專利名稱：用于診斷表達her2受體或其截短形式的癌癥的方法
用于診斷表達HER2受體或其截短形式的癌癥的方法本發(fā)明涉及從分離的樣本中診斷表達HER2受體癌癥的方法。本發(fā)明還提供用于癌癥的早期診斷和鑒定以及治療的化合物。
背景技術(shù)：
HER2(又稱c-erbB2、ErbB2或Neu)為I型跨膜蛋白，屬于表皮生長因子受體或 EGFR家族，也稱為HERl或ErbBl。該家族還包括其它兩個成員HER3和HER4。當HER1、HER3 或HER4與EGF-型配體結(jié)合時，其胞外功能域(domain)呈現(xiàn)“開放式”的構(gòu)型，形成同源二聚體和異源二聚體。由于它的胞外功能域為“開放式”構(gòu)型，即使它不與任何配體結(jié)合，HER2 也會與其它與配體相連的HER受體發(fā)生相互作用。由胞外功能域引起的二聚體的形成導致了胞內(nèi)HER受體激酶發(fā)生相互作用，隨后一些酪氨酸殘基發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸作用。這些磷酸酪氨酸，作為一組胞內(nèi)磷酸酪氨酸-結(jié)合蛋白耦合器(couplers)。細胞質(zhì)膜中發(fā)生的相互作用通過不同的信號轉(zhuǎn)導途徑傳至細胞核中， 例如由分裂素活化蛋白激酶(MAPK)激活的蛋白激酶途徑，由應力、磷脂酶C-γ激活的蛋白激酶途徑(JNK)等。所有這些信號回路控制著基因表達，以協(xié)調(diào)的方式進行修飾，發(fā)揮作用以決定細胞的狀態(tài)，例如細胞增殖、遷移、存活和粘附。因此，根據(jù)細胞背景，HER受體的激活導致明顯的細胞應答，使細胞轉(zhuǎn)化為介于癌細胞至早衰細胞之間的細胞。除了經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導模式，HER受體或其片段可以形成細胞內(nèi)含物并被轉(zhuǎn)運至細胞核，在細胞核中它們可直接調(diào)控特定基因的表達。已觀測到HER2的這一特殊情形(Wang 等.，"Binding at and transactivation of the C0X-2promoter by nuclear tyrosine kinase receptor ErbB-2”，Cancer Cell-2004, Vol. 6，pp. 251-26)，以及 C 端片段(CTF) 的該情形，其由HER4受體截短形式組成，包括整個細胞質(zhì)部分(Linggi等.，“ErbB-4 s80 intracellular domain abrogates ET02-dependent transcriptional repression", T. Biological Chemistry-2006, Vol. 281, pp. 25373-25380)。在人乳腺癌中，已發(fā)現(xiàn)了一系列C端片段或CTFs，推測其含有HER2的跨膜域和細 lfiM_。 (Molina ·，“NH(2)—terminal truncatedHER2 protein but not full-length receptor is associated with nodal metastasis in human breast cancer", Clinical Cancer Research-2002, Vol. 8, pp. 347-353)。還已知患有表達 HER2CTFs 乳腺癌的病人或患有表達相同截短形式(其不含HER2(HER2CTFs)的N-末端)乳腺癌的病人，比那些患有主要表達HER2完整形式的乳腺癌病人發(fā)展為癌癥轉(zhuǎn)移的可能性更大(Molina等 2002-supra)且予頁后更差(Saez等，“p95HER2 predicts worse outcome in patients with HER2-positive breast cancer，，,Clinical Cancer Research_2006，Vol. 12，pp. 424-431)。因此，及時檢測腫瘤中HER2的存在是十分重要的，更重要的是檢測它為完整形式還是截短(CTF)形式。當今，常規(guī)臨床試驗的層面上，使用抗體檢測HER2完整形式的存在，以便確定有問題的乳腺腫瘤的類型。如果要檢測HER2存的在，推薦的療法是施用治療性單克隆抗體， 如Genentech公司的曲妥單抗(trastuzumab)。該單克隆抗體用于治療癌癥的用途描述于W08906692中，Genentech公司所有。W08906692中描述了單克隆或多克隆抗體定向作用于HER2的胞外區(qū)，該胞外區(qū)與蛋白完整的外部區(qū)域相匹配，為它的N-末端。如前面所述， W08906692中提及的被抗體識別的抗原表位是HER2完整形式的胞外功能域的抗原部位，不包含截短形式或HER2的C端片段。因此，W08906692中描述的抗體和診斷方法不能檢測到截短的HER2的存在。此外，在所述HER2的CTFs表達的乳腺腫瘤中，抗體如曲妥單抗不是治療性的，因為它們不識別任何抗原表位。這一事實解釋了用曲妥單抗治療表達HER2截短形式(CTFs)的患者具有耐藥性。為防止出現(xiàn)Mez等2006 (supra)觀察到的較差的預后數(shù)量，應該采用選擇性療法治療表達HER2截短形式或CTFs的患者。為盡快檢測(診斷)和治療表達HER2截短形式腫瘤的患者，區(qū)分HER2的表達形式是非常有意義的。以便后續(xù)治療。Anido ^ "Biosynthesi s of tumorigenic HER2C-terminal fragments by alternative initiation of translation", European Molecular BioIory Organization (EMBO) Tournal-2006, Vol. 25, pp. 3234-3244，文獻中描述了除了由 α -分泌酶作用于HER2產(chǎn)生的片段之外，其產(chǎn)生截短形式(CTF)的Ρ95，Ρ95含有受體的跨膜片段和細胞質(zhì)片段，通過選擇性地從位于上游和下游的兩個甲硫氨酸起始翻譯的機制，還分別產(chǎn)生兩種HER2跨膜功能域的截短形式(CTF)。具體地，美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI) 的UniGene數(shù)據(jù)庫中登錄號為Ml 1730. 