噻嗪酮，美國(guó)專利5，549，974， 吡咯烷，美國(guó)專利5，525，735和5，519，134，嗎啉代化合物，美國(guó)專利5，506，337，苯并二氮 卓，美國(guó)專利5，288，514，等等)。用于制備組合性文庫(kù)的裝置可商購(gòu)獲得(見(jiàn)，例如，357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, ΜΑ,433A Applied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)計(jì)算機(jī)虛擬篩選方法來(lái)進(jìn)行用于構(gòu)建SHAL的配體 的初始篩選，在該情況中，不必要使用實(shí)質(zhì)的化合物進(jìn)行。在這樣的情況中，化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) 庫(kù)提供了寬范圍的部分，所述部分因其適于包含在本文所述的SHAL中而可被篩選?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如，MDL Available Chemicals Directory(MDL A⑶)目前是世界上可商購(gòu)獲得的化學(xué)物質(zhì)的最大的結(jié)構(gòu)可檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，可
自 MDL Information Systems, Inc.，San Leandro, California。 ^ ]^^又用于歹lj， 非意在限制。其他化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，ChemSpider，ZINC等)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知， 包括但不限于多種有機(jī)分子、肽、碳水化合物或核酸結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。C)結(jié)合靶的配體的計(jì)算鑒定使用計(jì)算機(jī)虛擬方法，計(jì)算方法可用于表征(例如，建模)靶(例如，靶蛋白)并 鑒定預(yù)期特異性結(jié)合靶的一些區(qū)域的分子(結(jié)合部分)。使用計(jì)算方法來(lái)鑒定特異性結(jié)合 特定靶的分子常常被稱為“對(duì)接”。對(duì)接方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。兩種對(duì)接的方法為“剛性分子對(duì)接”和柔性(軟 性)對(duì)接，在“剛性分子對(duì)接”中，所涉及的分子被作為在對(duì)接過(guò)程中不能改變其空間形狀 的剛性物體來(lái)處理，在柔性(軟性)對(duì)接中，當(dāng)分子對(duì)接時(shí)使(計(jì)算地)其改變形狀。
有幾種在兩個(gè)分子之間相互作用的物理力和化學(xué)力。這些力用于定義測(cè)量各解決 方法的質(zhì)量的多種對(duì)接評(píng)分。這些評(píng)分考慮了這些力的強(qiáng)度和對(duì)接解決方法的合理性。在 對(duì)接算法中通?？紤]的最顯著的力包括靜電力、范德華力以及氫鍵。對(duì)接問(wèn)題通常在形式上如下所述使A、B為在R3中具有其幾何表述的兩種剛性分 子(例如，靶和將與靶結(jié)合的潛在配體)。我們希望發(fā)現(xiàn)使得T · A和B之間的接觸表面最 大的剛性轉(zhuǎn)化T :R3- > R3。通常將接觸表面定義為其中分子之間的距離小于給定閾值的 表面。通常對(duì)接算法試圖實(shí)現(xiàn)“足夠大”代替“最大”的接觸表面，我們?cè)O(shè)法最大化的不是 接觸表面的尺寸，而是測(cè)量所建議的對(duì)接解決方法的質(zhì)量評(píng)分。這兩個(gè)參數(shù)具有相關(guān)性但 非等同。1.剛件對(duì)接剛性對(duì)接算法的一種方法由Kuntz等人(1982) J. Mol. Biol.，161 =269-288描述。 Kuntz等人的算法主要用于解決配體-蛋白質(zhì)對(duì)接，與此同時(shí)設(shè)法集中于分子表面上的“令 人感興趣的”位點(diǎn)。該算法的基本階段包括首先使用Connolly方法計(jì)算分子表面(見(jiàn)， 例如，Connolly (1983) J. Appl. Crystallography, 16 :548-558 ；Connolly (1983) Science, 221 :709-71 。這產(chǎn)生了在“平滑的”分子表面上具有其法線的一組點(diǎn)。然后，使用“假原 子”“球體發(fā)生器”(例如，SPHGEN)生成靶(例如，蛋白質(zhì))和配體分子表面的新的表述，然 后使用該表述來(lái)發(fā)現(xiàn)分子表面上的合理對(duì)接位點(diǎn)——SPHGEN所尋找的這些對(duì)接位點(diǎn)為受 體表面中的空穴。SPHGEN通常由下述五個(gè)階段組成首先，對(duì)于Connolly點(diǎn)Pi，Pj上的各配對(duì)，放置 穿過(guò)該配對(duì)的球體，使得其中心位于法線點(diǎn)之一上。然后該算法定義Snmi(i) = {中心位于 Pji線點(diǎn)上的球體}。假定具有η個(gè)Connolly點(diǎn)，那么，對(duì)于各1 <= i <=11且？1位于 靶表面上，我們舍棄Snmi(i)中的所有球體，并僅留具有最小半徑的一個(gè)。這舍棄了所有穿 透靶表面的球體。然后該算法通常僅留其中θ (例如，pi法線點(diǎn)和~至球體中心的半徑之 間的角度)<90°的球體。除非限定球體的點(diǎn)(pi和ρj)相互之間太近，并因此不位于靶 表面上的空穴內(nèi)。隨后該算法通常對(duì)于各原子僅保留具有最大半徑的球體。該步驟僅保留 “碰觸”原子表面的球體。最后，如果限定球體的點(diǎn)(Pi和~)屬于兩個(gè)不同的原子，且分子 序列上的這些原子之間的距離小于4，則舍棄球體。這樣做是因?yàn)棣谅菪系膹澢L(zhǎng)度為 3. 6，這些位點(diǎn)通常不作為可能的對(duì)接位點(diǎn)來(lái)處理。剩下的球體被稱為假原子。下一階段尋找成簇的交叉假原子。該類型的簇的存在 表明分子表面中空穴的存在，所述空穴被認(rèn)為是良好的對(duì)接位點(diǎn)。畢竟這是對(duì)于靶進(jìn)行處理(對(duì)于配體進(jìn)行相同處理)，但這次我們?nèi)∨c其法線相 對(duì)的點(diǎn)和矢量，以在表面內(nèi)產(chǎn)生球體，而不是在表面外。關(guān)于靶的SPHGEN結(jié)果有時(shí)被稱為 “陰性圖像”，關(guān)于配體的SPHGEN結(jié)果被稱為“陽(yáng)性圖像”。在一些實(shí)施方式中，關(guān)于配體和 靶的矢量可以逆轉(zhuǎn)(例如，從而發(fā)現(xiàn)在配體的空穴內(nèi)對(duì)接的靶成分)。然后通常進(jìn)行“匹配”。在該操作中，對(duì)于各對(duì)接位點(diǎn)，該算法設(shè)法找到轉(zhuǎn)化T，該 轉(zhuǎn)化T給出了靶的假原子中心與配體的那些假原子中心之間的良好對(duì)應(yīng)(在有些情況中， 配體的真原子的中心代替其假原子的中心使用)。在一些形式的DOCK中，將假原子簇分成 亞簇，以改進(jìn)該階段的復(fù)雜性。這樣做的一種方式是舍棄簇中最大的球體，這有時(shí)導(dǎo)致簇分 成兩個(gè)亞簇。
在剛性對(duì)接的匹配問(wèn)題中，進(jìn)行搜索以發(fā)現(xiàn)一個(gè)分子的平移和旋轉(zhuǎn)，使得兩個(gè)分 子中的令人感興趣的點(diǎn)之間形成良好的匹配。在一些實(shí)施方式中，代替點(diǎn)位置使用的點(diǎn)之 間的距離為對(duì)于各分子，靶⑴和配體(L)，合適的距離點(diǎn)陣分別被定義為dTM和 <」。 然后進(jìn)行搜索以發(fā)現(xiàn)T和L中兩個(gè)亞組，使得在容許一些誤差的情形下它們的距離相同。 這兩個(gè)亞組定義了其頂點(diǎn)之間具有幾乎相似距離的兩幅子圖。這可使用類似于Grimson和 Lozano-Perez的解釋樹(shù)的方法來(lái)進(jìn)行。解決匹配問(wèn)題的另一種方式是發(fā)現(xiàn)匹配圖中的“足夠大的”分團(tuán)(clique)。如果 靶中具有η個(gè)點(diǎn)，配體中具有m個(gè)點(diǎn)，則匹配圖具有n*m個(gè)頂點(diǎn)，其中各頂點(diǎn)代表來(lái)自靶的 點(diǎn)和來(lái)自配體的點(diǎn)。使G= (V，E)為匹配圖，使u、v為V中的頂點(diǎn)，其中u代表％和 (分 別為配體的點(diǎn)和靶中的點(diǎn))，ν代表vL和ντο只有當(dāng)ABS[dL(uL, vL)-dT(uT, ντ)] <容許誤差 時(shí)，將邊e= (u，v)添加至E。因此，匹配圖中的分團(tuán)定義了配體和受體中具有相似距離的 點(diǎn)的子集。為了評(píng)估匹配的質(zhì)量，計(jì)算評(píng)分。評(píng)分優(yōu)選考慮分子之間接觸表面的尺寸，且通 常不允許一個(gè)分子穿透另一個(gè)分子。DOCK算法使用填充結(jié)合位點(diǎn)的立方網(wǎng)格，該網(wǎng)格中的 每個(gè)單元具有依據(jù)其與受體原子中心的距離的評(píng)分如果距離為2.8A-4.5 A,評(píng)分為1， 如果距離小于2.8 A，評(píng)分為-127，如果距離大于4.5 A,評(píng)分為O。(在一些情況中，距離 2.8 A被.2.4人取代)。對(duì)于各個(gè)建議的轉(zhuǎn)化，計(jì)算網(wǎng)格中配體點(diǎn)(即，其原子或假原子的 中心)的位置，并將評(píng)分作為這些點(diǎn)的評(píng)分的總和來(lái)計(jì)算。在該算法的多種形式中可使用 另外的或可選的評(píng)分。例如，在一種形式中，對(duì)于具有良好匹配評(píng)分的轉(zhuǎn)化可計(jì)算范德華能 量評(píng)分。構(gòu)建HLA-DR 10的計(jì)算機(jī)模型。本文實(shí)施例中描述了 使用已確定用于四種密切 相關(guān)的人類HLA-DR分子(HLA-DR 1-4)的晶體結(jié)構(gòu)，鑒定蛋白質(zhì)表面上的獨(dú)特“ 口袋”，鑒定 結(jié)合一些獨(dú)特“ 口袋”的配體，以及使用這些配體構(gòu)建SHAL。前述說(shuō)明意在描述一種剛性對(duì)接的方法，而并非意在限制。