專利名稱：抗體純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本披露涉及蛋白質(zhì)純化的方法和混合物，具體地，涉及抗體純化工藝的方法和混 合物，該工藝包括去除聚集物和使用強化溶解性的添加劑(例如帶有兩性離子的化合物) 以強化抗體溶解性、避免聚集物的生成或在離子交換層析中發(fā)生閉塞，從而產(chǎn)生高純度的 基本不含聚集物的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
在血液和淋巴液中發(fā)現(xiàn)的IgM抗體通常是首先響應(yīng)感染的一類抗體，并能夠引起 其他免疫系統(tǒng)細(xì)胞破壞外來物質(zhì)。雖然IgM在醫(yī)療應(yīng)用上具有很好的前景，但是IgM具有 一些能夠限制其在標(biāo)準(zhǔn)抗體凈化工具中使用的特性。相比IgG，IgM的溶解性較差，且在極 端PH值下和低導(dǎo)電率環(huán)境下更容易變性(沉淀，包括聚集物的生成)。IgM通常能夠耐受 高鹽度，該特性能夠用于離子交換層析技術(shù)，但是當(dāng)其暴露于高疏水表面時容易發(fā)生變性， 這限制了疏水作用層析法(HIC)的有效性。更進一步地，盡管IgM在HIC中在合理的低鹽 度下能夠以輪廓分明的出峰從中度疏水底物中洗脫，對中度疏水介質(zhì)優(yōu)選較高鹽度以支持 高容量，然而IgM會在較高鹽度下發(fā)生沉淀。由于IgM通常電荷量比IgG更大，IgM與離子 交換體的連結(jié)強度比IgG更大，且比大多數(shù)污染物的連結(jié)強度大得多。IgM的大尺寸對純化 是一種挑戰(zhàn)，由于擴散系數(shù)小，對質(zhì)量輸運依賴于擴散作用的顆粒結(jié)構(gòu)的多孔離子交換介 質(zhì)而言所述大尺寸會成為一個問題。盡管IgM的一些性質(zhì)會限制其在標(biāo)準(zhǔn)純化工具中的應(yīng)用，IgM單克隆的電荷性質(zhì) 也提供了對IgG很少或從未遇到過的純化機會。這些電荷性質(zhì)允許開發(fā)出純化正交工藝， 該工藝僅需幾個步驟，無需對產(chǎn)品施加不必要的應(yīng)力。事實上，臨床級的IgM純化通?？赏?過三個在羥磷灰石、陰離子交換和陽離子交換上的連結(jié)_洗脫層析步驟實現(xiàn)。IgM純化中 的大部分進步來自使用單片結(jié)構(gòu)的離子交換體，所述單片結(jié)構(gòu)的離子交換體具有高連結(jié)容 量并能承受快速流速。更進一步地，單片的膜狀離子交換體在質(zhì)量傳輸上依賴于對流而非 擴散，由于對流與尺寸和流速無關(guān)，容量和溶解不受到IgM的大尺寸的影響。省略親和步 驟對開發(fā)有效、經(jīng)濟的純化工藝也是一個積極的貢獻。通過采用在線稀釋加載樣本，避免中 間透析，也可提高工藝經(jīng)濟性。在每一個步驟中，回收率與IgG純化中達到的回收率相當(dāng)。 (Gagnon 等人，Purification of IgM Monoclonal antibodies, BioPharm International Supplements, March 2008, pages 26-35 (March2, 2008) ；Gagnon ^A, IgM Purification The Next Generation,13thAnnual Waterside Conference, Miami, February 4—6,2008, available atwww. validated, com as Document No. PSG-080129)去除聚集物許多蛋白質(zhì)，包括例如IgG和IgM的抗體，能夠形成聚集物，所述聚集物必須在純化過程中去除，為了提供具有所需純度和產(chǎn)品安全性(對醫(yī)療用蛋白質(zhì)而言)的蛋白質(zhì)產(chǎn) 品。盡管去除聚集物是產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵決定因素，其可能增加產(chǎn)品加工難度、增加純化成 本，并限制了對最終純化(“精細(xì)純化”)方式的選擇。例如，尺寸排阻層析(SEC)去除聚集 物并允許緩沖液更換，但是SEC也存在過程慢、容量低、需要不成比例地大的柱床(需要極 高的填充技術(shù))且需要大量的緩沖劑。吸附方法在去除聚集物的有效性上存在限制，它們 的選擇性并不直接與蛋白質(zhì)的尺寸相關(guān)，相比非聚集態(tài)的蛋白質(zhì)，聚集物被保留的趨勢要 強得多(可能是由于其參與了大量的與吸附固體物質(zhì)之間的相互作用)，而超乎預(yù)料的分 離度是由于克隆之間以及產(chǎn)品的聚合與非聚合狀態(tài)之間的電荷分布的差異。非離子的聚合物和蛋白質(zhì)(常用作抗體沉淀劑)可添加入緩沖劑中，使效果與蛋 白質(zhì)尺寸成正比?？蛇x擇非離子的聚合物和蛋白質(zhì)作為添加劑(該添加劑可與吸附方法相 容)，強化吸附方法將聚集物從非聚集態(tài)的抗體中分離的能力，并滿足生產(chǎn)可注射到人體的 產(chǎn)品的常規(guī)要求。例如，非離子的聚乙二醇(PEG)被理解為是無毒的，可用于USP等級，具有 蛋白穩(wěn)定的特性，且價格不高。由于PEG優(yōu)先從蛋白表面分離出來，因此在所述蛋白質(zhì)周圍 形成了一層純水水合層，所述純水水合層與具有高濃度PEG的主體溶劑之間的非連續(xù)性在 熱動力學(xué)上是不利的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與PEG溶液發(fā)生接觸時，它們彼此共享一些水合水，因而將 一些水釋放回主體溶劑中，且相比單獨的蛋白質(zhì)之間的連接面積，它們具有較小的連接面。 由于蛋白質(zhì)表面積與蛋白質(zhì)尺寸成正比，非離子有機聚合物的作用大小與蛋白質(zhì)尺寸成正 比，因而通過選擇聚合物長度和濃度能夠強化尺寸選擇性。例如，沉淀IgM的PEG-6000的 百分比含量范圍比沉淀IgM的PEG-6000的百分比含量范圍要低。通過開發(fā)PEG在不同的層析分離中的效果，PEG所影響的尺寸選擇性能夠應(yīng)用于 其它應(yīng)用場合。當(dāng)PEG在離子交換環(huán)境中被用作緩沖添加劑的一部分，通過離子交換可將 較小的非聚集態(tài)的蛋白質(zhì)從較大的聚集物中分離出來。聚集物分離也可在使用包含PEG的 緩沖劑的羥磷灰石上進行，因而通過羥磷灰石層析去除聚集物。由于PEG對其他雜質(zhì)的效 果是可以預(yù)期的，在產(chǎn)品純化過程中，能夠考慮這些效果以達到理想的純化效果。例如由于 宿主細(xì)胞蛋白(HCP)通常比IgG小，PEG應(yīng)當(dāng)將其柱保留能力增強到一個較小的程度，同時 由于DNA、內(nèi)毒素和病毒通常比IgG大，PEG應(yīng)當(dāng)將其保留能力增強到一個較大的程度，這 樣才能更好地將污染物從產(chǎn)品中分離。因而，PEG能夠被用于顯著強化聚集物去除效率，并 且如果需要的話，強化其他污染物的去除，特別包括病毒顆粒(Gagnon等人，“Nonionic Polymer Enhancement of Aggregate Removal in IonExchange and Hydroxyapatite Chromatography" presented at 12thAnnual Waterside Conference, San Juan, Puerto Rico, April 23-25，2007，可從 www. validated, com 獲得，文件號 PSG-070430)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在某些實施方式中提供了從含有蛋白質(zhì)產(chǎn)品和蛋白質(zhì)產(chǎn)品聚集物的樣本 中純化蛋白質(zhì)產(chǎn)品的工藝，所述工藝包括以下步驟(i)第一層析步驟，包括使用非離子聚 合物去除所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的聚集物，其中所述非離子聚合物的濃度在層析條件下足以強化 所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品從所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品聚集物中的分離，由此在本步驟后收集組分，所述組分 包括基本不含聚集物的所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品；(ii)合并強化溶解的添加劑和第一層析步驟中 獲得的所述包括蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分或者包括隨后獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分，該隨后獲得的組分來自所述第一層析步驟中獲得的所述包括蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分，其中所述強化溶解的添 加劑從由兩性離子、尿素化合物和亞烷基二醇組成的群中選擇；和(iii)第二層析步驟，包 括使用離子交換層析(或者，當(dāng)所述第一層析步驟為離子交換層析時，羥磷灰石層析)其中 所述強化溶解的添加劑的濃度足以在所述層析條件下強化所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶解度并且 基本避免閉塞，其中所述強化溶劑的添加劑不干擾所述第二層析步驟，且其中所述工藝產(chǎn) 生基本不含有聚集物的純化蛋白質(zhì)產(chǎn)品。


圖1所示為如實施例3中所描述的使用陶瓷羥磷灰石(CHT)層析對IgM抗體LMl 進行初步純化的參考曲線，其中連續(xù)測量蛋白總量(A28tl, A3tltl)、濁度(A_)、導(dǎo)電率和pH值。圖2所示為實施例3中所描述的使用陰離子交換層析對LMl進行中間純化的參考 曲線，其中連續(xù)測量蛋白總量(A28CI，A3J、濁度(A_)、導(dǎo)電率和PH值。圖3所示為實施例3中所描述的使用陰離子交換層析對LMl進行中間純化的過程 中的LMl洗脫峰的高解析度參考曲線，其中連續(xù)測量蛋白總量(A28tl, A3tltl)、濁度(A_)、導(dǎo)電 率和pH值。圖4所示為實施例3中所描述的使用陽離子交換層析對LMl進行精細(xì)(最終)純 化的過程中的參考曲線，其中連續(xù)測量蛋白總量(A28tl, A3J、濁度(A_)、導(dǎo)電率和pH值。圖5所示為實施例3中所描述的使用陽離子交換層析對LMl進行精細(xì)純化的過程 中的LMl洗脫峰的高解析度參考曲線，其中連續(xù)測量蛋白總量(A28tl, A3tltl)、濁度(A_)、導(dǎo)電 率和pH值。圖6所示為對精細(xì)純化后的純化LMl采用HPSEC進行分析尺寸排阻層析的參考曲 線，其中連續(xù)測量蛋白總量(A28CI，A3J、濁度(Α_)、導(dǎo)電率和PH值。
具體實施例方式本公開在某些實施方式中提供了在純化工藝中的蛋白質(zhì)產(chǎn)品純化的方法和混合 物，所述純化工藝包括在第一層析分離步驟中使用非離子聚合物強化去除聚集物，接著進 行離子交換層析步驟，其中使用某些強化溶解的添加劑，所述強化溶解的添加劑的使用濃 度足夠高以強化所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶解，并在第二層析步驟(包括離子交換層析)中原本 易于發(fā)生閉塞的操作條件下阻止閉塞的發(fā)生。這里使用的參考層析步驟的第一和第二的說 法是關(guān)于其相對順序而言的，并不排除所述第一步驟之前或所述第一和第二步驟之間的層 析步驟。本公開在某些實施方式中提供了從混合物中純化獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)品的多步驟工藝 的方法和混合物，包括第一層析步驟，所述第一層析步驟包括使用非離子聚合物；和第二 層析步驟，所述第二層析步驟包括離子交換層析，其中，不根據(jù)本發(fā)明使用強化溶解的添加 劑，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品會形成聚集物或者在離子交換中純化操作條件下促進發(fā)生閉塞。其中 在某些實施方式中，所述工藝包括在使用強化溶解的添加劑之前，在至少一個步驟中使用 非離子聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以強化從所述混合物中去除聚集物。在第一層析步驟的下游位置，所述強化溶解的添加劑與含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組 分合并，所述第一層析步驟包括使用非離子聚合物，例如聚乙二醇，以促進從所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的聚集物中分離所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品。在某些實施方式中，由所述第一層析步驟收集到的所 述包括所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分被收集形成含有強化溶解的添加劑的混合物。在進一步的實 施方式中，在所述第一層析步驟后收集到的所述含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分進行進一步的 分離和純化步驟，由此所獲得的組分隨后與強化溶解的添加劑合并。