1的氨基酸序列，是選擇性地從611位和687位上的甲硫氨酸起始翻譯得到的。該文獻中還指出這些HER2受體(CTFs)的可選擇形式存在于乳腺腫瘤中。特別地，它指出大量存在的形式為CTF687，或者換言之，從687位上的甲硫氨酸起始翻譯獲得的蛋白。Anido等，提出將HER2的酪氨酸激酶活性抑制劑，例如拉帕替尼 (Iapatinib)用于治療以使表達這些HER2截短形式腫瘤的生長降至最低。酪氨酸激酶抑制劑通過與HER2受體的C-末端相互作用而發(fā)揮功效，所述HER2受體是以受體的完整形式和由其衍生的或通過選擇性起始翻譯產(chǎn)生的CTFs形式存在的。Scaltriti 等的文獻"Expression of p95HER2, a truncated form of the HER2 Receptor, and response to anti_HER2 therapies in breast cancer，，，Journal of National Cancer Institute-2007, Vol. 99, pp. 628-368” 中描述了用于檢測 HER2 受體截短形式中的一種存在的選擇性方法學研究實例，并列出一些用曲妥單抗(赫賽汀， Herceptin)治療產(chǎn)生耐藥性的可能原因。特別地，它強調(diào)不具有曲妥單抗識別的胞外功能域的P95HER2片段(HER2經(jīng)α -分泌酶蛋白水解后的產(chǎn)物)和其它該受體截短形式的沉積。 kaltriti提出了一種檢測p95HER2片段(經(jīng)α -分泌酶蛋白水解后的產(chǎn)物)的免疫熒光法。該新的檢測方法可在包埋于石蠟中的組織切片上進行，并按照臨床操作用福爾馬林固定。該新的方法學源自觀測到P95HER2截短形式，而非受體的完整形式，位于細胞的細胞質(zhì)膜和細胞質(zhì)中。這種方法提出通過用結(jié)合受體的細胞質(zhì)功能域的抗-HER2抗體對待測細胞質(zhì)進行染色，比較是否有P95HER2表達；并用抗-細胞角蛋白抗體檢測結(jié)果驗證這些結(jié)果， 該蛋白分布廣泛被用作診斷腫瘤的工具。然而，尚不清楚這種方法是否能夠有效地將那些表達HER2完整形式的腫瘤和表達截短形式的腫瘤區(qū)分開來。有必要尋找新的和有效的用于診斷和治療靶標，與問題癌癥的類型準確相關(guān)，以便能夠及時采取有效的治療方法治療那些預后最差的腫瘤，摒棄那些從一開始就沒有效果的療法。
本發(fā)明提供解決上述問題的方法以及對癌癥，特別是乳腺癌進行早期分類的新方法。發(fā)明概述已經(jīng)確定，一種由選擇性起始翻譯產(chǎn)生的HER2截短形式(CTF)的存在，與治療的癌癥類型的預測非常相關(guān)，這使醫(yī)師在治療過程中開處方變得容易。這種HER2截短形式 (CTF-611)已被測定具有SEQID NO 1的序列。該序列已被用于開發(fā)多種工具，以檢測組織樣本中HER2截短形式的存在，從而提供一種新的、可靠的診斷裝置，也可用于臨床診斷。本發(fā)明還提供識別HER2截短形式或CTF (其不能被曲妥單抗識別)的新抗體或其片段。這些抗體識別由SEQ ID NO :2包含的序列限定的抗原表位。本發(fā)明還提供適合用于產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤細胞系。目前可獲得的抗-HER2抗體識別CTFs和HER2或僅HER2，這使得難以將表達HER2和CTFs的患者與僅表達HER2的患者區(qū)分開來。與可獲得的抗-HER2 抗體相比，本發(fā)明抗體優(yōu)先結(jié)合CTF-611，從而能鑒定出表達這種CTF的患者。本發(fā)明還涉及患者樣本的癌癥診斷方法，其包括檢測所述患者樣本中由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式的存在。本發(fā)明還提供所述抗體或其片段在分離的樣本中診斷和預后檢測表達HER2受體的樣本中的應用。本發(fā)明進一步提供用于從分離的樣本中診斷和預后檢測表達HER2受體和/或 C-端片段的癌癥的試劑，其包括至少一種上述抗體或其片段。本發(fā)明還提供用于從分離的樣本中診斷和預后檢測表達HER2受體的癌癥的試劑盒，其包括用于檢測所述樣本中由SEQ ID N0:1組成的HER2受體截短形式存在的裝置。本發(fā)明還提供上述抗體或其片段在治療或制藥中的應用。特別地，該藥物用于治療或預防至少由SEQ ID NO 1組成的表達HER2受體截短形式的癌癥。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述的抗體或其片段用于制備治療或預防哺乳動物，包括人乳腺癌的藥物。本發(fā)明的另一目的是提供用于治療至少表達由SEQ ID NO :1組成的HER2受體截短形式的癌癥的藥物組合物，其含有上述抗體或其片段和至少一種藥用賦形劑和/或載體。


圖1 截短形式CTF-611的蛋白序列，與完整的HER2受體序列及截短形式 p95(648-CTF/p95)的序列對照圖，其為α -分泌酶蛋白水解的產(chǎn)物?？缒すδ苡虮硎韭菪€。其余分子以灰框顯示。用于產(chǎn)生單抗或多抗的多肽序列以下劃線表示。分子內(nèi)二硫鍵的位置以半胱氨酸之間的連接標示。圖2 乳腺癌樣本的電泳及蛋白質(zhì)印跡(轉(zhuǎn)移到膜上)。⑶表示可溶部分，(M)為膜部分。為檢測完整的HER2和CTF-611形式，使用直接作用于該蛋白細胞質(zhì)功能域的抗體。 DHL:乳酸脫氫酶(用作對照)。圖3 表達CTF-611截短形式(圖3A)腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量與表達完整HER2受體的轉(zhuǎn)基因小鼠相比較的測定結(jié)果；以及檢測到的腫瘤體積結(jié)果。(圖3B)。在Y軸上，N和V分別代表腫瘤數(shù)量和腫瘤體積。在X軸上，T代表時間(周)。圖4 圖4A為識別HER2受體細胞質(zhì)功能域(在所有完整和截短形式中的功能域) 的抗體(CBll)或抗SEQ ID Ν0:3(α-611-Α和α-611-Β)的多肽產(chǎn)生的多克隆抗體的電泳和蛋白質(zhì)印跡(轉(zhuǎn)移到膜上)結(jié)果。表達HER2受體完整形式、CTF-611J截短形式及ρ95截短形式的NCF7細胞裂解提取物痕跡。圖4Β為抗體α-611-Α、α-611-Β及CBll作用于含有完整的HER2受體以及截短形式CTF-611和ρ95的樣本的免疫沉淀試驗結(jié)果。