其他方法對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。應(yīng)注意，SPHGEN和DOCK程序可商購(gòu)獲得(例如，從加利福尼亞大 學(xué)和多個(gè)軟件制造商直接獲得)。2.柔性(軟性)對(duì)接柔性對(duì)接算法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(見(jiàn)，例如，Jiang和Kim(1991)J.Mol. Biol.，219 :79-102 ；Katchalski-Katzir 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，89 (6) 2195-2199，等)。在Jiang和Kim描述的方法(見(jiàn)上文)中，對(duì)于剛性轉(zhuǎn)化的六維空間進(jìn)行計(jì)數(shù)，并 根據(jù)這些轉(zhuǎn)化的能量值來(lái)對(duì)這些轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)分。將兩個(gè)分子置于網(wǎng)格上，并使用網(wǎng)格單元 之間的距離、穿透的數(shù)量以及點(diǎn)法線的方向來(lái)評(píng)估匹配。對(duì)于Connolly算法的輸出值來(lái)運(yùn) 行該算法并對(duì)于整個(gè)分子表面來(lái)運(yùn)行該算法(即，沒(méi)有尋找空穴——與DOCK算法相對(duì))。 為了減少計(jì)數(shù)，該算法通常使用兩種分辨率——低分辨率和高分辨率。低分辨率每平方埃 使用大約0. 3點(diǎn)，高分辨率每平方埃使用大約1點(diǎn)。網(wǎng)格中的各單元被標(biāo)記為“表面”(如果它含有至少一個(gè)Connolly點(diǎn))或“體 積”(如果它不含有任何Connolly點(diǎn))。通常，各表面單元含有2-3個(gè)Connolly點(diǎn)。對(duì)于分子之一(通常較小的一個(gè))的旋轉(zhuǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于各旋轉(zhuǎn)進(jìn)行下述操作計(jì)算分子的表面和體積單元。假定具有通過(guò)轉(zhuǎn)化匹配的至少一對(duì)表面單元(來(lái)自各分子的一 個(gè))，對(duì)于這些所有配對(duì)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于各配對(duì)計(jì)算轉(zhuǎn)化，并通過(guò)檢查法線的方向、表面-表 面匹配的數(shù)目以及穿透的數(shù)目來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)化。良好的轉(zhuǎn)化是具有少數(shù)穿透和許多表面-表 面匹配的那些轉(zhuǎn)化。這首先在低分辨率進(jìn)行，然后再在高分辨率下增加近似的能量評(píng)分來(lái) 計(jì)算最好結(jié)果。根據(jù)“有利”和“不利”相互作用的數(shù)目來(lái)計(jì)算近似的能量評(píng)分。有幾種對(duì) 于各分子的原子的分類，如果這些分類的組合良好促進(jìn)匹配的能量合理性，則被標(biāo)記為“有 利”，否則被標(biāo)記為“不利”。例如，將具有陽(yáng)性電荷的原子置于接近具有陽(yáng)性電荷的另一原子為不利，但如果 其中之一是H供體而另一個(gè)是H受體的兩個(gè)原子鄰近，則為有利。Katchalski-Katzir等人的方法(見(jiàn)上文)是對(duì)于可能的平移進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)使 用FFT來(lái)高效計(jì)算匹配評(píng)分。與前述算法相似，將兩個(gè)分子均置于三維網(wǎng)格上，但這里三種 類型的網(wǎng)格單元被定義為——“體積”、“表面”以及“中間”。如果分子為A和B，則點(diǎn)陣A1, ■^和B^n如下定義(l、m、n為網(wǎng)格坐標(biāo))如果(l，m，n)是“表面”單元，A^n = 1，如果 (1，m，η)是“中間”單元，Aljffljn = q，否則，Aljffljn = 0 ；如果(1，m，η)是“表面”單元，Bljffljn =1，如果(l，m，n)是“中間”單元，Blinun = r，否貝IJ，B^n = 0。在一些實(shí)施方式中，如下選擇參數(shù)使得q < 0，r > 0，q大，|r|小。使用FFT 來(lái)高效計(jì)算這些點(diǎn)陣的標(biāo)量積，因此顯著改進(jìn)該算法的性能。另外，應(yīng)注意的是前述說(shuō)明意在描述一種剛性對(duì)接的方法，并非意在限制。其他方 法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。例如，另外的方法/程序包括但不限于來(lái)自Tripos (http:// www.biosolveit.de/FlexX/)的FlexX，通常用于高流通量篩選。它使用經(jīng)驗(yàn)評(píng)分函數(shù)。它 允許通過(guò)在扭轉(zhuǎn)的化學(xué)鍵周圍旋轉(zhuǎn)以實(shí)現(xiàn)柔性對(duì)接。它作為Sybyl程序的模塊(Tripos， Inc.，St. Louis 發(fā)售)來(lái)售出；來(lái)自 CCDC 的 GOLD (http//www. ccdc. cam. ac. uk/prods/ gold/)，它使用遺傳算法來(lái)生成配體的構(gòu)象異構(gòu)體。它還使得能夠?qū)τ诜肿拥妮^小片段 內(nèi)的扭轉(zhuǎn)能量定制化，并可容納局部蛋白柔性。Autodock UCSD(http://www. scripps. edu/pub/olson-web/doc/autodock/)，它使用Lamarckian遺傳算法來(lái)生成配體的構(gòu)象 異構(gòu)體，當(dāng)僅有少數(shù)配體且結(jié)合能量需要較準(zhǔn)確時(shí)，AutoDock最好用。關(guān)于對(duì)接的一些 好的評(píng)述包括 Lyne (2002) Drug Discovery Today. 7 (20) 1047，和 Taylor 等人 Q002) J. Computer-Aided Mol. Design. ,16 :151。P)經(jīng)驗(yàn)方法和配體結(jié)合的驗(yàn)證使用計(jì)算機(jī)方法來(lái)鑒定用于構(gòu)建SHAL的配體至少需要關(guān)于靶分子結(jié)構(gòu)的一些信 息。本發(fā)明還構(gòu)思了使用不需要關(guān)于SHAL有待定向的靶的結(jié)構(gòu)的信息的方法。在一些“經(jīng)驗(yàn)”實(shí)施方式中，針對(duì)靶分子和/或展示靶分子的細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等來(lái) 篩選單個(gè)配體或配體文庫(kù)，以鑒定結(jié)合所需靶(至少低親和力)的配體。鑒定結(jié)合靶分子 不同區(qū)域的配體。在一些實(shí)施方式中，鑒定結(jié)合靶分子不同區(qū)域的配體且從這樣的結(jié)合不 相互排斥的配體。然后，可將可同時(shí)結(jié)合靶但不相互排斥的配體直接連接在一起或通過(guò)連接體連接 在一起，以生成多齒SHAL，隨后所述多齒SHAL因其結(jié)合(例如以高親和力)靶分子的能力 可任選地被篩選出。除了用于配體鑒定的經(jīng)驗(yàn)方法之外，對(duì)于證實(shí)使用上述計(jì)算機(jī)虛擬方法鑒定的配
28體的結(jié)合而言，物理篩選方法也是理想的。此外，另外確定兩個(gè)或兩個(gè)以上配體的結(jié)合方向 是理想的，例如，當(dāng)配體摻入SHAL時(shí)用以證實(shí)配體結(jié)合靶上的不同位點(diǎn)和/或用以估計(jì)間距。用于檢測(cè)一種或一種以上配體與靶結(jié)合的測(cè)定為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如，在 一種簡(jiǎn)單的實(shí)施方式中，可使用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記配體并使之與固定于基質(zhì)上的靶分子 接觸。在洗滌之后，檢測(cè)到與固定的靶分子結(jié)合的標(biāo)記物表明配體與靶結(jié)合。在一些實(shí)施 方式中，可使用不同的標(biāo)記物(例如，不同顏色熒光標(biāo)記物)來(lái)標(biāo)記不同的配體，并可觀察 多種配體的同時(shí)結(jié)合?？蛇x地，可進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。在這樣的測(cè)定中，使靶分子與已知結(jié)合靶的一種 配體接觸。還使靶與“試驗(yàn)”配體接觸，并評(píng)價(jià)在存在第一配體的情形下該試驗(yàn)配體與靶結(jié) 合的能力。還可進(jìn)行流體相測(cè)定。例如，可使用不同標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記配體和靶?？墒古潴w與靶 分子接觸，并可容易地評(píng)價(jià)(例如使用流式細(xì)胞儀)兩者的結(jié)合。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)方法為 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(見(jiàn)，例如，Omerod(1994)Flow Cytometry :APractical Approach. IRL Press, Oxford. ；Shapiro Practical Flow Cytometry.第 3 版，Alan R Liss, Inc.； Givan(1992)Flow Cytometry. First Principles. ffiley-Liss, New York ；Robinson (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, ffiley-Liss, New York,等等)。還可使用多種不同方法來(lái)測(cè)定配體結(jié)合和方向。這些方法包括但不限于飽和轉(zhuǎn)移 差異核磁共振(Mayer 和Meyer (1999) Angew Chem Int Edit，38 :1784-1788)，轉(zhuǎn)移核歐沃豪 斯效應(yīng)(trNOE)核磁共振(NMR)光譜法(Henrichsen 等人(1999) Angew Chem Int Edit.