在某些實施方式中的強化溶解的添加劑是兩性離子，所述兩性離子促進所述蛋白 質(zhì)產(chǎn)品的溶解，但具有足夠低的導(dǎo)電性因而不干擾離子交換層析的操作。在某些實施方式 中，所述工藝包括使用兩性離子(例如甘氨酸)，所述兩性離子的濃度足夠在原本容易發(fā)生 聚集或閉塞的操作條件下強化所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶解并阻止閉塞的發(fā)生，其中含有兩性離 子的混合物適用于至少一個離子交換步驟中，并且所述工藝產(chǎn)生基本不含聚集物的高純度 蛋白質(zhì)產(chǎn)品。在一個示例中，提供了用于從混合物中(例如，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中)純化IgM的 多步驟工藝的非限定的實施方式、方法和混合物，其中所述工藝包括在至少一個步驟中使 用含有PEG的緩沖劑，以去除至少部分IgM聚集物并提供富集IgM(IgM單體)的樣本，所述 工藝進一步包括使用低導(dǎo)電性的含有兩性離子的混合物，其中所述兩性離子的濃度足夠在 原本容易在下游的離子交換步驟產(chǎn)生聚集物或閉塞的操作條件下強化IgM的溶解并阻止 IgM聚集物的生成，所述工藝包括至少一個離子交換步驟，其中所述工藝產(chǎn)生基本不含聚集 物的高純度IgM產(chǎn)品。如本文所述，使用含有兩性離子的混合物強化蛋白質(zhì)溶解并防止生成聚集物或在 某些純化工藝步驟中發(fā)生閉塞，還提供了能夠直接與離子交換介質(zhì)相容的低導(dǎo)電性的樣品 緩沖劑，相比使用高鹽度的緩沖劑強化蛋白質(zhì)溶解并防止生成聚集物，其中高鹽度緩沖劑 不可直接與離子交換介質(zhì)相容。進一步如本文所述，強化去除聚集物的含有非離子聚合物 的緩沖劑可直接添加到含有兩性離子的混合物中，以強化蛋白質(zhì)溶解并基本上避免生成聚 集物，由此避免可能影響純化蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生成和質(zhì)量的進一步的操作，例如去鹽、去除聚 合物或緩沖劑交換。這些方法和混合物使不同的正交純化步驟之間具有相容性。在一個非限定的示例實施方式中，本發(fā)明提供了用于從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化 IgM的多步驟工藝，其中，所述工藝包括在至少一個步驟中使用PEG，其使用方式強化IgM單 體從IgM聚集物中的分離，并實現(xiàn)至少去除部分IgM聚集物，所述工藝進一步包括在后續(xù)步 驟中使用低導(dǎo)電性的含有兩性離子的混合物，其中所述兩性離子的濃度足以在原本易于生 成聚集物的條件下強化IgM的溶解并阻止IgM聚集物的生成。所述工藝進一步包括離子交 換純化步驟，其中所述含有兩性離子的混合物不干擾該離子交換步驟。在一個實施方式中， 使用甘氨酸作為兩性離子，其濃度足以強化IgM的溶解，并在原本在離子交換層析中易于 產(chǎn)生聚集物或發(fā)生閉塞的條件下防止生成IgM聚集物或發(fā)生閉塞。進一步地，在許多實際 應(yīng)用中，為了保持強化的溶解性和減少聚集物生成的危險，一旦開始所述純化工藝，應(yīng)當(dāng)注 意保證不間斷地完成所述純化工藝。在某些實施方式中，強化溶解的添加劑為兩性離子、尿素、尿素衍生物(例如烷基 脲(甲脲，乙脲等))或亞烷基二醇(例如乙二醇或丙二醇)。盡管本發(fā)明的不同種類的強 化溶解的添加劑的機理被理解為是不同的，上述所有添加劑均在離子交換層析步驟中強化 純化蛋白質(zhì)產(chǎn)品，所述離子交換層析步驟包括含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分和非離子聚合物 (例如聚乙二醇)，所述非離子聚合物由于被用于在先的層析步驟中，存在于含有所述蛋白
7質(zhì)產(chǎn)品的組分內(nèi)。在某些實施方式中，當(dāng)所述強化溶解的添加劑為尿素，所述尿素可能的濃 度可高達6摩爾，但優(yōu)選低于2摩爾的濃度。在某些實施方式中，當(dāng)所述強化溶解的添加劑 為乙二醇時，所述乙二醇的濃度可高達50%，但優(yōu)選低于20%的濃度。由于過高的乙二醇 或尿素的濃度可破壞一些IgM抗體，在一些實施方式中，所述強化溶解的添加劑的濃度被 調(diào)整到接近在第二層析步驟中阻止閉塞發(fā)生所需的最低濃度。含有兩性離子的混合物適用于本方法和混合物中的兩性離子，被理解為電中性但在不同原子上帶有正式 的正負(fù)電荷的化學(xué)化合物。兩性離子具有極性并通常在水中具有高溶解性，在大多數(shù)有機 溶劑中溶解性低。甘氨酸(Gly ；G)是可電離的氨基基團和可電離的羧酸基團組成的小氨基酸。在中 性或近中性的在水溶液中，甘氨酸主要以兩性離子的形式存在。甘氨酸的等電位點或等電 位PH值位于所述甘氨酸分子所在的環(huán)境中的所述氨基基團和所述羧酸基團的pKa值的中 間值。每摩爾甘氨酸被理解為可增加介電常數(shù)約18，甘氨酸被理解為應(yīng)當(dāng)充分強化溶劑的 電極性，反過來應(yīng)當(dāng)強化帶電分子(例如蛋白質(zhì))的溶解能力。水的介電常數(shù)約80，但對于 大多數(shù)現(xiàn)存系統(tǒng)，水的介電常數(shù)約100。1.0M的甘氨酸介電常數(shù)約100。甘氨酸適合作為本 文中的方法和混合物的兩性離子。不希望受限于本理論，確定甘氨酸適用于本方法和混合 物的除了其他原因之外的特別原因是在本文所提供的方法和混合物中的PH值范圍內(nèi)為兩 性離子，因此甘氨酸不會對溶液的導(dǎo)電性產(chǎn)生貢獻，因而不會影響接下來的離子交換步驟。 由于在本發(fā)明提供的方法和混合物的PH值范圍內(nèi)，甘氨酸的緩沖能力低到零，因此甘氨酸 被理解為不會明顯影響緩沖配置液。通過觀察，甘氨酸通過離子交換相互作用對蛋白質(zhì)的 影響為零或幾乎測量不到，且通過觀察甘氨酸沒有對實施本文提供的純化工藝產(chǎn)生任何不 需要的作用。其他適用的兩性離子包括，但不限于，含有酸基團和堿基團(電解的)的兩性電解 質(zhì)，所述兩性電解質(zhì)在其介電點以兩性離子的形式存在；“Good’ s”緩沖劑，例如基于氨基 磺酸的緩沖液MES，MOPS, HEPES, PIPES和CAPS緩沖劑；氨基酸(氨基羧酸)緩沖液，例如 甘氨酸、甘氨酸衍生物(二(羥乙基)甘氨酸，三(羥甲基)甘氨酸)和丙胺酸；可用作去 污劑的緩沖劑，例如CHAPSO ；以及天然產(chǎn)品，包括某些生物堿和甜菜堿。貫穿在本發(fā)明說明書中的“含有兩性離子的混合物”這一說法包含含有兩性離子 的緩沖溶液和非緩沖溶液，所述兩性離子的濃度足以在原本易于產(chǎn)生聚集物的條件下強化 蛋白質(zhì)溶解性并阻止聚集物生成。這里提供的含有兩性離子的混合物的概念，可根據(jù)所述 混合物的預(yù)計用途發(fā)生變化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定用于特定用途的含有兩性離子的 混合物的合適的含義。在下面的實施例所描述的非限定的示例實施方式中，一些含有兩性 離子的混合物是非緩沖的，例如在PH值約7(+/-0. 2)的水中的1. OM甘氨酸(非緩沖)，在其 他示例實施方式中，含有兩性離子的混合物包括緩沖劑和其他成分，例如pH值8. 0的50mM Tris、lM甘氨酸、2mM EDTA或pH值6. 2的50mM MES、1. OM甘氨酸或者緩沖液B :pH值6. 2的 20mM檸檬酸鹽、1. OM甘氨酸。如示例實施方式所示，含有兩性離子的混合物含有為實現(xiàn)其 預(yù)期功能的充足的兩性離子，例如1. OM甘氨酸，可進一步包括兩性離子緩沖劑，例如MES， 或非兩性離子緩沖劑例如Tris。本發(fā)明提供的含有兩性離子的混合物含有的兩性離子的濃度足夠滿足特定用途，這些混合物被理解為可包含濃度超過特定用途所需的最小濃度的兩性離子。作為預(yù)防措 施，若不引起不必要的效果的話，含有兩性離子的混合物可含有相比特定用途最低要求較 高的兩性離子等級。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對特定用途或其他相似物確定合適的兩性離子 等級，可以確定增加或降低兩性離子等級的效果。需要進一步理解的是，按照本發(fā)明提供的方法使用含有兩性離子的混合物，可減 少在原本易于產(chǎn)生聚集物和發(fā)生閉塞的離子交換工藝條件下的產(chǎn)生聚集物或發(fā)生閉塞的 危險，但并不能完全排除這樣的聚集或閉塞的可能。由此，為了盡可能減少暴露于易于發(fā)生 聚合的環(huán)境中，不中斷地完成所述工藝是有利的。純化工藝本公開提供了多步驟純化工藝的方法和混合物，所述多步驟純化工藝包括，但不 限于，提供樣品捕捉、去除聚集物和多級純化的步驟，其中當(dāng)操作條件可易于進行純化的蛋 白質(zhì)發(fā)生聚合時，使用含有混合物的強化溶解的添加劑。特別的，本公開提供了多步驟純化工藝的方法和混合物，所述多步驟純化工藝在 應(yīng)用于抗體(例如IgM或IgA)純化時具有優(yōu)勢。盡管，可以理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可操 作本公開所提供的方法和混合物以純化任何蛋白質(zhì)，在下面提供的非限定性的描述中將注 意力集中在使用本方法和混合物純化抗體。進一步地，盡管，可以理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員 可操作本公開所提供的方法和混合物以純化任何抗體，在下面提供的非限定性的描述和實 施例中提供的示例實施方式中，特別集中于使用本方法和混合物純化IgM。使用本方法和混 合物純化IgM的下文非限定的描述和實施例中，提供了充足的指導(dǎo)和工作實施例使本領(lǐng)域 的技術(shù)人員能夠?qū)ζ渌鞍踪|(zhì)的純化實施本發(fā)明。本公開提供了蛋白質(zhì)純化的多步驟工藝的方法和混合物，其中用于實施步驟的材 料、試劑和條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)特定實施的條件和環(huán)境進行選擇。類似的，本公開 提供了蛋白質(zhì)純化的多步驟工藝的方法和混合物，其中所述步驟可按照任意的順序?qū)嵤?。根?jù)一個方面，提供了去除聚集物，其中在含有非離子聚合物(例如PEG)的緩沖 液中的含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶液，被加載到不通過尺寸排阻起作用的層析介質(zhì)上，例如 羥磷灰石或離子交換介質(zhì)，由此蛋白質(zhì)產(chǎn)品(單體)能夠被從至少一些聚集物中分離，并收 集到富集所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品且基本不含聚集物的樣本。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定使用不同層 析介質(zhì)和條件下含有PEG的緩沖劑的理想用量。不希望受到本公開的限制，在羥磷灰石層 析過程中，尤其是使用陶瓷羥磷灰石時，使用含有PEG的緩沖劑去除聚集物的方法被發(fā)現(xiàn) 是可靠和容易實現(xiàn)的，同時在陰離子交換層析或陽離子交換層析過程中，使用含有PEG的 緩沖劑去除聚集物的方法有時候是有問題的，更進一步地，含有PEG的緩沖液中從陰離子 交換介質(zhì)或陽離子交換介質(zhì)中洗脫的樣本有時候會開始形成新的聚集物，所述新的聚集物 需要額外的處理(如高鹽度和/或甘氨酸)使其再次懸浮。根據(jù)另一方面，當(dāng)操作條件易于發(fā)生聚合時，含有蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶液也含有兩性 離子，所述兩性離子的濃度足以在易于發(fā)生聚合的操作條件(例如冷卻、低PH值或低導(dǎo)電 性)下強化所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶解并阻止生成聚集物。在一種實施方式中，含有所述蛋白 質(zhì)產(chǎn)品的溶液被導(dǎo)入含有兩性離子的環(huán)境，例如所述溶液被收集在含有兩性離子的混合物 中，所述混合物具有足夠高的兩性離子濃度，使所述含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶液被稀釋后， 保持所述兩性離子的有效性。特別地，含有甘氨酸的混合物適用于操作條件易于產(chǎn)生聚集