圖5 (A)裂解表達HER2，611-CTF或648-CTF的MCF7細胞并用作用于HER2細胞質(zhì)功能域的抗體CBll或作用于多肽MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC(見圖1)產(chǎn)生的兩個單獨的單克隆抗-611-CTF抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。(B)表達HER2，611-CTF或648-CTF 的MCF7細胞裂解物以1 1 1混合，并用指出的單克隆抗體進行免疫沉淀。將洗滌后的沉淀物與CBll抗體進行Western雜交分析。作為陰性對照，不加抗體(_)進行免疫沉淀。 (C)在共聚焦顯微鏡中分析表達HER2，611-CTF或648-CTF的MCF7細胞與表明的抗體之間的間接免疫熒光反應。圖6㈧和⑶采用流式細胞術(shù)檢測到的一種單克隆抗體特征。圖7 采用免疫組織化學檢測到的單克隆抗體特征。圖8 抗原表位的特征。圖8 (A)圖表顯示了 611-CTF近膜區(qū)的一級序列及不同組成的序列用于抗原表位作圖。圖8(B)蛋白質(zhì)印跡。圖9 乳腺癌樣本分析。圖9(A)分析結(jié)果表格。圖9(B)免疫細胞化學染色。發(fā)明詳述CTF-611如前所述，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)所述SEQ ID NO 1的HER2截短形式的差別檢測結(jié)果與預后差的一般類型的乳腺組織癌癥具有較好的相關(guān)性。因此，圖3顯示了表達截短形式 CTF-611 (SEQ ID NO 1)腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量的測定結(jié)果。為了獲得圖3的結(jié)果，cDNA構(gòu)建體在小鼠的上皮組織中表達，所述cDNA構(gòu)建體編碼人SEQ ID NO :1 (CTF-611)，圖中為M611-CTF。該cDNA構(gòu)建體包括在鼠乳腺瘤病毒 (MMTV)啟動子的控制下的SEQID NO :1。作為對照，使用表達HER2完整形式的小鼠細胞 FVB/N-Tg(MMTVneu) 202J，其也是在MMTV啟動子的控制下。從圖3A中可知，小鼠中表達以 CTF-611形式(SEQ ID NO 1) cDNA構(gòu)建體的腫瘤數(shù)量遠高于FVB/N-Tg (MMTVneu) 202J細胞中的一個，圖中為HER2/neu。檢測17周齡的表達CTF-611的轉(zhuǎn)基因動物的腫瘤，其代表首次即拿出FVB/N-Tg (MMTVneu) 202J小鼠前3個月。這一事實表明表達HER2片段的腫瘤比那些表達完整形式的腫瘤侵襲力更強。圖3B還表明表達具有SEQ ID NO 1的HER2的CTF 截短形式的動物腫瘤體積比那些表達HER2/neU完整受體的動物腫瘤體積大得多。第二個事實還表明這種類型的腫瘤侵襲力更強。發(fā)明人還確定了那些表達序列SEQ ID N0:1截短形式的腫瘤比那些觀察到的表達HER2/neU的腫瘤具有更高的肺部轉(zhuǎn)移指數(shù)。下面實施例 9中提供的實驗進一步證明了臨床相關(guān)性。所有這些轉(zhuǎn)基因動物數(shù)據(jù)揭示了具有SEQ ID NO=I的HER2受體截短形式與該受體的完整形式之間的差別檢測是非常必要的。顯然，所述SEQ ID NO 1包括所有來自個體間的等位基因的突變體，其包括一些氨基酸數(shù)量和類型上的變化，例如大概2個或3個氨基酸，或一個氨基酸被另一個氨基酸替換，其不改變受體的整體結(jié)構(gòu)。這些HER2截短形式可包含新抗原表位，換言之，新的抗原決定簇不存在于完整受體中，表明它們與分子的相互作用方式與完整受體(抗體、藥物等)不同。CTF-611 抗體發(fā)明人能夠制備CTF-611的多克隆抗體及單克隆抗體。這些抗體識別由SEQ ID NO :2中包含的序列限定的抗原表位，優(yōu)選SEQ ID NO :3或其包含的序列定義的抗原表位。 更優(yōu)選識別MPIWKFPDEEGAS(SEQ. ID NO 5)或其包含的序列定義的抗原表位的抗體。在本發(fā)明中，抗原表位被理解為肽類高分子(或抗原)的一部分，其序列和/或空間構(gòu)型能被免疫系統(tǒng)識別(抗體、T細胞、B細胞)。優(yōu)選本發(fā)明抗體能夠?qū)EQ ID NO 1的蛋白和HER2受體區(qū)分開來。而且，優(yōu)選本發(fā)明抗體能夠?qū)EQ ID N0:1的蛋白和HER2受體截短形式648-CTF/p95區(qū)別開來?？赏ㄟ^免疫熒光、流式細胞術(shù)、培養(yǎng)細胞的免疫組織化學及患者樣本的免疫組織化學中的一種或多種將所述區(qū)別可視化。特別優(yōu)選用流式細胞術(shù)和免疫沉淀進行定量區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明，在免疫沉淀實驗中，優(yōu)選本發(fā)明的抗體結(jié)合611-CTF比它們結(jié)合 HER2高出至少300倍，更優(yōu)選至少1000倍，最優(yōu)選1000-2000倍，詳述于實施例3中(用5 微克32H2及5微克20F4)。如上所述，抗體可以是多克隆的或單克隆的。在本發(fā)明中，“多克隆抗體”應被理解為是指由不同的B細胞(B淋巴細胞)產(chǎn)生的一組抗體。多克隆抗體是針對某一抗原(高分子)由免疫球蛋白分泌的混合物，由于是由不同的B細胞產(chǎn)生，這些免疫球蛋白中的任何一種都能夠識別不同的抗原表位。因此，在包含于多克隆抗體的不同免疫球蛋白群體中，有一類免疫球蛋白，它識別特定抗原表位或特定抗原的目標表位。例如，多克隆抗體可以通過將SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQID NO :4 或 SEQ ID NO :5的多肽與免疫原如鎮(zhèn)眼帽貝血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin)共軛連接制備得到，并用該共軛物免疫大白兔。單克隆抗體可使用相同或相似的免疫原制備得到。雜交瘤細胞系的制備采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。