專利名稱：改進(jìn)的基于纖連蛋白的結(jié)合分子及其用途的制作方法
改進(jìn)的基于纖連蛋白的結(jié)合分子及其用途優(yōu)先權(quán)信息本申請要求2008年5月2日遞交的美國臨時(shí)專利申請系列號(hào)61/050，142的優(yōu)選 權(quán)，其內(nèi)容在此全文并入作為參考。相關(guān)信息本說明書通篇引述的任何專利、專利申請和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容在此全文并入作為參考。
背景技術(shù)：
能夠與期望的靶表位特異性結(jié)合的分子作為治療劑和醫(yī)學(xué)診斷工具均具有極大 意義。此類分子的公知實(shí)例是單克隆抗體。對于幾乎任何結(jié)構(gòu)表位，都可以選擇出特異性 地并以高親和力與之結(jié)合的抗體。所以，抗體常規(guī)地用作為研究工具和FDA批準(zhǔn)的治療劑， 從而治療性和診斷性單克隆抗體的全球市場目前價(jià)值約$300億。然而，單克隆抗體具有許多缺點(diǎn)。例如，經(jīng)典抗體是大而復(fù)雜的分子。它們具有雜 四聚體結(jié)構(gòu)，含有通過分子間二硫鍵和分子內(nèi)二硫鍵連接在一起的兩條輕鏈和兩條重鏈。 這種結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得不能容易地在簡單的原核系統(tǒng)中表達(dá)抗體，而需要在更為精細(xì)(和昂 貴)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體?？贵w的大尺寸也限制了其治療效力，因?yàn)樗鼈兺?不能夠有效穿透某些組織間隙。另外，治療性抗體因?yàn)閾碛蠪c區(qū)，偶爾會(huì)觸發(fā)不期望的效 應(yīng)細(xì)胞功能和/或凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。另外，雙特異性或多特異性抗體的制備往往涉及困難復(fù) 雜的操作(參見例如 Josefina 等，(1997)，Nature Biotechnology, 15 159-163 ；和 Wu 等 (2007)Nature Biotechnology, 25 :1290_1297)。從而本領(lǐng)域需要能夠以高親和力和特異性與期望靶標(biāo)特異性結(jié)合的備選結(jié)合分 子。也需要生產(chǎn)雙特異性或多特異性結(jié)合分子的簡單方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了可以與靶抗原特異性結(jié)合因而可用于廣泛種類的治療和診斷應(yīng)用 的、基于III型纖連蛋白(Fn3)的結(jié)合分子。本發(fā)明基于意料不到的驚人發(fā)現(xiàn)，即含有至少 一個(gè)修飾的底環(huán)的Fn3保留結(jié)構(gòu)和構(gòu)象穩(wěn)定性，并能夠與靶分子結(jié)合。此外，本發(fā)明還基于 發(fā)現(xiàn)的新的雙特異性基于Fn3的結(jié)合分子，其中單個(gè)Fn3分子能夠通過利用Fn3的頂部和 底部環(huán)而結(jié)合一個(gè)或多個(gè)靶分子。本發(fā)明還提供了簡單有效的方法生成雙特異性和多特異 性基于Fn3的結(jié)合分子。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及單特異性Fn3基結(jié)合分子，其利用底部AB、 CD、EF環(huán)或C-末端結(jié)合一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)，例如人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶(“底部單特異 性Fn3基結(jié)合分子”)。這些底部單特異性Fn3基結(jié)合分子能夠連接在一起(例如以珍珠樣 方式)形成同時(shí)與多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的多特異性Fn3基結(jié)合分子，和/或可與一個(gè)或多個(gè)非Fn3 部分(例如功能部分)，例如人血清白蛋白(HSA)、抗體Fc區(qū)或聚乙二醇(PEG)，綴合，以例 如提高Fn3基結(jié)合分子的半衰期和穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，底部單特異性Fn3基結(jié)合分子可與利用頂部BC、DE或TO環(huán) 的Fn3基結(jié)合分子組合，以產(chǎn)生雙特異性Fn3基結(jié)合分子。本發(fā)明還提供了同時(shí)與兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的雙特異性Fn3基結(jié)合分子。這些雙特異性Fn3基結(jié)合分子還可連接在一 起(例如以珍珠樣方式)形成同時(shí)與多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的多特異性Fn3基結(jié)合分子，和/或可 與一個(gè)或多個(gè)如上文所述非Fn3部分(例如功能部分)綴合。本發(fā)明還提供了篩選Fn3基 結(jié)合分子文庫對靶標(biāo)、一般是靶蛋白的特異性結(jié)合的方法，以及在例如原核或真核系統(tǒng)中 制備Fn3基結(jié)合分子的方法。此外，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)n3基結(jié)合分子的組合物(例如治 療組合物)，以及此類組合物在多種治療和診斷應(yīng)用中的用途。從而，一方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的Fn3基結(jié)合分子，其中與野生型Fn3 結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO 1)相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域在底部AB、⑶、EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或 多個(gè)中有至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與特定靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列。在一個(gè)具體 實(shí)施方案中，底部AB、⑶、EF環(huán)區(qū)或C-末端中改變的氨基酸殘基包括SEQ ID N0:1第15、 16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95 或 96 位的一或多個(gè)氨基酸。該非 Fn3結(jié)合序列可以是例如CDR區(qū)(例如抗體CDR區(qū))或T細(xì)胞受體的全部或部分。另一方面，本發(fā)明涉及包含第一Fn3結(jié)構(gòu)域的Fn3基結(jié)合分子，其中與包含SEQ ID NO 1的野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域在底部AB、⑶、EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多 個(gè)中有至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第一靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列，并且其中與包 含SEQ ID N0:1的野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比，第二 Fn3結(jié)構(gòu)域在底部AB、⑶、EF環(huán)區(qū)或C-末 端之一個(gè)或多個(gè)中有至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列。另一方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的雙特異性Fn3基結(jié)合分子，其中與野生 型Fn3結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO 1)相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域在底部AB、CD、EF環(huán)區(qū)或C-末端 之一個(gè)或多個(gè)中有至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第一靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列，且 其中與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域(包含例如SEQ ID NO 1)相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域在頂部BC、DE、或 FG環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè)中有至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序 列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，底部AB、CD、EF環(huán)區(qū)或C-末端中改變的氨基酸殘基包括SEQ ID NO :1 第 15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95 或 96 位的一個(gè)或多 個(gè)氨基酸，而頂部BC、DE或TO環(huán)區(qū)中改變的氨基酸殘基包括SEQ ID NO :1第21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87 或 88位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。從而，本發(fā)明此類雙特異性Fn3基結(jié)合分子可以與同一分子或 不同分子上存在的兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)同時(shí)結(jié)合。另一方面，本發(fā)明提供了多特異性Fn3基結(jié)合分子，其含有連接在一起(例如以珍 珠樣方式)的兩個(gè)或更多個(gè)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的Fn3基結(jié)合分子，從而結(jié)合同一分子 或不同分子上的兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)。本發(fā)明“Fn3基結(jié)合分子”(這在下文包括雙特異性和多特異性Fn3基結(jié)合分子) 還可與一個(gè)或多個(gè)非Fn3部分結(jié)合或連接，所述非Fn3部分可以例如在體內(nèi)給藥時(shí)增加Fn3 基結(jié)合分子的半衰期。適宜的非Fn3部分包括但不限于抗體Fc區(qū)、人血清白蛋白(HSA)(或 其部分)、聚乙二醇(PEG)和/或與前述蛋白質(zhì)或具有增加的半衰期的其他血清蛋白結(jié)合的 多肽例如轉(zhuǎn)鐵蛋白。從而，另一方面，本發(fā)明提供了綴合物，其包括與非Fn3部分連接的一 個(gè)或多個(gè)Fn3基結(jié)合分子。又在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子和綴合物與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域(例 如SEQ ID NO :1)相比還包含至少一個(gè)修飾的氨基酸殘基用于連接功能部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氨基酸包括在選自如下的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中半胱氨酸或非天然氨基酸殘基 的取代或添加環(huán)區(qū)、β鏈區(qū)、β樣鏈區(qū)、C-末端區(qū)、位于C-末端和最C-末端的β鏈(或 β樣鏈)之間的區(qū)域、N-末端區(qū)、以及位于N-末端和最N-末端的β鏈(或β樣鏈)之 間的區(qū)域。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子可基于野生型Fn3序列(例如具有SEQ ID NO :1所示氨基 酸序列的人Fn3)以及此類野生型序列的修飾形式，如本文所討論的那樣。例如，F(xiàn)n3基結(jié) 合分子可以是嵌合體，具有來自至少兩個(gè)不同纖連蛋白組件的Fn3 β鏈。本發(fā)明還提供了組合物，包含本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子和綴合物，用適宜的載體配 制。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子和綴合物可用在多種治療和診斷應(yīng)用中，包括但不限于任 何可以使用抗體的應(yīng)用。例如，此類應(yīng)用包括治療和診斷自身免疫病、癌癥和感染性疾病。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)因如下詳細(xì)說明和權(quán)利要求書而變得顯而易見，例 如編碼Fn3基結(jié)合分子的多樣化核酸文庫。附圖的簡短說明

圖1顯示了 Fn3基結(jié)合分子的帶狀圖，其中構(gòu)成配體結(jié)合表面的環(huán)和構(gòu)架殘基突 出顯示。圖2圖示了 Fn3頂部和底部環(huán)面的示意圖。圖3A為單特異性Fn3基結(jié)合分子的示意圖，顯示了頂部或者底部的環(huán)能夠進(jìn)行修 飾以結(jié)合單個(gè)靶標(biāo)即靶標(biāo)A。圖3B為雙特異性Fn3基結(jié)合分子的示意圖，顯示了頂部和底部的環(huán)均能夠進(jìn)行修 飾以結(jié)合單個(gè)靶標(biāo)即靶標(biāo)A。雙特異性Fn3基結(jié)合分子還可用于結(jié)合兩個(gè)不同的靶標(biāo)，其中 頂環(huán)結(jié)合一個(gè)靶標(biāo)即靶標(biāo)A，而底環(huán)結(jié)合第二靶標(biāo)即靶標(biāo)B。圖4A為多特異性Fn3基結(jié)合分子的示意圖，其包含連接在一起的、帶有底環(huán)修飾 的兩個(gè)底部單特異性Fn3結(jié)構(gòu)域。圖4B為多特異性Fn3基結(jié)合分子的示意圖，其包含連接在一起的、帶有頂部和底 部環(huán)修飾的兩個(gè)雙特異性Fn3結(jié)構(gòu)域。圖5A為多特異性Fn3基結(jié)合分子的示意圖，其包含連接在一起的、帶有底環(huán)修飾 的多個(gè)單特異性Fn3結(jié)構(gòu)域。圖5B為多特異性Fn3基結(jié)合分子的示意圖，其包含連接在一起的、帶有頂部和底 部環(huán)修飾的多個(gè)雙特異性Fn3結(jié)構(gòu)域。圖6為用于克隆纖連蛋白cDNA的載體圖。圖7的表格顯示了選擇的多個(gè)單特異性Fn3基結(jié)合分子的氨基酸序列，其利用底 環(huán)或C-末端結(jié)合人血清白蛋白。圖8的表格顯示了選擇的多個(gè)單特異性Fn3基結(jié)合分子的氨基酸序列，其利用底 環(huán)或C-末端結(jié)合溶菌酶。圖9顯示了利用底環(huán)或C-末端結(jié)合人血清白蛋白該特定靶標(biāo)的、His標(biāo)記的單特 異性Fn3基結(jié)合分子的人血清白蛋白特異性ELISA分析。圖10是SDS-PAGE凝膠，顯示在大腸桿菌中成功表達(dá)了利用底環(huán)或C-末端結(jié)合特 定靶標(biāo)的單特異性Fn3基結(jié)合分子。
圖11是SDS-PAGE凝膠，顯示從大腸桿菌裂解物中成功純化了利用底環(huán)或C-末端 結(jié)合特定靶標(biāo)的單特異性Fn3基結(jié)合分子。圖12是SDS-PAGE凝膠，顯示從大腸桿菌裂解物中成功純化了利用底環(huán)或C-末端 結(jié)合特定靶標(biāo)的雙特異性Fn3基結(jié)合分子。圖13顯示了利用底環(huán)或C-末端以及頂環(huán)結(jié)合不同靶分子的雙特異性Fn3基結(jié)合 分子的ELISA分析。分離自克隆87和克隆89的雙特異性Fn3基結(jié)合分子具有結(jié)合VEGFR2 的頂環(huán)和結(jié)合人血清白蛋白的底環(huán)。該數(shù)據(jù)顯示單個(gè)Fn3基結(jié)合分子能夠工程化從而頂環(huán) 結(jié)合VEGFR2而底環(huán)結(jié)合HSA。圖14顯示了分離自克隆87的、利用頂環(huán)結(jié)合VEGFR2的雙特異性Fn3基結(jié)合分子 的Biacore結(jié)合研究。圖15顯示了分離自克隆87的、利用底環(huán)或C-末端結(jié)合HSA的雙特異性Fn3基結(jié) 合分子的Biacore結(jié)合研究。發(fā)明詳述為了確保清楚地理解說明書和權(quán)利要求書，下文便利地提供了如下定義。定義如本文所用，術(shù)語“III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域”或“Fn3結(jié)構(gòu)域”是指，來自任何生物 體的野生型Fn3結(jié)構(gòu)域、以及從來自兩種或兩種以上不同的Fn3結(jié)構(gòu)域的β鏈構(gòu)建的嵌合 Fn3結(jié)構(gòu)域。如本領(lǐng)域已知的那樣，天然存在的Fn3結(jié)構(gòu)域具有β夾心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由7個(gè) 稱作A、B、C、D、E、F和G的β鏈組成，其中這7個(gè)β鏈通過稱作AB、BC、CD、DE、EF和TO環(huán)的 6 個(gè)環(huán)連接(見例如，Bork 和 Doolittle，Proc.Natl.Acad. Sci. U. S. A 89 :8990，1992 ；Bork 等，Nature Biotech. 15 :553，1997 ；Meinke等，J. Bacteriol. 175 1910,1993 ；Watanabe等， J. Biol. Chem. 265 15659，1990 ；Main 等，1992 ；Leahy 等，1992 ；Dickinson 等，1994 ；美國專 利6，673，901 ；專利協(xié)作條約公布W0/03104418 ；以及美國專利申請2007/0082365，上述文 獻(xiàn)的所有教導(dǎo)特此并入此處作為參考)。三個(gè)環(huán)(BC、DE和re環(huán))位于結(jié)構(gòu)域的頂部，而 三個(gè)環(huán)(AB、CD和EF環(huán))位于結(jié)構(gòu)域的底部(見圖1)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu) 域來自人纖連蛋白的第10個(gè)Fn3結(jié)構(gòu)域C°Fn3) (SEQ ID NO 1)。如本文所用，術(shù)語“Fn3基結(jié)合分子”或“基于III型纖連蛋白(Fn3)的結(jié)合分子” 是指已經(jīng)經(jīng)過改變而包含了一個(gè)或多個(gè)非Fn3結(jié)合序列的Fn3結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中， 與相應(yīng)的野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比，底部AB、CD和/或EF環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)被改變，以含有 一個(gè)或多個(gè)非Fn3結(jié)合序列。在另一實(shí)施方案中，與相應(yīng)的野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比，改變底 部AB、⑶和EF環(huán)之一個(gè)或多個(gè)以及頂部BC、DE和TO環(huán)之一個(gè)或多個(gè)，以含有一個(gè)或多個(gè) 非Fn3結(jié)合序列。此類分子在本文稱為“雙特異性Fn3基結(jié)合分子”。在另一實(shí)施方案中， 兩個(gè)或多個(gè)Fn3基結(jié)合分子或雙特異性Fn3基結(jié)合分子連接在一起。此類分子在本文稱為 “多特異性Fn3基結(jié)合分子”。術(shù)語“非Fn3結(jié)合序列”是指不存在于天然(例如，野生型)Fn3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸 序列，其與特定靶標(biāo)結(jié)合。此類非Fn3結(jié)合序列典型地可以通過修飾(例如，通過替代和/ 或添加)野生型Fn3結(jié)構(gòu)域(例如在底環(huán)和/或頂環(huán)區(qū)內(nèi))而引入。這可通過例如野生型 Fn3結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸殘基的隨機(jī)或預(yù)定突變實(shí)現(xiàn)。此外或者備選地，非Fn3結(jié)合序列可以是 部分地或者完全地外源的，即，源自不同基因或氨基酸來源。例如，外源序列可以源自對于已知靶抗原具有已知結(jié)合特異性的抗體的高變區(qū)，例如一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。此類CDR可以 來自單抗體鏈(例如，輕鏈或重鏈的可變區(qū))或來自不同抗體鏈的組合。CDR還可來自兩種 不同抗體(例如，具有不同特異性)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，CDR來自納米抗體，例如，駝