9物的情況。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解甘氨酸能夠通過強化含有甘氨酸的溶液的溶劑極 性，強化蛋白質(zhì)溶解，因而增加所述溶劑溶解帶電分子(例如蛋白質(zhì))的容量。以示例方 式，多克隆的IgM溶液在PBS中10mg/ml時是渾濁的，在IM甘氨酸中100mg/ml時是如水般 清澈的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解由于甘氨酸在該純化工藝的PH值范圍內(nèi)是兩性離子， 不會對導(dǎo)電性有所貢獻，因而不會干擾后續(xù)的離子交換步驟。類似的，由于在本方法和混合 物的PH值范圍內(nèi)甘氨酸的緩沖容量為零，甘氨酸不會顯著干擾緩沖劑配液。最后，需要理 解的是，由于離子交換基團必須與所述溶劑競爭，因此通過離子交換的蛋白質(zhì)相互作用在 高介電常數(shù)下相對略弱，盡管如此，據(jù)觀察在不同的示例實施方式中，介電常數(shù)約100的甘 氨酸對通過離子交換對蛋白質(zhì)相互作用的影響效果幾乎無法測得，由此據(jù)觀察甘氨酸對本 純化工藝不具有實際影響效果。如本發(fā)明所述，甘氨酸可用作強化溶解的添加劑，其濃度范 圍在約50mM到約5M之間，或者在約IOOmM到約4M之間，或者在約250mM到約3M之間，或 者在約500mM到約2M之間，或者在約750mM到約IM之間。甘氨酸可用于溶液中，約50mM， 或者約lOOmM，或者約250mM，或者約500mM，或者約750mM，或者約1M，或者約1. 1M,或者約 1. 2M，或者約1. 3M，或者約1. 4M，或者約1. 5M，或者約1. 6M，或者約1. 7M，或者約1. 8M，或者 約1. 9M，或者約2M。需要理解的是，作為預(yù)防手段，甘氨酸的使用濃度可高于達到所需效果 必須的濃度，如為了強化蛋白質(zhì)溶解和/或避免生成聚集物，其中本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確 定在特定實施中所能夠容忍的甘氨酸濃度。如本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)品純化產(chǎn)生基本不含聚集物的純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。本 發(fā)明所提供的基本不含聚集物的純化的蛋白質(zhì)樣本的所述聚集物含量能夠少于約5%，可 預(yù)期少于約1%，或者少于約0.5%，或者少于約0. 1%，可能小于用于測量聚集物容量的方 法的檢測下限。特別地，基本不含聚集物的純化的IgM樣本的所述聚集物含量能夠少于約 5 %，可預(yù)期少于約1 %，或者少于約0. 5 %，或者少于約0. 1 %，可能小于用于測量聚集物容 量的方法的檢測下限。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純化，對產(chǎn)品的分離和回收能夠通過使用線性梯度、 階梯梯度或線性與階梯梯度的組合實現(xiàn)。根據(jù)一個方面，線性梯度可用于將所述蛋白質(zhì)產(chǎn) 品從聚集物和/或其他污染物(例如HCP)中更好地分離。根據(jù)一個方面，階梯梯度可用于 減少洗脫產(chǎn)品的體積。為達到相同終點，選擇線性和/或階梯梯度，需要理解的是，每種選 擇都會產(chǎn)生選擇性的微小變化，所述選擇性會影響純度和聚集物含量。階梯和/或線性梯 度的選擇需要理解的是，步驟間隔的設(shè)定點在一定程度上決定于柱負(fù)荷，其中柱負(fù)荷達到 95%的飽和容量的設(shè)定點顯著低于負(fù)荷50%的柱設(shè)定點。針對特定實施方式，可利用本領(lǐng) 域技術(shù)人員所知的因素和方法選擇和使用梯度。初步純化執(zhí)行第一步驟完成初步純化，產(chǎn)生富集所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分。當(dāng)初步純化包括 獲取樣品，初步純化后收集的所述富集組分應(yīng)當(dāng)相比初始材料具有更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品濃 度。當(dāng)初步純化不包括獲取樣本，所述富集組分的蛋白質(zhì)產(chǎn)品濃度可能不明顯較大，但盡管 如此，由于從所述初始材料中分離了至少部分污染物，依然會是富集的(例如，當(dāng)所述初始 材料通過介質(zhì)，所述介質(zhì)結(jié)合某些污染物但不結(jié)合所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品時)。當(dāng)初步純化包括去 除聚集物時，所述富集組分可預(yù)期為基本不含聚集物。當(dāng)初步純化不包括去除聚集物時，會 在另一個純化步驟中去除聚集物。在一個實施方式中，第一步驟完成了獲取樣本、去除聚集物和初步純化，產(chǎn)生高度富集蛋白質(zhì)產(chǎn)品且基本不含聚集物的組分，其中蛋白質(zhì)產(chǎn)品的濃 度比所述初始材料中的濃度高。在另一個實施方式中，第一步驟完成了獲取樣本和初步純 化，但不包括去除聚集物，產(chǎn)生具有比初始材料中高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品濃度的組分，其中由于將 所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品從至少一些污染物中分離出來，所述組分富集蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并且所述組分 含有在所述第一步驟之前和/或之中形成的聚集物?？蛇x地，如果預(yù)期中所述工序條件易 于產(chǎn)生聚集物，初步純化可使用含有兩性離子的混合物實現(xiàn)。中間純化執(zhí)行另一步驟完成中間純化，產(chǎn)生相比在初步純化后收集到的組分具有更高所述 蛋白質(zhì)產(chǎn)品富集度的蛋白質(zhì)產(chǎn)品組分。若初步純化不包括樣本獲取，那么可以在中間純化 過程中執(zhí)行樣本獲取以增加蛋白質(zhì)產(chǎn)品的濃度。若初步純化不包括去除聚集物，那么可以 在中間純化過程中執(zhí)行去除聚集物。在一個實施方式中，在包括樣本獲取和去除聚集物的 初步純化之后，具有更高濃度和基本不含聚集物的蛋白質(zhì)產(chǎn)品通過離子交換進一步純化， 例如陰離子交換或陽離子交換，產(chǎn)生具有更高純度的濃縮的基本不含聚集物的蛋白質(zhì)產(chǎn)品 組分。在另一個實施方式中，在包括樣本獲取的初步純化之后，濃縮的蛋白質(zhì)產(chǎn)品組分通過 包括去除聚集物的中間純化進一步純化，產(chǎn)生具有更高純度的濃縮的基本不含聚集物的蛋 白質(zhì)產(chǎn)品組分。在另一個實施方式中，在將所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品從某些污染物中分離的初步純 化之后，所述蛋白質(zhì)組分被進一步純化，包括樣本獲取和去除聚合無，產(chǎn)生具有更高純度的 濃縮的基本不含聚集物的蛋白質(zhì)產(chǎn)品組分。中間純化的執(zhí)行中可使用含有兩性離子的混合 物，也可不使用，需要理解的是，若所述操作條件易于產(chǎn)生聚集物，會使用含有兩性離子的 混合物執(zhí)行中間純化。最終、精細(xì)純化執(zhí)行進一步的步驟完成所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的最終(或稱“精細(xì)”)純化。在該步驟后 收集的所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品組分預(yù)期具有超過99%的純度，其污染物或聚集物濃度在可測范圍 以下。精細(xì)純化的執(zhí)行中可使用含有兩性離子的混合物或其他強化溶解的添加劑，也可不 使用，需要理解的是，若所述操作條件易于產(chǎn)生聚集物，會使用含有兩性離子的混合物執(zhí)行 精細(xì)純化?？刹捎萌魏魏线m的方法執(zhí)行精細(xì)純化，包括但不限于，羥磷灰石層析或離子交換 層析。附加步驟本發(fā)明所提供的純化工藝可包括附加步驟，包括但不限于，過濾、病毒滅活(例如 通過溶劑/去污劑混合物(S/D)方法)或去除污染物的附加步驟。盡管所述工藝可包括 可選的過濾、去鹽、二次過濾或緩沖交換步驟，可預(yù)期本發(fā)明所提供的方法和混合物能夠減 少或消除許多這樣的步驟。在所述工藝過程中的任何時間可進行分析測量，例如評價在多 個階段收集到的樣品的樣品純度和聚集物含量，以確定不同工藝參數(shù)的效果。在精細(xì)純化 后收集到的IgM組分的純度可通過多種分析測量方法，例如分析SEC (例如實施例4中的 HPSEC)、電泳測量(例如變形或非變形的膠電泳、IEF、一維或二維電泳等)、肽指紋圖譜(氣 相層析-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Maldi-TOF)等)，進行 評價。根據(jù)一個方面，在精細(xì)純化后對所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品組分執(zhí)行分析SEC(例如HPSEC)以 確認(rèn)所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品具有超過99%的純度且不含可測得的污染物。工藝步驟的順序
本發(fā)明所提供的工藝步驟的順序可依照任何次序排列，只要預(yù)先注意使用非離子 的聚合物實現(xiàn)去除聚集物，并按需要使用強化溶解的添加劑(例如含有兩性離子的混合 物)保持強化的溶解性并在不同層析模式之間提供相容性。在下面的實施例中所描述的示 例實施方式中，所述第一純化步驟涉及樣本獲取、去除聚集物和初步純化，所述初步純化使 用PEG(以分離并去除聚集物)通過陶瓷羥磷灰石(CHT)執(zhí)行，其中來自CHT的組分被收集 到含有兩性離子的混合物中，所述含有兩性離子的混合物能夠與下一步的中間純化的陰離 子交換介質(zhì)相容，并與隨后的精細(xì)純化步驟地陽離子交換介質(zhì)相容。根據(jù)本發(fā)明的純化可 采用不同的步驟順序執(zhí)行。在另一個實施方式中，所述第一步驟涉及樣本獲取和陽離子交 換的初步純化，隨后進行中間純化和通過CHT去除聚集物(使用PEG)，然后進行通過陰離子 交換的精細(xì)純化的最終步驟。在另一個實施方式中，所述第一步驟涉及獲取樣本和陰離子 交換的初步純化，隨后進行中間純化和通過CHT去除聚集物(使用PEG)，然后進行通過陽離 子交換的精細(xì)純化的最終步驟。在另一個實施方式中，所述第一步驟涉及獲取樣本和陽離 子交換的初步純化，隨后進行陰離子交換的中間純化，隨后通過CHT去除聚集物并進行精 細(xì)純化的最終步驟。在另一個實施方式中，所述第一步驟涉及獲取樣本和陰離子交換的初 步純化，隨后進行陽離子交換的中間純化，隨后通過CHT去除聚集物并進行精細(xì)純化的最 終步驟。在某些實施方式中，所述第一層析步驟包括陽離子交換層析，所述陽離子交換層 析包括聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量足夠去除聚集物；所述第二層析步驟包括羥磷灰石 層析或陰離子交換層析。在某些其他實施方式中，所述第一層析步驟包括陰離子交換層析， 所述陰離子交換層析包括聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量足夠去除聚集物；所述第二層析 步驟包括羥磷灰石層析或陽離子交換層析。1#抗體純化本公開提供了在IgM純化的應(yīng)用上具有優(yōu)勢的特定方法和混合物。IgM的某些特 性使通過少數(shù)步驟實現(xiàn)IgM的顯著純化的正交純化程序的開發(fā)和使用成為可能，由此去除 了可能導(dǎo)致回收IgM的產(chǎn)量和/或純度下降的不必要的步驟。例如，大多數(shù)IgM(包括單克 隆IgM)具有高電荷，因而通過離子交換方法保留的強度足夠高以實現(xiàn)中等PH值下的高結(jié) 合容量。另外，在生理PH值和導(dǎo)電性條件下IgM與羥磷灰石的結(jié)合強度大，使IgM純化中 優(yōu)選使用羥磷灰石。由此，利用IgM可能利于純化的某些特性提供了方法和混合物，并減少或避免了 在純化過程中由于IgM的某些特性可能引起的問題。例如，IgM純化會與IgG純化會有所不 同，是由于IgM的可溶解范圍比IgG窄、IgM相比IgG更易于發(fā)生變性、當(dāng)暴露于疏水表面 (例如在疏水作用層析中)時IgM常發(fā)生變性、且IgM對極端pH值敏感、并在慣常用于IgG 的陰離子交換或吸引力純化的條件下容易發(fā)生沉淀，其中低導(dǎo)電性的溶液會調(diào)整IgM的所 述PH值敏感性。由此，在某些實施方式中，通過使用強化溶解的添加劑，在離子交換層析過 程中的抑制閉塞。本方法和混合物提供了 IgM純化工藝，所述IgM純化工藝包括使用含有PEG的溶 液以強化從復(fù)雜混合物(例如細(xì)胞培養(yǎng)上清液)中去除IgM聚集物，并進一步包括在例子 交換層析中使用含有兩性離子的混合物(例如含有約1. OM的甘氨酸)，以強化IgM的溶解 性并增強IgM在原本易于產(chǎn)生聚集物的環(huán)境下的穩(wěn)定性，以達到在所述IgM純化工藝中避免或至少減少新聚集物生成的目的。本方法和混合物的非限定的示例實施方式出現(xiàn)在下面的實施例中。在實施例中， 采用本文提供的工藝純化三種不同的單克隆IgMs (SAM6、CMl和LMl)。在如下所述的實施 方式中，實行下面的純化步驟(I)樣本獲取并使用含有PEG的緩沖劑通過羥磷灰石層析 進行初步純化；(II)使用含有兩性粒子的混合物通過陰離子交換層析進行中間純化；以及 (III)使用含有兩性粒子的混合物通過陽離子交換層析進行精細(xì)純化，以產(chǎn)生基本不含聚 集物的高純度IgM。這里給出的純化步驟的順序可依照任何順序，只要所述工藝的執(zhí)行方式 能夠完成聚集物的去除，并使用含有兩性離子的混合物保持強化的IgM溶解性并避免IgM 聚集物。根據(jù)這里給出的另一個方面，純化步驟的順序的執(zhí)行方式，可在不同的步驟中提供 在不同的層析模式之間具有相容性的緩沖劑。