然后，將雜交瘤細胞系培養(yǎng)于適合的培養(yǎng)基中，回收產(chǎn)生的單克隆抗體。在優(yōu)選的實施方式中，它們是由根據(jù)布達佩斯條約，在2008年4月9日保藏于“德國微生物菌種保藏中心-DSMZ”的保藏號(accessnumber)為DSM AC(^904的雜交瘤細胞系或由根據(jù)布達佩斯條約，在2008年11月6日保藏于“德國微生物菌種保藏中心-DSMZ”的保藏號為DSMACa980的雜交瘤細胞系制備得到的。特別優(yōu)選用這些雜交瘤細胞系制備得到的單克隆抗體以及至少具有同等功能的單克隆抗體。至少具有同等功能是指那些能夠同樣地或更好地區(qū)分CTF-611和HER2的抗體。適用的抗體還包括人源化(humanized)抗體和人源抗體(human antibodies)。因此，本發(fā)明還提供分離得到的SEQ ID N0. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 5的多肽。根據(jù)本發(fā)明可以使用抗體片段，而非完整抗體。所述抗體片段選自由F(ab)、 F(ab')和Fv組成的組。在本發(fā)明中，抗體片段指抗體的一部分，其具有足夠的長度和適合的結(jié)構(gòu)以結(jié)合存在于HER2受體截短形式中的抗原表位，從而實施樣品檢測。實施例2和3給出了具體的抗體。顯然，本發(fā)明還包括其它直接作用于SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3限定的CTF-611截短形式抗原表位的多克隆或單克隆抗體，因此，根據(jù)本發(fā)明的教導，它們可由本領(lǐng)域技術(shù)人員直接得出。同樣地，本發(fā)明包括所述抗體的片段， 例如F(ab)、F(ab，)、Fv等，或任何能夠產(chǎn)生可直接作用于SEQ ID NO. 2和SEQ IDN0. 3的多肽的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。診斷方法根據(jù)本發(fā)明的診斷方法，檢測HER2受體截短形式的存在可分別采用下述方法進行相對于所述HER2受體的完整形式而言，通過由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的 HER2受體截短形式的在流動相-固定相系統(tǒng)中的差速遷移進行檢測；以及通過與含有SEQ ID NO 1的HER2受體截短形式的特異性抗體結(jié)合進行檢測。在本發(fā)明中，通過差速遷移檢測應理解為在特定的流動相-固定相系統(tǒng)中基于不同待測化合物的流動性而進行分離的任何分析技術(shù)，例如電泳。這種不同的流動性可能由化合物所帶不同電荷、不同分子量或?qū)ζ渌衔锊煌挠H和力而導致。這種差別檢測可通過本領(lǐng)域已知的分析技術(shù)，例如電泳、分子排阻層析、抗體親和試驗、免疫熒光、免疫細胞化學、免疫組織化學、流式細胞術(shù)等來實施。特別優(yōu)選免疫組織化學?？蓪⒁环N或多種方法結(jié)合以增強可靠性。由SEQ ID NO 1組成的HER2受體截短形式，在本發(fā)明中也稱為CTF-611的差別檢測，就整體或完整HER2受體而言，能夠使圖1中的兩種不同分子量和不同序列的蛋白可視化。SEQ ID NO 1所示的截短形式由從HER2受體全序列的611位甲硫氨酸選擇性起始翻譯得到的蛋白組成。因此這種形式或CTF含有新的胞外功能域、跨膜片段及胞質(zhì)功能域。跨膜片段和胞質(zhì)功能域與HER2受體的完整形式相同。根據(jù)圖1的另一個截短形式為p95或 CTF-648。該形式為α-分泌酶作用于完整HER2受體的產(chǎn)物，其將胞外功能域的大部分分割開來。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，檢測樣本中由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式存在的步驟包括使用至少一種上述抗體進行檢測。在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的診斷方法包括檢測SEQ ID NO :3限定的抗原表位。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段被用作診斷及預后檢測的試劑，或者直接用它們各自的多肽序列標記(例如用放射性同位素)或間接地(例如通過添加或結(jié)合熒光試劑或在選擇反應培養(yǎng)基中通過反應能夠產(chǎn)生熒光的試劑)，上述目的均是為了產(chǎn)生可視信號，如有可能，進行定量，以檢測樣本中由SEQ ID Ν0:1組成的HER2受體截短形式的存在。以相同的方式，設(shè)計含有至少通過直接或間接與間隔臂相連的方法與固體支持物結(jié)合的抗體的診斷試劑，這種類型的試劑能夠俘獲樣本的SEQ ID NO :1序列的形式，隨后用其它非特異性抗體(例如CB11)檢測它的存在。本發(fā)明的診斷及預后檢測試劑還可用于免疫組織化學操作。為此目的，單克隆或多克隆抗體(一級或二級)需適當?shù)貥擞浺援a(chǎn)生可視信號，在定量的最佳情況下，一旦它們與測試組織相接觸，它們就能夠與待測靶蛋白，也就是SEQ ID NO 1序列的HER2的CTF片段發(fā)生作用。
為了便于醫(yī)師的分析、診斷及預后檢測，將診斷試劑設(shè)計成試劑盒形式，除抗體外，其包括反應試劑(例如用于免疫組織化學染色的試劑)、緩沖液及適合于檢測樣本中 SEQ ID NO :1的截短形式存在的檢測溶液，反映CTF-611不同表達水平的對照載片以及詳細的說明，協(xié)助醫(yī)師診斷評價。這種試劑盒還包括用于半定量免疫組織化學測定HER2的方法(例如Here印test )。因此，本發(fā)明提供用于診斷及預后檢測的試劑盒，除了本領(lǐng)域熟知的反應試劑及適合于抗體和抗原表位發(fā)生反應的緩沖液之外，其至少包括一種抗體或其片段，所述抗體或片段能識別由SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5定義的抗原表位。本發(fā)明的診斷方法及試劑盒能夠預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后差及抗Here印test 。