樣重鏈。如本文所用的術(shù)語“單特異性”是指包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域、與一個(gè)或多個(gè)靶分子結(jié)合的 Fn3基結(jié)合分子，其中僅Fn3結(jié)構(gòu)域的底部區(qū)域或Fn3結(jié)構(gòu)域的頂部區(qū)域但不是兩者同時(shí)用 于結(jié)合。例如，底部單特異性Fn3基結(jié)合分子僅利用Fn3結(jié)構(gòu)域的底環(huán)例如AB、CD或EF環(huán) 或者C-末端結(jié)合靶標(biāo)，而頂部單特異性Fn3基結(jié)合分子僅利用Fn3結(jié)構(gòu)域的頂環(huán)例如BC、 DE和re環(huán)結(jié)合靶標(biāo)。應(yīng)理解并非頂部或底部區(qū)域的所有3個(gè)環(huán)均需要用來結(jié)合靶分子。單特異性Fn3結(jié)構(gòu)域也可連接在一起(例如以珍珠樣方式)形成多特異性Fn3基 結(jié)合分子，其包含例如連接在一起的至少兩個(gè)單特異性Fn3結(jié)構(gòu)域。對于底部單特異性結(jié) 合分子，每一個(gè)Fn3結(jié)構(gòu)域利用至少一個(gè)底環(huán)或C-末端區(qū)域與一個(gè)或多個(gè)靶分子結(jié)合。在 一個(gè)實(shí)施方案中，該多特異性Fn3基結(jié)合分子與同一靶分子(例如靶標(biāo)A)的不同靶區(qū)域結(jié) 合。例如，一個(gè)Fn3結(jié)構(gòu)域可與靶標(biāo)A的第一靶區(qū)域結(jié)合，而另一 Fn3結(jié)構(gòu)域可與靶標(biāo)A的 第二靶區(qū)域結(jié)合。這可用來增加Fn3基結(jié)合分子對靶分子的親合力。在另一實(shí)施方案中，多 特異性Fn3基結(jié)合分子與多個(gè)靶分子結(jié)合。例如，一個(gè)Fn3結(jié)構(gòu)域可與靶標(biāo)A結(jié)合，而另一 個(gè)Fn3結(jié)構(gòu)域可與靶標(biāo)B(例如半衰期延長劑)結(jié)合。而在另一實(shí)施方案中，多特異性Fn3 基結(jié)合分子包含至少兩個(gè)與靶標(biāo)A的不同靶區(qū)域結(jié)合的單特異性Fn3結(jié)構(gòu)域和至少兩個(gè)與 靶標(biāo)B的不同靶區(qū)域結(jié)合的單特異性Fn3結(jié)構(gòu)域。技術(shù)人員將會(huì)理解任何數(shù)目的Fn3結(jié)構(gòu) 域均能夠以這樣的方式相連，以創(chuàng)建能夠與同一靶分子或不同靶分子的不同靶區(qū)域結(jié)合的 多特異性Fn3基結(jié)合分子。如本文所用的術(shù)語“雙特異性”是指既利用Fn3結(jié)構(gòu)域的底部區(qū)域又利用Fn3結(jié)構(gòu) 域的頂部區(qū)域與一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的Fn3基結(jié)合分子。例如，雙特異性Fn3基結(jié)合分子 可以包含既利用該分子的底環(huán)例如AB、CD或EF環(huán)或者C-末端、又利用該分子的頂環(huán)例如 BC、DE和TO環(huán)結(jié)合靶標(biāo)的Fn3結(jié)構(gòu)域。雙特異性Fn3基結(jié)合分子可用于結(jié)合同一靶分子， 例如靶標(biāo)A，該靶分子可與雙特異性Fn3基結(jié)合分子的頂部和底部均結(jié)合(見圖3b)。可選 地，雙特異性Fn3基結(jié)合分子可用于結(jié)合兩個(gè)不同的靶分子，例如靶標(biāo)A和靶標(biāo)B。在這種 情況下，頂環(huán)可用于結(jié)合靶標(biāo)A，而底環(huán)可以用于結(jié)合靶標(biāo)B，或者反之亦然(見圖3b)。雙 特異性Fn3基結(jié)合分子也可連接在一起(例如以珍珠樣方式)形成多特異性Fn3基結(jié)合分 子。如本文所用的術(shù)語“多特異性”是指該Fn3基結(jié)合分子包含至少兩個(gè)連接在一起 的單特異性Fn3基結(jié)合分子或者至少兩個(gè)連接在一起的雙特異性Fn3基結(jié)合分子。術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ”是指來自抗體可變結(jié)構(gòu)域或來自T細(xì)胞受體的高變環(huán)。 CDR在抗體可變區(qū)中的定位已有精確定義(參見Kabat，E.A.等Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242，1991，和 Chothia，C.等，J. Mol. Biol. 196 :901_917，1987， 其并入本文作為參考)。術(shù)語“單域抗體”是指任何天然存在的單可變結(jié)構(gòu)域抗體和相應(yīng)的 工程化結(jié)合片段，包括如Domantis (Domantis/GSK (Cambridge，UK)所述的人結(jié)構(gòu)域抗體、 或如下文所定義的駝?lì)惣{米抗體(camelid nanobody) 0
術(shù)語“單鏈抗體”是指由利用重組方法通過合成接頭連接在一起的輕鏈可變區(qū)抗 原結(jié)合部分和重鏈可變區(qū)抗原結(jié)合部分，其中所述接頭使之形成單個(gè)蛋白質(zhì)鏈，在該鏈中 VL和VH區(qū)配對形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988) Science 242 423-426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85 :5879_5883)。術(shù)語“駝?lì)惣{米抗體”是指這樣的駝?lì)惪贵w區(qū)域，該區(qū)域?yàn)槿狈p鏈的小單可變 結(jié)構(gòu)域，其可以通過遺傳工程化產(chǎn)生對靶標(biāo)具有高親和力的小蛋白質(zhì)而獲得，從而得到小 分子量的抗體衍生蛋白質(zhì)。參見例如W007042289和1998年6月2日授權(quán)的美國專利 No. 5，759，808 ；還請參見Sti jlemans，B.等，2004。工程化的駝?lì)惪贵w及抗體片段文庫可商 購獲得，例如購自Ablynx，Ghent，比利時(shí)。同其他非人源抗體一樣，駝?lì)惪贵w的氨基酸序列 可以重組改變，以獲得與人序列更密切類似的序列，即，該納米抗體可以“人源化”。因而能 夠使駝?lì)惪贵w在人中的天然低的抗原性進(jìn)一步降低。術(shù)語“靶標(biāo)”是指本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子所識(shí)別的抗原或表位。靶標(biāo)包括但不限 于蛋白質(zhì)、肽、糖和/或脂質(zhì)上存在的表位。術(shù)語“綴合物”是指與一個(gè)或多個(gè)非Fn3部分化學(xué)或遺傳連接的Fn3基結(jié)合分子。術(shù)語“非Fn3部分”是指賦予與之結(jié)合的分子額外功能的生物或化學(xué)實(shí)體。在一 個(gè)特定實(shí)施方案中，非Fn3部分是多肽，例如人血清白蛋白(HSA)或化學(xué)實(shí)體，例如聚乙二 醇(PEG)，其可以增加Fn3基結(jié)合分子的體內(nèi)半衰期。術(shù)語“非天然氨基酸殘基”是指不存在于天然(野生型)Fn3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘 基。此類非天然氨基酸殘基可以通過取代天然氨基酸和/或通過向天然Fn3氨基酸序列中 插入非天然氨基酸而引入。還可以摻入非天然氨基酸殘基，以賦予Fn3基結(jié)合分子期望的 功能，例如連接功能性部分(例如PEG)的能力。術(shù)語“聚乙二醇”或“PEG”指聚亞烷基二醇化合物或其衍生物，有或無偶聯(lián)劑、或 以偶聯(lián)或活化部分衍生。術(shù)語“特異性結(jié)合”或“與……特異性結(jié)合”是指，按照表面等離子體共振測量，在 標(biāo)準(zhǔn)生理鹽和pH條件下于室溫，F(xiàn)n3基結(jié)合分子以至少1 X 10_6M的親和力與靶標(biāo)結(jié)合、和/ 或以比其對非特異性抗原的親和力高至少2倍(優(yōu)選至少10倍)的親和力與靶標(biāo)結(jié)合的 能力。鍾本發(fā)明提供了與靶抗原特異性結(jié)合的基于III型纖連蛋白(Fn3)的結(jié)合分子。本 發(fā)明提供了與一個(gè)或多個(gè)靶分子結(jié)合的、在底部AB、CD、EF環(huán)區(qū)或C-末端之至少一個(gè)或多 個(gè)中具有修飾的、單特異性Fn3結(jié)合分子。本發(fā)明還提供了雙特異性Fn3基結(jié)合分子，其以 兩個(gè)相對的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合相同靶分子或同時(shí)結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)靶抗原。本發(fā)明Fn3基結(jié)合 分子也可連接在一起(例如以珍珠樣方式)形成多特異性Fn3基結(jié)合分子，和/或可與非 Fn3部分例如人血清白蛋白(HSA)綴合，以提高半衰期和穩(wěn)定性。與其他結(jié)合分子，例如抗 體非常相似，F(xiàn)n3基結(jié)合分子可用在多種治療和診斷應(yīng)用中。單特異性Fn3基結(jié)合分子一方面，本發(fā)明提供了單特異性Fn3基結(jié)合分子，其與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比被改 變(例如，在底部和/或頂部環(huán)區(qū))，以產(chǎn)生與特定靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列。在一個(gè)實(shí) 施方案中，單特異性Fn3基結(jié)合分子利用底部AB、CD、EF環(huán)或C-末端結(jié)合一個(gè)或多個(gè)靶分子。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的Fn3基結(jié)合分子，其中 與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與特定靶標(biāo)結(jié) 合的非Fn3結(jié)合序列。在特別的實(shí)施方案中，野生型Fn3結(jié)構(gòu)域是人Fn3結(jié)構(gòu)域，例如人 10Fn3(SEQ ID NO :1)。另外，鄰近環(huán)區(qū)的一個(gè)或多個(gè)β鏈中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與野 生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比也可突變，以貢獻(xiàn)額外的非Fn3結(jié)合序列或可與非Fn3部分相連的殘 基。底部AB、CD、EF環(huán)區(qū)或C-末端以及鄰近β鏈中可改變的具體氨基酸殘基包括例如， SEQ ID NO :1 第 15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95 或 96 位的氨基 酸。例如，例示性的非Fn3結(jié)合序列可以包括抗體或T細(xì)胞受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 的全部或部分。另一方面，本發(fā)明提供了 Fn3基結(jié)合分子文庫，其可用來鑒定與特定的期望靶標(biāo) 結(jié)合的Fn3基結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫含有Fn3基結(jié)合分子，其中與野生型Fn3 結(jié)構(gòu)域例如人10Fn3 (SEQ ID NO 1)相比，每一個(gè)Fn3基結(jié)合分子均在底部AB、CD、EF環(huán)區(qū) 或C-末端之一個(gè)或多個(gè)中含有至少一個(gè)氨基酸改變。AB、⑶、EF環(huán)區(qū)以及β鏈中可改變 的具體氨基酸殘基包括例如，SEQ ID NO :1 第 15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、 63、64、93、95或96位的氨基酸。在另一實(shí)施方案中，文庫含有Fn3基結(jié)合分子，其中與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域例如人 10Fn3 (SEQ ID NO 1)相比，每一個(gè)Fn3基結(jié)合分子均在頂部BC、DE或TO環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè) 中含有至少一個(gè)氨基酸改變。BC、DE或re環(huán)區(qū)以及β鏈中可改變的具體氨基酸殘基包括 例如，SEQ ID NO :1 第 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、 79、80、80、81、82、83、84、85、86、87 或 88 位的氨基酸。文庫多樣性可例如，通過隨機(jī)誘變、“模糊突變(walk through mutagenesis)” 或“精確突變(look through mutagenesis) ” 一個(gè)或多個(gè)公開的SEQ ID N0:1中殘 基而生成(7，195，880 ;6，951，725 ;7，078，197 ;7，022，479 ;5，922，545 ;5，830，721 ； 5，605，793，5，830，650 ；6，194，550 ；6，699，658 ；7，063，943 ；5，866，344 和專利協(xié)作條約公 開 W006023144)?？蛇x地，F(xiàn)n3基結(jié)合分子可通過組合來自一個(gè)或多個(gè)不同文庫成員的非Fn3結(jié)合 序列而生成。在特定的實(shí)施方案中，雙特異性Fn3基結(jié)合分子通過將來自一個(gè)文庫成員的 底部AB、CD、EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè)的非Fn3結(jié)合序列和來自另一文庫成員的頂 部BC、DE或TO環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè)的非Fn3結(jié)合序列一起組合到單個(gè)雙特異性Fn3基結(jié)合 分子之中而生成。編碼本文所述的Fn3基結(jié)合分子文庫的核酸或其變體可利用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法 構(gòu)建，包括但不限于基于PCR的或酶介導(dǎo)的基因工程法，從頭開始的DNA或RNA合成，和/ 或盒式誘變。Fn3基結(jié)合分子的適宜靶標(biāo)包括但不限于半衰期延長劑(例如HSA)、溶菌酶、細(xì) 胞受體、細(xì)胞受體配體、細(xì)菌或病毒(參見圖1)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，靶標(biāo)參與人類疾 病，例如自身免疫病、癌癥或感染性疾病。本說明書特別描述了如下新的Fn3基結(jié)合分子的鑒定和生產(chǎn)，所述Fn3基結(jié)合分子利用Fn3分子的底環(huán)與靶標(biāo)例如HSA結(jié)合。利用本發(fā)明的方法已經(jīng)生成了數(shù)以百計(jì)的克 隆，而代表性的一些已經(jīng)如實(shí)施例4所示進(jìn)行了表征。圖7顯示了從該Fn3支架蛋白文庫 中分離的與HSA結(jié)合的多個(gè)代表性序列(SEQ ID N0:7-41)。此外，發(fā)現(xiàn)許多獨(dú)立隨機(jī)化的環(huán)傾向于趨于一共有序列，該共有序列可能參與HSA 的結(jié)合(SEQ ID N0:42)。因此，預(yù)期具有此共有序列的多肽將可用作為HSA結(jié)合劑，即使 在此共有序列從其所鑒定自的蛋白質(zhì)環(huán)境中分離出來時(shí)也是如此。圖8顯示了從該Fn3支架蛋白文庫中分離的與溶菌酶結(jié)合的多個(gè)代表性序列(SEQ ID NO 43-116)。實(shí)施例5中的數(shù)據(jù)顯示了代表性的一些Fn3基結(jié)合蛋白對HSA的結(jié)合研 究。結(jié)果顯示Fn3結(jié)合分子可利用具有結(jié)合靶標(biāo)能力的修飾的底環(huán)來生成。該數(shù)據(jù)顯示，可生成至少一個(gè)底環(huán)被修飾的Fn3基結(jié)合分子的文庫，以便其與靶 標(biāo)結(jié)合。對于該HSA文庫，底環(huán)與野生型Fn3保持相同的長度。對于溶菌酶文庫，底環(huán)長度 變化不等，而對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有不利影響。此外，這些具有修飾的底環(huán)的單特異性Fn3基結(jié) 合分子維持構(gòu)象穩(wěn)定性，并且能夠表達(dá)和純化而保留結(jié)合能力。因而，本發(fā)明的方法可用來 生成具有至少一個(gè)修飾的底環(huán)的Fn3基結(jié)合分子、以及利用底部面與靶標(biāo)結(jié)合的Fn3基結(jié) 合分子的文庫。雙特異件Fn3基結(jié)合分子如前面部分所討論的那樣，另一方面，本發(fā)明提供了能夠同時(shí)與兩個(gè)或更多個(gè)靶 標(biāo)結(jié)合的雙特異性Fn3基結(jié)合分子。此類雙特異性Fn3基結(jié)合分子在同一蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi) 包含兩個(gè)或更多個(gè)非Fn3結(jié)合序列。這可通過改變頂部和底部AB、BC、⑶、DE、EF或TO環(huán) 區(qū)中的任意兩個(gè)或更多個(gè)而包含非Fn3結(jié)合序列來實(shí)現(xiàn)(見圖1)。在特別的實(shí)施方案中， 雙特異性Fn3基結(jié)合分子在頂部和底部環(huán)區(qū)中均改變，以創(chuàng)建兩個(gè)分開的結(jié)合特異性。從而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的雙特異性Fn3基結(jié)合分 子，其中與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO 1)相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域底部AB、⑶、EF環(huán) 區(qū)之一個(gè)或多個(gè)中的至少一個(gè)氨基酸改變，以創(chuàng)建與第一靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列，且 其中與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO 1)相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域頂部BC、DE和TO環(huán)區(qū) 之一個(gè)或多個(gè)中的至少一個(gè)氨基酸改變，以創(chuàng)建與第二靶標(biāo)結(jié)合的非Fn3結(jié)合序列。底部 AB、⑶、EF環(huán)區(qū)或C-末端以及鄰近β鏈中可改變的具體氨基酸殘基包括例如，SEQ ID NO 1 第 15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95 或 96 位的氨基酸。BC、DE 和re環(huán)區(qū)以及鄰近β鏈中可改變的具體氨基酸殘基包括例如，SEQ ID NO :1第21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、80、80、81、82、83、84、85、86、87 或88位的氨基酸。本發(fā)明雙特異性Fn3基結(jié)合分子同時(shí)與兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合。靶標(biāo)可存在于同 一分子上，從而同一靶分子的兩個(gè)區(qū)域由于雙特異性Fn3基結(jié)合結(jié)構(gòu)域與該靶標(biāo)的結(jié)合而 并置?？蛇x地，靶標(biāo)可存在于不同的分子上，從而這兩個(gè)不同的分子由于雙特異性Fn3基結(jié) 合分子與靶標(biāo)的結(jié)合而并置。靶標(biāo)還可以是相同的，從而雙特異性Fn3基結(jié)合分子能夠簇 集靶分子，與抗體能夠簇集分子的方式一樣。適宜的靶標(biāo)包括之前上文所述的那些，單獨(dú)地或與可以增強(qiáng)雙特異性Fn3基結(jié)合 分子理化性能的分子(例如半衰期延長劑，例如HSA、抗體Fc受體或PEG)上存在的靶標(biāo)組 合。適宜的靶標(biāo)還包括賦予附加功能特性的分子，例如細(xì)胞毒性、標(biāo)記或成像部分，如本文所述的那樣。適宜的靶標(biāo)還能用來誘導(dǎo)雙特異性Fn3基結(jié)合分子二聚化，條件是這兩個(gè)雙 特異性Fn3基結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子能夠與該靶標(biāo)同時(shí)結(jié)合。例如，兩個(gè)雙特異性Fn3基結(jié)合分 子可以以獨(dú)特型/抗獨(dú)特型的關(guān)系起作用。在這種情況下，F(xiàn)n3結(jié)合分子的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn) 將與靶分子結(jié)合，而該Fn3結(jié)合分子的第二結(jié)合位點(diǎn)將與該Fn3結(jié)合分子上的結(jié)合區(qū)結(jié)合。 例如，雙特異性Fn3結(jié)合分子的底環(huán)可以與靶標(biāo)A結(jié)合，而該雙特異性分子的頂環(huán)可以與第 二雙特異性Fn3結(jié)合分子結(jié)合。這將引起Fn3結(jié)合分子以這樣的方式多聚化，該方式使得 底環(huán)靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)可用于結(jié)合靶標(biāo)A，而頂環(huán)結(jié)合位點(diǎn)引起與第二 Fn3結(jié)合分子的自我締