從細(xì)胞培養(yǎng)液中對IgM進行初步純化在下面的實施例中出現(xiàn)的示例實施方式中，使用含有PEG的緩沖劑的羥磷灰石層 析被用于獲取樣本、去除聚集物，初步純化步驟產(chǎn)生高度富集IgM且基本不含聚集物的組 分，其中含有IgM的組分隨后被引到進入含有兩性離子的混合物中。在使用PEG的情況下， IgM(單體)和IgM聚集物結(jié)合到羥磷灰石，但是由于PEG作為緩沖添加劑的尺寸選擇作用， IgM(單體)和IgM聚集物具有不同的洗脫曲線。陶瓷羥磷灰石(CHT)適合該步驟。需要理解的是，為了從該步驟達到理想的純化效果，在加載樣本后進行大量的沖 洗是很重要的。在加載樣本并大量沖洗所述柱(介質(zhì))之后，通過增加鹽濃度到預(yù)設(shè)程度， 以線性梯度或以階梯梯度洗脫所述樣本，隨后所述柱被保持在該鹽濃度之下直到洗脫所述 抗體峰。通過實施例的方法，從CHT中洗脫IgM可采用在5柱體積(CV)上添加125mM到 350mM的線性梯度的磷酸鈉(實施例1，25 %到70 %的緩沖劑B)，或者在5柱體積(CV)上添 加165mM到365mM的線性梯度的磷酸鈉(實施例2，33%到73%的緩沖劑B)，或者在5柱體 積(CV)上添加IOOmM到325mM的線性梯度的磷酸鈉(實施例2，20%到65%的緩沖劑B)。 所有的緩沖劑PH值為7. 0并含有10%的PEG-600。在從羥磷灰石洗脫的過程中，可根據(jù)方案收集來自IgM洗脫峰中點的組分以增強 樣本純度，所述方案有望排除在所述洗脫峰前端的早洗脫污染物，更重要的是，有望排除在 所述IgM洗脫峰的尾端比IgM更早洗脫的聚集物。如下文所述，所述IgM洗脫峰可直接收 集到含有兩性離子的混合物中，例如IM甘氨酸。由于聚集物的出現(xiàn)可導(dǎo)致混濁，所述“如水 般清澈”的IgM洗脫峰顯示出基本不含聚集物，且所述IgM組分在被收集到IM甘氨酸中之 后依然保持清澈。所述線形梯度部分可被轉(zhuǎn)化為階梯梯度以減少洗脫產(chǎn)品的體積。在初步純化步驟后的樣本純度(例如，聚集起來的IgM洗脫峰組分中的IgM含量， 以總蛋白質(zhì)的百分比表示)可以超過約50%，或者超過約60%，或者超過約70%，或者超過 約80 %，或者超過約85 %，或者超過約90 %，或者超過約95 %。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠為了 特定的用途在該步驟后測量所述樣本純度，并且如果需要的話，改變工藝條件以改進樣本 純度。在下面的示例實施方式中，在CHT后的SAM6樣本純度超過90%，可能超過95% (實 施例1)，在CHT后的LMl樣本純度高達90%。在下面的實施例2中的示例實施方式中，在 CHT后的CMl樣本純度僅為約50%，但考慮到在下面的陰離子交換步驟中污染物很容易去 除污染物，這也認(rèn)為是可以接受的。當(dāng)初步純化步驟為使用含有PEG的緩沖劑的羥磷灰石層析時，該步驟提供了主要的聚集物去除步驟。蛋白質(zhì)樣本中的所述聚集物的含量(以分析尺寸排阻層析法測得，以 總蛋白質(zhì)的百分比表示)少于約5%，且預(yù)期為少于1%。尤其地，IgM樣本的所述聚集物 含量少于約5%，且預(yù)期為少于1 %。若所述聚集物含量超過1 %，本領(lǐng)域技術(shù)人員可改變洗 脫條件以實現(xiàn)更好地從聚集物中洗脫IgM，例如通過降低從羥磷灰石中洗脫的最終鹽濃度。 在某些實施方式中，聚集物的存在使用G4000SWXL上的分析尺寸排阻層析是無法測得的， 其中檢測下限約為0. 1%，因此無可測得的聚集物通常是指聚集物含量少于0. 1%。當(dāng)分析 后續(xù)純化步驟獲得的IgM組分時，聚集物全部或絕大多數(shù)消失，也就是說在所述初始材料 中發(fā)現(xiàn)的聚集物是在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的。該結(jié)果與IgG的聚集物生成模式相一致。但是， 在該步驟之后，在所述純化工藝接下來的部分之中必須避免可能導(dǎo)致新的聚集物生成的條 件。由此，在所述純化工藝接下來的部分之中，將使用含有兩性離子的混合物強化IgM溶解 性并避免生成聚集物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確認(rèn)適用于本步驟的PEG聚合物種類和濃度。在下面描述的 非限定實施方式中，可使用相同濃度的PEG-600和PEG-1000，兩者可互換。PEG-1000的效 果被發(fā)現(xiàn)較強，其引起所述抗體的洗脫較晚，并相似地強化聚集物的去除。對應(yīng)調(diào)整沖洗和 洗脫緩沖液的鹽濃度，PEG能夠被完全忽略，其可能會導(dǎo)致IgM較早洗脫。IM甘氨酸的兩性離子濃度可能高于必須濃度，由此作為預(yù)防手段。盡管降低甘氨 酸濃度濃度可能并不會危害所述IgM產(chǎn)品的產(chǎn)生和/或純度，但為了預(yù)備和為了大規(guī)模的 純化，應(yīng)當(dāng)在降低甘氨酸濃度之前通過實驗確認(rèn)降低兩性離子濃度的效果。如下文所指出的，可在本步驟中，當(dāng)抗體結(jié)合到CHT上時或者從CHT上洗脫后，通 過溶劑/去污劑混合物(S/D)方法執(zhí)行病毒滅活。II使用陰離子交換層析執(zhí)行IgM的中間純化在下面的實施例中出現(xiàn)的示例實施方式中，在中間純化步驟，可通過使用含有兩 性離子的混合物的陰離子交換進一步純化所述IgM樣本。在示例實施方式中，由于采用在 初步純化中CHT上使用了含有PEG的緩沖劑實現(xiàn)了聚集物的去除，在接下來的純化步驟中 的溶液不含有PEG但它們含有兩性離子(甘氨酸)，其濃度足夠強化IgM的溶解性并避免生 成聚集物。推薦CHT上的所述初步純化之后，盡快采用陰離子交換層析執(zhí)行IgM的中間純 化，例如CHT上的所述初步純化之后24小時以內(nèi)。在示例實施方式中，樣本溶液(從CHT收集的IgM洗脫峰聚集起來收集到IM甘氨 酸中)的PH值被調(diào)整到合適的高pH值(Tris50mM，pH8. 0)并加載到陰離子交換介質(zhì)上，
例如季胺強陰離子交換體，例如CIM QA ( CIM 對流交互介質(zhì)， BIA Separations, Klagenfurt，奧地利)。其他可使用的陰離子交換介質(zhì)，包括可能相比QA具有更大容量的 弱陰離子交換體(例如DEAE或EDA)，盡管弱陰離子交換體的選擇性和緩沖效果的差異可 能需要調(diào)整(例如更大量的柱平衡劑)，以及盡管在洗脫過程中削弱對PH值的控制。如果 可能的話，可使用單片結(jié)構(gòu)的陰離子交換體，如下面的實施例中所示，盡管也可使用非單片 結(jié)構(gòu)的離子交換體，其中工藝系數(shù)例如流速會進行調(diào)整，且污染物去除、容量、特別是病毒 去除可能有所下降，這些需要納入考慮。盡管可按任何順序執(zhí)行步驟，當(dāng)從所述第一步驟洗 脫的樣本具有高鹽度(例如從CHT洗脫的IgM具有高鹽度)時，將陰離子交換層析作為第 二步驟是有利的，由此從CHT洗脫的具有高鹽度的組分不會出現(xiàn)與陰離子交換的相容性問 題，尤其是在樣本加載過程中的實際稀釋之后。
含有IgM的樣本能夠通過在線稀釋被加載到所述柱上，所述在線稀釋避免IgM經(jīng) 歷PH值、緩沖劑成分或鹽濃度的突然變化，所述變化易于產(chǎn)生聚集物(變性)。在實施例中 的示例實施方式中，通過一個泵供應(yīng)的一份含有IgM的樣本被在線稀釋到通過另一個泵供 應(yīng)的兩份加載緩沖劑中，造成總稀釋量為IOX從CHT柱洗脫的IgM組分的體積?？刹捎闷?他在線稀釋或不同的樣本加載技術(shù)弓丨導(dǎo)用于中間純化的樣本。當(dāng)樣本被加載后，所述柱被大量沖洗，洗脫材料的一個小峰。采用線性體度或階梯 梯度將所述鹽濃度增加到預(yù)定程度洗脫IgM，隨后所述柱被保持在該鹽濃度之下直到洗脫 所述抗體峰。在實施例的示例實施方式中，洗脫SAM6的NaCl梯度為約200mM NaCl,0. 5M 甘氨酸(實施例1)和洗脫CMl的NaCl梯度為約225mM NaCl, 0. 5M甘氨酸(實施例2)，洗 脫LMl的磷酸鈉梯度為約250mM磷酸鈉，0.5M甘氨酸。組分的收集從前端的10%最大峰高 度開始到尾端的10%最大峰高度為止，所述收集的組分被匯集到一起?？梢灶A(yù)料在所述尾 端會洗脫一些剩余的聚集物。由于洗脫緩沖劑的低PH值(6. 2)，推薦在該步驟之后聚集的 含有IgM的組分?jǐn)R置時間少于約24小時。陰離子交換能夠在一個小時內(nèi)完成，但為了方便 起見可能放慢，需要理解的是減少流速即不會改善也不會降低柱的性能。若打算但尚未執(zhí) 行病毒過濾步驟，可在通過陰離子交換完成中間純化之后選擇執(zhí)行病毒過濾。使用陽離子交換層析執(zhí)行IgM的精細(xì)純化經(jīng)過中間純化后匯集起來的組分隨后進行最終或精細(xì)純化。在實施例中出現(xiàn)的示 例實施方式中，聚集起來的從使用陰離子交換的中間純化中洗脫的含有IgM的組分進一步 進行純化，該純化通過使用含有兩性離子的混合物的陽離子交換層析進行。由于初始緩沖 劑的導(dǎo)電性相對較低(鹽濃度低)，使用含有兩性離子的混合物(例如IM甘氨酸)對于保 持蛋白質(zhì)溶解度并在陽離子交換條件下避免聚集物的產(chǎn)生是很重要的。合適的介質(zhì)包括硫 酸強陽離子交換劑CIM S03 (單片)，或其他不同形式的強/弱陽離子交換介質(zhì)，可由 實踐本方法和混合物的本領(lǐng)域技術(shù)人員進行選擇和使用。在加載樣本后，所述柱被大量沖洗。緩沖劑更換與所述柱相容性問題可通過在線 稀釋(例如10X)解決，所述在線稀釋為使用含有IM甘氨酸的陽離子交換柱平衡緩沖劑稀 釋所述IgM樣本。按照線性梯度或按照階梯梯度將提高所述鹽濃度到預(yù)設(shè)程度，由此洗脫IgM，隨后 所述柱被保持在該鹽濃度之下直到洗脫所述抗體峰。從所述前端的10%最大峰高度開始 收集，直到尾端預(yù)設(shè)截止點為止，并將收集到的組分聚集在一起，由此回收到高純度的IgM。 如果在所述溶液中出現(xiàn)任何聚集物，可以預(yù)期任何剩余的聚集物會在所述IgM峰的所述尾 端洗脫。在所述IgM峰的尾端的收集IgM組分的截止點可以位于40%最大峰高度，或30% 最大峰高度，或25%最大峰高度，或20%最大峰高度，或15%最大峰高度，或10%最大峰高 度。該步驟的回收效率相對所述柱上處理的可測得的IgM，可以超過約75%，或超過 約80 %，或超過約85 %，或超過約90 %，或超過約95 %，在精細(xì)純化后收集到的IgM組分的 純度可以通過各種分析測量方法(例如在實施例4中采用HPSEC)進行評估。精細(xì)純化后 的純度可以超過約80%，或超過約90%，或超過約95%，或超過約99%。最終的IgM制備 被認(rèn)為是不含有可測得得聚集物(即，如果出現(xiàn)任何聚集物，其出現(xiàn)的量低于所述檢測下 限)。
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需要理解的是，當(dāng)執(zhí)行陽離子交換步驟時，陽離子交換將所述抗體暴露于易于產(chǎn) 生聚集物的條件下(包括低PH值和低導(dǎo)電性)，因而在避免聚集物產(chǎn)生上，所述陽離子交換 步驟可能是在整個工藝中最關(guān)鍵的步驟。盡管甘氨酸的高濃度對溶解性的最大化是非常重 要的，需要進一步理解的是，甘氨酸或者其他適用的兩性離子的高濃度降低聚集物的風(fēng)險 但無法將其完全消除。本發(fā)明所提供的方法和混合物提供了避免不需要的聚集物生成的附 加方法。例如，應(yīng)當(dāng)避免陽離子交換中的中斷，注意保證陽離子交換工藝一旦開始應(yīng)當(dāng)無中 斷地完成。除非另行定義，本發(fā)明所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常理解的含義一致。除非另行定義，本發(fā)明中所使用的下列詞匯的含義如下所述。本發(fā)明中的表示單個的詞匯“某”、“一個”、“所述”，除非文中清楚指出，包括復(fù)數(shù) 含義。由此，例如，“一化合物”包括多個化合物，“一殘基”或“一氨基酸”包括一種或多種