， 38 :98-102 ；Cosman 等人(2002) Chem Res Toxicol 15 :1218-1228)。這些方法可用于在每 個(gè)實(shí)驗(yàn)中篩選混合物中的幾種至幾百種配體，以確定哪些配體與靶分子結(jié)合(例如，在生 物相關(guān)條件下)并確定哪些配體與相同(或不同)位點(diǎn)結(jié)合。還可對(duì)于已經(jīng)被確定結(jié)合的 那些配體進(jìn)行擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(Lin等人(1997) J. Organic Chem. ,62 =8930-8931)以評(píng)價(jià)各化合 物的相對(duì)結(jié)合親和力。其他檢測(cè)配體與靶分子結(jié)合的方法包括但不限于表面等離子共振(BIAcore測(cè) 定)、飽和轉(zhuǎn)移差異核磁共振光譜法、其他核磁共振光譜法檢測(cè)、質(zhì)譜法、捕獲微點(diǎn)陣、基于 微珠的文庫(kù)測(cè)定以及其他物理結(jié)合測(cè)定。前述測(cè)定意在為說(shuō)明性，并非限制性。使用本發(fā)明提供的教導(dǎo)，用于檢測(cè)配體與靶 分子結(jié)合的其他許多測(cè)定將是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。在鑒定結(jié)合靶分子(例如，HLA-DR10)的一組配體之后，可進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，例如，通 過(guò)NMR來(lái)檢測(cè)它們是否結(jié)合包含靶分子的“口袋”之一(例如，在HLA-DRlO的情況中，結(jié)合 包含Lym-I表位的“ 口袋”之一)。如上所述，這可通過(guò)制備靶和已知結(jié)合配體之間的復(fù)合物并確定是否第二配體可 結(jié)合該復(fù)合物來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)。因此，例如，在HLA-DRlO靶的情況中，可制備Lym-I HLA-DR10 復(fù)合物，并可再檢測(cè)結(jié)合HLA-DR10的那組配體，以確定當(dāng)Lym-I抗體被結(jié)合時(shí)這些配體是 否仍與蛋白結(jié)合?？设b定不再結(jié)合Lym-1:HLA-DR10復(fù)合物的那些配體(這些配體結(jié)合區(qū)分 HLA-DR10與其他HLA-DR分子的獨(dú)特位點(diǎn))，并將它們用于第二組競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，以鑒定結(jié)合Lym-I表位中不同位點(diǎn)的那些分子。在使用配體對(duì)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，可將在缺乏Lym-I抗體的 情況下結(jié)合的配體和HLA-DRlO蛋白之間發(fā)生的轉(zhuǎn)移核歐沃豪斯效應(yīng)(trNOE) (Cosman等人 (2002)Chem Res Toxicol 15 :1218-1228)用于鑒定結(jié)合相同和不同位點(diǎn)的那些配體。結(jié) 合的配體表現(xiàn)陰性核歐沃豪斯效應(yīng)(NOE)信號(hào)，而未結(jié)合的配體具有陽(yáng)性信號(hào)(見(jiàn)上文)。 如果配對(duì)中的兩種配體均被觀察到同時(shí)與蛋白結(jié)合，則結(jié)果將表明兩種配體必須結(jié)合不同 位點(diǎn)。因此，篩選可容易地鑒定結(jié)合靶分子中不同位點(diǎn)(例如，結(jié)合HLA-DRlO的Lym-I表 位中的不同位點(diǎn)(位點(diǎn)1和位點(diǎn)2))的多組配體。在鑒定了結(jié)合靶上不同位點(diǎn)的多組配體之后，可任選使用傳統(tǒng)分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn) 一步評(píng)估結(jié)合位點(diǎn)中配體的方向。分子動(dòng)力學(xué)的模擬方法在實(shí)施例中清楚地描述。例如， 對(duì)于各配體，可模擬結(jié)合“口袋”中的1至3個(gè)方向持續(xù)500微微秒。這將有助于確定配體 上的哪些官能團(tuán)可能與靶接觸和哪些官能團(tuán)易受溶劑影響。該信息可用于鑒定具有修飾的 或不同的官能團(tuán)(可檢測(cè)它們結(jié)合靶的能力)的類似物，并證實(shí)特定官能團(tuán)可用作連接體 連接的位點(diǎn)而不破壞配體與靶的結(jié)合。文獻(xiàn)中描述了使用這些方法用于鑒定結(jié)合多種靶上的特異性位點(diǎn)的配體。例如， 這些方法已用于鑒定結(jié)合破傷風(fēng)神經(jīng)毒素的靶向結(jié)構(gòu)域上的特異性位點(diǎn)的配體(Cosman 等人 U002)Chem Res Toxicol 15 :1218-1228 ；Lightstone 等人 U000) Chem. Res. Toxicol.，13 :356-362)，和鑒定我們已經(jīng)鑒定的結(jié)合HLA-DR10的11種配體。我們先前的研究使用相似方法鑒定結(jié)合破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(見(jiàn)上文)靶向結(jié)構(gòu)域上 兩個(gè)位點(diǎn)的配體，該研究要求實(shí)驗(yàn)性篩選少于30種配體。觀察到超過(guò)半數(shù)的被預(yù)測(cè)結(jié)合蛋 白質(zhì)的配體實(shí)驗(yàn)性結(jié)合。因此，我們認(rèn)為每個(gè)位點(diǎn)篩選一組30種配體會(huì)提供足夠數(shù)量的 結(jié)合以啟動(dòng)SHAL合成的化合物。然而，如果在一些實(shí)施方式中，在第一輪NMR篩選中沒(méi)有 鑒定出合適數(shù)量的配體(例如，3-5)以結(jié)合，則可選擇另外的數(shù)組配體，并且對(duì)它們進(jìn)行篩 選，直至發(fā)現(xiàn)結(jié)合靶中兩個(gè)不同位點(diǎn)的合適配體。在一些實(shí)施方式中，有待連接在一起的配體對(duì)(或其他多配體組合)的選擇基于 下列標(biāo)準(zhǔn)(重要性逐級(jí)降低)1)結(jié)合位點(diǎn)(構(gòu)成一對(duì)的兩種配體優(yōu)選結(jié)合不同位點(diǎn))；2) 所獲得的可利用的官能團(tuán)的信息的可靠性，該官能團(tuán)可用于將分子與連接體連接而不破壞 結(jié)合(優(yōu)選被證實(shí)結(jié)合的已知衍生物的類似物，表明特定官能團(tuán)的修飾不影響結(jié)合)；3)配 體與連接體連接的期望的容易度(配體優(yōu)選具有促進(jìn)將不同配體置于連接體的相對(duì)端的 不對(duì)稱連接化學(xué)方法的官能團(tuán))；4)相對(duì)結(jié)合親和力，例如通過(guò)NMR擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的(通常 首先選擇表現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)最強(qiáng)結(jié)合的配體)；5)關(guān)于它們?cè)趧?dòng)物或人類中的毒性的已知信息 (通常優(yōu)選使用已知無(wú)毒性或已被允許用于其它藥物制劑的配體)；以及6)配體價(jià)格。因?yàn)橛锌赡茉S多單個(gè)配體(單個(gè)部分)可與其他蛋白質(zhì)微弱結(jié)合，在單個(gè)配體用 于生成SHAL之前預(yù)篩選單個(gè)配體以確定它們是否結(jié)合可在循環(huán)中遇到的其他蛋白質(zhì)是不 必要的(或者無(wú)意義的)。預(yù)期任何單個(gè)配體(用于生成二齒SHAL的配對(duì)的一半)與其他 蛋白質(zhì)結(jié)合是微弱的(充其量是微摩爾)。因此，分子的解離速率高，僅通過(guò)一個(gè)配體與其 他蛋白結(jié)合的SHAL將從組織和循環(huán)快速去除。只有當(dāng)配對(duì)中的兩個(gè)配體同時(shí)與由合適距 離(由連接它們的連接體的長(zhǎng)度來(lái)說(shuō)明)分開(kāi)的位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，才獲得高親和力(和低解離 速率)。只有當(dāng)SHAL與期望的靶接觸時(shí)才滿足這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。一旦結(jié)合，預(yù)期解離速率比對(duì) 于任一配體單獨(dú)觀察到降低1000倍至1，000，000倍(基于先前的研究)。出于該原因，預(yù)期交叉反應(yīng)不會(huì)是顯著的復(fù)雜情況。E)組合的計(jì)算方法/經(jīng)驗(yàn)方法SHAL與其靶的區(qū)域的結(jié)合基于適合度(fit)和電荷，并取決于結(jié)合部分的三維結(jié) 構(gòu)和組成。在上述計(jì)算方法中，生成SHAL可涉及定義/鑒定靶分子上的有吸引力的區(qū)域。 因此，例如，可對(duì)于所有類型的蛋白質(zhì)，包括抗原、受體以及信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，進(jìn)行建模以發(fā)現(xiàn) 對(duì)接位點(diǎn)和配體。隨后可使用經(jīng)驗(yàn)方法檢測(cè)配體。這些方法通常要求在建模中所包括的組 成性分子的信息。上述經(jīng)驗(yàn)方法依賴于篩選潛在配體文庫(kù)(例如，組合性文庫(kù))以發(fā)現(xiàn)合適的結(jié)合 劑。在該方法中，不需要除了令人感興趣的靶(例如，蛋白質(zhì)、細(xì)胞等)的可用性以外的預(yù)知 信息。實(shí)驗(yàn)性篩選用于結(jié)合劑的文庫(kù)。這之后可進(jìn)行與分子的競(jìng)爭(zhēng)，所述分子例如抗體、肽 或已知與被選擇用于靶向的區(qū)域中的分子反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)(配體)。該方法允許去除令人 不感興趣的結(jié)合化學(xué)物質(zhì)或肽，并定義結(jié)合令人感興趣的區(qū)域的那些結(jié)合化學(xué)物質(zhì)或肽。第三種方法在性質(zhì)上處于中性，利用有吸引力的靶分子和這些分子的區(qū)域的預(yù)知 信息用于初始的競(jìng)爭(zhēng)性篩選和反篩選。