I=I ο本說明書特別描述了新的雙特異性Fn3分子的鑒定和生產(chǎn)，其利用同一 Fn3分子 的底環(huán)和頂環(huán)兩者與兩個(gè)不同的靶分子例如HSA和VEGFR2結(jié)合。利用本發(fā)明的方法已經(jīng) 生成了數(shù)以百計(jì)的克隆，特別是一個(gè)克隆即克隆89在實(shí)施例6和7中更詳細(xì)地描述?？寺?89是雙特異性Fn3基結(jié)合分子，其中該Fn3分子的底環(huán)與HSA結(jié)合，而同一 Fn3分子的頂環(huán) 與 VEGFR2 結(jié)合(SEQ ID NO 120)。雙特異性Fn3結(jié)合分子還可通過首先鑒定具有期望功能(例如與HSA結(jié)合)的單 特異性Fn3基結(jié)合分子來創(chuàng)建。該單特異性Fn3基結(jié)合分子僅在兩結(jié)合界面之一(即，要 么是頂環(huán)，要么是底環(huán)，但并非兩者)具有環(huán)變異。一旦鑒定到具有期望功能的適宜的單特 異性Fn3基結(jié)合分子，則利用該分子作為支架來生成文庫，其中改變該Fn3分子的相對面的 環(huán)，從而生成雙特異性Fn3基結(jié)合分子文庫。此雙特異性Fn3基結(jié)合分子文庫隨之用來進(jìn) 行針對第二靶分子的篩選，以鑒定與兩個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的雙特異性實(shí)體。例如，單特異性Fn3基 結(jié)合分子可利用至少一個(gè)底環(huán)與HSA結(jié)合。這種單特異性Fn3基結(jié)合分子用作為支架來生 成文庫，其中變化分子的至少一個(gè)頂環(huán)，以便其與第二靶標(biāo)例如VEGFR2結(jié)合，由此創(chuàng)建雙 特異性Fn3基分子文庫。此雙特異性Fn3基分子文庫可用來針對VEGFR2靶標(biāo)進(jìn)行篩選。VEGFR2是VEGF信號(hào)傳遞的促血管生成作用的一級(jí)介導(dǎo)者。VEGFR-2由VEGF-A、 VEGF-C和VEGF-D結(jié)合和激活。在內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGFR-2激活將刺激細(xì)胞增殖和遷移；在體 內(nèi)，VEGFR-2激活將觸發(fā)血管生成，并增加血管系統(tǒng)的透性。增加的血管生成已充分確立為 腫瘤生長和多種視網(wǎng)膜病的重要特征，而增加的血管系統(tǒng)透性是許多炎性反應(yīng)的重要事件 (參見例如 W02005056764)。本申請數(shù)據(jù)顯示，具有修飾的底環(huán)的雙特異性Fn3基結(jié)合分子維持構(gòu)象穩(wěn)定性， 并且能夠表達(dá)和純化而保留結(jié)合能力。技術(shù)人員將會(huì)理解，利用本文公開的本發(fā)明方法能 夠生成任何雙特異性Fn3基結(jié)合分子?？稍O(shè)計(jì)所述雙特異性分子以與任何目的靶標(biāo)結(jié)合。 例如，所述雙特異性分子可與同一靶標(biāo)的不同結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合?？蛇x地，所述雙特異性分子可 與不同的靶分子結(jié)合。多特異性Fn3基結(jié)合分子另一方面，本發(fā)明提供了多特異性Fn3基結(jié)合分子，其包含連接在一起(例如遺傳 或化學(xué)地)的兩個(gè)或更多個(gè)單特異性Fn3基結(jié)合分子或雙特異性Fn3基結(jié)合分子。多特異 性Fn3基結(jié)合分子包含至少一個(gè)單體Fn3基結(jié)合分子，所述單體分子利用底環(huán)AB、CD、EF之 至少一個(gè)與靶標(biāo)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性Fn3基結(jié)合分子包含以珍珠樣方式連接在一起的兩 個(gè)或更多個(gè)Fn3基結(jié)合分子，其中每個(gè)個(gè)體Fn3基結(jié)合分子各與特定靶標(biāo)結(jié)合。同雙特異性Fn3基結(jié)合分子一樣，此類靶標(biāo)可存在于同一分子或不同分子上，從而不同的分子因?yàn)槎嗵?異性Fn3基結(jié)合分子的結(jié)合而并置。靶標(biāo)還可相同，從而多特異性Fn3基結(jié)合分子能夠簇 集靶分子，與抗體的方式類似。親合力也可以通過同一靶分子與Fn3基結(jié)合分子上能夠獨(dú) 立地與靶分子不同區(qū)域結(jié)合的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而增加。多種Fn3基結(jié)合分子可摻入到多特異性Fn3基結(jié)合分子中，包括具有單結(jié)合特異 性的Fn3基結(jié)合分子，雙特異性Fn3基結(jié)合分子，或兩類Fn3基結(jié)合分子的組合。從而，多 特異性Fn3基結(jié)合分子的適宜靶標(biāo)包括上文針對Fn3基結(jié)合分子和雙特異性Fn3基結(jié)合分 子所述的那些。多特異性Fn3基結(jié)合分子可利用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法產(chǎn)生。例如，F(xiàn)n3基結(jié)合分 子可以遺傳連接，從而多特異性Fn3基結(jié)合分子表達(dá)為單個(gè)多肽。這種連接可以是直 接的或者通過附加的氨基酸“接頭”序列而賦予。適宜的非限制性方法和接頭描述在例 如US20060286603和W004041862A2中。例示性的多肽接頭包括但不限于:GS接頭例如 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO 118),GSGSGSGSGS(SEQ ID NO :121)、PSTSTST(SEQ ID NO 122)和 EIDKPSQ(SEQ ID NO :123)及其多聚體。實(shí)施例6顯示了如何利用G-S接頭制備多特異性 Fn3基結(jié)合分子。具體地，多特異性Fn3基結(jié)合分子利用GGGGSGGGGS (SEQ ID NO :118)接 頭序列創(chuàng)建，該接頭序列將利用頂環(huán)結(jié)合VEGFR2的第一單特異性Fn3基結(jié)合分子與利用底 環(huán)結(jié)合HSA的第二單特異性Fn3基結(jié)合分子連接在一起(SEQ ID NO :119)。利用接頭序列生成的多特異性Fn3基結(jié)合分子就與靶分子的結(jié)合而言具有改進(jìn) 的空間位阻，從而使得能夠利用較短的接頭序列將兩個(gè)或更多個(gè)單體Fn3基結(jié)合分子連接 在一起。較短的接頭序列導(dǎo)致較小的免疫原性反應(yīng)，且不太可能被切割掉。可選地，多特異性Fn3基結(jié)合分子可利用本領(lǐng)域已知的方法通過化學(xué)綴合個(gè)體 Fn3基結(jié)合分子而制備。多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑可用于共價(jià)綴合。交聯(lián)劑的實(shí)例包括例如蛋 白質(zhì)A、碳化二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?SATA)、5，5’-二硫代雙(2-硝 基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基_3_ (2-吡啶二硫代)-丙酸 酯(SPDP)和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-SMCC) (參見例如 Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu，MA 等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A 82:8648)。其他方法包括 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78，118-132 ； Brennan 等(1985)Science 229 :81_83)和 Glennie 等(1987)J. Immunol. 139 :2367_2375) 中所述的那些。優(yōu)選的綴合劑是SATA和sulfo-SMCC，兩者均可購自Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)。半胱氨酸殘基可引入到Fn3結(jié)合分子的特定位置上(參見例如)，然 后利用試劑例如DPDPB或DTME (可購自Pierce)與巰基交聯(lián)以將兩個(gè)分子連接在一起。實(shí)施例6和7描述了新的雙特異性Fn3分子的鑒定和生產(chǎn)，其利用以接頭序列連 接在一起的兩個(gè)分開的單特異性Fn3分子與兩個(gè)不同的靶標(biāo)即HSA和VEGFR2結(jié)合。在該 具體實(shí)施例中，一個(gè)單體Fn3基結(jié)合分子利用底環(huán)與HSA結(jié)合，而另一單特異性Fn3基結(jié)合 分子利用頂環(huán)結(jié)合VEGFR2。利用本發(fā)明的方法已經(jīng)生成了數(shù)以百計(jì)的克隆，且已經(jīng)表征了 代表性的一些，特別是克隆89。數(shù)據(jù)顯示，具有修飾的底環(huán)的該多特異性Fn3基結(jié)合分子維 持構(gòu)象穩(wěn)定性，并且能夠表達(dá)和純化而保留結(jié)合能力。技術(shù)人員將會(huì)理解，利用本發(fā)明的方 法能夠生成任何多特異性Fn3基結(jié)合分子。可設(shè)計(jì)此類多特異性結(jié)合分子以與單個(gè)靶標(biāo)結(jié) 合?？蛇x地，可設(shè)計(jì)多特異性結(jié)合分子以與兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合。
Fn3基結(jié)合分子的綴合物另一方面，本發(fā)明提供了綴合物，其含有與一個(gè)或多個(gè)非Fn3部分相連的Fn3基結(jié) 合分子。此類非Fn3部分能夠例如賦予Fn3基結(jié)合分子額外的功能或理化性能。在一個(gè)實(shí) 施方案中，F(xiàn)n3基結(jié)合分子與抗體Fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)連接或融合。使分子與Fc結(jié)構(gòu) 域例如IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域融合的方法在本領(lǐng)域已知(參見例如U. S. 5，428，130)。此類綴合 物由于Fc與FcRn結(jié)合的能力(這在IgG穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，保護(hù)與之結(jié)合的分子免于 代謝)，而具有增加的循環(huán)半衰期。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)n3基結(jié)合分子與一或多個(gè)人血清白蛋白(HSA)多肽或其部 分融合。HSA成熟形式為585個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)重大比例的血清滲透壓，而且也可以 作為內(nèi)源和外源配體的載體起作用。白蛋白作為載體分子的角色及其惰性性質(zhì)對于用作體 內(nèi)多肽的載體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的用途而言是期望的性能。作為白蛋白融合蛋白組分的白蛋白用 作多種蛋白質(zhì)的載體的用途已經(jīng)在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413 622中提出。此 外，也已經(jīng)提出(EP 399 666)使用HSA的N-末端片段與多肽融合。從而，通過將本發(fā)明的 分子與白蛋白、或白蛋白的片段(部分)或變體、或足以穩(wěn)定本發(fā)明蛋白質(zhì)和/或其活性 的、能夠結(jié)合HAS的分子(“抗HSA結(jié)合劑”)進(jìn)行遺傳或化學(xué)融合或綴合，本發(fā)明分子可以 被穩(wěn)定化以延長保質(zhì)期，和/或使得分子的活性在溶液中、在體外、和/或在體內(nèi)得以保留 延長的時(shí)間。白蛋白與其他蛋白質(zhì)的融合可以通過基因操作使編碼HSA或其片段的DNA與編碼 蛋白質(zhì)的DNA連接而實(shí)現(xiàn)。然后用融合的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適宜的宿主，其中所述融 合的核苷酸序列被安排在適宜的質(zhì)粒上以致可以表達(dá)融合多肽。表達(dá)可以由例如原核或真 核細(xì)胞在體外實(shí)現(xiàn)，或由例如轉(zhuǎn)基因生物在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。與HSA融合相關(guān)的其他方法可見于 例如WO 2001077137和WO 200306007，并入本文作為參考。在一具體實(shí)施方案中，融合蛋白 質(zhì)的表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系例如CHO細(xì)胞系中進(jìn)行。本發(fā)明其他Fn3基結(jié)合分子綴合物包括與非Fn3基結(jié)合分子例如其他肽或蛋白質(zhì) (例如抗體或受體的配體)相連的Fn3基結(jié)合分子，以生成結(jié)合至少兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)或 靶分子的分子。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子綴合物可利用本領(lǐng)域已知的方法通過使組成分子相連而 制備。例如，組成分子可利用可用來進(jìn)行共價(jià)綴合的多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑來化學(xué)連接。交 聯(lián)劑的實(shí)例包括蛋白質(zhì)A、碳化二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?SATA)、 5，5’_ 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺 基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺 基琥珀酰亞胺酯(sulfo-SMCC)(參見例如 Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu, MA 等(1985)Proc. Natl.Acad. Sci.U. S. A 82 :8648)。其他方法包括 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 ；Brennan ^ (1985) Science 229:81-83)和 Glennie 等(1987) J. Immunol. 139 =2367-2375)中所述的那些。優(yōu)選的綴合劑是SATA和sulfo-SMCC，兩者均 胃_自 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)。可選地，組成分子可以在同一載體上編碼并作為單個(gè)蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。 制備此類融合蛋白質(zhì)的方法描述在例如美國專利No. 5，260，203 ；美國專利No. 5，455，030 ； 美國專禾Ij No. 4，881，175 ；美國專利No. 5，132，405 ；美國專利No. 5，091，513 ；美國專利No. 5，476，786 ；美國專利No. 5，013，653 ；美國專利No. 5，258，498和美國專利 No. 5，482，858 中。又在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與聚乙二醇(PEG)綴合的Fn3基結(jié)合分子， 以例如增加分子的生物學(xué)(例如血清)半衰期。使蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法在本領(lǐng)域公 知。例如，F(xiàn)n3基結(jié)合分子可與聚乙二醇部分，例如PEG的活性酯或醛衍生物，在一個(gè)或多 個(gè)PEG基團(tuán)可以與所述分子連接的條件下反應(yīng)。術(shù)語“聚乙二醇化部分”、“聚乙二醇部分” 或“PEG部分”包括聚亞烷基二醇化合物或其衍生物，有或無偶聯(lián)劑或以偶聯(lián)或活化部分衍 生(例如，以硫醇、三氟甲磺酸(triflate)、tresylate、氮雜環(huán)丙烷(azirdine)、環(huán)氧乙烷 (oxirane)，或優(yōu)選以馬來酰亞胺部分衍生，例如PEG-馬來酰亞胺)。其他適當(dāng)?shù)木蹃喭榛?二醇化合物包括但不限于馬來酰亞胺基單甲氧基聚乙二醇、活化的聚乙二醇聚丙二醇，而 且還包括如下類型的荷電或中性聚合物葡聚糖、多聚乙酰神經(jīng)氨酸、或其他基于糖的聚合 物、氨基酸的聚合物、和生物素衍生物。選擇適宜官能團(tuán)用于PEG衍生物以該分子上或?qū)⑴cPEG偶聯(lián)的分子上可利用的反 應(yīng)基團(tuán)的類型為基礎(chǔ)來進(jìn)行。對于蛋白質(zhì)而言，典型的反應(yīng)性氨基酸包括賴氨酸、半胱氨 酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。還可以利用N-末端氨基基 團(tuán)和C-末端羧酸。