殘基和氨基酸。本發(fā)明所引用的所有公開出版物、專利和專利申請，為各種目的被明確引用在此 作為參考。實施例實施例1. SAM6純化步驟I.獲取樣本和采用羥磷灰石層析的初步純化SAM6 IgM從一升澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的初始材料開始純化，其包含約200gIgM/ ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液。首先，細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用0. 22微米(0. 22 μ m)的濾網(wǎng)進行過濾，隨 后以1 %的體積比添加pH7. 0的500mM磷酸鈉，產(chǎn)生5mM的最終磷酸鹽濃度。如果所述上清 液已經(jīng)含有磷酸鹽，向所述過濾上清液中添加pH7. 0的500mM磷酸鈉的量為達到至少5mM 磷酸鹽濃度所需的最小量。以1 %的體積比添加pH8. 0的IMTris溶液，產(chǎn)生IOmM的最終 Tris濃度，預(yù)期產(chǎn)生6. 8到7. 2之間的最終pH值。所述樣本溶液可到達室溫(18-23°C )。羥磷灰石層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱11 型 CHT，40 微米，ATOLL 11.3x100mm 柱流速100-200cm/hr(Atoll 柱上 1. 67-3. 34ml/min)緩沖劑A =IOmM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑B :500mM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑C=LOM甘氨酸(非緩沖)ρΗ7 (+/-O. 2)緩沖劑D :600mM KPO4, pH7緩沖劑E 1. OM NaOH緩沖劑F 0. IM NaOH,或20%乙醇，5mM磷酸鈉pH7羥磷灰石層析在緩沖劑A (如上)中平衡所述柱(陶瓷羥磷灰石，CHTtmII型，40微米(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)，11. 3x100mm 柱，預(yù)填 ATOLL Gmbh))。對所述樣本采用 100 柱體積(100CV)的緩沖劑A中。加載樣本后，所述柱以2到5倍CV的緩沖劑A沖洗(沖洗 1)。所述柱隨后以25%緩沖劑B(125mM磷酸鹽，10% PEG-600)沖洗，直到讀數(shù)返回到通過 測量280nm，A280的吸收量所確定的基值以下。采用一⑴CV線性梯度達到70%緩沖劑B(350mM磷酸鹽，10% PEG-600)從所述柱中洗脫樣本，所述柱被置于該置于該70%緩沖劑B中直到所述產(chǎn)品峰被洗脫。0. 5CV的組分 被直接收集到1. 15CV的IM甘氨酸(緩沖劑C)中。所述洗脫峰是如水般清澈的，并且在以 甘氨酸稀釋時保持清澈。組分的儲存溫度為4°C。如推薦的，組分的收集從前端的10%最 大峰高度開始到尾端的10%最大峰高度為止，所述收集的組分被匯集到一起進行進一步的 純化。可預(yù)期該收集/聚集的策略能夠排除可能在所述樣本峰的尾端開始洗脫的聚集物。 用5-10CV的緩沖劑D清洗所述CHT柱，用緩沖劑E清潔，并貯存在緩沖劑F中。CHT上的初步純化在IOcm床高、流速20cm/hr下，需要約6小時，包括約5小時加 載樣本。樣本純度超過90% IgM，聚集物濃度低于1%。關(guān)于初步純化的注釋初步的數(shù)據(jù)指出當(dāng)在Ix體積CHT上處理IOOx體積時，大多數(shù)的IgM都能夠被結(jié) 合。如果在后期的流過組分中發(fā)現(xiàn)明顯的產(chǎn)品損失，那么所述產(chǎn)品的處理量應(yīng)當(dāng)相應(yīng)降低。 通過計算可知工藝時間會隨床高增加，因而若床高加倍工藝時間也加倍。因此可以得出結(jié) 論，在這些條件下，在整個工藝規(guī)模內(nèi)適用15cm的床，IOcm床也可適用，決定于持續(xù)獲得良 好填料質(zhì)量的能力，在整個工藝規(guī)模內(nèi)不應(yīng)使用超過20cm的床。為了從本步驟達到理想的純化效果，加載樣本后進行大量沖洗是很重要的。當(dāng)在 該清洗中洗脫一個大峰時，可能達到后續(xù)IgM洗脫峰的兩倍尺寸，意味著高達5%的顯著產(chǎn) 品損失，該峰可能包含各種污染物，例如宿主細(xì)胞蛋白(HCP)，還有IgM片段，所述IgM片段 通常依然能夠被抗-IgM抗體檢測到，所述抗-IgM抗體無法區(qū)分完整的IgM和IgM片段。盡 管沖洗緩劑的鹽濃度可較低，以防止明顯的IgM損失，但可能增加HPC的污染。如果希望或者需要，在該步驟中，當(dāng)所述抗體被結(jié)合到CHT時或者在從CHT洗脫 后，可通過溶劑/去污劑混合物(S/D)方法進行病毒滅活。如果在所述抗體被結(jié)合到CHT 時執(zhí)行，應(yīng)當(dāng)在所述第一次沖洗(緩沖劑A)后進行。在一種方法中，根據(jù)本領(lǐng)域所知的方 法準(zhǔn)備CV的S/D試劑，第一個CV的S/D試劑快速流過所述柱(200cm/hr)，其后第二個CV 的S/D試劑花費一個小時緩慢流過所述柱。所述柱以至少IOCV的IOmM磷酸鹽+S/D步驟 中所用的去污劑進行沖洗，去除殘余的2%的磷酸三丁脂(TNBP)，并以5CV的緩沖劑A進行 沖洗以去除殘余的去污劑并重新開始所述純化。S/D處理也可在所述CHT步驟之后執(zhí)行，這 是因為其也能夠與后續(xù)的陰離子交換步驟相容。注意，S/D處理對該抗體的效果未被評估。II采用陰離子交換層析的中間純化在完成CHT上的初步純化之后的24個小時內(nèi)開始采用陰離子交換層析的中間純 化。陰離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱CIM QA單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A :50mM Tris, IM 甘氨酸，2mM EDTA, pH8. 0緩沖劑B :50mM MES, IOmM NaCl, 1. OM 甘氨酸，ρΗ6. 2緩沖劑C :50mM MES，500mM NaCl，ρΗ6· 2緩沖劑D :1. OM NaOH緩沖劑E :0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陰離子交換層析
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向從CHT中收集并聚集在一起的組分中以5%的體積比添加lMTris，pH8. 0的溶 液，產(chǎn)生50mM的最終Tris濃度，所述樣本溶液可達到室溫(18_23°C )。所述柱包括八(8)ml強陰離子交換體CIM QA單片，所述柱在緩沖劑A中被平 衡，所述樣本溶液通過在線稀釋被加載到所述柱上，所述在線稀釋如下所述一份樣本(由 泵A供應(yīng))中加入兩份緩沖劑A (由泵B供應(yīng))。該樣本稀釋產(chǎn)生的總稀釋量為IOx的從 CHT柱洗脫的體積。用于該步驟的QA單片的期望柱容量約為每毫升單片30mg IgM。所述 柱用緩沖劑B沖洗(沖洗1)，然后以77%緩沖劑B，23%緩沖劑C沖洗(沖洗2)，該沖洗洗 脫一小峰。如果需要的話，緩沖劑C的制備可含有IM NaCl，以提供更有效的清潔，盡管需要 相應(yīng)調(diào)整梯度設(shè)定點。隨后使用5CV線性梯度達到52 %緩沖劑B，48 %緩沖劑C從而洗脫樣品，所述柱被 置于52%緩沖劑B，48%緩沖劑C中直到所述樣本峰被完全洗脫。所述樣本峰包括在200mM NaCl和0. 5M甘氨酸下洗脫的IgM，是清澈的。從前端的10%最大峰高度開始到尾端的10% 最大峰高度為止所收集的組分被匯集到一起?？梢灶A(yù)期任何殘留的聚集物是在尾端被洗脫 的。所述柱通過100%的緩沖劑C清洗，產(chǎn)生含有混合了幾種污染物的少量IgM的小尖峰， 隨后產(chǎn)生一連串其他小污染物峰。所述柱在緩沖劑D中清潔并貯存在緩沖劑E中。該中間 純化步驟在不到一個小時內(nèi)完成。在緩沖劑A中，可期待EDTA去除任何的鈣，在CHT步驟中鈣可能已經(jīng)被所述樣本 攜帶，使用PH8. 0強化所述介質(zhì)的結(jié)合能力。清洗和洗脫可在pH6. 2下執(zhí)行以強化去除宿 主細(xì)胞蛋白(HCP)，并提供洗脫樣本，所述洗脫樣本的PH值能夠與在后續(xù)陽離子交換純化 中使用的緩沖劑直接相容。由于洗脫緩沖劑的低PH值(6. 2)，在該步驟后聚集起來的含有 IgM的組分的擱置時間少于約24小時。關(guān)于中間純化的注釋若計劃進行病毒過濾步驟，但之前尚未執(zhí)行，可在所述陰離子交換步驟后執(zhí)行，其 中應(yīng)當(dāng)使用追加溶液50mM MES, 150mM NaCl，pH6. 2，所述抗體應(yīng)當(dāng)在后續(xù)的陽離子交換步 驟中再次濃縮。如果在所述CHT步驟后通過溶劑/去污劑混合物(S/D)方法執(zhí)行病毒滅活(見上 述注釋)，那么應(yīng)當(dāng)對所述陰離子交換工藝執(zhí)行附加的去污劑沖洗，例如，通過向陰離子交 換緩沖劑A中添加去污劑，并在添加樣本后使用至少IOCV的緩沖劑A。在該情況下，推薦在 緩沖劑B沖洗時重新開始純化。該抗體與陰離子交換體的強結(jié)合意味著洗脫pH值可進一步降低；但這增加了產(chǎn) 品變性的風(fēng)險，并且盡管高甘氨酸溶液可降低該風(fēng)險，但并不能完全消除。III通過陽離子交換層析進行精細(xì)純化陽離子交換層析在所述陰離子交換層析(如上所述)24小時內(nèi)開始。陽離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱:CIM S03單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A :50mM MES, 1. OM 甘氨酸，pH6. 2緩沖劑B :20mM檸檬酸鹽，1. OM甘氨酸，pH6. 2緩沖劑C:250mM檸檬酸鹽，pH6. 2
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緩沖劑D :1. OM NaOH緩沖劑E :0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陽離子交換層析一旦開始，采用陽離子交換層析的最終純化步驟應(yīng)不中斷地完成。樣本(從陰離子交換中聚集起來的組分)可達到室溫(18_23°C )。所述柱在緩沖 劑A中平衡。樣本依照1份樣本溶液到9份緩沖劑A進行在線稀釋，通過在線稀釋加載樣 本。CIM S03介質(zhì)的容量顯示為約30mg IgM/ml。所述柱以2-5CV緩沖劑A沖洗(沖洗1 2CV就足夠了，不超過5CV)，然后以5CV 95%緩沖劑B、5%緩沖劑C沖洗(沖洗2)，該沖洗 形成一小峰。 樣本使用5CV線形梯度達到60 %緩沖劑B、40 %緩沖劑C洗脫，所述柱被置于60 % 緩沖劑B、40%緩沖劑C中直到所述樣本峰被完全洗脫。從前端的10%最大峰高度開始到 尾端的10%最大峰高度為止所收集的組分被匯集到一起。洗脫的IgM是清澈的。可以預(yù) 期任何殘留的聚集物是在尾端被洗脫的。500mM磷酸鹽pH7的溶液以10%的體積比被添加 到所述聚集起來的組分中，以增加所述PH值，所述溶液被儲存在4°C下。所述柱用緩沖劑B 清洗，該清洗形成一小峰。所述柱在緩沖劑D中清潔并貯存在緩沖劑E中。關(guān)于精細(xì)純化的注釋由于所述陽離子交換將所述抗體暴露于易于產(chǎn)生聚集物的條件下(包括低PH值 和低導(dǎo)電性)，因此所述陽離子交換步驟可能是在整個工藝中最關(guān)鍵的步驟。盡管甘氨酸的 高濃度對溶解性的最大化是非常重要的，其只能降低風(fēng)險但無法將其完全消除。應(yīng)當(dāng)避免 中斷，注意保證陽離子交換工藝一旦開始應(yīng)當(dāng)無中斷地完成。實施例2. CMl純化I.獲取樣本和采用羥磷灰石層析的初步純化CMl IgM從500ml澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的初始材料開始純化，其包含約200 μ g IgM/ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液。首先，細(xì)胞培養(yǎng)上清液可達到室溫(18-23°C )，然后采用0. 22微 米(0. 22 μ m)的濾網(wǎng)進行過濾，隨后以1 %的體積比添加pH7. 0的500mM磷酸鈉，產(chǎn)生5mM 的最終磷酸鹽濃度。如果所述上清液已經(jīng)含有磷酸鹽，向所述過濾上清液中添加PH7. 0的 500mM磷酸鈉的量為達到至少5mM磷酸鹽濃度所需的最小量。羥磷灰石層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱11 型 CHT，40 微米，ATOLL 11. 3x1 OOmm ft流速不超過200cm/hr (Atoll 柱上 3. 34ml/min)緩沖劑A IOmM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑B :500mM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑C:1.0M甘氨酸(非緩沖)pH7(+/-0.2)緩沖劑D :600mM KPO4, pH7緩沖劑E :1. OM NaOH緩沖劑F 0. IM NaOH,或20%乙醇，5mM磷酸鈉pH7羥磷灰石層析在緩沖劑A中平衡所述柱(陶瓷羥磷灰石，CHTtmII型，40微米(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)，11. 3x1 OOmm 柱，預(yù)填 ATOLLGmbh))。對所述樣本采用 50 柱體