相對于HER2受體的完整形式而言，本發(fā)明的另一種類型試劑盒包括通過由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式的差速遷移進行檢測的所有必要的裝置。在表達HER2受體或其截短形式的癌癥組中，乳腺癌最為突出。其它癌癥也表達這些蛋白，包括肺癌、胰腺癌、大腸癌、胃癌、前列腺癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮癌、陰道癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、喉癌、腹膜癌、鼻癌和喉癌、輸卵管癌、腎母細胞癌、淋巴癌，以及秋千肉瘤、滑膜肉瘤、髓母細胞瘤、滋養(yǎng)層細胞瘤、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、膽管癌、膽脂瘤、軟骨肉瘤、室管膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)瘤、橫紋肌肉瘤。因此，本發(fā)明的診斷方法尤其適用于診斷這些癌癥中的任何一種。除體外檢測CTFS，還可將抗體用于體內(nèi)成像。治療方法本發(fā)明的抗體或其片段還可用于治療，特別是癌癥治療，特別是那些表達HER2受體或其截短形式的癌癥。優(yōu)選人源化和人源抗體及其片段。本發(fā)明抗體還可用于治療至少表達由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成的 HER2受體截短形式癌癥的藥物組合物。該組合物含有藥用載體或賦形劑及至少一種識別由 SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3序列定義的抗原表位。該藥物組合物還包括抗體混合物，除本發(fā)明抗體外，含有其它作用于HER2或其片段的抗體，例如Herceptest ?；诒景l(fā)明附圖及示例性說明但不限于實施例，以下描述了診斷及預后檢測表達 HER2受體和/或其C端片段(截短形式)癌癥的方法；新的多肽及作用于所述多肽的特異性抗體；新的細胞株；檢測用診斷試劑及試劑盒，所有這些均為本發(fā)明目的。盡管沒有具體說明，本發(fā)明中使用的技術(shù)和科學術(shù)語為本領(lǐng)域熟知。相似或等同的方法及材料可用于本發(fā)明的實施。說明書及權(quán)利要求中“包括(comprise)”及該詞的變化形式，例如“包括(comprising)”不能排除其它技術(shù)特征、添加劑、組分或步驟?；谡f明書或?qū)嵤┍景l(fā)明，本發(fā)明的其它目的、好處及特征對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，以下例舉的實施例及附圖不用來限制本發(fā)明范圍。此外，應理解本發(fā)明包括所有上述優(yōu)選的及特殊組的組合。
實施例以下實施例描述了從分離的表達HER2受體和/或其截短形式的癌癥樣本中，檢測序列SEQ ID NO 1的截短形式存在的不同方法。
試驗步驟細胞將MCF7Tet_0ff細胞(BD生物科學)置于含有10% FBS(Gibco)、4mM L-谷酰胺(PAA Laboratories)、0· 2mg/ml G418 (Gibco)和 1 μ g/ml 強力霉素(Sigma)的 DMEM/ F-12(l 1) (Gibco)中，在 37°C，5% C02 的條件下保存。使用 FuGENE6 (Roche)，以各種表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。用0. lmg/ml的潮霉素B (Invitrogen)篩選含有基于整合質(zhì)粒pUHDlOlh 的單一穩(wěn)定克隆。通過去除強力霉素誘導編碼HER2和CTFs的cDNAs的pUHDlOlh表達。 首先用0. 5%胰蛋白酶-EDTA (GIBCO)分離細胞，通過離心洗3次，在培養(yǎng)皿中接種細胞IOh 后更換培養(yǎng)基。以作用于HER2細胞質(zhì)功能域的抗體通過免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測同源的各細胞株。挑選出兩株穩(wěn)定的細胞株用于試驗。蛋白質(zhì)印跡在改變的RIIPA 緩沖液 QOmM NaH2P04/Na0HpH7. 4,150mM NaCl, 1% Triton X-100，5mM EDTA, IOOmM PMSF, 25mM NaF, 16 μ g/ml 抑肽酶，10 μ g/ml 亮肽素和 1. 3mM Na3VO4)中將表達不同HER2亞型的細胞進行裂解，用DC蛋白檢測試劑(BIO-RAD)測定蛋白濃度。將樣本與含有5% β-巰基乙醇的加樣緩沖液(終濃度62mM Tris pH6. 8， 12%甘油，2. 5% SDS)混合，在99°C培養(yǎng)5min，然后進行SDS-PAGE，分離出15 μ g蛋白。蛋白質(zhì)印跡中的特殊信號用軟件ImageJ 1.38 (NIH)進行定量。免疫沉淀將細胞裂解物與不同的抗體在4°C培養(yǎng)lh。然后，用蛋白A純化免疫復合物。用裂解緩沖液洗滌免疫沉淀物3次，與加樣緩沖液混合并進行蛋白質(zhì)印跡分析。將接種于蓋玻片的用于免疫熒光顯微觀察的細胞用PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定20min并用0. 2% Triton X-100通透化處理lOmin。用含有1 % BSA、0. 1 %皂甙和 0. 02% NaN3 的 PBS 進行封閉(blocking)和抗體結(jié)合，用帶 DAPI 的 Vectashield(Vector laboratories)流式細胞術(shù)在4°C用PBS洗滌表達HER2、611-CTF或648-的MCF7細胞并在含5mM EDTA的PBS中分離。將分離的細胞與10 μ g/ml抗-32H2單克隆抗體在含5% BSA的PBS 中培養(yǎng)30min，于4°C洗滌并于4°C用FITC-共軛的抗鼠IgG(Becton-Dickinson)在含5% BSA的PBS中染色30min，在FACscan上進行流式細胞術(shù)，使用FACscan研究軟件(Becton Dickinson Immunocytometry Sys. , Mountain View, CA)。免疫組織化學.在4°C用PBS洗滌表達HER2、611-CTF或648-的MCF7細胞并在含5mM EDTA的PBS中分離。然后，離心，在10%中性福爾馬林中固定細胞沉淀物，脫水并包埋于石蠟中。將來自細胞沉淀物的切片或來自4μπι厚的人體組織切片置于多聚賴氨酸包被的載玻片上。通過以下操作及進行免疫組織化學分析1.脫石蠟和再水化切片1. 1 于 60°C培養(yǎng)載玻片 30min。1. 2給載玻片脫石蠟3次，每次5min。與潔凈的二甲苯混合培養(yǎng)，接著用乙醇分析純洗滌2次，每次;3min。1. 3逐漸置于蒸餾水中乙醇95°C 3min,乙醇70°C 3min,乙醇50°C 3min，蒸餾水。2.抗原回收在低pH(6)進行 PT 連接(Link), ENVISION FLEX TARGETRETRIEVAL SOLUTION 高 pH 10x. DM 812。20min，95°C。用Envision Flex 洗滌緩沖液洗滌 xlODM 811，15min。