優(yōu)選，聚乙二醇化借助于與活性PEG分子(或類似的活性水溶性聚合物)的?；?反應(yīng)或烷基化反應(yīng)而進(jìn)行。如本文所用，術(shù)語“聚乙二醇”旨在涵蓋已經(jīng)被用來衍生其他蛋 白質(zhì)的任何形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇，或聚乙二醇-馬 來酰亞胺。聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域已知，并且可應(yīng)用于本發(fā)明。參見例如WO 2005056764、U. S. 7，045，337、U. S. 7，083，970、U. S. 6，927，042、Nishimura 等的 EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。Fn3基結(jié)合分子可以工程化以納入至少一個(gè)半胱氨酸 氨基酸或至少一個(gè)非天然氨基酸以促進(jìn)聚乙二醇化。Fn3基結(jié)合分子綴合物與其特定靶標(biāo)的結(jié)合可通過多種測定法來確認(rèn)，例如， 可以放射性標(biāo)記融合物并用在放射性免疫測定法(RIA)中(參見例如Weintraub，B.， Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society,March, 1986，并入本文作為參考)。放射性同位素可 通過諸如應(yīng)用Y-計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或者通過放射自顯影法等方法來檢測。本發(fā)明其他Fn3基結(jié)合分子綴合物包括與標(biāo)簽(例如生物素)或化學(xué)品(例如免 疫毒素或化療劑)相連的Fn3基結(jié)合分子。此類化學(xué)品包括細(xì)胞毒性劑，即，任何對細(xì)胞有 害(例如殺傷)的物質(zhì)。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、 絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基 蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)類固醇、普魯卡因、丁卡因、 利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素，以及它們的類似物或同系物。治療劑還包括例如抗代謝 物(例如，氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪)，烷化 劑(例如，氮芥、thio印a苯丁酸氮芥、美法侖、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰 胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C和順二氯二氨鉬(II) (DDP)順鉬)，蒽環(huán)類 藥物(例如，柔紅霉素(以前稱作道諾霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放線菌素D (以 前稱作放線菌素)、博來霉素、光神霉素和氨曲霉素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。能夠與本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子綴合的治療性細(xì)胞毒素的其他實(shí)例包括 duocarmycins、刺孢霉素、美登素和auristatins，以及它們的衍生物。細(xì)胞毒素可以利用本領(lǐng)域可用的接頭技術(shù)與本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子綴合。已經(jīng)用 來與細(xì)胞毒素綴合的接頭類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接頭。例 如，接頭可以選擇為易被溶酶體區(qū)室內(nèi)的低PH斷裂、或者易被蛋白酶(例如優(yōu)先地在腫瘤 組織中表達(dá)的蛋白酶，例如組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、C、D))斷裂的接頭。有關(guān)細(xì)胞 毒素、接頭的類型以及綴合治療劑的方法的更多討論還參見Saito，G.等(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55 :199_215 ；Trail,P. Α.等(2003)Cancer Immunol. Immunother. 52 :328_337 ； Payne, G. (2003)Cancer Cell 3 207-212 ；Allen, Τ. Μ. (2002)Nat.Rev.Cancer 2 750-763 ；Pastan, I.禾P Kreitman，R. J. (2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3 :1089—1091 ； Senter, P.D.禾口 Springer，C. J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53 :247_264。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子還可以與放射性同位素綴合以生成細(xì)胞毒性放射性藥物， 也稱為放射性免疫綴合物。能夠與Fn3基結(jié)合分子綴合用于診斷或治療用途的放射性同 位素的實(shí)例包括但不限于碘m、銦m、釔9°和镥177。制備放射性免疫綴合物的方法在本 領(lǐng)域已經(jīng)確立。放射性免疫綴合物的實(shí)例可商購獲得，包括替伊莫單抗(ibritumomab)、 tiuxetan和托西莫單抗(tositumomab)，且類似的方法可用來應(yīng)用本發(fā)明的分子制備放射 性免疫綴合物。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子綴合物可用來調(diào)節(jié)給定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理 解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是擁有期望生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多 肽。例如，此類蛋白質(zhì)可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、 假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)諸如腫瘤壞死因子或干擾素-Y等；或生物學(xué)反應(yīng)調(diào) 節(jié)劑，例如，淋巴因子、白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒 細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因 子。綴合此類治療性部分的技術(shù)公知，并且可應(yīng)用于本發(fā)明的分子，參見例如Arnon 等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy“， in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(編輯)，243-56 頁(Alan R. Liss,Inc.1985) ；Hellstrom 等，“Antibodies For Drug Delivery"，in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson 等 (編輯 )，623—53 M (Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe，“ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review“， in Monoclonal Antibodies ' 84 !Biological And Clinical Applications， Pinchera 等(編輯) ,475-506 頁 (1985) ； “ Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy “，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等(編 輯)，303-16 頁 (Academic Press 1985)，和 Thorpe 等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"，Immunol. Rev.，62 :119-58 (1982)。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子還可以通過羥乙基淀粉化(hesylation)修飾，其利用與藥 物相連的羥乙基淀粉(“HES”)衍生物以修飾藥物特征。HES是可以被機(jī)體酶代謝的、衍生 自蠟質(zhì)玉米淀粉的、修飾的天然聚合物。這種修飾通過增加分子的穩(wěn)定性以及減小腎臟清除而使循環(huán)半衰期延長，導(dǎo)致增加的生物學(xué)活性。此外，HES化潛在地改變免疫原性或變應(yīng) 原性。通過改變不同的參數(shù)，例如HES的分子量，可以定制范圍廣泛的HES藥物綴合物。DE 196 28 705和DE 101 29 369描述了在無水二甲亞砜(DMSO)中借助于羥乙基 淀粉的相應(yīng)醛糖內(nèi)酯使羥乙基淀粉分別與血紅蛋白和兩性霉素B的游離氨基偶聯(lián)的可行 方法。由于因?yàn)槿芙舛鹊脑蚧蛘呤堑鞍踪|(zhì)變性的原因使用無水非質(zhì)子溶劑往往是不可行 的(特別是在蛋白質(zhì)的情況下)，故也可利用HES在水性介質(zhì)中偶聯(lián)的方法。例如，通過水 溶性碳化二亞胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺)的介導(dǎo)，可以偶聯(lián)已 在鏈還原端選擇性氧化為醛糖酸的羥乙基淀粉(PCT/EP 02/02928)?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的其 他羥乙基淀粉化方法描述在例如 U. S. 20070134197、U. S. 20060258607、U. S. 20060217293、 U. S. 20060100176 和 U. S. 20060052342 中。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子還可利用糖殘基來修飾。修飾蛋白質(zhì)的糖殘基或使蛋白質(zhì) 糖基化的方法在本領(lǐng)域已知(參見例如Borman(2006)Chem. & Eng. News 84(36) :13_22和 Borman (2007) Chem. & Eng. News 85 19-20)，并且可應(yīng)用于本發(fā)明的分子。另外地或可選地，可制備本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子，其具有改變的糖基化類型，例如 巖藻糖殘基量減小的低巖藻糖基化模式，或平分型GlcNac結(jié)構(gòu)增加的Fn3基結(jié)合分子。此 類糖修飾可通過例如在具有改變的糖基化機(jī)器的宿主細(xì)胞中表達(dá)Fn3基結(jié)合分子來實(shí)現(xiàn)。 具有改變的糖基化機(jī)器的細(xì)胞在本領(lǐng)域已有描述，并且可用作為宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明重組 的Fn3基結(jié)合分子，由此產(chǎn)生糖基化改變的本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子。例如，Hang等的EP 1，176，195描述了編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FUT8基因被功能性破壞了的細(xì)胞系，從而在這樣 的細(xì)胞系中表達(dá)的抗體呈現(xiàn)低巖藻糖基化。Presta的PCT公開WO 03/035835描述了變體 CHO細(xì)胞系即Lecl3細(xì)胞，其使巖藻糖與Asn (297)連接的糖相連的能力下降，也導(dǎo)致該宿 主細(xì)胞中表達(dá)的抗體低巖藻糖基化(還請參見Shields, R. L.等，2002 J. Biol. Chem. 277 26733-26740)。產(chǎn)生具有人樣糖基化模式的多肽的方法也已經(jīng)由EP1297172B1以及源于 Glycofi的其他同族專利描述過。牛成Fn3基結(jié)合分子的方法1)核酸和氨基酸改變具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸修飾(例如，改變)的本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子可 通過多種已知方法生成。一般，此類修飾的Fn3基結(jié)合分子可通過重組方法產(chǎn)生。而且，由 于遺傳密碼的簡并性，可利用多種核酸序列來編碼每個(gè)期望的分子。例示性的本領(lǐng)域公認(rèn)的制備編碼起始分子的氨基酸序列變體的核酸分子的方法 包括但不限于通過定點(diǎn)(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、PCR誘變以及盒式誘變早先制備的編 碼分子的DNA來制備。定點(diǎn)誘變是制備取代變體的優(yōu)選方法。此技術(shù)在本領(lǐng)域公知(參見例如Carter等 Nucleic Acids Res. 13 4431-4443 (1985)和 Kunkel 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82 488(1987))。簡言之，在進(jìn)行DNA定點(diǎn)誘變時(shí)，親本DNA通過如下方式改變首先使編碼期 望突變的寡核苷酸與此親本DNA的單鏈雜交。雜交后，利用雜交的寡核苷酸作為引物，而利 用該親本DNA單鏈作為模板，利用DNA聚合酶合成完整的第二鏈。從而，編碼期望突變的寡 核苷酸被摻入到所得的雙鏈DNA中。PCR誘變也適合于制備起始分子的氨基酸序列變體。參見Higuchi，in PCRProtocols,177-183 頁(Academic Press,1990)；禾口 Vallette 等，Nuc. Acids Res. 17 723-733 (1989)。簡言之，當(dāng)小量模板DNA在PCR中用作為起始材料時(shí)，可利用在序列上與 模板DNA相應(yīng)區(qū)域稍有差異的引物來生成相對大量的特定DNA片段，該片段僅在引物有別 于模板的位置上與模板序列存在差異。另一種制備變體的方法，即盒式誘變，是以Wells等Gene 34 :315_323 (1985)描述 的技術(shù)為基礎(chǔ)的。起始材料是含有待突變的起始多肽DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。鑒定親 本DNA中待突變的密碼子。所鑒定的突變位點(diǎn)的每一側(cè)必需有獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 如果不存在這樣的限制性位點(diǎn)，則可以利用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法將其引入在起始 多肽DNA的適當(dāng)位置上。在這些位點(diǎn)切割質(zhì)粒DNA以使之線性化。利用標(biāo)準(zhǔn)方法合成編碼 兩限制性位點(diǎn)之間的DNA序列但含有期望突變的雙鏈寡核苷酸，其中兩條寡核苷酸鏈分開 合成，然后利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)雜交在一起。這種雙鏈寡核苷酸稱為盒。此盒設(shè)計(jì)為具有與線性 化質(zhì)粒末端適配的5’和3’端，從而能夠直接連接到質(zhì)粒中。這樣該質(zhì)粒含有突變的DNA 序列了?？蛇x地，或另外地，可確定編碼分子的多肽變體的期望氨基酸序列，并合成產(chǎn)生編 碼此氨基酸序列變體的核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，可以進(jìn)一步修飾本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子，從而改 變其氨基酸序列(例如與野生型不同)，但期望的活性不變。例如，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行導(dǎo)致“非 必需”氨基酸殘基處的氨基酸取代的其他核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸殘基可 以替換為相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，一段氨基酸鏈可以替換為 結(jié)構(gòu)上類似的、差別在于側(cè)鏈家族成員的順序和/或組成的鏈，即可進(jìn)行保守取代，其中氨 基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已經(jīng)定義，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨 酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側(cè)鏈(例如， 蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。除了氨基酸取代，本發(fā)明還考慮起始分子氨基酸序列的其他修飾，以生成功能上 等同的分子。例如，可以缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的此實(shí)施方案， 缺失不超過1個(gè)至約10個(gè)殘基。包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失的Fn3基結(jié)合分子將優(yōu)選保 留起始多肽分子的至少約80%、優(yōu)選至少約90%、最優(yōu)選至少約95%。還可以制備氨基酸插入變體，其保留原始Fn3結(jié)構(gòu)域或Fn3基結(jié)合分子的功能。例 如，可以將至少一個(gè)氨基酸殘基(例如，1個(gè)或2個(gè)氨基酸殘基，一般不超過10個(gè)殘基)引 入到分子中，在另一實(shí)施方案中，可以在Fn3結(jié)構(gòu)域或單個(gè)Fn3基結(jié)合分子中組合種種氨基 酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，對Fn3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸取代，以包括半胱氨酸或其他非天 然氨基酸，從而適合于通過公知的綴合方法使部分(moiety)與該Fn3基結(jié)合分子綴合。尤 其是，本發(fā)明涉及具Fn3支架的Fn3基結(jié)合分子的特定氨基酸變體，其中一個(gè)或多個(gè)絲氨酸 殘基被半胱氨酸或非天然氨基酸取代。能夠取代的絲氨酸殘基包括但不限于Ser 1432、 Ser 1436、Ser 1458、Ser 1475和Ser 1504。能夠取代的Fn3支架的其他氨基酸位置包括但不限于V1426、L1434、T1473和T1486。非天然存在的氨基酸可利用例如Ambrex技術(shù)(參 見例如US 7，045，337 ；7, 083，970)取代到Fn3支架中。2)用于鑒定Fn3基結(jié)合分子的篩選測定法可采用多種篩選測定法來鑒定本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子?；旧先魏芜x擇對期望抗 原的結(jié)合的體外或體內(nèi)篩選方法均可利用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞、病毒或噬菌體表面展示Fn3基結(jié)合分子，并利用固 定化抗原對其進(jìn)行選擇。適宜的篩選方法描述在美國專利No. 7，063，943 ；6，699，658 ； 7，063，943和5866344中。此類表面展示可能要求創(chuàng)建Fn3基結(jié)合分子和正常存在于細(xì)胞、 病毒或噬菌體外表面上的適宜蛋白質(zhì)之間的融合蛋白質(zhì)。