19積(CV)。加載樣本后，所述柱以2到5倍CV的緩沖劑A沖洗(沖洗1 :2CV已足夠，需要保證 不超過5CV，無需沖洗到基值)。所述柱隨后以23%緩沖劑B(165mM磷酸鹽，10% PEG-600) 清洗，直到讀數(shù)返回到基值(沖洗2)。在所述第二次沖洗步驟中洗脫一個大峰，大致與所述 產(chǎn)品峰相當(dāng)，其中可預(yù)期該沖洗會洗脫IgM片段。如上所述，5-10%范圍內(nèi)的明顯產(chǎn)品損失 可能是該沖洗所轉(zhuǎn)移的片段，如果完整產(chǎn)品的損失看起來過度了，應(yīng)當(dāng)降低緩沖劑B的濃 度，但這可能增加HCP帶來的污染。采用5CV線性梯度達到73%緩沖劑B(360mM磷酸鹽，10% PEG-600)從所述柱中洗 脫樣本，在該點之后所述柱被置于該置于該73%緩沖劑B中直到所述產(chǎn)品峰被洗脫。0. 5CV 的組分被直接收集到1. 15CV的IM甘氨酸(緩沖劑C)中。所述洗脫峰是如水般清澈的，并 且在以甘氨酸稀釋時保持清澈。組分的收集從前端的10%最大峰高度開始到尾端的10% 最大峰高度為止，所述收集的組分被匯集到一起進行進一步的純化?？深A(yù)期該收集/聚集 的策略能夠排除可能在所述樣本峰的尾端開始洗脫的聚集物。組分的儲存溫度為4°C。用 5-10CM的緩沖劑D洗凈所述CHT柱，用緩沖劑E清潔，并貯存在緩沖劑F中。對IOcm床高的CHT上的初步純化需要流速20mg/hr、約6小時，包括需要約2. 5小 時加載樣本?；陉庪x子交換結(jié)果，CHT之后的樣本純度約50%。本樣本純度相比SAMl (上 述實施例1)或LMl (下述實施例3)低得多，但是所述污染物在后續(xù)陰離子交混步驟中很容 易消除。所述CHT步驟被確認(rèn)為在本工藝中的主要聚集物去除步驟，聚集物通過G400SWXL 上的分析尺寸排阻層析無法測得(未展示數(shù)據(jù))，這被認(rèn)為意味著聚集物含量低于0. 1%。 相比加載在所述柱上的初始樣本，總回收量是低的，這很大程度上是由于在所述沖洗步驟 中去除了 IgM片段并在所述清洗階段去除了聚集物。關(guān)于初步純化的注釋所述CHT步驟的結(jié)合容量可能是所述純化工藝中最模糊的參數(shù)。初步的數(shù)據(jù)指出 當(dāng)在Ix體積CHT上處理50x樣本體積時，大多數(shù)的IgM都能夠被結(jié)合。CMl與CHT的強結(jié) 合(比LMl和SAM6都要強)暗示了可能達到大得多的柱容量，但是主要污染物(如下所述) 的競爭結(jié)合可能是一個限制。如任何實施方式所慣常的，流過的組分在最初的幾輪中被保 留下來并測量IgM含量以確定柱容量。當(dāng)確認(rèn)有效結(jié)合后，可確定所述加載體積。如果在后 期的流過組分中發(fā)現(xiàn)明顯的產(chǎn)品損失，那么所述產(chǎn)品的處理量應(yīng)當(dāng)相應(yīng)降低。類似地，無法 預(yù)期的柱壽命也給出了為CHT步驟準(zhǔn)備專用柱的啟示，所述專用柱被設(shè)計為容納CHT的高 密度和沉降速度，其中除非需要導(dǎo)入空氣或應(yīng)累積性能損失的需要，所述專用柱不應(yīng)卸料。與預(yù)期一致，尤其由于在所述去除了 IgM片段(在沖洗步驟中)和聚集物(在所 述清洗階段中)，該步驟的回收率是最低的。若在后續(xù)的兩個陰離子交換步驟中回收率為 90%，為了達到60%的整體工藝回收率只需要在CHT步驟達到75%的回收率。大多數(shù)商業(yè) IgG工藝達到50-60%的整體工藝回收率，除非初始聚集物濃度高，在這些情況下整體工藝 回收率可能為25%或更低。根據(jù)獲得適用于臨床條件的材料的目的，評估這個階段的數(shù)據(jù)， 其中所述工藝可能不需要的工藝最高經(jīng)濟效率，在工藝發(fā)展中可能也不需要所述工藝的最 高效率。由于CMl與LMl有一項共同的重要化學(xué)特征-與陽離子交換體的結(jié)合弱_并且由 于LMl在某些條件下與PEG發(fā)生問題，對CMl進行額外的試驗以確定其是否顯示出相似的 敏感性。從在10% PEG-600中的CHT中洗脫的CMl在洗脫時如水般清澈并且在室溫下保持清澈，但是在4°C下迅速變混濁。通過使用IM甘氨酸稀釋立刻逆轉(zhuǎn)混濁過程，這與LMl中 所觀察到的一致，由此確定將CMl直接收集到1. OM甘氨酸稀釋液中是可取的(1份樣本由 2. 3份1. OM(非緩沖)甘氨酸、pH7稀釋)。在稀釋后，未發(fā)現(xiàn)更多的溶解度問題，但認(rèn)為謹(jǐn) 慎起見，建議在完成CHT步驟后24小時內(nèi)開始下一步驟。考慮可能的冷卻和/或不溶解問 題。盡管像在所述CHT步驟中使用的那樣PEG不產(chǎn)生新的溶解現(xiàn)象，其強化了已存在的現(xiàn) 象。進一步地，確定需要非常注意預(yù)先冷卻的材料以保證在任何形式的工藝之前其是充分 溶解的。將樣本在本工藝的所有步驟中置于18-23°C之中的規(guī)定，可能是預(yù)防性的。根據(jù)對 直接從4°C的貯存中取出的材料所進行的有效試驗，從4°C的材料開始是可能的，這使整個 工藝更快更方便。依照之前預(yù)期的裝瓶濃度(如果已知的話)，畫出從4°C到23°C的溫度溶 解曲線，或者如果之前預(yù)期的裝瓶濃度未知時設(shè)為20mg/ml。PEG-600和PEG-1000在本工藝中可彼此替換使用。PEG-1000的效果相比PEG-600 略強，并會引起所述抗體的洗脫稍早，類似地強化去除聚集物。如果PEG被完全省略，所述 抗體的洗脫大大提前，沖洗洗脫/洗脫設(shè)定點分別為75mM磷酸鹽和235mM磷酸鹽。現(xiàn)在的甘氨酸濃度是預(yù)防性的，可能可以下降而不引起對所述產(chǎn)品的危險，但這 應(yīng)當(dāng)在大尺量執(zhí)行之前通過試驗確認(rèn)。CHT之后的擱置時間可能可以延長到一周，但應(yīng)當(dāng)通過試驗確認(rèn)。評價較長擱置時 間的一種方法可以是檢查混濁度(600nm分光光度分析)和分析尺寸排阻曲線(測量聚集 物含量)，兩者均應(yīng)每天檢查。如前所述，可在所述抗體結(jié)合到CHT或從CHT中洗脫之后，通過溶劑/去污劑混合 物方法進行病毒滅活。II采用陰離子交換層析的中間純化在完成CHT上的初步純化之后的24個小時內(nèi)開始采用陰離子交換層析的中間純 化。陰離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱CIM QA單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A:50mM Tris，1. OM 甘氨酸，2mM EDTA，ρΗ8· 0緩沖劑B :50mM MES, IOmM NaCl，1. OM 甘氨酸，ρΗ6. 2緩沖劑C :50mM MES,500mM NaCl，pH6. 2緩沖劑D :1. OM NaOH緩沖劑E :0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陰離子交換層析向從CHT中收集并聚集在一起的組分中以5%的體積比添加lMTris，pH8. 0的溶 液，產(chǎn)生50mM的最終Tris濃度。所述柱在緩沖劑A中平衡。樣本溶液通過在線稀釋被加 載到所述柱上，所述在線稀釋如下所述一份樣本中加入兩份緩沖劑A。該樣本稀釋產(chǎn)生的 總稀釋量為IOx的從CHT柱洗脫的體積。用于該步驟的QA單片的期望柱容量約為每毫升 單片(介質(zhì))30mg IgM，預(yù)計堿性的pH值會進一步增加結(jié)合容量。所述柱用緩沖劑B沖洗 (沖洗1)，然后以71 %緩沖劑B，29%緩沖劑C沖洗(沖洗2)，該沖洗洗脫一污染物的大峰，也可能含有一些IgM。本實施例中所使用的MES緩沖劑是兩性離子，能夠為陰離子和陽離子 交換都提供較好的緩沖效果。使用5CV線性梯度達到53%緩沖劑B，47%緩沖劑C從而洗脫樣品，隨后所述柱被 置于53%緩沖劑B，47%緩沖劑C中直到所述樣本峰被完全洗脫。從10%最大峰高度開始 持續(xù)到峰下降到10%最大峰值(尾端)為止所收集的組分被匯集到一起?？梢灶A(yù)期任何殘 留的聚集物是在尾端被洗脫的。所述柱通過100%的緩沖劑C清洗，產(chǎn)生含有混合了幾種污 染物的少量IgM的小尖峰，隨后產(chǎn)生一連串其他小污染物峰?？墒褂肐M NaCl取代500mM CaCl配置緩沖劑C，以達到更好的清洗效果，盡管需要根據(jù)更高的NaCl濃度調(diào)整所有的混 合物或梯度。使用緩沖劑D清潔所述柱并將其貯存在緩沖劑E中。該中間純化步驟在不到 一個小時內(nèi)完成。從所述陰離子交換體中洗脫的所述產(chǎn)品(CMl)具有約0.5M甘氨酸和約 225mM NaCl的平均濃度，略高于SAM6 (上文實施例1)或LMl (下文實施例3)。在該步驟之 后的純度為約95-98% IgM。本步驟回收率約90%。對于從上述給料量的CHT步驟的IgM量而言，8ml CIM QA單片柱尺寸過大了。在 另一個實驗中發(fā)現(xiàn)，在4ml/min下的Iml單片(3個0. 34ml片堆疊而成)，結(jié)合了來自加載 250ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液的5ml CHT柱的所有IgM，意味著8ml單片能夠保留來自加載2升細(xì) 胞培養(yǎng)上清液的CHT柱的IgM。如前所述，可期待EDTA去除任何的鈣，在CHT步驟中鈣可 能已經(jīng)被所述樣本攜帶，PH8. 0有望強化所述介質(zhì)的結(jié)合能力。清洗和洗脫步驟可在pH6. 2 下執(zhí)行以強化去除HCP，并提供洗脫樣本，所述洗脫樣本能夠與在后續(xù)陽離子交換純化中的 緩沖劑直接相容。然而，建議盡快執(zhí)行下面的步驟，優(yōu)選24小時以內(nèi)，使所述洗脫樣本保持 在pH6. 2下的時間盡可能地短。提高用于后續(xù)陽離子交換步驟的溶液的pH值是不現(xiàn)實的， 這會引起結(jié)合效率的降低，即便在最佳環(huán)境下所述CMl IgM與陽離子交換介質(zhì)的結(jié)合也是 弱的。III通過陽離子交換層析進行精細(xì)純化陽離子交換層析在所述陰離子交換層析(如上所述)24小時內(nèi)開始。陽離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱CIM S03單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A IOmM檸檬酸鹽，1. OM甘氨酸，pH6. 2緩沖劑B :250mM檸檬酸鹽，pH6. 2緩沖劑C :1. OM NaOH緩沖劑D :0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陽離子交換層析樣本溶液(從陰離子交換中聚集起來的組分)可達到室溫(18_23°C )。所述柱在 緩沖劑A中平衡。樣本依照1份樣本溶液到9份緩沖劑A進行在線稀釋，通過在線稀釋加 載樣本。注意緩沖劑A含有IOmM檸檬酸鹽，這與在其他實施例中的陽離子交換層析所使用 的緩沖劑A不同。所述介質(zhì)的單體容量顯示為至少30mg IgM/ml。所述柱以2-5CV緩沖劑 A沖洗(沖洗1 :2CV就足夠了，不超過5CV)。樣本使用5CV線形梯度達到12%緩沖劑B洗 脫，隨后所述柱被置于12%緩沖劑B中直到所述樣本峰被完全洗脫。從10%最大峰高度開 始持續(xù)到所述峰下降到10%最大峰高度(尾端)為止所收集的組分被匯集到一起。在尾端的5%最大峰值處開始的長而低的峰中預(yù)計會洗脫聚集物，因此在尾端10%最大峰值處之 后收集到的組分，不被匯集到從所述主峰中收集的組分中。500mM磷酸鹽pH7的溶液以10% 的體積比被添加到所述聚集起來的組分中，以提高PH值和導(dǎo)電性。由此產(chǎn)生含有25mM檸檬 酸鹽、50mM磷酸鹽、800mM甘氨酸，pH 6. 7的高純度IgM溶液，所述溶液被儲存在4°C下； 或者可直接將組分收集在磷酸鹽稀釋液(500mM磷酸鹽，pH7)中。所述柱用緩沖劑B清洗， 該清洗形成一小峰，理論上含有聚集物。所述柱在緩沖劑C中清潔并貯存在緩沖劑D中。該步驟在少于1個小時內(nèi)完成，但如果需要的話可以放慢?？梢源_定降低流速既 不會改善也不會降低柱性能。整體回收率約為90%，從所述主洗脫峰收集的所述組分的純 度超過99% IgM。一旦開始，采用陽離子交換層析的最終純化步驟應(yīng)不中斷地完成，這是因為陽離 子交換將IgM CMl暴露于易于產(chǎn)生聚集物的條件下(低pH值和極低導(dǎo)電性)，盡管溶液中 的甘氨酸能夠改善溶解性，甘氨酸只能降低聚集物風(fēng)險但無法將其完全消除。對于從上述給料量的CHT步驟中所回收的IgM量而言，這里的8ml柱尺寸過大了。 在單獨實驗中，在Iml單片(3個0. 34ml片堆疊而成)能夠結(jié)合從加載250ml細(xì)胞培養(yǎng)上 清液的5ml CHT柱之后的所述陽離子交換步驟中洗脫的所有IgM。該結(jié)果意味著8ml單片 能夠保留并釋放由加載到CHT上的至少2升細(xì)胞培養(yǎng)上清液(CHT給料)所生產(chǎn)的IgM。實施例3. LMl純化II.獲取樣本和采用羥磷灰石層析的初步純化LMlIgM從一(1)升澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的初始材料開始純化，其包含約200 μ g IgM/ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液。首先，細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用0. 22微米(0. 22 μ m)的濾網(wǎng)進行過濾。 以1 %的體積比添加PH7. 0的500mM磷酸鈉溶液，產(chǎn)生5mM的最終磷酸鹽濃度。如果所述 上清液已經(jīng)含有磷酸鹽，向所述過濾上清液中添加pH7. 0的500mM磷酸鈉的量為達到至少 5mM磷酸鹽濃度所需的最小量。測量溶液pH值，若pH值低于pH6. 8，添加pH8. 0的IMTris 溶液，產(chǎn)生6.8到7.2之間的最終pH值。所述樣本溶液可到達室溫(18-23°C)。羥磷灰石層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱11 型 CHT，40 微米，ATOLL 11. 3x1 OOmm ft流速100-200cm/hr(Atoll 柱上 1. 67-3. 34ml/min)緩沖劑A IOmM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑B :500mM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑C :50mM Tris, 1. OM 甘氨酸，2mM EDTA, pH8 (+/-O. 2)緩沖劑D :600mM KPO4, pH7緩沖劑E :1. OM NaOH緩沖劑F :0. IM NaOH,或20%乙醇，5mM磷酸鈉pH7羥磷灰石層析在緩沖劑A中平衡所述柱。對所述樣本采用100柱體積(100CV)。加載樣本后，所 述柱以2到5倍CV的緩沖劑A沖洗(沖洗1 :2CV就足夠了，不超過5CV)。所述柱隨后以 20%緩沖劑B(IOOmM磷酸鹽，10% PEG-600)沖洗，在該沖洗(沖洗2)中洗脫一大峰；所述 峰包括宿主細(xì)胞蛋白(HCP)。所述柱以20%緩沖劑B沖洗直到讀數(shù)返回到基值以下，在該 步驟中“沖洗到基值”對最佳的IgM純化是很重要的。