因此，例如，可計(jì)算性預(yù)測(cè)初始靶或配體文庫(kù)組分。 然后，如本文所述，可篩選和反篩選優(yōu)化的靶或靶集合和/或優(yōu)化的文庫(kù)，以鑒定最佳的結(jié) 合劑。F)基于微珠的文庫(kù)篩詵用于篩選結(jié)合靶分子的配體的一種方法涉及產(chǎn)生包含大量潛在配體的組合性文 庫(kù)，所述配體各自附著于不同微珠/固體載體。組合性文庫(kù)可為“隨機(jī)”文庫(kù)，或可被合成 以提供多種具有例如特定(例如，優(yōu)化的)核心化學(xué)性質(zhì)的變異體。組合性合成方法是公知的并被用于快速制備不同化合物的大“文庫(kù)”。在多種實(shí)施 方式中，將初始材料(例如，氨基酸)共價(jià)錨定于固體載體。這之后分步添加諸如氨基酸、 核苷酸、有機(jī)小分子等之類的單體(通常為受保護(hù)的單體)。數(shù)百萬(wàn)的不同分子可通過(guò)許多 不同步驟和許多反應(yīng)試劑來(lái)生成(例如，在分開(kāi)-混合合成方法中)，但通常各微珠僅含有 一種化合物?？稍诮M成文庫(kù)的化合物仍與微珠結(jié)合的時(shí)候?qū)ζ溥M(jìn)行篩選?？墒褂帽壬?、熒光 方法、放射攝影方法或其他方法觀察陽(yáng)性(結(jié)合的)微珠。這些可被捕獲(例如，使用移液 管，如果微珠是磁性微珠則使用金屬棒)，然后可對(duì)化合物進(jìn)行表征。因此，例如，可以合成結(jié)合HLA-DRlO分子的肽配體的文庫(kù)。已有對(duì)肽合成化學(xué)方 法的完善研究。然而，為了獲得在體內(nèi)具有較長(zhǎng)半衰期的肽配體，可以選擇生成其中肽包含 D氨基酸的肽配體文庫(kù)。預(yù)期這樣的肽對(duì)于體內(nèi)蛋白水解具有更大的抵抗力。另外，通常認(rèn) 為D氨基酸無(wú)毒性。HLA-DRlO上的Lym-I表位為高度極性。因此，在合成潛在結(jié)合劑的文庫(kù)中，可以選 擇極性D氨基酸用于合成(例如，Ser、ASp等)。使用分開(kāi)/混合合成(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利 5，574，656)生成與微珠結(jié)合的D肽的文庫(kù)。然后將HRP標(biāo)記的HLA-DRlO添加至微珠混合物。顯現(xiàn)HRP的顏色標(biāo)記物，并移取 陽(yáng)性微珠。然后，可針對(duì)例如HLA-DRlO陽(yáng)性細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性微珠。在該測(cè)定中檢測(cè)為陽(yáng) 性的微珠隨后可針對(duì)例如組織切片來(lái)檢測(cè)，以確保結(jié)合為HLA-DRlO特異性。然后，可對(duì)該 測(cè)定中的特異性結(jié)合劑進(jìn)行表征(例如，使用埃德曼降解、質(zhì)譜法等來(lái)測(cè)序)。
可選地，在文庫(kù)合成過(guò)程中具有用于對(duì)各化合物的身份進(jìn)行編碼的策略(見(jiàn)， 例如，美國(guó)專利 5，565，324 ；5，723，598 ；5，834，195 ；6，060，596 ；6，503，759 ；6，507，945 ； 6，721，665 ；6, 714，875 ；等等)。從而，使用這樣的“標(biāo)記”策略，可容易地確定陽(yáng)性結(jié)合劑 的身份。G)連接配體(結(jié)合部分)以牛成多齒SHAL一旦鑒定了結(jié)合靶上不同位點(diǎn)的兩種或兩種以上配體(結(jié)合部分)，則將所述配 體直接連接或通過(guò)連接體連接，以生成多齒SHAL。在僅兩種配體被連接的情況中，SHAL是 二齒的。在三種配體被連接的情況中，SHAL是三齒的，諸如此類。用于直接連接分子或通過(guò)連接體連接分子的許多化學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的。用于將配體(結(jié)合部分)相互連接以形成SHAL的具體化學(xué)方法將取決于所需的配 體的化學(xué)性質(zhì)和“中間配體”間距。配體通常含有許多種官能團(tuán)，例如，羧酸(C00H)，游離 胺基(-NH2)，所述官能團(tuán)可用于與連接體上或其他配體上的合適官能團(tuán)反應(yīng)而在此結(jié)合配 體?？蛇x地，可將配體衍生成暴露或連接另外的反應(yīng)性官能團(tuán)。該衍生可涉及許多 連接體分子中的任何連接體的連接，例如可獲自Pierce Chemical Company, Rockford Illinois的那些連接體分子。本文所使用的“連接體”是用于連接兩種或兩種以上配體(結(jié)合部分)而形成多齒 SHAL的分子。通常選擇能夠與組成SHAL的所有配體形成共價(jià)鍵的連接體。合適的連接體 為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，包括但不限于直鏈或支鏈碳連接體、雜環(huán)碳連接體、氨基酸、核酸、 樹(shù)狀聚合物、合成聚合物、肽連接體、肽以及核酸類似物、碳水化合物、聚乙二醇等。在組成 SHAL的一種或一種以上配體為多肽的情況中，可通過(guò)連接體的側(cè)基(例如，通過(guò)與半胱氨 酸的二硫鍵)或通過(guò)末端氨基酸的α碳氨基或羧基將之與組成性氨基酸連接。在一些實(shí)施方式中，具有與第一配體上的基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)和與第二配體上的官 能團(tuán)反應(yīng)的另一基團(tuán)的雙官能連接體可用于形成期望的SHAL。可選地，衍生可涉及配體的 化學(xué)處理，例如，糖蛋白、碳水化合物或的核酸糖部分與高碘酸鹽的乙二醇裂解，生成游離 醛基?？墒褂坞x醛基與連接體上的游離胺基或胼基反應(yīng)而使連接體與配體結(jié)合(見(jiàn)，例如， 美國(guó)專利第4，671，958號(hào))。用于生成多肽(例如抗體或抗體片段)上游離巰基的操作程 序也是已知的(見(jiàn)，美國(guó)專利第4，659，839號(hào))。在一些實(shí)施方式中，將基于賴氨酸、谷氨酸以及聚乙二醇(PEG)的具有不同長(zhǎng)度 的連接體用于偶聯(lián)配體。已經(jīng)使用賴氨酸和PEG的組合生成連接體來(lái)合成許多SHAL(見(jiàn)， 例如，實(shí)施例和圖13)。分子與PEG共軛的化學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見(jiàn)，例 如，Veronese(2001)Biomaterials，22 :405-417 ；Zalipsky 禾口 Menon-Rudolph(1997)， Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications. J. M.Harris 禾口 X. Zalipsky (編輯)，Am. Chem. Soc. Washington, D. C.第 318-341 頁(yè)；Delgado 等人(1992) Drug Carrier Syst.，9 :249-304 ；Pedley 等人(1994) Br. J. Cancer, 70 :1126-113-0 ；Eyre 禾口 Farver (1991)，Textbook of Clinical Oncology, Holleb 等人(編輯)，Am. Cancer Soc.，Atlanta GA 第 377-390 頁(yè)；Lee 等人(1999) Bioconjug. Chem.，10 :973-981 ；Nucci 等人(1991)Adv. Drug Deliv.，6 133-151 ;Francis 等人(1996)J. Drug Targeting,3 321-340)。
用于生成這些SHAL的合成方案的一個(gè)有利特點(diǎn)是所述方法允許幾乎任何類型的 分子與連接體上的第三位點(diǎn)連接。在第一輪的SHAL合成中，生物素已連接在該位點(diǎn)以促進(jìn) 體外結(jié)合研究。生物素標(biāo)記物使得可以通過(guò)表面等離子共振來(lái)快速檢測(cè)與分離的蛋白質(zhì)結(jié) 合并檢測(cè)SHAL結(jié)合活細(xì)胞和組織切片的選擇性。一旦檢測(cè)并證實(shí)SHAL與靶(例如，HLA-DR10)結(jié)合，可在最后一輪合成中連接諸 如DOTA的金屬螯合物(或其他效應(yīng)劑)，以使得能夠?qū)⒎派湫院怂鼗蚱渌?yīng)劑遞送至帶 有靶的細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)。在再檢測(cè)效應(yīng)劑-SHAL共軛物以再證實(shí)它們結(jié)合靶的能力之后，可任選檢測(cè)表現(xiàn) 出對(duì)其靶具有最好選擇性的共軛物在試驗(yàn)生物(例如，小鼠)中的生物分布。在后續(xù)的研 究中也可將其他獨(dú)特分子連接至該位點(diǎn)，使得這些相同的SHAL也可用于例如檢測(cè)用于放 射性同位素遞送的預(yù)靶向方法的實(shí)用性。H)分步固相SHAL合成在一些實(shí)施方式中，通過(guò)分步固相合成方法進(jìn)行SHAL合成。在該方法中，將各連 接體組分或配體連接至與樹(shù)脂表面共價(jià)連接的生長(zhǎng)分子(SHAL)上。在各化學(xué)反應(yīng)之后，可 充分洗滌樹(shù)脂，以去除未反應(yīng)的產(chǎn)物。在一種方法中，在合成開(kāi)始時(shí)，將DOTA與連接體連接。在洗除多余的DOTA之后， 在樹(shù)脂上進(jìn)行多個(gè)額外的化學(xué)反應(yīng)，以添加多種連接體和配體，并且在各反應(yīng)之后，再洗除 未反應(yīng)的產(chǎn)物。在SHAL合成完成時(shí)，存在于樣品中的游離DOTA的量是檢測(cè)不到的(當(dāng)通 過(guò)HPLC和質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí))。DOTA連接極其穩(wěn)定，因此一旦DOTA被連接，則不會(huì)從SHAL解