適宜制備此類融合物的蛋白質(zhì)在 本領(lǐng)域公知。在另一實(shí)施方案中，利用體外表型-基因型關(guān)聯(lián)展示例如核糖體或多核糖體 展示來篩選Fn3基結(jié)合分子。此類“分子進(jìn)化”方法為本領(lǐng)域公知(參見例如美國專利 No. 6，194，550 和 7，195，880)。篩選方法可以包括一個(gè)或多個(gè)體外或體內(nèi)親和力成熟步驟?？刹捎萌魏斡H和力成 熟方法，引起Fn3結(jié)構(gòu)域或CDR中的氨基酸變化，提高Fn3基結(jié)合分子與期望抗原的結(jié)合。 這些氨基酸變化可以例如，借助于隨機(jī)誘變、“模糊誘變(walk through mutagenesis) ”和 “精確誘變(look through mutagenesis)”而實(shí)現(xiàn)。例如，此類誘變可利用易錯(cuò)PCR，利用 酵母或細(xì)菌“增突”株，在從頭合成所有或部分Fn3基結(jié)合分子期間摻入隨機(jī)或確定的核 酸變化而實(shí)現(xiàn)。實(shí)施親和力成熟和/或誘變的方法描述在例如，美國專利No. 7，195，880 ； 6，951，725 ；7，078，197 ；7，022，479 ；5，922，545 ；5，830，721 ；5，605，793, 5，830，650 ； 6，194，550 ；6，699，658 ；7，063，943 ；5866344 和專利協(xié)作條約公開 W006023144 中。此類親 和力成熟方法可能還需要增加抗原結(jié)合篩選測定法的嚴(yán)緊度，以選擇對抗原具有提高的親 和力的Fn3基結(jié)合分子。本領(lǐng)域公認(rèn)的增加蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用測定法的嚴(yán)緊度的方 法可在本文使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變一個(gè)或多個(gè)測定條件(例如，測定緩沖液的鹽濃 度)以減小Fn3基結(jié)合分子對期望抗原的親和力。在另一實(shí)施方案中，縮短允許Fn3基結(jié) 合分子與期望抗原結(jié)合的時(shí)間長度。在另一實(shí)施方案中，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用測定 法中增添競爭性結(jié)合步驟。例如，首先使Fn3基結(jié)合分子與期望的固定化抗原結(jié)合。然后 添加特定濃度的非固定化抗原，其起與固定化抗原競爭結(jié)合的作用，從而對抗原具有最低 親和力的Fn3基結(jié)合分子從固定化的抗原上洗脫出來，導(dǎo)致選擇出具有提高的抗原結(jié)合親 和力的Fn3基結(jié)合分子。測定條件的嚴(yán)緊度還可以通過增加添加到測定中的非固定化抗原 的濃度來增加。本發(fā)明的篩選方法還可能需要多輪選擇，以富集抗原結(jié)合性提高的一種或多種 Fn3基結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在每一輪選擇中，向Fn3基結(jié)合分子中引入進(jìn)一步的 氨基酸突變。在另一實(shí)施方案中，在每一輪選擇中，增加與期望抗原結(jié)合的嚴(yán)緊度，以選擇 抗原親和力增加的Fn3基結(jié)合分子。在本發(fā)明雙特異性Fn3基結(jié)合分子的情況下，優(yōu)選獨(dú)立地篩選每一種結(jié)合特異 性。從而，利用其中AB、CD和EF環(huán)之一個(gè)或多個(gè)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變了的第一 Fn3 基結(jié)合分子文庫進(jìn)行第一篩選，以鑒定與第一靶標(biāo)結(jié)合的Fn3基結(jié)合分子個(gè)體。利用其中 BC、DE和TO環(huán)之一個(gè)或多個(gè)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變了的第二 Fn3基結(jié)合分子文庫進(jìn)行第二篩選，以鑒定與第二靶標(biāo)結(jié)合的Fn3基結(jié)合分子個(gè)體。利用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法確定 自兩個(gè)篩選鑒定的單特異性Fn3基結(jié)合分子個(gè)體的氨基酸序列。雙特異性Fn3基結(jié)合分子 通過將來自這些Fn3基結(jié)合分子個(gè)體的第一和第二靶標(biāo)結(jié)合序列組合到單個(gè)嵌合Fn3基結(jié) 合分子中而生成。3)制備方法本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子一般通過重組表達(dá)產(chǎn)生。編碼所述分子的核酸插入到表達(dá) 載體中。編碼所述分子的DNA區(qū)段于表達(dá)載體中有效連接確保其表達(dá)的控制序列。表達(dá)控 制序列包括但不限于啟動(dòng)子(例如天然相伴或異源的啟動(dòng)子)、信號(hào)序列、增強(qiáng)子元件和 轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選表達(dá)控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動(dòng)子 系統(tǒng)。一旦載體已經(jīng)摻入到適當(dāng)?shù)乃拗髦?，則將宿主維持在適合于高水平表達(dá)所述核苷酸 序列、以及收集和純化該交叉反應(yīng)性Fn3基結(jié)合分子的條件下。這些表達(dá)載體一般可作為游離體或者宿主染色DNA的一個(gè)部分而在宿主生物體 中復(fù)制。通常表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記(例如，氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或 新霉素抗性)，以允許檢測轉(zhuǎn)化了期望的DNA序列的那些細(xì)胞(參見例如Itakura等，美國 專利 4，704，362)。大腸桿菌是一種尤其可用于克隆本發(fā)明多核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。 其他適合于應(yīng)用的微生物宿主包括芽孢桿菌屬(bacilli)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),以及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，例如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙 雷氏菌屬(Serratia)和多種假單胞菌屬(Pseudomonas)菌種。其他微生物例如酵母也可用于表達(dá)。酵母屬(Saccharomyces)和畢赤氏酵母屬 (Pichia)為例示性的酵母宿主，適宜載體按期望具有表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子)、復(fù)制起 點(diǎn)、終止序列等。典型的啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng) 子包括例如來自醇脫氫酶、異細(xì)胞色素CGsocytochrome C)以及負(fù)責(zé)甲醇、麥芽糖和半乳 糖利用的酶的啟動(dòng)子。除了微生物，哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物也可以用來表達(dá)和生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(例如 編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。參見Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y.，N. Y. (1987)。實(shí)際上優(yōu)選真核細(xì)胞，因?yàn)楸绢I(lǐng)域已經(jīng)研發(fā)了許多能夠分 泌異源蛋白質(zhì)(例如完整免疫球蛋白)的適宜宿主細(xì)胞系，包括CHO細(xì)胞系、多種COS細(xì) 胞系、HeLa細(xì)胞、293細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞以及雜交瘤。用于這些細(xì)胞的表 達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(Queen等，Immunol. Rev. 89 49(1986))，以及必要的加工信息位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多聚腺苷酸化 位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列為來源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛 乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒等的啟動(dòng)子。參見Co等，J. Immunol. 148 =1149(1992) 0可選地，編碼序列可摻入到轉(zhuǎn)基因中，以引入到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組中，隨后在 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中表達(dá)(參見例如Deboer等，U. S. 5，741，957，Rosen, U. S. 5，304，489和 Meade等，U. S. 5，849，992)。適宜的轉(zhuǎn)基因包括輕鏈和/或重鏈編碼序列，有效連接于來自 乳腺特異性基因例如酪蛋白或β乳球蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。含目的多核苷酸序列和表達(dá)控制序列的載體可通過公知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞 中，所用方法取決于細(xì)胞宿主的類型。例如，可以短暫熱擊化學(xué)感受態(tài)原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染(lipofection)、生物轟擊(biolistics)或基于病毒的轉(zhuǎn)染可用于 其它細(xì)胞宿主(一般參見 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)。其他用來轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法包括應(yīng)用 polybrene、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射(一般參見Sambrook等，同前)。為 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因可顯微注射到受精卵中，或者可摻入到胚胎干細(xì)胞的基因組中，并 將此類細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到去核卵細(xì)胞中。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子一經(jīng)表達(dá)，則可按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化，包括 硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等(一般參見Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag, N. Y.，(1982))。對于制藥用途，優(yōu)選基本上純的、至少約 90-95%均質(zhì)的分子，最優(yōu)選98-99%或更高均質(zhì)性。4)將⑶R移植到Fn3基結(jié)合分子上的方法一方面，本發(fā)明描述了 Fn3基結(jié)合分子，其與野生型Fn3結(jié)構(gòu)域相比發(fā)生了改變以 含有抗體或T細(xì)胞受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的全部或部分。任何抗體或T細(xì)胞受體可變區(qū)的CDR區(qū)或其抗原結(jié)合片段均適合于移植。CDR可 從任何動(dòng)物的抗體或T細(xì)胞受體庫(repertoire)中獲得，包括但不限于嚙齒類動(dòng)物、靈 長類動(dòng)物、駝?lì)悇?dòng)物或鯊魚。在特別的實(shí)施方案中，CDR從單域抗體例如納米抗體的CDRl、 CDR2和CDR3獲得。在更具體的實(shí)施方案中，單域抗體例如納米抗體的CDR1、2和3移植到 Fn3結(jié)構(gòu)域的AB、BC、⑶、DE、EF或TO環(huán)之任一中，由此向Fn3基結(jié)合分子提供原始納米抗 體的靶結(jié)合特異性。駝?lì)惪贵w和抗體片段的工程化文庫可商購獲得，例如Ablynx，Ghent, 比利時(shí)?？贵w庫(repertoire)可來自用一種或多種抗原刺激的動(dòng)物，或來自未用抗原刺激 過的幼稚動(dòng)物。另外或者可選地，CDR可從通過體外或體內(nèi)文庫篩選方法所產(chǎn)生的抗體或 其抗原結(jié)合片段獲得，所述方法包括但不限于體外多聚核糖體或核糖體展示、噬菌體展示 或酵母展示技術(shù)。這包括非由體外或體內(nèi)文庫篩選方法最初產(chǎn)生的、而是利用體外或體內(nèi) 篩選方法隨后經(jīng)歷了誘變或一個(gè)或多個(gè)親和力成熟步驟的抗體。此類體外或體內(nèi)文庫篩 選方法或親和力成熟方法的實(shí)例描述在美國專利No. 7，195，880 ；6, 951，725 ；7, 078，197 ； 7，022，479 ；5，922，545 ；5，830，721 ；5，605，793,5，830，650 ；6，194，550 ；6，699，658 ； 7，063，943 ；5866344以及專利協(xié)作條約公開W006023144中。鑒定抗體CDR的方法在本領(lǐng)域公知(參見Kabat等，U. S. Dept. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)； Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 901-917 (1987) ；MacCallum 等，J. Mol. Biol. 262 732-745(1996))。可以分離和測序編碼特定抗體的核酸，并通過相對于確立的抗體序列命 名法來檢查所編碼的蛋白質(zhì)而推出CDR序列。將高變區(qū)或CDR移植到本發(fā)明基于Fn3的結(jié) 合支架中的方法包括例如，基因工程法、從頭核酸合成或基于PCR的基因組裝(參見例如美 國專利 No. 5，225. 539)。上述技術(shù)允許鑒定適宜的支架環(huán)，用來選擇和呈遞高變區(qū)或⑶R。不過，可以調(diào)用 其他法則，基于Fn3結(jié)構(gòu)域和供體抗體的結(jié)構(gòu)建模，進(jìn)一步改進(jìn)高變區(qū)的合身性以及呈遞。一方面，可以突變Fn3結(jié)構(gòu)域任一 β鏈中的特定氨基酸殘基，以允許CDR環(huán)采取 保留或提高抗原結(jié)合的構(gòu)象。這種方法可應(yīng)用結(jié)構(gòu)建模和序列比較的組合，通過類似于將 CDR移植到異源抗體構(gòu)架中的方式來進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，鄰近CDR的Fn3結(jié)構(gòu)域殘基以類似于 Queen 等(參見美國專利 No. 6，180，370 ；5，693，762 ；5，693，761 ；5，585，089 ； 7，022，500)實(shí)施的方式進(jìn)行突變。在另一實(shí)施方案中，落在CDR殘基一個(gè)范德華半徑范圍 內(nèi)的Fn3結(jié)構(gòu)域殘基以類似于Winter等(參見美國專利No. 6，548，640 ;6，982，321)實(shí)施 的方式進(jìn)行突變。在另一實(shí)施方案中，不靠近CDR殘基、但根據(jù)Fn3結(jié)構(gòu)域和供體抗體的結(jié) 構(gòu)建模預(yù)測將調(diào)節(jié)CDR殘基構(gòu)象的Fn3結(jié)構(gòu)域殘基，以類似于Carter等或Adair等(見美 國專利 No. 6，407，213 ；6，639，055 ；5，859，205 ；6，632，927)實(shí)施的方式進(jìn)行突變。組合物本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子具有體內(nèi)治療用途。從而，本發(fā)明還提供了組合物，例如藥 物組合物，含有與可藥用載體配制在一起的一種或組合的Fn3基結(jié)合分子(或其變體、融合 物和綴合物)。本發(fā)明的藥物組合物還可以在組合治療中給藥，即與其他藥劑組合。例如， 組合治療可包括本發(fā)明的組合物連同至少一種或多種其他治療劑，例如抗炎藥、抗癌藥和 化療劑。本發(fā)明的藥物組合物還可聯(lián)合放射治療給藥。與其他基于Fn3的分子共給藥也涵 蓋在本發(fā)明中。如本文所用，“可藥用載體”包括任何及所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、衣料、 抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選載體適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、胃腸 外、脊髓或表皮給藥(例如，通過注射或輸注)。取決于給藥路徑，活性化合物，即抗體、雙特 異性和多特異性分子，可用保護(hù)化合物免受酸及其他可能使化合物失活的天然條件作用的 材料進(jìn)行包衣?！翱伤幱名}”是指保留親本化合物的期望生物學(xué)活性而不帶來任何不期望的毒性 效應(yīng)的鹽(參見例如Berge，S. Μ.，等(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。此類鹽的實(shí)例包括 酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機(jī)酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴 酸、氫碘酸、亞磷酸等)以及無毒有機(jī)酸(例如脂肪族單羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的 鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂肪族磺酸和芳族磺酸等)的那些鹽。堿加成鹽包括衍生自 堿土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣等)以及無毒有機(jī)胺(例如N，N’ - 二芐基乙二胺、N-甲基葡 糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的那些鹽。本發(fā)明的組合物可通過多種本領(lǐng)域公知的方法給藥。如技術(shù)人員將會(huì)理解的那 樣，給藥路徑和/或給藥方式將取決于期望的結(jié)果?；钚曰衔锟捎梅乐够衔锟焖籴尫?的載體配制，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)。可利用生物可降解 的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。 許多制備此類制劑的方法被授予專利或是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編輯，Marcel Dekker, Inc.，New York,1978。為通過某些給藥路徑給藥本發(fā)明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料包 衣化合物，或與該材料共給藥化合物。例如，化合物可以在適當(dāng)?shù)妮d體例如脂質(zhì)體或稀釋劑 中對受試者給藥?？伤幱玫南♂寗┌}水和水性緩沖溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF 乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan 等(1984) J. Neuroimmunol. 