3.免疫組織化學染色AUT0STAINER 加 Link DAKO試劑盒ENVISI0NFLEX+M0USE，高 pH(Link)Envision Flex 過氧化物酶封閉 SM801。Envision Flex/HRP SM 802。Envision Flex DAB+色原體 DM 807。Envision Flex 底物緩沖液 SM 803。Envision Flex 洗滌緩沖液 IOx DM 811。Envision Flex 目標回收溶液高 pH IOx DM 812。Envision Flex+ 鼠(Iinker)SM 84。加入過氧化物酶5min并用洗滌緩沖液洗滌。蛋白質(zhì)組件5% 15_20min。用洗滌緩沖液洗滌?！?2Η2 洗脫 1 1000-1 3000 (lmg/ml 母液)或 20F4 洗脫 1 20-1 50 (Img/ ml母液)2小時?！鲇孟礈炀彌_液洗滌?！龆?Flex HRP，F(xiàn)lex+ 鼠 / 兔)20min?！鲇孟礈炀彌_液洗滌?！?DAB 5min?！鲇孟礈炀彌_液洗滌?！鎏K木精。■用蒸餾水洗滌。3.脫水并用封固劑固定3. 1用濃度遞增的乙醇進行梯度洗滌(50%，70(%，95(%，每次洗滌&1^1)。3. 2依次置于蒸餾水中(乙醇95%，70%，50%，蒸餾水，每次洗滌;3min)。3. 3用二甲苯/桉油精洗滌(洗滌3次，每次aiiin)。3. 4 用 DPX 封固。轉(zhuǎn)基因小鼠TG 611和TG 687小鼠通過基因工程方法，將編碼687-CTF和611-CTF的序列克隆至pMB載體(Dr. Marcos Malumbres惠贈，CNI0, Madrid)的勞氏肉瘤病毒增強的小鼠乳腺瘤病毒長末端重復區(qū)下游的多克隆位點II?；A(chǔ)系(Founder lines)是通過向受精的卵母細胞中顯微注射線性質(zhì)粒DNA而得到的，所述卵母細胞來自動物生物技術(shù)和基因治療中心(Centre de Biotecnologia Animal i Terapia Genica, Universitat Autonoma de Barcelona)提供的超排FVB小鼠。通過Southern雜交分析基礎(chǔ)小鼠(founder mice)的基因型?；A(chǔ)動物鑒定后，常規(guī)菌群通過PCR基因分型。雄性和雌性FVB/N-Tg (MMTVneu) 202J 小鼠來自 Jackson 實驗室(Bar Harbor，ME)。全組織封片(Whole Mounts)及組織學將哺乳動物腺體包埋于載玻片上，在4%多聚甲醛中固定過夜并轉(zhuǎn)移至70%乙醇中。將載玻片用水沖洗5min并置于0.2%過濾的品紅溶液中染色Mh。然后腺體用濃度遞減的乙醇連續(xù)脫水，然后脫脂并貯存于水楊酸甲酯中。將固定的腺體封閉(blocked)于石蠟中，切片并用蘇木精和伊紅染色用于組織學分析。實施例1 通過差諫遷移檢測SEQ ID NO :1片段。圖2顯示了凝膠電泳和Western-型轉(zhuǎn)移(蛋白質(zhì)印跡)的結(jié)果，將不同的乳腺癌樣本(108、114、101、103、131、134和145)加樣于泳道上。分析來自各樣本細胞裂解物的可溶部分( 和膜部分(M)，使HER2分子的類型可視化并確定其組成。大體上，預計完整受體和SEQ ID N0:1形式都存在于細胞膜中，為了檢測完整的HER2及CTF-611形式，使用抗體 (CBll)直接作用于所述蛋白的細胞質(zhì)功能域，其是兩種蛋白形式共有的功能域。作為分析對照，檢測乳酸脫氫酶的存在(DHL)。在大部分樣本中，出現(xiàn)完整HER2受體對應的條帶以及在細胞膜部分中，出現(xiàn)SEQ ID NO 1的CTF-611形式對應的條帶。因此，圖2表明可通過蛋白電泳分析檢測HER2受體截短形式的類型。此外，序列 SEQ ID NO :1的HER2片段的存在表示特定的癌癥類型，至于實施例，在表達HER2的癌癥中， 乳腺癌應被當作個案來評價和處理。實施例2 用針對新的SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3限定的抗原表位的多克隆抗體檢測SEQ ID NO 1的HER2片段的存在。為了能夠檢測序列為SEQ ID NO :1的HER2截短形式的存在，采用其它裝置替代電泳中的差速遷移裝置，合成具有SEQ ID NO :4序列的多肽并用所述多肽免疫4只兔子。該多肽對應于CTF-611形式或SEQID NO :1的N-末端的32個氨基酸，其中大部分半胱氨酸被絲氨酸取代，使多肽能夠與免疫原琥珀?；€孔慽血蘭蛋白(Keyhole-limpethemocyanin， KLH)共軛結(jié)合。因此，與SEQ ID NO :3相同，改造SEQ ID NO :4對應的多肽以實施免疫技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，直接作用于SEQ ID NO :4合成的多肽的抗體還可識別HER2受體截短形式(SEQ ID NO :1或CTF-611)中由SEQ ID NO :3定義的抗原表位。相似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，如果合成的免疫多肽由SEQ ID NO: 2組成，其包括所有位于胞外區(qū)的CTF-611 受體的氨基酸，出于相同目的，得到等同的直接作用于其它多肽的抗體。對表達HER2受體完整形式、CTF-611截短形式和p95截短形式的MCF7細胞裂解提取物進行SDS電泳及后續(xù)的Western轉(zhuǎn)移。