1 OI)篩詵SHAL的親和力和詵擇件在一些實(shí)施方式中，篩選包含不同配體(結(jié)合部分)和/或包含不同長(zhǎng)度連接體 的SHAL的文庫(kù)，以鑒定對(duì)于靶具有最好親和力和/或選擇性的那些SHAL?？梢砸栽S多方式 進(jìn)行這樣的篩選測(cè)定，包括但不限于篩選與分離的靶結(jié)合，篩選與培養(yǎng)物中的細(xì)胞結(jié)合，篩 選與組織點(diǎn)陣中的細(xì)胞結(jié)合，以及篩選在體內(nèi)與期望的靶結(jié)合。1.SHAL與分離的靶(例如，蛋白質(zhì))結(jié)合在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)下述方法來(lái)評(píng)估最佳SHAL的結(jié)合親和力對(duì)于 SHAL-靶復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，隨后使用例如IASYS Plus或BiaCore儀器對(duì)SHAL-靶 結(jié)合親和力進(jìn)行更準(zhǔn)確的表面等離子共振(SPR)光譜檢測(cè)(Shuck(1997)Armu Rev Biophys Biomol Struct. ,26 :541-566 ；Van Regenmortal(2001)Cell Mol Life Sci.,58 794-800)。為了進(jìn)行SI^R檢測(cè)，可通過(guò)第三官能團(tuán)(如上所述)將生物素添加至連接體，并 且可使SHAL與可商購(gòu)獲得的鏈霉親和素包被的芯片結(jié)合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，認(rèn)為 僅表現(xiàn)出nM或更高結(jié)合親和力的那些SHAL是有用的。然后，可對(duì)表現(xiàn)最大親和力的SHAL 檢測(cè)其選擇性?？蛇M(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)在與靶相關(guān)的分子的存在下SHAL結(jié)合靶的選擇性。因 此，例如，在SHAL定向HLA-DRlO的情況中，可評(píng)估SHAL在由親和色譜法提取和分離的Raji 細(xì)胞表面蛋白的存在下結(jié)合靶分子的能力。在使用生物素化SHAL處理凝膠并洗除多余的 未結(jié)合的SHAL之后，可通過(guò)使用若丹明標(biāo)記的鏈霉親和素染色來(lái)檢測(cè)結(jié)合的SHAL的位置。 在一些實(shí)施方式中，被認(rèn)為表現(xiàn)合理的蛋白質(zhì)選擇性的SHAL可為其中95%或更多熒光與 HLA-DRlO單體和多聚體峰值相關(guān)的那些分子。
2. SHAL與培養(yǎng)物中的細(xì)胞結(jié)合在SHAL靶是細(xì)胞上的標(biāo)志物(例如，癌細(xì)胞標(biāo)志物)的情況中，期望評(píng)估SHAL與 完整細(xì)胞結(jié)合的特異性。利用例如結(jié)合的若丹明標(biāo)記的鏈霉親和素的熒光，可使用生物素化(或否則標(biāo)記 的)SHAL進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合研究，以證實(shí)SHAL與靶(例如，Raji)細(xì)胞結(jié)合。如果觀察到SHAL 結(jié)合，可進(jìn)行Sra檢測(cè)以確定完整細(xì)胞與SHAL的親和力。在一些實(shí)施方式中，可選擇在靶 (例如，腫瘤)細(xì)胞的染色強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照表現(xiàn)至少2倍、優(yōu)選至少5倍以及更優(yōu)選至少10 倍差異的那些SHAL用于進(jìn)一步檢測(cè)和研制?？墒褂门c連接體連接的DOTA分子來(lái)合成最有 前景的SHAL的類似物，并可使用放射性核素標(biāo)記的SHAL進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得更多的定量 數(shù)據(jù)，還使用NanoSIMS或其他方法設(shè)法確定SHAL是保留在細(xì)胞表面還是被內(nèi)化。該信息 可用于決定關(guān)于有待載入螯合劑的放射性同位素的類型。如果SHAL仍位于表面，通常單獨(dú) 使用SHAL或與不需要內(nèi)化的效應(yīng)劑(例如，諸如9(1釔之類的α發(fā)射體，多種可檢測(cè)標(biāo)記物 等)一起使用。如果獲得證據(jù)表明當(dāng)SHAL與靶細(xì)胞結(jié)合時(shí)被內(nèi)化，則可將SHAL與當(dāng)內(nèi)化 時(shí)具有活性的效應(yīng)劑一起使用。3.使用組織點(diǎn)陣分析細(xì)胞詵擇件組織點(diǎn)陣技術(shù)可用于篩選SHAL以確定組織特異性(例如，在抗腫瘤SHAL的情況 中惡性組織和正常組織反應(yīng)性)。組織點(diǎn)陣為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(見(jiàn)，例如，Kononen等人 (1998) Nat Med.，4 :844-847 ；Torhorst 等人(2001)Am J Pathol.，159 :2249-2256 ；Nocito 等人OOOinnt J &1^吐，94:1-5，等等)。以其基本形式，通過(guò)取各單個(gè)腫瘤小塊/大塊 的小核心并將這些核心組裝成單塊(見(jiàn)上文)來(lái)形成組織微點(diǎn)陣。通過(guò)對(duì)該新塊進(jìn)行切片， 可使用標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)方法和原位雜交技術(shù)。因此，可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定數(shù)百組織樣 品而不必要進(jìn)行數(shù)百不同的實(shí)驗(yàn)。圖2和3描述了可如何使用組織點(diǎn)陣，并顯示了示例的 組織點(diǎn)陣的圖。在一種實(shí)施方式中，對(duì)于正常組織點(diǎn)陣，我們已經(jīng)鑒定了 80種獨(dú)特的組織，包括 置于組織微點(diǎn)陣上的口咽、心臟、肺臟、胃、脾臟、肝臟、腎臟、腸、骨髓、胰腺、膀胱、肌肉、腎 上腺、乳房、腦、正常前列腺和皮膚。對(duì)于淋巴細(xì)胞特異性組織點(diǎn)陣，我們包括新生物淋巴細(xì) 胞系、異種移植物以及從UC Davis的人類生物樣品庫(kù)收集的患者材料。使用這些或相似的 組織點(diǎn)陣，可確定SHAL與正常組織的非特異性結(jié)合以及與淋巴細(xì)胞和前列腺腫瘤新生物 的特異性結(jié)合。SHAL與組織點(diǎn)陣的雜交是直接的。使用本文所述的生物素化SHAL，可容易 地將標(biāo)記的鏈霉親和素(例如，若丹明標(biāo)記的鏈霉親和素)用于鑒定結(jié)合SHAL的那些細(xì) 胞。當(dāng)需要時(shí)，可通過(guò)傳統(tǒng)組織學(xué)和免疫組織學(xué)方法來(lái)驗(yàn)證組織微點(diǎn)陣結(jié)果。在一種示例性方法中，可使用組織微點(diǎn)陣儀(例如，Beecher Instruments, Silver Spring, Maryland)和 Kononen 等人(1998)Nat Med.，4 :844-847 描述的技術(shù)，從各“供 體”組織塊的受選擇區(qū)打孔獲得具有0. 6-mm直徑的2-4個(gè)組織圓柱體，并將其帶入接受 體石蠟塊，以組裝組織微點(diǎn)陣。然后，可以以4 μ m厚度對(duì)含有例如200-400個(gè)核心的組織 微點(diǎn)陣載玻片制作切片?？蛇M(jìn)行常規(guī)蘇木素伊紅染色以證實(shí)各核心代表其選擇的組織病 理。對(duì)于免疫組織化學(xué)，可將檸檬酸鹽緩沖液中的微波用于抗原修復(fù)?？赏ㄟ^(guò)共聚焦掃描 儀來(lái)捕獲載玻片的圖像Gcar^cope，Mountain View, CA)并如下所述使用MrSid Viewer 2.0(LizardTech, he.)來(lái)觀察。在計(jì)算機(jī)而非顯微鏡上觀察組織點(diǎn)陣圖像的能力顯著增加了分析的效率。數(shù)字化病理學(xué)方法的主要障礙是載玻片的數(shù)字化形式顯示。與以CT、MRI或現(xiàn)在 的“數(shù)字化平片”賦予患者的數(shù)字化顯示開(kāi)始的放射學(xué)方法不同，病理學(xué)方法需要對(duì)所有組 織樣品進(jìn)行加工并將其制備成用于判讀的固定于載玻片上的染色組織切片。新的技術(shù)生 成了整個(gè)載玻片的圖像，因此生成整個(gè)組織病理樣品的真實(shí)數(shù)字化顯示(整張載玻片成像 (Whole Slide Imaging))。大多數(shù)目前的儀器使用配備數(shù)字化攝影機(jī)的顯微鏡和滑臺(tái)以捕 獲數(shù)千個(gè)單獨(dú)的圖像。由內(nèi)容專家對(duì)各圖像進(jìn)行聚焦。一旦需要，則通常將這些圖像合并 (或)在一起以形成載玻片的最終顯示。該方法非常耗時(shí)，而且由于涉及大量圖像，圖像通 常對(duì)不準(zhǔn)。ScanScope (Aperio Technology)是一種新型數(shù)字化載玻片掃描儀，在3-5分鐘 內(nèi)掃描載玻片，以50，OOOdpi捕獲8至12十億位元組圖像。然后，對(duì)圖像進(jìn)行壓縮、加工 以及儲(chǔ)存用以顯示(見(jiàn)下文)。Lizardtech⑧的MrSid⑧使用專屬多層小波Jpeg格式以 達(dá)20 1的壓縮比壓縮8至12千兆字節(jié)的圖像，而無(wú)顯著的圖像衰減。然后可局部觀察 圖像或從萬(wàn)維網(wǎng)服務(wù)器獲得服務(wù)。與標(biāo)準(zhǔn)的基于萬(wàn)維網(wǎng)的靜止圖像(通常下載在瀏覽器內(nèi) 觀察)不同，MrSid加工的圖像是從萬(wàn)維網(wǎng)觀察，且瀏覽器應(yīng)用從不下載完整圖像。因?yàn)閳D 像是以其最大分辨率取得，通過(guò)服務(wù)器構(gòu)建圖像的“較低”放大率視圖。使用kar^cope和 Zoomify瀏覽器的組合，可在少于20分鐘內(nèi)捕獲并處理整個(gè)載玻片(12十億位元組)。4.詵擇件的體內(nèi)分析當(dāng)然，也可容易地檢測(cè)SHAL的體內(nèi)選擇性。這可通過(guò)將SHAL給藥于包含展示SHAL 所定向的靶的細(xì)胞或組織的試驗(yàn)動(dòng)物(例如，實(shí)驗(yàn)大鼠)而實(shí)現(xiàn)。在足夠的時(shí)間之后，可處 死動(dòng)物，并檢測(cè)(例如，組織學(xué)方法)靶組織和正常組織以評(píng)估SHAL的特異性和遞送量。在 一些實(shí)施方式中，可將SHAL與允許非侵入性成像的成像劑偶聯(lián)并因此允許實(shí)時(shí)藥效動(dòng)力 學(xué)評(píng)估。通過(guò)示例，可使用建立的方法進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)和放射劑量測(cè)定小鼠研究(例 如，對(duì)于實(shí)施例中描述的SHAL)，以生成用以選擇用于患者藥效動(dòng)力學(xué)和放射劑量測(cè)定的 臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)?？