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盡管在該第二沖洗階段洗脫的所述峰的含量有時顯示了高達5%的明顯產(chǎn)品損 失，但這些產(chǎn)品可能是IgM片段。然而，當(dāng)產(chǎn)品損失看來過大時，減少緩沖劑B的濃度，但需 要了解減少緩沖劑B可能增加HCP的污染(即，在該沖洗步驟中HCP的徹底去除較弱，導(dǎo)致 將HCP帶到其它的步驟中去)?；蛘?，如果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品損失較少或沒有，提高所述沖洗步驟中 的磷酸鹽濃度，該提高以較小的沖洗體積將讀數(shù)QSOnm的UV吸收率)重新降低到基值，并 去除更多的HCP。采用5CV線性梯度達到65% B (325mM磷酸鹽，10% PEG-600)執(zhí)行洗脫，在該點后 所述柱被置于該置于該65%緩沖劑B中直到所述產(chǎn)品峰被洗脫。0. 5CV的組分被直接收集 到1. 15CV的IM甘氨酸(緩沖劑C,50mM Tris, 1. OM甘氨酸，2mM EDTA，pH8)中。所述洗脫 峰是如水般清澈的，并且在以甘氨酸稀釋時保持清澈。組分的收集從前端的10%最大峰高 度開始，但只到尾端開始出現(xiàn)污染物峰的肩(見圖1中所示的CHT中的LMl洗脫參考曲線) 為止。盡管聚集物可能在所述峰的尾端已經(jīng)開始洗脫，該收集/聚集的策略應(yīng)該已經(jīng)排除 了聚集物。可以確定，盡管所述梯度的終點可以略為減小(可能低至300mM磷酸鹽)，以提 供較高的產(chǎn)品純度，需要了解的是由于在后面的工藝步驟中去除了污染物，因此在該階段 不是必須采取該策略。組分的儲存溫度為4°C。用5-10CV的緩沖劑D清洗所述CHT柱，用 緩沖劑E清潔，并貯存在緩沖劑F中。在該實施例中，省略了如實施例1和2中所述的樣本稀釋，這是因為稀釋使樣本 加載時間加倍并且較低的稀釋的樣本的氯化鈉含量會導(dǎo)致結(jié)合更多污染物，生產(chǎn)較低純度 的IgM組分。結(jié)果顯示，當(dāng)對Ix體積的柱施加IOOx體積時(即100CV樣本溶液)，大多數(shù) IgM都被結(jié)合，盡管流過的組分應(yīng)當(dāng)在前幾輪中被留下，直到能夠確定樣本加載體積與柱容 量之間的關(guān)系。如果確認(rèn)了有效結(jié)合，那么就能夠增加所述加載體積。如果在稍后的流過 組分中檢測到明顯的產(chǎn)品損失，那么對應(yīng)減少所述樣本施加體積。采用具有不同產(chǎn)品濃度 的不同細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)需要分別確認(rèn)動態(tài)結(jié)合容量。CHT上的初步純化在IOcm床高、流速200cm/hr下，需要約6小時，包括需要5小時 加載樣本?？梢源_定工藝時間隨床高正比增加，即床高加倍則工藝時間加倍，這意味著初步 純化的CHT柱大概不應(yīng)在整個工藝規(guī)模下超過20cm床高，其中15cm是合適的，IOcm可能是 合適的，由持續(xù)具有良好填料質(zhì)量的能力決定。從CHT中洗脫后的樣本純度高達90%。由 于CHT上的初步純化也在IgM純化中提供了主要的聚集物去除步驟，從CHT洗脫后的聚集 物濃度低于1%，該參數(shù)通過尺寸排阻層析(SEC)確定。在聚集物濃度超過的情況下， 降低緩沖劑B的濃度(例如如上所述，降低到60%緩沖劑B)，盡管SEC的結(jié)果始終顯示聚 集物濃度低于1%，由此在本階段沒有明顯的理由需要對工藝進行調(diào)整。關(guān)于初步純化的注釋可以確認(rèn)，可使用相同濃度的PEG-600和PEG-1000，兩者可交換。PEG-1000的效 果略強，會引起所述抗體的洗脫稍晚，并相似地強化聚集物的去除；然而PEG-600熔點較低 且黏度較低。當(dāng)完全省略PEG時，所述抗體的洗脫大大提前，沖洗洗脫/洗脫設(shè)定點分別為 50mM磷酸鹽和210mM磷酸鹽，且?guī)缀醪蝗コ奂?。為了開發(fā)醫(yī)療用途的純化產(chǎn)品，研究在 不犧牲聚集物的去除的條件下所述PEG濃度能夠降低多少是值得的。作為替代方案，另外， 可替換使用PEG-400，由于PEG-400在室溫下為液體，這能夠簡化緩沖劑的制備。II采用陰離子交換層析的中間純化
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陰離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱CIM QA單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A:50mM Tris，IM 甘氨酸，2mM EDTA，ρΗ8· 0緩沖劑B IOmM磷酸鈉，1. OM甘氨酸，pH7. 0緩沖劑C 500mM磷酸鈉，pH7緩沖劑D :1. OM NaOH緩沖劑E :0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陰離子交換層析所述樣本溶液可達到室溫(18_23°C )。所述柱在緩沖劑A中被平衡。對2. 5CV/ min的8ml單體使用循環(huán)流速2. 5CV/min，樣本容量的測量在12CV/min下進行。所述樣本 溶液通過在線稀釋被加載到所述柱上，所述在線稀釋為一份樣本溶液中加入兩份緩沖劑A， 產(chǎn)生的總稀釋量為IOx的從CHT柱洗脫的體積。所述加載溶液中包括甘氨酸以強化抗體溶 解性并在整個樣本稀釋中抑制IgM聚合。用于該步驟的QA單片的期望柱容量約為每毫升 單片30mg IgM。所述柱用緩沖劑B沖洗(沖洗1)，然后以5CV 85%緩沖劑B，15%緩沖劑 C沖洗(沖洗幻，該沖洗產(chǎn)生一小峰，但不會導(dǎo)致明顯的IgM損失。使用5CV線性梯度達到51 %緩沖劑B，49%緩沖劑C從而洗脫樣品，隨后所述柱被 置于51%緩沖劑B，49%緩沖劑C中直到所述樣本峰被完全洗脫。在約250mM磷酸鈉(約 0. 5M甘氨酸中)下洗脫LM1，含有LMl的組分在洗脫時是清澈的。從前端的10%最大峰高 度開始持續(xù)到所述峰下降到10%最大峰高度(尾端)為止所收集的組分被匯集到一起?？?以預(yù)期任何殘留的聚集物是在尾端被洗脫的。所述柱通過100%的緩沖劑C清洗，產(chǎn)生含有 混合了幾種污染物的少量IgM的小尖峰，隨后產(chǎn)生一連串其他小污染物峰。所述柱在緩沖 劑D中清潔并貯存在緩沖劑E中。該中間純化步驟在不到一個小時內(nèi)完成，盡管如果需要 的話可以將其放慢。圖2和圖3顯示了在下述特定條件下通過陰離子交換層析進行LMl中間純化的參 考曲線，其中圖2顯示了整個純化步驟的參考曲線，圖3顯示了通過陰離子交換層析進行 LMl中間純化的洗脫峰高分析度曲線。圖2和圖3中的LMl陰離子層析執(zhí)行條件 CIM QA,層疊在一個外殼中的 3x0. 34ml 片，％il/min緩沖劑A :50mM Tris, IM 甘氨酸，2mM EDTA, pH8緩沖劑B IOmM NaPO4, IM 甘氨酸，pH7緩沖劑C :500mM NaP04, pH7平衡柱通過在線稀釋加載樣本，所述樣本為來自CHT的聚集起來的樣本(已經(jīng)以緩沖劑 A稀釋到3. 3x)，所述在線稀釋為1份樣本，兩份緩沖劑A用緩沖劑A沖洗用緩沖劑B沖洗洗脫:48CVLG 到 100% B
如上所述，可期待EDTA去除任何的鈣，由于CHT具有去除并用鈣替代除鈣以外的 金屬的能力，在CHT步驟中鈣可能已經(jīng)被所述樣本攜帶。所述加載溶液保持pH8. 0以強化 所述介質(zhì)的結(jié)合能力。清洗和洗脫在PH7. 0下執(zhí)行以強化去除HCP，并提供洗脫樣本，所述 洗脫樣本能夠與在后續(xù)陽離子交換純化中的緩沖劑直接相容。若需要但尚未執(zhí)行病毒過濾 步驟，可在所述陰離子交換步驟后執(zhí)行病毒過濾步驟。III通過陽離子交換層析進行精細(xì)純化陽離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱CIM S03單片(8ml)流速每分鐘高達10CV，較低的流速不會降低也不會顯著提升性能緩沖劑A =IOmM磷酸鈉，1. OM甘氨酸，pH7緩沖劑B 500mM磷酸鈉，pH7緩沖劑C :1. OM NaOH緩沖劑D 0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陽離子交換層析樣本溶液(從陰離子交換中聚集起來的組分)可達到室溫。所述柱在緩沖劑A中 平衡。樣本依照1份樣本溶液到9份緩沖劑A進行在線稀釋，通過在線稀釋加載樣本。在 這些條件下所述柱的容量顯示為至少每毫升單體30mg IgM0所述柱以2-5CV緩沖劑A沖洗 (沖洗1 :2CV就足夠了，不超過5CV)。樣本使用5CV線形梯度達到15%緩沖劑8(75!111磷 酸鹽)洗脫，隨后所述柱被置于15%緩沖劑B中直到所述樣本峰被完全洗脫。含有IgM的 組分在洗脫時是清澈的。可以確定由于LMl在低導(dǎo)電率值(低鹽度)下被洗脫，可以添加 NaCl，例如直到最終濃度0. 1M，以穩(wěn)定所述抗體并防止產(chǎn)生聚集物，其中NaCl能夠在洗脫 后立刻添加或者將組分直接收集到高鹽度的稀釋液中。收集到的組分被儲存在4°C下。所 述柱用緩沖劑B清洗，該清洗形成一含有顯著的IgM量的小峰。所述柱在緩沖劑D中清潔 并貯存在緩沖劑E中。圖4和圖5顯示了在下述特定條件下采用陽離子交換層析的LMl精細(xì)純化參考曲 線，其中圖4顯示了整個純化步驟的參考曲線，圖5顯示了通過LMl精細(xì)純化的洗脫峰高解 析度曲線。圖4和圖5中的精細(xì)純化執(zhí)行條件CIM S03,層疊在一個外殼中的 3x0. 34ml 片，％il/min緩沖劑A IOmM NaPO4, IM 甘氨酸，pH7緩沖劑B :500mM NaP04, pH7平衡柱通過在線稀釋加載樣本，所述樣本為來自陰離子交換的聚集起來的樣本，所述在 線稀釋為1份樣本，9份緩沖劑A用緩沖劑A沖洗洗脫:48CVLG 到 100% B對采用陽離子交換層析的LMl純化，所述洗脫峰的形狀在尾端缺乏定義，是非典 型的(見圖4和5，尤其圖5)。因此，為了防止收集到聚集物，匯集的規(guī)范被設(shè)定為排除大 部分的尾端部分，例如組分的收集僅僅持續(xù)到在所述尾端所述峰降低到25%最大峰值的位置，為了保證在所述尾端洗脫的聚集物不會與IgM峰一起被收集。該策略的有效性通過在 精細(xì)純化后采用高性能尺寸排阻層析(HPSEC)分析所述LMl峰組分進行評估，如實施例4 所述，并不能檢測到聚集物的存在(即聚集物的濃度低于約0. 的檢測下限)，確認(rèn)該方 法能夠產(chǎn)生不含有可檢測的IgM聚集物的制品。實施例4.純化的LMl的分析尺寸排阻層析對從精細(xì)純化層析獲得的含有IgM的組分進行分析尺寸排阻層析(SEC)以評估所 述純化的IgM的尺寸(分子半徑)，以及純度和所述含有IgM的樣本的其他特征。在如上面 的實施例4所述的采用陽離子交換層析的LMl精細(xì)純化中，從所述洗脫峰收集并匯集在一 起的 100ml LMl 樣本被加載到 GSW4000SEC 介質(zhì)(Toso BioSep, Stuttgart, DE)，以 0. 5ml/ min的流速用SEC緩沖劑(25mM MES, 0. 5mM甘氨酸，0. 5M NaCl, 0. 2M精氨酸，pH6. 8)執(zhí)行。 通過測量^Onm和300nm的吸收率測量蛋白質(zhì)總量，測量600nm的吸收率測量混濁度，從而 分析SEC洗脫液。也測量所述溶液的導(dǎo)電性。該樣本的分析SEC曲線如圖6所示。LMl在 單一的峰中洗脫，意味著幾乎不含例如IgM片段和IgM聚集物的污染物。所述LMl峰的中 心在注入后8. 55分鐘洗脫(圖6)。LMl洗脫時間為純化CMl所觀察到的所述SEC洗脫峰 之后1. 03分鐘(數(shù)據(jù)未顯示)，以及純化SAM6所觀察到的所述SEC洗脫峰之后1. 03分鐘 (數(shù)據(jù)未顯示)。已知所述SEC緩沖劑是為了防止特定氫結(jié)合、以及離子與疏水作用而特別 配制的，這些結(jié)果顯示了相比另兩種抗體(CMl和SAM6)，LM1 IgM具有較小的水力半徑。LMl 也顯示了從陽離子交換介質(zhì)中的不尋常的洗脫曲線，注意所述陽離子交換洗脫曲線和所觀 察到的LMl對pH值的敏感度。在含有LMl的樣本的SEC過程中，如A28tl和A3tltl的測量結(jié)果的平行軌跡所證實的， 在注入后20分鐘處所見的洗脫峰是緩沖劑人造峰。如A·、A300, A600的測量結(jié)果的平行軌 跡，以及同時發(fā)生的測得的導(dǎo)電性的增加所證實的，在注入后四到30分鐘所觀察到的人造 峰是由于樣本緩沖劑從所述柱洗脫的過程中引起的折射率的變化造成的。實施例5. SAM6純化程序I獲取樣本和采用羥磷灰石層析的初步純化通過使用2M尿素替代實施例1的工藝中的IM甘氨酸執(zhí)行所述SAM6純化程序。含 有尿素的緩沖劑在使用之前通過陰離子交換過濾進行過濾，例如Sartobind Q(單步，nano， lml)。強烈建議使用ACS級或更好的尿素。含有尿素的緩沖劑被指定為在不超過7天內(nèi)過 期，作為預(yù)防措施盡量減少氨甲?；目赡堋AM6 IgM從一升澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的初始材料開始純化，其包含約200 μ g IgM/ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液。首先，細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用0.22微米(0. 22 μ m)的濾網(wǎng)進行過 濾，隨后以1 %的體積比添加pH7. 0的500mM磷酸鈉，產(chǎn)生5mM的最終磷酸鹽濃度。如果所 述樣本已經(jīng)含有磷酸鹽，向所述過濾上清液中添加pH7. 0的500mM磷酸鈉的量為達到至少 5mM磷酸鹽濃度所需的最小量。以的體積比添加IMTris pH8. 0溶液，產(chǎn)生IOmM的最終 Tris濃度，預(yù)期產(chǎn)生6. 8到7. 2之間的最終pH值。所述樣本溶液可到達室溫(18-23°C )。羥磷灰石層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱11 型 CHT，40 微米，ATOLL 11.3x100mm 柱流速100-200cm/hr(Atoll 柱上 1. 67-3. 34ml/min)緩沖劑A IOmM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0