7 27)?？伤幱幂d體包括無菌水性溶液或分散液以及用于即時(shí)制備無菌注射液或分散液 的無菌粉劑。此類介質(zhì)和試劑用作藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域已知。除非與活性化合物不相容，否則任何常規(guī)介質(zhì)或試劑均可以考慮在本發(fā)明藥物組合物中使用。增補(bǔ)活性化合 物也可摻入到組合物中。治療性組合物一般必需是無菌的，并在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。組合物可以配制 為溶液、微乳、脂質(zhì)體或其他適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)， 含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)，及其適宜的混合物。 恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可例如通過應(yīng)用衣料如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的顆粒大 小，以及通過應(yīng)用表面活性劑來維持。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中納入等滲劑，例如糖、 多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。可注射組合物的延時(shí)吸收可通過在組合物中納入延 遲吸收的藥劑來實(shí)現(xiàn)，例如單硬脂酸鹽和明膠。無菌可注射溶液可通過按需要將處于適當(dāng)溶劑中的所需量的活性化合物與一種 或組合的上文列舉的成分摻在一起、接著微濾除菌來制備。一般而言，分散體通過將活性化 合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和來自上文列舉的那些的所需其他成分的無菌媒介物中來 制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷 凍干燥(凍干)，從之前的無菌過濾溶液得到活性成分外加任何其他期望成分的粉劑。調(diào)整劑量方案以提供最佳的期望反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單個(gè)大 劑量(bolus)，可以在一段時(shí)間給藥幾個(gè)分劑量，或者可以按照治療情形的緊急性的指示， 成比例地降低或增加劑量。例如，本發(fā)明而3基結(jié)合分子可以每周一次或兩次皮下注射給 藥，或者每月一次或兩次皮下注射。特別有利的是以劑量單位形式配制胃腸外組合物，以易于給藥和統(tǒng)一劑量。如本 文所用的劑量單位形式是指適于作為單個(gè)劑量用于待治療受試者的、物理上離散的單位； 每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算可以產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的活性化合物以及所需的藥物載體。 本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格受制于并直接取決于(a)活性化合物的獨(dú)特特征和欲實(shí)現(xiàn)的 特定治療效果，和(b)個(gè)體敏感性對配制此類活性化合物用于治療造成的本領(lǐng)域固有限 制?？伤幱每寡趸瘎┑膶?shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸 鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；( 油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、 丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3) 金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。對于治療組合物，本發(fā)明的制劑包括適合于口服、鼻腔、局部(包括頰和舌下)、直 腸、陰道和/或胃腸外給藥的那些。制劑可以便利地以單位劑量形式存在，并且可以通過藥 學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分量將取決 于待治療的受試者和具體的給藥方式?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分 量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般而言，在100%當(dāng)中，該量范圍將是約0.001% 至約90%的活性成分，優(yōu)選約0. 005%至約70%，最優(yōu)選約0. 01%至約30%。本發(fā)明適合于陰道給藥的制劑還包括含有本領(lǐng)域已知適當(dāng)?shù)妮d體的栓劑、棉塞 劑、霜?jiǎng)?、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑。用于局部或透皮給藥本發(fā)明組合物的劑型包括粉 劑、噴霧劑、膏劑、糊劑、霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑?；钚曰衔锟梢栽跓o菌條 件下與可藥用的載體、與任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。如本文所用的短語“胃腸外給藥”和“經(jīng)胃腸外給藥”表示除消化道和局部給藥之外的給藥方式，通常通過注射，并且包括，但不限于，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、包膜內(nèi)、 眼眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、包膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)、硬膜 外和胸骨內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明的藥物組合物中可采用的適宜水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多 元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適宜的混合物，植物油，例如橄欖油，和可注射 的有機(jī)酯，例如油酸乙酯。恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可例如通過應(yīng)用衣料如卵磷脂，在分散體的情況下 通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑來維持。這些組合物還可以含有助劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。防止存在微 生物既可以通過同前的滅菌方法、又可以通過納入多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來確保，例如 對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。還可能期望在組合物中納入等滲劑，例如糖、氯 化鈉等。另外，可注射藥物形式的延時(shí)吸收可以通過納入延遲吸收的藥劑來實(shí)現(xiàn)，例如單硬 脂酸鋁和明膠。當(dāng)本發(fā)明的化合物作為藥物對人和動(dòng)物給藥時(shí)，它們可以單獨(dú)地或作為含有例如 0. 001-90% (更優(yōu)選0. 005-70%，例如0. 01-30% )活性成分連同可藥用載體的藥物組合
物給予。不管選擇的給藥路徑如何，本發(fā)明的化合物(其可以以適宜的水合形式應(yīng)用)和/ 或本發(fā)明的藥物組合物均可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法配制成可藥用的劑型。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化，以獲得對于具體的患 者、組合物和給藥方式而言能有效實(shí)現(xiàn)期望治療反應(yīng)、而對該患者無毒的活性成分量。選擇 的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明具體組合物或其酯、鹽或 酰胺的活性，給藥路徑，給藥時(shí)間，所采用具體化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與所采 用的具體組合物組合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、 病情、總體健康和既往病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的類似因素。具有本領(lǐng)域普通技術(shù)水平的醫(yī) 師或獸醫(yī)能夠容易地確定和開處有效量的所需藥物組合物。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)可以以比為 實(shí)現(xiàn)期望治療效果所需低的水平開始藥物組合物中的本發(fā)明化合物的劑量，并逐漸增加劑 量，直至實(shí)現(xiàn)期望的效果。一般而言，本發(fā)明組合物適宜的日劑量將使化合物的量為有效產(chǎn) 生治療效果的最低劑量。這樣的有效劑量一般將取決于上文所述的因素。優(yōu)選給藥是靜脈 內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，優(yōu)選在靠近靶部位處給藥。如果期望，治療組合物的有效日劑量 可以在一整天中以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔分開為兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)分劑量來 給藥，任選以單位劑量的形式。雖說可以單獨(dú)給藥本發(fā)明的化合物，但是優(yōu)選以藥物制劑 (組合物)形式給藥所述化合物。治療組合物可用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā) 明的治療組合物可用無針頭皮下注射裝置給藥，例如美國專利No. 5，399，163,5, 383，851、 5，312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中所述的裝置?？捎糜诒?發(fā)明的植入物和器件的公知實(shí)例包括美國專利No. 4，487，603，其公開了以可控速率 分配藥物的可植入微輸注泵；美國專利No. 4，486，194，其公開了通過皮膚給藥藥物的 治療裝置；美國專利No. 4，447，233，其公開了以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注 泵；美國專利No. 4，447，224，其公開了用于連續(xù)藥物遞送的可變流可植入輸注裝置； 美國專利No. 4，439，196，其公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；以及美國專利No. 4，475，196，其公開了滲透藥物遞送系統(tǒng)。許多其他此類植入物、遞送系統(tǒng)和器件為本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知。在某些實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的分子以確保體內(nèi)恰當(dāng)?shù)姆植肌＠?，血腦屏 障(BBB)排除許多高度親水的化合物。為確保本發(fā)明的治療性化合物穿過BBB (如果期望 的話)，可例如在脂質(zhì)體中配制之。有關(guān)制備脂質(zhì)體的方法，參見例如美國專利4，522,811 ； 5，374，548和5，399，331。脂質(zhì)體可以含有選擇性運(yùn)輸?shù)教囟?xì)胞或器官中的一個(gè)或多個(gè) 部分，從而增強(qiáng)靶向藥物遞送(參見例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 :685)。 例示性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如授予Low等的美國專利5，416，016)；甘露 糖苷(Umezawa 等，(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 :1038)；抗體(P. G. Bloeman 等(1995)FEBS Lett. 357 140 ；M. Owais 等(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39 180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am. J. Physiol. 1233 :134)，其不同類型以 及所發(fā)明分子的組分可以含在本發(fā)明制劑中；pl20 (khreier等(1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；還請參見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346 :123 J. J. Killion ； I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4 :273。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療化合 物配制在脂質(zhì)體中；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包括靶向部分。在最優(yōu)選的實(shí)施方案 中，脂質(zhì)體中的治療化合物通過在靠近腫瘤或感染的部位快速濃注來遞送。組合物必須具 有達(dá)到易于注射程度的流動(dòng)性。其在制備和儲(chǔ)存條件下必需穩(wěn)定，并且必需防止其遭到微 生物如細(xì)菌和真菌的污染。在另一實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的分子以防止或減小跨胎盤運(yùn)輸。這可 通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如通過聚乙二醇化而3基結(jié)合分子。更多參考可見 Cunningham-Rundles C， Zhuo Z， Griffith B， Keenan J. (1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152 :177-190 ；以及 Landor Μ. (1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283。這在 Fn3 基 結(jié)合分子用于治療或預(yù)防復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)時(shí)尤其有利?；衔镆种瓢┌Y的能力可在能預(yù)測人腫瘤中的功效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中進(jìn)行評價(jià)。 可選地，組合物的這種特性可通過利用技術(shù)人員已知測定法研究化合物的抑制能力、例如 體外抑制作用來評價(jià)。治療有效量的治療化合物能夠降低腫瘤大小，或以其他方式緩解受 試者癥狀。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠基于諸如受試者的個(gè)頭、受試者癥狀的嚴(yán)重程度以 及所選擇的具體組合物或給藥路徑等因素來確定這樣的量。就組合物可通過注射器遞送而言，組合物必需是無菌流動(dòng)的。除了水，載體可以是 等滲緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適宜的混合 物。例如，可通過應(yīng)用衣料如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通 過應(yīng)用表面活性劑來維持恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中納入等滲劑，例如 糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、和氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長期吸收可通過在組合物納入 延遲吸收的藥劑來實(shí)現(xiàn)，例如單硬脂酸鋁或明膠。當(dāng)活性化合物如上文所述進(jìn)行了適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)時(shí)，化合物可以口服給藥，例如，用惰 性稀釋劑或可同化可食用的載體。治療和診斷應(yīng)用
可以構(gòu)建本文所述的而3基結(jié)合分子以結(jié)合任何目的抗原或靶標(biāo)。此類靶標(biāo)包括 但不限于簇結(jié)構(gòu)域(cluster domains)、細(xì)胞受體、細(xì)胞受體配體、生長因子、白介素、蛋白 質(zhì)變應(yīng)原、細(xì)菌或病毒(參見圖1)。還可以修飾本文所述的而3基結(jié)合分子，以具有增加的 穩(wěn)定性和半衰期，以及其他功能部分。相應(yīng)地，這些分子可在使用抗體的所有領(lǐng)域中采用以 替代抗體，包括研究、治療和診斷領(lǐng)域。另外，由于這些分子擁有比抗體優(yōu)越的溶解性和穩(wěn) 定性特性，本文所述的抗體模擬物還可以在破壞或失活抗體分子的條件下應(yīng)用。例如，可向培養(yǎng)中(例如體外或離體)或受試者(例如體內(nèi))中的細(xì)胞施用這些分 子，以治療、預(yù)防或診斷多種紊亂。如本文所用的術(shù)語“受試者”旨在包括人和非人動(dòng)物。非 人動(dòng)物包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長動(dòng)物、綿羊、狗、貓、 牛、馬、雞、兩棲動(dòng)物和爬行動(dòng)物。當(dāng)而3分子與其他藥劑一起給藥時(shí)，兩者可以按任何次序 或同時(shí)給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明而3基結(jié)合分子(及其變體、融合物和綴合物)可用來 檢測該分子所結(jié)合的靶標(biāo)和/或雙特異性/多特異性而3基結(jié)合分子所結(jié)合的靶標(biāo)的水 平。例如，這可通過使樣品(例如體外樣品)和對照樣品與所述分子在允許分子和靶標(biāo)之間 形成復(fù)合物的條件下接觸來實(shí)現(xiàn)。檢測分子和靶標(biāo)之間形成的任何復(fù)合物，并在樣品和對 照之間進(jìn)行比較。例如，可利用本發(fā)明的組合物進(jìn)行本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，如ELISA、 FACS和流式細(xì)胞計(jì)測定法。同樣落在本發(fā)明范圍內(nèi)的是試劑盒，其含有本發(fā)明的組合物(例如，而3基結(jié)合分 子、其變體、融合物和綴合物)和使用說明。試劑盒可進(jìn)一步含有至少一種其他試劑或一種 或多種其他本發(fā)明而3基結(jié)合分子(例如，具有互補(bǔ)活性、與區(qū)別于第一分子的靶抗原上的 表位結(jié)合的抗體)。試劑盒一般包括表明試劑盒內(nèi)含物的目的用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括 試劑盒上或與之附隨提供的、或以其他方式與試劑盒相伴的任何書面或記錄材料。如上文所述，本發(fā)明的分子可以在研究、治療和診斷領(lǐng)域的所有方面采用。可利用 本發(fā)明而3基結(jié)合分子(及其變體、融合物和綴合物)治療的例示性疾病/紊亂包括但不 限于自身免疫病、癌癥、感染及其他病原性適應(yīng)癥?？衫帽景l(fā)明而3基結(jié)合分子的自身免疫病的具體實(shí)例包括但不限于如下多發(fā) 性硬化及其他脫髓鞘??；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性腸病；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；I型糖尿?。谎仔?