墒褂媒⒌姆椒▽?duì)帶有限定尺寸的Raji人淋巴瘤異種移植物的雌性 裸小鼠進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究(DeNardo等人(1998)Clin. Cancer Res.，4 =2483-2490 ； Kukis 等人(1995) Cancer Res.，55 :878-884)。可使用含有 111In 或 90Y 的 DOTA 標(biāo)記的 SHAL 注射小鼠，并可處死小鼠，例如，在至少5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各時(shí)間點(diǎn)處死，以提供用于分析的樣 品。可在預(yù)期這些小分子的早期時(shí)間點(diǎn)和晚期時(shí)間點(diǎn)的極端值進(jìn)行初始研究，這樣可確定 中間時(shí)間點(diǎn)?？蓪㈦牡臄?shù)據(jù)用于定義極端時(shí)間點(diǎn)。當(dāng)將"。!！或5^用作示蹤劑時(shí)，最長(zhǎng)的 時(shí)間點(diǎn)通常為約5天。可使用碘化鈉檢測(cè)儀系統(tǒng)來(lái)確定機(jī)體總清除率。可通過(guò)從小鼠尾靜 脈取循環(huán)血樣品來(lái)監(jiān)測(cè)血清除率。在處死時(shí)，可移取異種移植物和正常組織，對(duì)其進(jìn)行稱重 并在Y井式計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)，以提供器官分布數(shù)據(jù)。為了評(píng)價(jià)SHAL劑量(質(zhì)量)效應(yīng)，可在例如5個(gè)劑量水平進(jìn)行研究(再次以小量 SHAL和大量SHAL開(kāi)始以指導(dǎo)待研究的中間量的選擇)。因?yàn)镾HAL的新穎性，可獲得的小 鼠抗體(例如，Lym-I)研究和例如生長(zhǎng)抑素受體肽配體的信息通常指導(dǎo)研究時(shí)間點(diǎn)和劑量 水平的選擇。在一些實(shí)施方式中，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明SHAL的理想藥物代謝動(dòng)力學(xué)和放射劑量測(cè)定是
35在甲狀腺瘤治療中使用碘化鈉(NaI)實(shí)現(xiàn)的那些方法。SHAL應(yīng)小至足夠完全穿透惡性腫瘤 并容易在尿中分泌。通常，對(duì)于淋巴瘤和白血病的靶識(shí)別和結(jié)合親和力優(yōu)于現(xiàn)有抗體至少 一個(gè)數(shù)量級(jí)將提供所需的腫瘤細(xì)胞選擇性。盡管，較小的分子(例如SHAL)從循環(huán)快速清 除可被認(rèn)為是缺點(diǎn)，但NaI在甲狀腺瘤治療中的顯著效果已經(jīng)顯示如果該試劑具有親和力 和選擇性的合適組合，則這種“缺點(diǎn)”可轉(zhuǎn)化為優(yōu)點(diǎn)。如果SHAL被很好地?cái)z取、僅靶向特異 性的細(xì)胞家族(例如，B淋巴細(xì)胞及其惡性相關(guān)物)、以低解離速率緊密結(jié)合以及被快速?gòu)?系統(tǒng)清除，則正常組織(相對(duì)于惡性組織)接受的劑量應(yīng)顯著低于使用現(xiàn)有的靶向抗體獲 得的劑量。使用作為指導(dǎo)方法的建立的方法(DeNardo等人Q000) J. Nuc 1. Med. ,41 952-958 ；DeNardo 等人(1999) J. Nucl. Med. ,40 :1317-1326 ；DeNardo 等人(1999) J. Nucl. Med. ,40 :302-310 ；Shen 等人(1994) J. Nucl. Med. ,35 :1381-1389 ；Siegel (1994) J. Nucl. Med. ,35 :1213-1216)，可容易地研制用于患有B細(xì)胞型淋巴瘤性疾病或其他癌癥的患者的 藥物代謝動(dòng)力學(xué)和放射劑量測(cè)定研究的方案。可使用在小鼠中生成的數(shù)據(jù)確定突出的SHAL 劑量(質(zhì)量)水平，并使用已知方法調(diào)整所述SHAL劑量(質(zhì)量)水平用于小鼠和患者的相 關(guān) BSA (見(jiàn)，例如，F(xiàn)reireich 等人(1996) Cancer Chemother. Rep. ,50 :219-244)。在一些實(shí) 施方式中，使用關(guān)于非清髓性策略的腫瘤至骨髓的治療指數(shù)的信息和關(guān)于清髓性策略的腫 瘤至劑量限制性非骨髓器官的治療指數(shù)的信息選擇提供最佳劑量水平的方案。τ) imm^m^^^Mi^m^mmu^m^mt shal力、##十牛iu 及代謝可使用計(jì)算機(jī)建模和實(shí)驗(yàn)性研究通過(guò)改變連接體長(zhǎng)度和/或連接體和配體的結(jié) 構(gòu)來(lái)優(yōu)化SHAL親和力、選擇性和代謝?？蓽p小或增加連接體長(zhǎng)度，以改進(jìn)SHAL對(duì)其靶的親 和力。還可對(duì)用于生成SHAL的單個(gè)配體進(jìn)行改變或?qū)蝹€(gè)配體結(jié)構(gòu)進(jìn)行變化來(lái)改進(jìn)結(jié)合、 靶選擇性以及優(yōu)化未結(jié)合的SHAL從生物體的清除。如果需要，還可考慮通過(guò)摻入連接螯合 劑與SHAL的可裂解的化學(xué)鍵(例如，肽或其他可裂解連接體)對(duì)連接體自身的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修 飾以促進(jìn)SHAL從正常組織和外周血清除。如果觀察到特定SHAL表現(xiàn)非特異性結(jié)合(例如，與細(xì)胞提取物中的許多蛋白結(jié)合 或與Raji和對(duì)照細(xì)胞結(jié)合)，可使用不同配體對(duì)來(lái)合成另外的SHAL，直至鑒定出合適的特 異性的SHAL。1. SHAL對(duì)于靶分子的結(jié)合親禾Π力的Jl大化通過(guò)改變和優(yōu)化分隔配體的連接體的長(zhǎng)度可使多齒試劑與蛋白質(zhì)或細(xì)胞表面靶 的結(jié)合親和力增加一個(gè)至一些數(shù)量級(jí)。在不受特定理論限制的情況下，我們相信該種增加 與下列因素有關(guān)實(shí)現(xiàn)配體之間的最佳分隔以使得它們結(jié)合各自的位點(diǎn)，以及與提供連接 體自身中足夠旋轉(zhuǎn)柔性以優(yōu)化其結(jié)合位點(diǎn)(例如，結(jié)合“口袋”)中各配體的相互作用。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)估計(jì)有待于連接在一起的兩個(gè)(或兩個(gè)以上)結(jié)合的配 體之間的距離來(lái)鑒定被選擇用于初始的SHAL的初始連接體長(zhǎng)度。一旦已經(jīng)確定所連接的 配體的特定組合實(shí)際上與靶結(jié)合，可進(jìn)行另外的建模來(lái)進(jìn)一步精化連接體的長(zhǎng)度并優(yōu)化 SHAL結(jié)合親和力。例如，在靶是HLA-DRlO的情況中，可使用分別在“ 口袋”中結(jié)合的兩個(gè)配體來(lái)對(duì) HLA-DRlOii亞單位的結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，并且所述配體通過(guò)多種長(zhǎng)度PEG連接體相互連接(見(jiàn)，例如，本文實(shí)施例)。從分子動(dòng)力學(xué)研究來(lái)講，可評(píng)估結(jié)合的配體的方向以改進(jìn)連接體設(shè) 計(jì)。可進(jìn)行進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬以包括連接體和配體，從而模擬與靶相互作用的多齒 配體，例如本文所述。一旦獲得這些建模實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可使用涵蓋被預(yù)測(cè)為最佳尺寸范圍的連接體來(lái)合 成另外一組SHAL，并實(shí)驗(yàn)性檢測(cè)其結(jié)合親和力。2. SHAL的靶詵擇件和代謝的優(yōu)化還可使用計(jì)算方法以確定是否被連接在一起而產(chǎn)生SHAL的單個(gè)配體的結(jié)構(gòu)的變 化改進(jìn)了靶選擇性并優(yōu)化了 SHAL代謝以及其從正常組織和外周循環(huán)的清除。這可通過(guò)例 如檢查靶向的結(jié)合“ 口袋”中存在的官能團(tuán)的類型及其與結(jié)合的配體相關(guān)的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)?？墒褂门潴w的不同構(gòu)象和所選擇的配體類似物來(lái)幫助鑒定最佳適配各結(jié)合位點(diǎn) (例如，“口袋”)的配體衍生物，從而進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)研究。可進(jìn)行擴(kuò)散NMR實(shí)驗(yàn)(Lin等人 (1997) J. Organic Chem. ,62 :8930-8931)來(lái)對(duì)亞組配體類似物的親和力進(jìn)行比較并分級(jí)。 通?；谟?jì)算機(jī)建模提供的結(jié)果和類似物的商業(yè)可用性或合成的容易度來(lái)篩選被選擇用 于分析的特定類似物。如果實(shí)驗(yàn)性地鑒定了較高親和力的類似物，則可合成一組新的SHAL 并檢測(cè)它們的親和力、結(jié)合靶的選擇性以及理想的代謝特性(例如，從外周循環(huán)、肝臟以及 腎臟的快速清除)。在一些實(shí)施方式中，SHAL的小尺寸可導(dǎo)致其從組織過(guò)于快速清除而不能將合適量 的效應(yīng)劑有效遞送至靶細(xì)胞。如果觀察到這個(gè)現(xiàn)象，可將多種方法用于優(yōu)化SHAL在靶組織 中的滯留時(shí)間。一種方法涉及使用連接體上的生物素連接位點(diǎn)以添加結(jié)合靶上另一位點(diǎn)的 第三配體。預(yù)期這增加SHAL的親和力至亞皮摩爾水平并顯著降低結(jié)合分子的解離速率?？?選地，可通過(guò)將SHAL與較大的多臂PEG分子和/或其他分子連接而顯著增加其有效尺寸。K)示例性 SHAL使用本文提供的教導(dǎo)，可容易地制備結(jié)合例如癌癥標(biāo)志物(例如，HLA-DR10)的許 多不同SHAL。