SEQ IDNO 1的截短形式實際表現(xiàn)為相似分子量的兩個片段。如用糖苷酶-F進行的實驗可得出，一種酶能夠減少蛋白上的N-多糖(未顯示)，CTF-611片段為翻譯后修飾底物。具體地，合成約IlOkDa的片段并隨后進入分泌途徑進行N-糖基化。兩只免疫兔子的血清能識別完整HER2受體和CTF-611。從圖4A中可以看出，檢測到完整HER2受體和SEQ ID NO :1或CTF-611對應的條帶。圖4A表明，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果得到識別HER2受體細胞質(zhì)功能域(為完整形式和截短形式共有的功能域)的抗體(CBll)； 或得到存在于兔血清中的由SEQ ID N0:4所述的多肽產(chǎn)生的多克隆抗體(α-611-Α和 α-611-Β)。由于抗體α-611-Α和α-611-B對應于完整HER2和CTF-611的信號，推知它們能夠識別存在于兩種受體形式中的線性抗原表位。作為SDS電泳和蛋白質(zhì)印跡的陰性對照，使用表達Ρ95受體形式的MCF7細胞裂解物，其不具有作用于所設(shè)計的抗體的抗原表位。比較這些結(jié)果，當用抗體α-611-A和α-611_Β及抗體CBl 1進行免疫沉淀時，檢測到直接作用于SEQ ID NO :4多肽的抗體比作用于受體截短形式(CTF-611)的抗體優(yōu)選沉淀。易于形成沉淀的混合物中含有比例為1 1 1的表達HER2受體不同形式的細胞裂解物。圖4B中清楚地體現(xiàn)了這些結(jié)果。圖中，顯示出SDS電泳和蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移得到的條帶，這些條帶是加樣抗體α-611-Α、α-611-B和CBll進行免疫沉淀試驗得到的結(jié)果。 對照條帶(input)是用易于和不同抗體形成免疫沉淀的三種類型的細胞裂解物1:1:1 的混合物加樣。用CBll進行蛋白質(zhì)印跡。約106個表達全長HER2、611-CTF或648-CTF 的細胞在 500 μ 1 裂解緩沖液中裂解(50mM Tris HCL pH7. 4,137mM NaCl,2mM EDTA, 10% 甘油，1 % NP40)。裂解物通過14000g離心30min而澄清。Input :5 μ 1裂解混合物(全長 HER2 CTF611 CTF648，1 1 1)。IP :50 μ 1 裂解混合物+5 μ 1 來自兔或 CBll 的抗 61ICTF 血清。用抗體α -611-A和α -611-B免疫沉淀得到的相應條帶，比CTF-611的糖基化和非糖基化形式得到的蛋白分子量條帶明顯更深，從而可清楚地區(qū)分開來。即，所述直接作用于SEQ ID NO :4多肽的抗體不能與HER2受體的完整形式發(fā)生免疫沉淀，這表明它們精確地識別未發(fā)生變化的完整HER2受體的抗原表位。因此，可知抗體α-611-Α和α_611_Β對 CTF-611具有特異性。這種特異性通過間接免疫沉淀試驗(未顯示)得以驗證，其中親和純化多克隆抗體α-611-Α和α-611-Β僅能使表達CTF-611截短片段的樣本染色。這一事實的好處是， 使用它們檢測表達于分離的腫瘤組織樣本中的HER2受體的不同形式成為可能。多克隆抗體的親和純化操作如下(i)用HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare)純化總IgG。將兔血清抗體固定于用結(jié)合緩沖液(Na2HPO4)平衡的柱上，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌并用10倍柱體積的檸檬酸(ρΗ2· 7)洗脫。用ρΗ8的Tris-HCL中和洗脫液。(ii)用固定于HiTrap NHS柱的多肽進行純化。將用于免疫兔子的同樣的多肽固定于HiTrap NHS柱上。將上述步驟中純化的Igk加樣到用結(jié)合緩沖液(Na2HPO4)平衡過的柱上，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌并用10倍柱體積的檸檬酸(pH2. 7)洗脫。用pH8 的1Tris-HCL中和洗脫液。(iii)最后將純化的抗體用PBS 0. 02% NaN3透析。完整的HER2受體包括，靠近細胞膜含有6個二硫橋的區(qū)域，圖1中以半胱氨酸之間的連接線表示。CTF-611或SEQ ID NO :1序列的截短形式僅含5個半胱氨酸，以證實它們之間形成的二硫橋用以穩(wěn)固該截短形式的同型二聚體(homodimers)。整體上從圖4中可知，靠近SEQID NO :1截短形式的細胞膜區(qū)域與完整的HER2受體中抗原區(qū)域不同。據(jù)此，根據(jù)前述內(nèi)容可知可進行差別檢測。輸入(input)中不同HER2亞型的定量，根據(jù)標準化的HER2量免疫沉淀CBll及抗-6Il-B列于下表
權(quán)利要求
1.識別HER2受體截短形式抗原表位的抗體或其片段，所述抗原表位由SEQID NO :2包含的序列限定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其片段，其中所述抗原表位由SEQID NO :3包含的序列限定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段適于將SEQID NO 1所示的蛋白與HER2受體區(qū)別開來。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段適于將 SEQ ID NO 1所示的蛋白與HER2受體截短形式648_CTF/p95上區(qū)別開來。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的抗體或其片段，其中可以通過免疫熒光、流式細胞術(shù)、培養(yǎng)細胞中的免疫組織化學和患者樣本中的免疫組織化學中的一種或多種將所述區(qū)別可視化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體或其片段，其為多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體或其片段，其為單克隆抗體或其片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或其片段，其是由保藏于DSMZ(德國微生物菌種保藏中心)的保藏號為DSM ACC2904的雜交瘤細胞系或保藏號為DSMACa980的雜交瘤細胞系制備得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的抗體或其片段，其中所述片段選自由F(ab)、 F(ab，)和Fv組成的組。