皮膚??；Sjogren氏綜合癥；和移植排斥?？衫帽景l(fā)明而3基結(jié)合分子的癌癥的具體實(shí)例包括但不限于如下肺癌；乳腺 癌；前列腺癌；膀胱癌；黑色素瘤；非霍奇金淋巴瘤；結(jié)腸直腸癌；胰腺癌；子宮內(nèi)膜癌 ’腎 癌；皮膚癌(非黑色素瘤)；白血病；和甲狀腺癌。VEGF相關(guān)疾病的具體實(shí)例包括例如與不當(dāng)血管生成相關(guān)的許多病情，包括但不 限于自身免疫病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病或銀屑病)；心臟紊亂(例如動(dòng)脈粥樣 硬化或血管再狹窄)；視網(wǎng)膜病(例如泛化增生性視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān) 性黃斑變性或新生血管性青光眼)；腎病(例如糖尿病腎病；惡性腎硬化；血栓性微血管病 綜合癥；移植排斥；炎性腎?。荒I小球腎炎；膜增生性腎小球腎炎；溶血性尿毒癥綜合征和 高血壓性腎硬化)；血管母細(xì)胞瘤；血管瘤；甲狀腺增生；組織移植；慢性炎癥；Meigs綜合 癥；心包積液；胸腔積液；自身免疫?。惶悄虿?；子宮內(nèi)膜異位；慢性哮喘；不期望的纖維化 (特別是肝纖維化)和癌癥，以及因癌癥引起的并發(fā)癥，例如胸腔積液和腹水。而3基結(jié)合分子可用來治療或預(yù)防過度增生性疾病或癌癥以及癌癥的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。癌癥的非限制性實(shí) 例包括膀胱癌、血癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、軟骨癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴結(jié)癌、神經(jīng) 組織癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨骼肌癌、皮膚癌、脊髓癌、脾癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、 甲狀腺癌、氣管癌、泌尿生殖道癌、輸尿管癌、尿道癌、子宮癌或陰道癌。其他可治療的病情 可見美國專利號(hào)6，524，583，在此并入作為參考。描述過VEGFR-2結(jié)合多肽用途的其他參 考文獻(xiàn)包括McLeod DS 等，hvest Ophthalmol Vis ki. 2002 年 2 月；43 ) :474-82; Watanabe 等 Exp Dermatol. 2004 年 11 月；13 (11) :671-81 ；Yoshiji H 等，Gut. 2003 Sep ； 52(9) :1347-54 ；Verheul 等，Oncologist. 2000 ;5 Suppl 1 45-50 ；Boldicke 等，Stem Cells. 2001 ；19(1) :24_36。如本文所述，血管生成相關(guān)疾病包括但不限于血管生成依賴 性癌癥，包括例如實(shí)體瘤、血液傳播腫瘤例如白血病以及腫瘤轉(zhuǎn)移。良性腫瘤，例如血管瘤、 聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼和膿性肉芽腫；炎性紊亂，例如免疫和非免疫性炎癥；慢性關(guān) 節(jié)風(fēng)濕病和銀屑病；眼部血管生成性疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑 變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶體后纖維增生癥、虹膜紅變；Osier-Webber氏 綜合癥；心肌血管新生；斑塊內(nèi)新生血管形成；毛細(xì)血管擴(kuò)張；血友病性關(guān)節(jié)病；血管纖維 瘤；和創(chuàng)面肉芽(wound granulation)以及創(chuàng)面愈合；毛細(xì)血管擴(kuò)張、銀屑病、硬皮病、膿性 肉芽腫、冠狀動(dòng)脈側(cè)支病、肢體缺血后血管發(fā)生、角膜疾病、虹膜紅變、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性新 生血管形成、骨折、血管發(fā)生(vasculogenesis)、造血(參見例如W02005056764)?？衫帽景l(fā)明而3基結(jié)合分子的感染的具體實(shí)例包括但不限于如下細(xì)胞、真菌、 細(xì)菌和病毒感染。本發(fā)明進(jìn)一步通過如下實(shí)施例舉例說明，其不應(yīng)闡釋為進(jìn)一步的限制。本申請通 篇引述的所有附圖和所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請的內(nèi)容明確并入本文作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1^.r^^mm&m^^icm一般而言，除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施采用化學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技 術(shù)、免疫學(xué)(特別是例如抗體技術(shù))的常規(guī)技術(shù)、和多肽制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。參見例如 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis, Molecular Cloning :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology),510, Paul, S. , Humana Pr (1996) ；Antibody Engineering :A Practical Approach(Practical Approach Series,169), McCafferty 編 輯，Irl Pr(1996) ；Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow 等，C. S. H. L. Press, Pub. (1999)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編輯，John Wiley & Sons (1992) 0適合用來實(shí)施本發(fā)明的其他方法、 技術(shù)和序列見美國專利 No. 7，153，661 ；7，119，171 ；7，078，490 ；6，703，199 ；6，673，901 和 6，462，189。利用人纖連蛋白10 0^31°)來設(shè)計(jì)、分離和工程化單特異性結(jié)合劑。首先利用標(biāo)準(zhǔn) 選擇方法獨(dú)立地自兩個(gè)文庫分離初始結(jié)合劑。然后誘變該富集的群體，并進(jìn)行后續(xù)多輪隨 機(jī)誘變和富集，以獲得期望的單特異性結(jié)合劑。
文庫構(gòu)建使用如SEQ ID NO 1所示的野生型而31(1序列作為基礎(chǔ)，生成利用頂部或底部環(huán)的 結(jié)合劑的文庫。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYT ITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEI(SEQ ID NO 1)利用計(jì)算模建，選擇野生型!^31°的兩組可變區(qū)進(jìn)行隨機(jī)化。第一組包含接觸溶劑 的頂環(huán)BC、DE和TO，命名為文庫A，并在SEQ ID NO :2中黑體顯示的區(qū)域隨機(jī)化。文庫A (具有接觸溶劑的頂環(huán)BC、DE和TO的β -夾層結(jié)構(gòu))。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISff DAPAVTV RYYRITYGETGGNSPVQEFTV PGSK S TATISGLKPGVDYTITVYAVT GRGDSPASSK PISINYRTEI (SEQ ID NO 2)第二組包含接觸溶劑的底環(huán)ΑΒ、⑶、EF和C-末端，命名為文庫B，并在斜體顯示的 下劃線區(qū)域隨機(jī)化。文庫B (具有接觸溶劑的底環(huán)ΑΒ、⑶、EF和C-末端的β -夾層結(jié)構(gòu))。VSD VPRDLE VVAAT PTS LLISffDAPAVTVRYYRITYG ETGGNSPV QEFTVPGSKSTATI SGLKP G V DYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY R T EI (SEQ ID NO 3)在德國GeneartAG公司優(yōu)化對應(yīng)于兩個(gè)文庫的DNA序列用于大腸桿菌中進(jìn)行表 達(dá)。分別將SEQ ID NO :2和3的粗體或下劃線斜體區(qū)域合成為簡并位置。文庫由合成的簡 并寡核苷酸和凝膠純化的對應(yīng)于全長片段的基因來組裝。擴(kuò)增利用末端引物進(jìn)行，而隨后 將擴(kuò)增文庫連接到克隆載體PCRIcript中得到起始文庫。然后獨(dú)立篩選文庫A和B，以如 下文實(shí)施例2所述鑒定單特異性結(jié)合劑。實(shí)施例2tmmmmmm^^^本發(fā)明描述了如何對實(shí)施例1所述的文庫A和B中生成的纖連蛋白單特異性 結(jié)合劑進(jìn)行篩選。利用同源重組法將文庫A和B均獨(dú)立亞克隆到酵母展示載體例如 pYDl (Invitrogen)中，并利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化到適宜菌株例如EBY100中。基本上按照Lipovsek，D.等(J MoI Biol. 2007 May 11 ；368 (4) :1024-41)之前 公開的方法，進(jìn)行些許微小改動(dòng)，呈遞和選擇針對雞蛋溶菌酶的纖連蛋白基結(jié)合劑。獨(dú)立地 篩選兩個(gè)文庫，尋找雞蛋清溶菌酶的結(jié)合劑。(i)利用磁珠分選來選擇對雞蛋清溶菌酶的結(jié)合對于所有選擇，呈現(xiàn)基分子的文庫A或B的酵母培養(yǎng)物在含半乳糖的培養(yǎng)基 (90% SG-CAA/10% SD-CAA，50 μ g/mL 卡那霉素，100U/mL 青霉素 G，200U/mL 鏈霉素)中于 30°C誘導(dǎo)18小時(shí)。IO9誘導(dǎo)的文庫A或B的酵母細(xì)胞用25mL冰冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)， PH 7.4，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0. 5 %牛血清白蛋白(BSA)洗滌，然后在5mL含有1 μ M 生物素化雞蛋清溶菌酶(HEL-b，Sigma, St. Louis, MO)的相同緩沖液中室溫輕搖孵育1小 時(shí)。孵育后，樣品在冰上冷卻，用25mL冰冷PBS，pH 7. 4,2mM EDTA，0. 5% BSA洗滌，并重懸 于2. 5mL相同的緩沖液中。向酵母中添加100-μ L等份試樣的鏈霉親和素微磁珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，并在冰上孵育10分鐘。向樣品中添加冰冷PBS，pH 7. 4,2mM EDTA, 0. 5% BSA至總體積25mL，之后即刻在AutoMACS細(xì)胞分離器(Miltenyi Biotec)上利用 陽性篩選稀有細(xì)胞的預(yù)設(shè)程序(p0SSel_S)進(jìn)行分離。選擇的細(xì)胞收集在6mL SD-CAA，pH 4. 5，50 μ g/mL卡那霉素，100U/mL青霉素G，200U/mL鏈霉素中；通過系列稀釋接著涂在 SD-CAA瓊脂板上來定量；并在50mL相同培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)2天。(ii)利用熒光激活細(xì)胞分選來選擇對雞蛋清溶菌酶的結(jié)合后續(xù)多輪選擇通過FACS進(jìn)行，以2X IO6至3X IO6誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞開始。細(xì)胞用 ImL PBS，pH 7. 4，0. 1 % BSA洗滌，重懸于100 μ L含有生物素化雞蛋清溶菌酶的相同緩沖液 中，并在室溫輕搖孵育1小時(shí)。在用ImL冰冷PBS，pH 7. 4,0. 1% BSA洗滌之后，細(xì)胞用抗體和鏈霉親和素標(biāo)記。 利用FITC綴合的小鼠單克隆抗c-myc抗體(AbD Serotec)來標(biāo)記表面展示c-myc標(biāo)記的抗 體模擬物的酵母，并利用PE標(biāo)記的鏈霉親和素(Invitrogen)或抗生物素抗體(Miltenyi) 來標(biāo)記與結(jié)合溶菌酶的抗體模擬物相連的HEL-b。對用FITC綴合的小鼠抗c-myc抗體和 PE綴合的鏈霉親和素(Invitrogen)標(biāo)記的酵母細(xì)胞進(jìn)行FACS分選。雙標(biāo)記的酵母細(xì)胞在Dako MoFlo高速細(xì)胞分選儀上以488nm激發(fā)光、 6000-10, 000細(xì)胞/秒進(jìn)行分選。調(diào)整門控，以收集具有最高的0. 1-1%的HEL-b-相關(guān)信 號(hào)(PE)并處于表達(dá)相關(guān)信號(hào)(FITC)的前半部內(nèi)的酵母細(xì)胞。通過使用相同抗體和鏈霉親 和素試劑但在無HEL-b的情況下標(biāo)記的樣品副本，以避免選擇結(jié)合檢測試劑而非溶菌酶的 細(xì)胞。對于所有文庫，頭兩輪FACS分選在用1 μ M HEL-b標(biāo)記的酵母上進(jìn)行。一旦在存 在而非不存在HEL-b時(shí)觀察到用PE標(biāo)記的細(xì)胞群，則HEL-b的濃度在后續(xù)輪中降低一個(gè)數(shù) 量級(jí)。選擇的細(xì)胞收集在0. 5mL SD-CAA, pH 4. 5，50 μ g/mL卡那霉素，100U/mL青霉素G， 200U/mL鏈霉素中。收集的細(xì)胞在5mL相同的培養(yǎng)基中于30°C震蕩培養(yǎng)2天至飽和，之后 誘導(dǎo)并標(biāo)記以進(jìn)行下一輪分選。經(jīng)數(shù)輪FACS分選之后，將最終的富集群涂布在SDCAA板上，并于30°C孵育2天。 利用Genetix Clonepix挑取單菌落，并重新列陣到含SD-CAA培養(yǎng)基的96孔板中。經(jīng)M 小時(shí)孵育之后，通過離心收集細(xì)胞，并重懸于SD-GAA培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)表面表達(dá)的獨(dú)特而3 分子。陽性克隆通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA鑒定。純化對應(yīng)于獨(dú)特而3陽性克隆的質(zhì)粒DNA，并測序以 鑒定單特異性結(jié)合劑。一旦從文庫A或B中鑒定并選擇到單特異性結(jié)合劑，則可獨(dú)立地利用其生成治療 性分子。尤其是，由文庫B生成的利用而3分子底環(huán)的單特異性結(jié)合劑，可用來生成針對目 的靶標(biāo)的新治療性結(jié)合分子。來自文庫B的多個(gè)單特異性結(jié)合劑可用接頭組合以產(chǎn)生能夠 與單個(gè)靶標(biāo)(例如TNF)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域結(jié)合的而3結(jié)合分子?？蛇x地，來自文庫B的包 含而3結(jié)合分子的結(jié)合劑還可設(shè)計(jì)成與多個(gè)靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(例如HAS和TNF的一 個(gè)或多個(gè)區(qū)域)結(jié)合。另外，從文庫A和文庫B生成的單特異性結(jié)合劑可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)組合， 以如下文實(shí)施例3所述生成雙特異性和多特異性結(jié)合劑。實(shí)施例3牛成雙Iil能I千連蛋白基結(jié)合分子在人而3的X-射線結(jié)構(gòu)上計(jì)算建模所述隨機(jī)化區(qū)域，表明通過組合文庫A和B各 自的單特異性結(jié)合劑能夠創(chuàng)建雙特異性纖連蛋白結(jié)合分子。這些結(jié)合分子可工程化，從而 它們識(shí)別相同靶分子上不同的區(qū)域，或者雙特異性或多特異性纖連蛋白分子的不同結(jié)合位點(diǎn)能夠與兩個(gè)或更多個(gè)不同靶標(biāo)上的不同區(qū)域結(jié)合。例如，對應(yīng)于結(jié)合劑A (通過篩選文庫A獲得)的適宜序列和對應(yīng)于結(jié)合劑A (通 過篩選文庫B獲得)的適宜序列可組合成為單個(gè)分子以生成雙特異性分子。通過篩選文庫A (具有接觸溶劑的頂環(huán)BC、DE和TO的β-夾層結(jié)構(gòu))鑒定的結(jié)合 劑Α。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWXXXXXXXRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPXXXXTATISGLKPGVDYT ITVYAVTXXXXXXXXXXPISINYRTEI(SEQ ID NO 4)其中X是任意氨基酸序列。通過篩選文庫B (具有接觸溶劑的底環(huán)ΑΒ、⑶、EF和C-末端的β -夾層結(jié)構(gòu))鑒 定的結(jié)合劑B。VSDVPRDLEVVAATZZSLLISWDAPAVTVRYYRITYGZZZZZZZVQEFTVPGSKSTATIZZZZZGZDYT ITVYAVTGRGDSPASSKPISINYZTZZ(SEQ ID NO 5)其中Z是任意氨基酸序列。通過組合篩選文庫A (具有接觸溶劑的頂環(huán)BC、DE和TO的β -夾層結(jié)構(gòu))和B (具 有接觸溶劑的底環(huán)AB、CD、EF和C-末端的β -夾層結(jié)構(gòu))所獲得的序列而鑒定的結(jié)合劑 C。將兩個(gè)序列合并成一個(gè)分子得到雙特異性結(jié)合劑C。VSDVPRDLEVVAATZZSLLISWXXXXXXXRYYRITYGZZZZZZZVQEFTVPXXXXTATIZZZZZGZDYT ITVYAVTXXXXXXXXXXPISINYZTZZ(SEQ ID NO 6)其中X和Z是任意氨基酸序列。然后在德國Geneart AG公司合成并優(yōu)化對應(yīng)于結(jié)合劑C的組合氨基酸序列的DNA 以在大腸桿菌中表達(dá)?？寺〉酱竽c桿菌中和隨后的純化遵循第4章(制備方法)所列的標(biāo) 準(zhǔn)方案?？蛇x地，雙功能而3基結(jié)合分子可通過將兩個(gè)或更多個(gè)單特異性而3基結(jié)合分子 連接起來而生成。實(shí)施例4^Mmmi&M^mmmmmmm^^^重復(fù)實(shí)施例2所述的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)以生成利用纖連蛋白底環(huán)結(jié)合半衰期延長劑HSA的 單特異性而3基結(jié)合分子。使用另外的文庫生成利用底環(huán)結(jié)合溶菌酶的單特異性而3基結(jié) 合分子。(a)從酵母中分離富集庫經(jīng)數(shù)輪選擇后，測定所選群的序列。利用Zymopr印試劑盒(Zymo Research, Orange, CA)從各選擇的酵母群的ImL飽和培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA，并將2 μ L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到電 感受態(tài)iTop 10大腸桿菌(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。對96個(gè)克隆進(jìn)行了質(zhì)粒小量制 備物制備和序列分析。(b)亞克隆到大腸桿菌中編碼富集的纖連蛋白庫的基因克隆到圖6所示的pNAT40載體中，并將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化 到電感受態(tài)Acella大腸桿菌菌株(Gaithersburg，MD)中。選擇和測序了許多克隆。所選 的潛在而3基HSA結(jié)合劑克隆的氨基酸序列，連同共有結(jié)合序列(SEQ ID NO 42)示于圖7。 圖8顯示了所選的潛在而3基溶菌酶結(jié)合劑克隆的氨基酸序列。