在多種實(shí)施方式中，SHAL包括但不限于二齒SHAL (包含兩個(gè)結(jié)合配體)、三 齒SHAL(包含三個(gè)結(jié)合配體)、四齒SHAL(包含四個(gè)結(jié)合配體)、五齒SHAL(包含五個(gè)結(jié)合 配體)，等等。在多種實(shí)施方式中，SHAL可為多聚體(例如，包含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更 多SHAL的結(jié)構(gòu)和/或復(fù)合物)。SHAL可為同源多聚體(包含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多 SHAL)，或異源多聚體(包含例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多SHAL，其中至少兩個(gè)為不同 種類的SHAL)。在一些實(shí)施方式中，SHAL包含表1、5、6、7或8的任何表格中描述的一種或一種以 上、優(yōu)選兩種或兩種以上或三種或三種以上配體和/或其類似物。一些優(yōu)選的SHAL包括但 不限于二齒SHAL (見(jiàn)，例如圖22和23)、三齒SHAL (見(jiàn)，例如圖24A)、二聚體二齒SHAL、二 聚(雙)三齒SHAL (見(jiàn)，例如，圖MB)，等等。在一些實(shí)施方式中，SHAL包含表1中所示的 一種或一種以上配體。表1.可包含在本文所述的SHAL中的示例配體。其中一些(使用*標(biāo)記)可替代 Ct配體使用或作為第四組分與連接體連接，其不起幫助SHAL更好結(jié)合蛋白質(zhì)的作用但一 旦SHAL進(jìn)入細(xì)胞則作為抑制劑。
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合癌細(xì)胞的選擇性高親和力配體(SHAL)，所述SHAL包含結(jié)合所述癌細(xì)胞的標(biāo)志物上第一位點(diǎn)的第一配體，該第一配體與第二配體連接，所述 第二配體結(jié)合所述癌細(xì)胞的相同標(biāo)志物或不同標(biāo)志物上的第二位點(diǎn)，其中所述第一位點(diǎn)和 所述第二位點(diǎn)為不同位點(diǎn)；并且其中，至少所述第一配體選自下列配體B0C-4-氨基甲基-L-苯丙氨酸、4[[5-(三氟 甲基)吡啶-2-基]氧]苯基]N-苯基氨基甲酸酯、(R)-2-[4-(5-氯-3-氟-2-吡啶基 氧)苯氧基]丙酸、2-(((3-氯-5(三氟甲基)吡啶-2-基氧)苯氧基)甲基)丙烯酸酯、 2-(((3-氯-5(三氟甲基)吡啶-2-基氧)苯基)甲基)丙烯酸酯、2-(((3-氯-5(三氟甲 基)吡啶-2-基氧)苯基)甲基)丙烯腈、3-(3-氯-4-{[5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧} 苯胺基)-3-氧丙酸、稀禾定、烯草酮、5-(四癸基氧)-2-糠酸、2-[(2,6- 二氯苯基)氨基] 苯乙酸、2-[4- (4-氯苯氧基)苯氧基]丙酸、(RS) -2- {4-[3-氯_5_ (三氟甲基)-2-吡啶基] 氧]苯氧基}丙酸、(RS)-2-[4-(6-氯-1，3-苯噁唑-2-基氧)苯氧基]丙酸、(RS)-2-[4-(2, 4-二氯苯氧基)苯氧基]丙酸、(RS)-2-{4-[5-(三氟甲基)-2-吡啶基氧]苯氧基}丙酸、 (RS)-2-[4-(6-氯喹啉-2-基氧)苯氧基]丙酸、(RS)-2-[4_(a，α , α-三氟-ρ-甲苯 氧基)苯氧基]丙酸、5-α4，6-二氯三嗪基-2-基]氨基)熒光素氯化氫、3-[Ν44-乙酰 基苯基)氨基甲?；鵠吡啶-2-羧酸、3-(2-{[3_氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧}苯 胺基)-3-氧丙酸、L-鳥(niǎo)氨酸-β -丙氨酸、2-甲基-1- (3-嗎啉代丙基)-5-苯基-IH-吡 咯-3-羧酸、馬尿酸、馬尿酰基-D-賴氨酸和馬尿?；?L-苯丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第二配體是有機(jī)小分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第一配體結(jié)合與所述第二配體結(jié)合的位點(diǎn) 不同的位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第一位點(diǎn)是所述標(biāo)志物上的口袋。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的SHAL，其中，所述第二位點(diǎn)是所述標(biāo)志物上的口袋。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述標(biāo)志物是HLA-DR細(xì)胞表面抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第一配體和所述第二配體結(jié)合由Lym-I抗 體識(shí)別的表位中的位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第一配體是有機(jī)小分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的SHAL，其中，所述第二配體是有機(jī)小分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第二配體是選自表1、5、6、7或8中的配體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述SHAL是進(jìn)一步包含第三配體的三齒配體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的SHAL，其中，所述第二配體和所述第三配體獨(dú)立地選自表 1、5、6、7或8中的配體。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的SHAL，其中所述第一配體是4-( 二甲氨基)偶氮苯-4'-磺?；?L-纈氨酸(Dv)；所述第二配體是444-(4-氯芐基)哌嗪并]-3-硝基苯甲酸(Cb)；以及所述第三配體選自下列配體4-[[5-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧]苯基]N-苯基氨 基甲酸酯、(R)-2_[4-(5-氯-3-氟-2-吡啶基氧)苯氧基]丙酸、2-(((3-氯-5(三氟甲 基)吡啶-2-基氧)苯氧基)甲基)丙烯酸酯、2-(((3-氯-5(三氟甲基)吡啶-2-基氧) 苯基)甲基)丙烯酸酯、2-(((3-氯-5(三氟甲基)吡啶-2-基氧)苯基)甲基)丙烯腈、3-(3-氯-4-{[5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧}苯胺基)-3-氧丙酸、稀禾定、烯草酮、5-(四 癸基氧)-2-糠酸、2-K2，6-二氯苯基)氨基]苯乙酸、2-[4-(4_氯苯氧基)苯氧基]丙酸、 (RS) -2- {4-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧]苯氧基}丙酸、(RS) -2-[4- (6-氯-1， 3-苯聴唑-2-基氧)苯氧基]丙酸、(RS)-2-[4-(2，4-二氯苯氧基)苯氧基]丙酸、 (RS)-2-{4-[5-(三氟甲基)-2-吡啶基氧]苯氧基}丙酸、(RS)-2-W-(6-氯喹啉-2-基 氧)苯氧基]丙酸以及(RS)-2-[4_(a，α, α-三氟-ρ-甲苯氧基)苯氧基]丙酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的SHAL，其中，所述SHAL是表2中描述的SHAL。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SHAL，其中，所述第一配體通過(guò)連接體與所述第二配體連 接，所述連接體選自PEG型連接體、肽或肽類似物連接體、親和素/生物素連接體、直鏈碳 連接體、雜環(huán)連接體、支鏈碳連接體、樹(shù)狀聚合物、核酸連接體、糖或碳水化合物連接體、硫 醇連接體、酯連接體、包含胺的連接體以及包含羧基的連接體。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的SHAL，其中，所述第一配體、所述第二配體和所述第三配體 通過(guò)含有選自下列連接體成分的連接體相互連接PEG型連接體、肽連接體、親和素/生物 素連接體、直鏈碳連接體、雜環(huán)連接體、支鏈碳連接體、樹(shù)狀聚合物、核酸連接體、糖或碳水 化合物連接體、硫醇連接體、酯連接體、包含胺的連接體以及包含羧基的連接體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的SHAL，其中，所述連接體包括聚乙二醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的SHAL，其中，所述連接體包括聚乙二醇和賴氨酸。
19.一種特異性結(jié)合癌細(xì)胞的選擇性高親和力配體(SHAL)，所述SHAL包含相互連接的三個(gè)配體，其中所述第一配體是4-( 二甲氨基)偶氮苯-4'-磺?；?L-纈氨酸(Dv)；所述第二配體是444-(4-氯芐基)哌嗪并]-3-硝基苯甲酸(Cb)；以及所述第三配體選自3- (2- ([3-氯-5-三氟甲基)-2-吡啶基]氧)-苯胺基)-3-氧丙 酸(Ct)，或其類似物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的SHAL，其中，所述第一配體、所述第二配體和所述第三配體 通過(guò)含有選自下列連接體成分的連接體相互連接PEG型連接體、肽連接體、親和素/生物 素連接體、直鏈碳連接體、雜環(huán)連接體、支鏈碳連接體、樹(shù)狀聚合物、核酸連接體、糖或碳水 化合物連接體、硫醇連接體、酯連接體、包含胺的連接體以及包含羧基的連接體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的SHAL，其中，所述連接體包括聚乙二醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的SHAL，其中，所述連接體包括聚乙二醇和賴氨酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的SHAL，其中，所述SHAL包括下列結(jié)構(gòu)
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的SHAL，其中，所述SHAL包括下列結(jié)構(gòu)