10.制備權(quán)利要求7或8所述單克隆抗體的雜交瘤細胞。
11.制備權(quán)利要求1-9中任一項所述抗體的方法，包括用SEQIDNO :3或SEQ ID NO 4 所示序列的肽進行免疫接種，其任選地與免疫原結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于獲得單克隆抗體的方法，其中權(quán)利要求10所述的雜交瘤細胞系在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，且單克隆抗體可從該培養(yǎng)基中回收得到。
13.由SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 組成的分離肽。
14.一種癌癥診斷的方法，其包括檢測患者樣本中由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式的存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中采用獨立選自下組的方法進行檢測(i)通過由SEQ ID NO 1組成的HER2受體截短形式相對于所述HER2受體的完整形式的差速遷移進行檢測；以及( )通過與權(quán)利要求1-12中任一項所述的一個或多個抗體相結(jié)合進行檢測。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其為預測腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法。
17.權(quán)利要求1-9任一項所述抗體或其片段的應用，其用于從分離的樣本中診斷和預后檢測表達HER2受體的癌癥。
18.用于從分離的樣本中診斷和預后檢測表達HER2受體或其截短形式類型癌癥的試劑，其至少含有一種權(quán)利要求1-9任一項所述的抗體或其片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于診斷的試劑，其中抗體或其片段設(shè)置在固體支持物上。
20.用于從分離的樣本中診斷和預后檢測表達HER2受體或其截短形式類型癌癥的試劑盒，其包括用于檢測樣本中由SEQ ID N0:1組成的HER2受體截短形式存在的裝置。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用于診斷和預后檢測的試劑盒，其中所述檢測裝置至少含有一種權(quán)利要求19或20所述的試劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用于診斷和預后檢測的試劑盒，其中所述檢測裝置通過如 SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的HER2受體截短形式相對于所述HER2受體的完整形式的差速遷移進行檢測。
23.用于治療的權(quán)利要求1-9中任一項所述的抗體或其片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體或其片段，其用于治療或預防至少表達由SEQID NO 1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式的癌癥。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的抗體或其片段，其用于治療或預防哺乳動物，包括人的乳腺癌。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一項所述的抗體或其片段，其用于治療或預防選自下組的癌癥肺癌、胰腺癌、大腸癌、胃癌、前列腺癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎癌、睪丸癌、甲狀腺癌、 膀胱癌、子宮癌、陰道癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、喉癌、腹膜癌、鼻癌和喉癌、輸卵管癌、腎母細胞癌、淋巴癌，以及秋千肉瘤、滑膜肉瘤、髓母細胞瘤、滋養(yǎng)層細胞瘤、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、膽管癌、膽脂瘤、軟骨肉瘤、室管膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)瘤、橫紋肌肉瘤。
27.權(quán)利要求1-9中任一項所述的抗體或其片段在生產(chǎn)用于治療癌癥的藥物中的應用。
28.用于治療至少表達由SEQID NO :1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式的癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1-9任一項所述的抗體或其片段和至少一種藥用賦形劑和/或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達HER2受體癌癥的診斷和治療方法。本發(fā)明提供識別HER2受體截短形式抗原表位的抗體或其片段，所述抗原表位的序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明還提供癌癥的診斷方法，其包括檢測患者樣本中由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的HER2受體截短形式的存在。
文檔編號C07K16/30GK102202692SQ200980126660
公開日2011年9月28日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月2日
發(fā)明者吉姆·佩德森, 梭爾·勞斯, 皮爾·戴維·安吉麗妮, 祖亞昆·阿瑞巴斯·洛佩茲, 約瑟·巴塞爾加·托雷斯, 約瑟夫·路易斯·帕拉·帕勞 申請人:加泰羅尼亞研究和進修民間基金會, 西班牙瓦爾德希伯倫大學醫(yī)院發(fā)展研究院非公募基金會, 西班牙瓦爾德希伯倫腫瘤研究院非公募基金會