選擇HSA文庫的個(gè)體克隆，通過菌落挑取器(colony picker) (Genetix Clonepix2, Boston,ΜΑ)用于接種96深孔板中含100 μ g/ml卡那霉素的Iml過夜表達(dá)培養(yǎng) 基(OvernightExpress media，Novagen，Gibbstown，NJ)，并于 37°C劇烈震蕩培養(yǎng)過夜。第 二天通過3000rpm離心15分鐘收獲細(xì)胞沉淀，棄掉上清液。深孔板在_80°C冷凍兩次各30 分鐘，并在室溫融化。隨后，添加含TBS、具有0. 2mg/ml溶菌酶和ImM EDTA的250 μ 1裂解 緩沖液，板在室溫孵育1小時(shí)，接著添加含0. lmg/ml DNaselUOmM MgCl2的250 μ 1 TBS，在 室溫孵育另外1小時(shí)。裂解的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到96 孔Multiscreen HTS(Millipore，Billerica，MA)上，通 過離心使上清液澄清。澄清的含有潛在而3基HSA結(jié)合劑的上清液隨后用來進(jìn)行ELISA試 驗(yàn)，如下文實(shí)施例5所述。實(shí)施例5鰣鼎賄齢該實(shí)施例首次舉例說明了能夠通過修飾而3的至少一個(gè)底環(huán)(例如環(huán)AB、⑶和/ 或EF)而，成功產(chǎn)生利用所述底環(huán)結(jié)合靶標(biāo)的而3基分子，而生成而3基結(jié)合分子。在該實(shí) 施例中，研究了潛在的基于而3的HSA結(jié)合劑。為評價(jià)結(jié)合特征，使用了 ELISA試驗(yàn)。預(yù)處理ELISA板(Nunc Maxisorb)的每個(gè)孔 用100 μ 1 1. 0 μ g/mL HSA的PBS溶液包被，蓋上塑料膜，并在4°C孵育過夜。第二天除去包 被液，板用PBS洗滌兩次。每孔通過添加200yL 25mg/ml酪蛋白/PBS來封閉孔，并在潮濕 密閉容器中于37°C孵育1小時(shí)。在除去封閉液并用PBS洗滌兩次之后，添加50 μ 1事先制 備的表達(dá)潛在單特異性結(jié)合劑的大腸桿菌裂解物，并震動(dòng)孵育1小時(shí)。隨后板用PBS/Tween 20(0. 05% )緩沖液洗滌5次，接著添加于0. 25%酪蛋白/PBS中稀釋的HRP綴合的抗His 標(biāo)簽抗體(Abeam, Cambridge, ΜΑ)制品，每孔50 μ L。孵育1小時(shí)之后，除去His標(biāo)簽抗體 溶液，且板用PBS/Tween 20(0. 05% )洗滌5次。最后ELISA通過添加底物溶液(SureBlue TMB微孔底物溶液，KPL)顯色，每孔50 μ L。選擇陽性克隆，隨后進(jìn)行表達(dá)篩選以鑒定候選 物用于大規(guī)模生產(chǎn)。圖9顯示了來自所選克隆的His標(biāo)記的纖連蛋白的人血清白蛋白特異性ELISA分 析的代表性非限制性實(shí)例。向ELISA板的孔中添加可溶性纖連蛋白!^10結(jié)構(gòu)域的粗裂解 物，所述ELISA板用HSA抗原包被，且另外用PBS+1%酪蛋白封閉。基于而3的HSA結(jié)合劑 的檢測利用單克隆HRP綴合的抗His抗體進(jìn)行。ELISA如上文所述通過TMB底物顯色。通 過ELISA讀數(shù)器測量450nm的OD值(Y軸)。每個(gè)柱代表一個(gè)個(gè)體克隆提取物。數(shù)據(jù)顯示， 許多克隆為陽性1^3基HSA結(jié)合劑，展示出比背景高約3倍的結(jié)合。該結(jié)果首次證明纖連 蛋白分子的底環(huán)可用來結(jié)合靶標(biāo)例如HSA。為純化表達(dá)的單特異性而3基HSA結(jié)合劑，將澄清的裂解液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板 中，并添力口 20 μ L 50% (ν/ν)荷載 Ni2+ 的 MagneHis 珠漿(Promega)。利用 KingFisher 機(jī) 器人(Thermo Scientific)進(jìn)行自動(dòng)純化。在30分鐘孵育后，珠子以Iml洗滌緩沖液/ 孔(50mM磷酸鹽，IM NaCl，20mM咪唑，pH 7.6)洗滌兩次。最后結(jié)合的纖連蛋白用200 μ 1 PBS+300mM咪唑pH 7. 6洗脫。等分試樣的粗提取物和洗脫物通過SDS凝膠電泳分析(數(shù)據(jù) 未顯不)ο為進(jìn)一步證明底部而3基HSA結(jié)合劑能夠成功地表達(dá)，在大腸桿菌中進(jìn)行小規(guī)?？傮w表達(dá)實(shí)驗(yàn)。來自M個(gè)構(gòu)建體的總體表達(dá)的樣品在沈孔似￥61 BisTris 4-2% NuPAGE 凝膠(Invitrogen)上進(jìn)行分析。泳道1含有分子量大小標(biāo)準(zhǔn)keBlue plus2 (Invitrogen)。 結(jié)果顯示了具有修飾底環(huán)的纖連蛋白分子在大腸桿菌中的成功表達(dá)。在絕大多數(shù)所選的克 隆中出現(xiàn)約16kDa(對應(yīng)于纖連蛋白 ^η10( ll_12kDa)加上N-末端His標(biāo)簽、S標(biāo)簽和 prescission切割位點(diǎn))的蛋白質(zhì)條帶，如圖10所示。這些結(jié)果進(jìn)一步證明所述單特異性 Fn3基結(jié)合分子能夠成功在大腸桿菌中表達(dá)并保留結(jié)合活性。為證明表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠純化而對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無不利影響(例如降解)，如上文 所述純化樣品，并在沈孔Novex BisTris 4-2% NuPAGE凝膠(Invitrogen)上進(jìn)行分析。 泳道1含有分子量大小標(biāo)準(zhǔn)Mark 12 (Invitrogen)。在大多數(shù)克隆中清晰地出現(xiàn)了 16kDa 的條帶，如圖10所示。質(zhì)譜分析證實(shí)了正確分子量處存在純化了的纖連蛋白，如表1所示。表1 基于而3的纖連蛋白結(jié)合分子的質(zhì)譜分析
權(quán)利要求
1.包含而3結(jié)構(gòu)域的基于III型纖連蛋白0^3)的結(jié)合分子，其中與包含SEQID NO: 1的野生型而3結(jié)構(gòu)域相比，該而3結(jié)構(gòu)域的底部AB、⑶、EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè) 中的至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與特定靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列。
2.權(quán)利要求1的而3基結(jié)合分子，其中所述至少一個(gè)氨基酸殘基選自下組SEQID NO 1 第 15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95 和 96 位的氨基酸。
3.權(quán)利要求1或2的而3基結(jié)合分子，其中非而3結(jié)合序列包含抗體或T細(xì)胞受體的 互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻的全部或部分。
4.權(quán)利要求1的而3基結(jié)合分子，其中特定靶標(biāo)是半衰期延長劑。
5.權(quán)利要求4的而3基結(jié)合分子，其中半衰期延長劑是人血清白蛋白。
6.權(quán)利要求1的而3基結(jié)合分子，其中特定靶標(biāo)是溶菌酶。
7.包含第一而3結(jié)構(gòu)域的而3基結(jié)合分子，其中與包含SEQID N0:1的野生型而3結(jié) 構(gòu)域相比，該而3結(jié)構(gòu)域底部AB、⑶、或EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè)中的至少一個(gè)氨基 酸被改變，以產(chǎn)生與第一靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列，且其中與包含SEQ ID NO :1的野生型 Fn3結(jié)構(gòu)域相比，第二而3結(jié)構(gòu)域的底部AB、⑶、或EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè)中的至 少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列。
8.權(quán)利要求7的而3基結(jié)合分子，其中所述第一和第二靶標(biāo)存在于同一分子上。
9.權(quán)利要求7的而3基結(jié)合分子，其中所述第一和第二靶標(biāo)存在于不同的分子上。
10.包含第一而3結(jié)構(gòu)域的而3基結(jié)合分子，其中與包含SEQID N0:1的野生型而3 結(jié)構(gòu)域相比，該而3結(jié)構(gòu)域的底部AB、⑶、或EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè)中的至少一個(gè) 氨基酸被改變，以產(chǎn)生與半衰期延長劑結(jié)合的非而3結(jié)合序列，且其中與包含SEQ ID NO 1 的野生型而3結(jié)構(gòu)域相比，第二而3結(jié)構(gòu)域的底部AB、⑶、或EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多 個(gè)中的至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列。
11.權(quán)利要求10的而3基結(jié)合分子，其中半衰期延長劑是人血清白蛋白。
12.權(quán)利要求10的而3基結(jié)合分子，其中第二靶標(biāo)是VEGFR2。
13.包含而3結(jié)構(gòu)域的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中與包含SEQID NO :1的野生型 Fn3結(jié)構(gòu)域相比，該而3結(jié)構(gòu)域的底部AB、⑶、或EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè)中的至少 一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第一靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列，且其中與包含SEQ ID NO 1 的野生型而3結(jié)構(gòu)域相比，該而3結(jié)構(gòu)域的頂部BC、DE或TO環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè)中的至少一 個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列。
14.權(quán)利要求13的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中所述底部AB、CD或EF環(huán)區(qū)中的至 少一個(gè)氨基酸選自下組:SEQ ID NO 1 第 15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、 64、93、95和96位的氨基酸，且其中所述頂部BC、DE或TO環(huán)區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸選自下 組=SEQ ID NO 1 第 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、51、52、53、54、55、56、76、77、78、79、 80、80、81、82、83、84、85、86、87 和 88 位的氨基酸。
15.權(quán)利要求13或14的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中非而3結(jié)合序列包含抗體或T 細(xì)胞受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的全部或部分。
16.權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中所述第一和第二靶標(biāo) 存在于同一分子上。
17.權(quán)利要求13至14的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中所述第一和第二靶標(biāo)存在于不同的分子上。
18.包含而3結(jié)構(gòu)域的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中與包含SEQID NO :1的野生型 Fn3結(jié)構(gòu)域相比，該Fn3結(jié)構(gòu)域的底部AB、⑶、或EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多個(gè)中的至少 一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與半衰期延長劑結(jié)合的非而3結(jié)合序列，且其中與包含SEQ ID NO 1的野生型而3結(jié)構(gòu)域相比，該而3結(jié)構(gòu)域的頂部BC、DE或TO環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè)中的 至少一個(gè)氨基酸被改變，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列。
19.權(quán)利要求18的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中半衰期延長劑是人血清白蛋白。
20.權(quán)利要求18的雙特異性而3基結(jié)合分子，其中第二靶標(biāo)是VEGFR2。
21.多特異性而3基結(jié)合分子，包含兩個(gè)或更多個(gè)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合 分子。
22.權(quán)利要求21的多特異性而3基結(jié)合分子，其中每一個(gè)所述而3基結(jié)合分子與不同 的靶標(biāo)結(jié)合。
23.權(quán)利要求22的多特異性而3基結(jié)合分子，其中所述不同的靶標(biāo)存在于同一分子上。
24.權(quán)利要求22的多特異性而3基結(jié)合分子，其中所述不同的靶標(biāo)存在于不同的分子上。
25.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子，其與增加該而3基結(jié)合分子半衰期的非 Fn3部分結(jié)合。
26.包含兩個(gè)或更多個(gè)單特異性而3基結(jié)合分子的多特異性而3基結(jié)合分子，其中至 少一個(gè)單特異性而3基結(jié)合分子在而3結(jié)構(gòu)域的底部AB、CD、EF環(huán)區(qū)或C-末端之一個(gè)或多 個(gè)中包含與含SEQ ID NO 1的野生型而3結(jié)構(gòu)域相比改變了的至少一個(gè)氨基酸，以產(chǎn)生與 第一靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列；且其中第二單特異性而3基結(jié)合分子在而3結(jié)構(gòu)域的頂 部BC、DE或TO環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè)中包含與含SEQ ID NO 1的野生型而3結(jié)構(gòu)域相比改變 了的至少一個(gè)氨基酸，以產(chǎn)生與第二靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序列，其中所述第一和第二單 特異性而3基結(jié)合分子通過接頭序列相連。
27.權(quán)利要求沈的多特異性而3基結(jié)合分子，還包含第三單特異性而3基結(jié)合分子， 其在而3結(jié)構(gòu)域的頂部BC、DE或TO環(huán)區(qū)之一個(gè)或多個(gè)中具有與含SEQ ID N0:1的野生型 Fn3結(jié)構(gòu)域相比改變了的至少一個(gè)氨基酸，以產(chǎn)生與一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的非而3結(jié)合序 列，且其中第二和第三單特異性而3基結(jié)合分子通過接頭序列相連。
28.權(quán)利要求沈的多特異性而3基結(jié)合分子，其中第一靶標(biāo)是半衰期延長劑。
29.權(quán)利要求觀的多特異性而3基結(jié)合分子，其中半衰期延長劑是人血清白蛋白。
30.權(quán)利要求沈的多特異性而3基結(jié)合分子，其中第二靶標(biāo)是VEGFR2。
31.權(quán)利要求沈的多特異性而3基結(jié)合分子，其中接頭序列是G-S接頭序列。
32.而3基結(jié)合分子，包含SEQID NO :119 (克隆87)。
33.而3基結(jié)合分子，包含SEQID NO 120 (克隆89)。
34.綴合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)非而3部分連接的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié) 合分子。
35.權(quán)利要求34的綴合物，其中非而3部分包含或結(jié)合增加而3基結(jié)合分子半衰期的 分子。
36.權(quán)利要求34-35中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子或綴合物，其中非而3部分包含選自下組的分子抗體Fc區(qū)、人血清白蛋白(HSA)和聚乙二醇(PEG)。
37.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子或綴合物，其還包含與含SEQID N0:1的 野生型而3結(jié)構(gòu)域相比至少一個(gè)修飾的氨基酸殘基，用來連接功能部分。
38.權(quán)利要求37的而3基結(jié)合分子或綴合物，其中修飾的氨基酸殘基包括半胱氨酸殘 基或非天然氨基酸殘基的添加或取代。
39.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子或綴合物，其包含來自兩個(gè)或更多個(gè)不 同而3結(jié)構(gòu)域的β鏈。
40.組合物，包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子或綴合物以及載體。
41.治療受試者的疾病的方法，所述疾病選自下組自身免疫病、癌癥和感染性疾病， 所述方法包括向受試者施用前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子、綴合物或組合物。
42.檢測樣品中的蛋白質(zhì)的方法，包括標(biāo)記前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子 或綴合物，使標(biāo)記的結(jié)合分子或綴合物與樣品接觸，并檢測而3基結(jié)合分子或綴合物和蛋 白質(zhì)之間的復(fù)合物形成。
43.多樣化核酸文庫，其編碼權(quán)利要求1、7、10、18、21和沈中任一項(xiàng)的而3基結(jié)合分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了與特定靶抗原結(jié)合的基于III型纖連蛋白(Fn3)的結(jié)合分子。本發(fā)明還提供了與兩個(gè)或更多個(gè)靶標(biāo)同時(shí)結(jié)合的雙特異性Fn3基結(jié)合分子。本發(fā)明Fn3基結(jié)合分子還可連接在一起形成多特異性Fn3基結(jié)合分子，和/或可與非Fn3部分例如人血清白蛋白(HSA)綴合，以改進(jìn)半衰期和穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了Fn3基結(jié)合分子的產(chǎn)生、篩選以及應(yīng)用于多種治療及診斷應(yīng)用中的方法。
文檔編號(hào)C07K14/78GK102076713SQ200980125313
公開日2011年5月25日 申請日期2009年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月2日
發(fā)明者A·洛, J·海斯特維爾 申請人:諾瓦提斯公司