25.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)所述的SHAL，其中，所述SHAL是二價(jià)的。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至25任一項(xiàng)所述的SHAL，其中，所述SHAL與轉(zhuǎn)導(dǎo)肽連接。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的SHAL，其中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽選自SV40的核定位信號(hào)、HIVTat 蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、整合素結(jié)合肽(RGD肽)、玻璃粘連蛋白(VN肽)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu) 域、果蠅的觸角蛋白、VP22、寡精氨酸、乳糖基化聚-L-賴氨酸或其他寡聚物、S-G-E-H-T-N-G-P-S-K-T-S-V-R-ff-V-ff-D,S-M-T-T-M-E-F-G-H-S-M-I-T-P-Y-K-I-D,Q-D-G-G-T-W-H-L-V -A-Y-C-A-K-S-H-R-Y、M-S-D-P-N-M-N-P-G-T-L-G-S-S-H-I-L-W、S-P-G-N-Q-S-T-G-V-I-G-T-P-S-F-S-N-H、S-S-G-A-N-Y-F-F-N-A-I-Y-D-F-L-S-N-F 以及G-T-S-R-A-N-S-Y-D-N-L-L-S-E-T-L-T-Q。 ,OHH3N.c.N
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的SHAL，其中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是六精氨酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)所述的SHAL，其中所述SHAL與效應(yīng)劑連接。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑選自附加表位、抗體、第二SHAL、標(biāo) 記物、細(xì)胞毒素、脂質(zhì)體、放射性核素、藥物、前藥、酶抑制劑、病毒顆粒、細(xì)胞因子以及螯合 劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑是選自親和素和生物素的附加表位。
32.根據(jù)權(quán)利要求四所述的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑是選自白喉毒素、假單胞菌外毒 素、篦麻毒素、相思豆毒素以及胸苷激酶的細(xì)胞毒素。
33.根據(jù)權(quán)利要求四所述的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑是包含下列金屬同位素的螯合 劑99TC、2°3Pb、67Ga J8GaJ2AsJ11ICru97Riu62Ciu64Ciu5午e、52mMn、51Cr、186Re、_Re、77AS、90Y、 67CU、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198AU、199AU、161Tb、1(l9Pd、165Dy、149Rii、151Pm、153Sm、157Gd、1H3Gd、 166Ho,172Tm^169Yb,175Yb,177Lu^105Rh 以及 111Ago
34.根據(jù)權(quán)利要求四所述的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑是包含α發(fā)射體的螯合劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的SHAL，其中，所述α發(fā)射體是鉍213。
36.根據(jù)權(quán)利要四的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑是包含DOTA的螯合劑。
37.根據(jù)權(quán)利要四的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑是脂質(zhì)或脂質(zhì)體。
38.根據(jù)權(quán)利要求四所述的SHAL，其中，所述效應(yīng)劑選自3-(2-([3_氯_5_(三 氟甲基)-2-吡啶基]氧)_苯胺基)-3-氧丙酸(Ct)、4[[5-(三氟甲基)吡啶-2-基] 氧]苯基]N-苯基氨基甲酸酯、(R)-2-[4-(5-氯-3-氟-2-吡啶基氧)苯氧基]丙酸、 2-(((3-氯-5(三氟甲基)吡啶-2-基氧)苯氧基)甲基)丙烯酸酯、2-(((3-氯-5(三氟 甲基)吡啶-2-基氧)苯基)甲基)丙烯酸酯、2-(((3-氯-5(三氟甲基)吡啶-2-基氧) 苯基)甲基)丙烯腈、3- (3-氯-4- {[5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧}苯胺基)-3-氧丙酸、 稀禾定、烯草酮、5_(四癸基氧)-2-糠酸、2-K2，6-二氯苯基)氨基]苯乙酸、2-[4-(4_氯苯 氧基)苯氧基]丙酸、(RS)-2-{4-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氧]苯氧基}丙酸、 (RS)-2-[4-(6-氯-1，3-苯.卩惡唑-2-基氧)苯氧基]丙酸、(RS)-2-(2，4-二氯苯氧基) 苯氧基]丙酸、(RS) -2- {4- [5-(三氟甲基)-2-吡啶基氧]苯氧基}丙酸、(RS) -2- [4- (6-氯 喹啉-2-基氧)苯氧基]丙酸以及(RS)-2-[4_(a，α, α -三氟-ρ-甲苯氧基)苯氧基] 丙酸。
39.一種抑制表達(dá)HLA-DRlO標(biāo)志物的癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，所述方法包括 使所述癌細(xì)胞與權(quán)利要求1至38任一項(xiàng)所述的選擇性高親和力多齒配體(SHAL)接觸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述細(xì)胞是實(shí)體瘤細(xì)胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述癌細(xì)胞是惡性B淋巴細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述癌細(xì)胞與非何杰金氏淋巴瘤或白血病或 其他B細(xì)胞衍生的惡性腫瘤有關(guān)。
44.一種藥物制劑，所述制劑包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和權(quán)利要求1至38任一項(xiàng) 所述的SHAL。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的藥物制劑，其中，所述制劑是單位劑型制劑。
46.一種檢測(cè)癌細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述癌細(xì)胞與包含連接至可檢測(cè)標(biāo)記物的權(quán)利要求1至25任一項(xiàng)所述的SHAL的嵌 合分子接觸；以及檢測(cè)所述可檢測(cè)標(biāo)記物是否存在。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述可檢測(cè)標(biāo)記物選自..、發(fā)射體、正電子發(fā) 射體、X射線發(fā)射體、α發(fā)射體以及熒光發(fā)射體。
48.一種檢測(cè)癌細(xì)胞的方法，其中，所述方法包括使癌細(xì)胞與包含連接至附加表位的權(quán)利要求1至25任一項(xiàng)所述的SHAL的嵌合分子接觸；使所述嵌合分子與包含可檢測(cè)部分的螯合劑接觸，由此所述螯合劑結(jié)合至所述附加表 位，從而使所述可檢測(cè)部分與所述螯合劑結(jié)合；以及 檢測(cè)所述可檢測(cè)部分。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述可檢測(cè)部分是放射性核素。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述可檢測(cè)部分選自:Υ發(fā)射體、正電子發(fā)射 體、α發(fā)射體、X射線發(fā)射體以及熒光發(fā)射體。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述檢測(cè)包括外部成像。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述檢測(cè)包括內(nèi)部成像。
53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述可檢測(cè)部分包括選自下列的金屬同位素 99TC、2°3Pb、67Ga、68Ga、72AS、mIn、113mIn、97RU、62CU、641CU、5￥e、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77AS、90Y、 67CU、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198AU、199AU、161Tb、1(l9Pd、165Dy、149Rii、151Pm、153Sm、157Gd、1H3Gd、 166Ho,172Tm^169Yb,175Yb,177Lu^105Rh 以及 111Ago
54.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述螯合劑包括D0TA。
55.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述附加表位是親和素、生物素或酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了新型選擇性高親和力多齒配體(SHAL)，SHAL可以以類似于使用抗體的方式用于多種用途。多齒配體通常包含多個(gè)配體，各配體結(jié)合靶分子上的不同區(qū)域。配體直接連接或通過(guò)連接體連接，因此形成通常以高選擇性和高親和力結(jié)合靶分子的多齒部分。
文檔編號(hào)C07J43/00GK102083850SQ200980122906
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者G·L·德納多, R·L·巴爾霍恩, S·J·德納多 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì), 勞倫斯利弗莫爾國(guó)家安全有限責(zé)任公司