緩沖劑B :500mM 磷酸鈉，10% PEG-600，pH7. 0緩沖劑C 1. OM甘氨酸(非緩沖)pH7 (+/-O. 2)緩沖劑D IOmM 磷酸鈉，2M 尿素，2mM EDTA, pH7緩沖劑E :1. OM NaOH緩沖劑F 0. IM NaOH,或20%乙醇，5mM磷酸鈉pH7羥磷灰石層析在緩沖劑A (如上)中平衡所述柱(陶瓷羥磷灰石，CHTtmII型，40微米(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，11. 3x100mm 柱，預(yù)填 ATOLL Gmbti))。對所述樣本采用 100 柱 體積(100CV)、流速約0. lml/min的緩沖劑A。加載樣本后，所述柱以2到5倍CV的緩沖劑 A沖洗(沖洗1)。所述柱隨后以25%緩沖劑B(125mM磷酸鹽，10% PEG-600)沖洗，直到讀 數(shù)返回到通過測量^Onm，A280的吸收量所確定的基值以下。停止流動并且將Sartobind Q薄膜陰離子交換濾網(wǎng)結(jié)合到所述CHT柱的底部，然 后在沖洗條件下重新開始流動直到所述監(jiān)視器顯示Q料筒達到平衡。(A ImL料筒容納IOmL CHT柱，可能為10倍，可能多得多)。采用一⑴CV線性梯度達到70%緩沖劑B (350mM磷酸鹽，10% PEG-600)從所述柱 中洗脫樣本，所述柱被置于該置于該70%緩沖劑B中直到所述產(chǎn)品峰被洗脫。0. 5CV或更 少的組分被收集，聚集的溶液使用緩沖劑C稀釋到初始聚集體積的3. 3倍。所述洗脫峰是 如水般清澈的，并且在以甘氨酸稀釋時保持清澈。組分的儲存溫度為4°C。如推薦的，組分 的收集從前端的10%最大峰高度開始到尾端的10%最大峰高度為止，所述收集的組分被 匯集到一起進行進一步的純化。可預(yù)期該收集/聚集的策略能夠排除可能在所述樣本峰的 尾端開始洗脫的聚集物。用5-10CV的緩沖劑D清洗所述CHT柱，用緩沖劑E清潔，并貯存 在緩沖劑F中。II采用陰離子交換層析的中間純化在完成CHT上的初步純化之后的M個小時內(nèi)開始采用陰離子交換層析的中間純 化，且以％il/min的最小流速在AKTA ExplorerlOO上執(zhí)行。陰離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱CIM QA單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A =IOmM磷酸鈉，2M尿素，pH7緩沖劑B :50mM MES, IOmM NaCl，2M 尿素，ρΗ6· 2緩沖劑C :50mM MES，500mM NaCl，pH6. 2緩沖劑D :1. OM NaOH緩沖劑E 0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陰離子交換層析向從CHT中收集并聚集在一起的組分中以5%的體積比添加lMTris，pH8. 0的溶 液，產(chǎn)生50mM的最終Tris濃度，所述樣本溶液可達到室溫(18_23°C )。所述柱包括八(8)ml強陰離子交換體CIM QA單片，所述柱在緩沖劑A中被平 衡，所述樣本溶液通過在線稀釋被加載到所述柱上，所述在線稀釋為一份樣本(由泵A供 應(yīng))中加入4份緩沖劑A (由泵B供應(yīng))。該樣本稀釋產(chǎn)生的總稀釋量為IOx的從CHT柱洗脫的體積。用于該步驟的QA單片的期望柱容量約為每毫升單片30mg IgM。所述柱用緩沖 劑B沖洗(沖洗1)，然后以95%緩沖劑B，5%緩沖劑C沖洗(沖洗2)。隨后使用5CV線性梯度達到52%緩沖劑B，48%緩沖劑C從而洗脫樣品，所述柱被 置于52%緩沖劑B，48%緩沖劑C中直到所述樣本峰被完全洗脫。從前端的10%最大峰高 度開始到尾端的10%最大峰高度為止所收集的組分被匯集到一起?？梢灶A(yù)期任何殘留的聚 集物是在尾端被洗脫的。所述柱通過100%的緩沖劑C清洗，產(chǎn)生含有混合了幾種污染物的 少量IgM的小尖峰，隨后產(chǎn)生一連串其他小污染物峰。所述柱在緩沖劑D中清潔并貯存在 緩沖劑E中。該中間純化步驟在不到一個小時內(nèi)完成。關(guān)于中間純化的注釋注意1-2M NaCl可能會實現(xiàn)更好的柱清洗效果。唯一的缺點是需要制備該額外的 緩沖劑。所述柱使用Benzonase核酸酶進行臨時清洗去除積累的DNA可延長柱壽命(例如， 每10次使用，或者當(dāng)背壓變得過大時)。純化應(yīng)當(dāng)盡可能快地進入到下一步驟，以限制產(chǎn)品暴露于尿素中的時間。Tris尿 素緩沖劑的堿性PH值增加氨甲?；奈ｋU，但這通過簡短的接觸過程抵消。在較早的工藝 中，使用PH7的磷酸鹽，而所述容量規(guī)格也設(shè)在該pH值，因此Tris pH8可能能夠替代之前 的緩沖劑而不降低純化性能。III通過陽離子交換層析進行精細(xì)純化陽離子交換層析在所述陰離子交換層析(如上所述) 小時內(nèi)開始，且以^il/min 的最小流速在AKTA Explorer 100上執(zhí)行。陽離子交換層析的條件和試劑介質(zhì)/ 柱GIM(g) 單片(8ml)流速每分鐘高達IOCV緩沖劑A =IOmM磷酸鈉，2M尿素，pH7緩沖劑B :20mM檸檬酸鹽，2M尿素，pH6. 2緩沖劑C :250mM檸檬酸鹽，pH6. 2緩沖劑D :1. OM NaOH緩沖劑E 0. OlM NaOH 或 20% 乙醇陽離子交換層析一旦開始，采用陽離子交換層析的最終純化步驟應(yīng)不中斷地完成。樣本(從陰離子交換中聚集起來的組分)可達到室溫(18_23°C )。所述柱在緩沖 劑A中平衡。樣本依照1份樣本溶液到9份緩沖劑A進行在線稀釋，通過在線稀釋加載樣 本。CIM S03介質(zhì)的容量顯示為約30mg IgM/ml。所述柱以2-5CV緩沖劑A沖洗(沖洗1 2CV就足夠了，不超過5CV)，然后以5CV 95%緩沖劑B、5%緩沖劑C沖洗(沖洗幻，該沖洗 形成一小峰。 樣本使用5CV線形梯度達到60 %緩沖劑B、40 %緩沖劑C洗脫，然后所述柱被置于
60%緩沖劑B、40%緩沖劑C中直到所述樣本峰被完全洗脫。從前端的10%最大峰高度開
始到尾端的10%最大峰高度為止所收集的組分被匯集到一起。洗脫的IgM是清澈的?？梢?br> 預(yù)期任何殘留的聚集物是在尾端被洗脫的。PH7 500mM的磷酸鹽溶液以10%的體積比被添
加到所述聚集起來的組分中，以增加所述PH值，所述溶液被儲存在4°C下。所述柱用緩沖劑
29B清洗，該清洗形成一小峰。所述柱在緩沖劑D中清潔并貯存在緩沖劑E中。關(guān)于精細(xì)純化的注釋所述IgM應(yīng)當(dāng)在純化后不久，進行再次過濾去除尿素形成最終配液實施例6. LMl純化程序通過使用LMl替代實施例5的工藝中的SAM6執(zhí)行所述LMl純化程序，同時對所使 用的緩沖劑作出一定調(diào)整。在使用陰離子交換層析的所述中間純化中，緩沖劑A和B如下 制備緩沖劑A :50mM Tris, 2M EDTA，pH8. 0緩沖劑B =IOmM磷酸鈉，2Μ尿素，pH7. 0在采用陽離子交換層析步驟的精細(xì)純化中，省略所述第二沖洗，緩沖劑B、緩沖劑 B和C的混合物被下面的緩沖劑B所替代500mM磷酸鈉，pH7。所述洗脫步驟采用5CV線形 梯度達到15%緩沖劑B(75ml磷酸鹽)執(zhí)行。從10%最大峰值到所述峰值后的25% pf最 大峰值進行聚集。添加NaCl到0. IM濃度以穩(wěn)定所述抗體并抑制聚合。
權(quán)利要求
1.從樣本中純化蛋白質(zhì)產(chǎn)品的工藝，所述樣本包含所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品和所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品 的聚集物，所述工藝包括(a)第一層析步驟，包括使用非離子聚合物去除所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的所述聚集物，其中所 述非離子聚合物的濃度足以在所述層析條件下強化從所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的聚集物分離所述 蛋白質(zhì)產(chǎn)品，由此在本步驟之后收集含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品基本不含聚集物的組分；(b)合并步驟，將強化溶解性的添加劑與從所述第一層析步驟獲得的含有所述蛋白質(zhì) 產(chǎn)品的組分相合并，或者與隨后獲得的含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分相合并，該隨后獲得的 組分來自所述從所述第一層析步驟獲得的含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分，其中所述強化溶解 性的添加劑從由兩性離子、尿素化合物和亞烷基二醇組成的群中選?。灰约?c)第二層析步驟，包括使用離子交換層析，其中所述強化溶解性的添加劑的濃度足以 強化所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的溶解性并且基本上避免在所述層析條件下發(fā)生閉塞，且其中所述強 化溶解性的添加劑不干擾所述第二層析步驟，并且其中所述工藝產(chǎn)生基本不含聚集物的純 化蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
3.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品為免疫球蛋白或其片段。
4.如權(quán)利要求3所述的工藝，其中所述免疫球蛋白為IgM。
5.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述強化溶解的添加劑從由甘氨酸、甜菜堿、尿素、 乙二醇和聚乙二醇組成的群中選取。
6.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述第一層析步驟的所述非離子聚合物為聚乙二醇 (PEG)。
7.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述第一層析步驟包括羥磷灰石層析，其中所述非 離子聚合物的濃度足以在羥磷灰石層析條件下強化從所述聚集物中分離所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
8.如權(quán)利要求7所述的工藝，其中所述非離子聚合物為聚乙二醇且所述強化溶解的添 加劑從由甘氨酸和尿素組成的群中選取。
9.如權(quán)利要求8所述的工藝，其中在所述羥磷灰石層析后收集的所述組分被收集到含 有所述強化溶解的添加劑的混合物中。
10.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中對在所述第一層析步驟后收集的所述含有所述蛋 白質(zhì)產(chǎn)品的組分進行進一步的分離或純化步驟，從而產(chǎn)生含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品的組分，所 述蛋白質(zhì)產(chǎn)品來自從所述第一層析獲得的組分，所述進一步的分離或純化步驟在將該組分 與所述強化溶解的添加劑合并的步驟之前。
11.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述第二層析步驟包括陰離子交換層析。
12.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述第二層析步驟包括陽離子交換層析。
13.如權(quán)利要求11所述的工藝，其中所述第二層析步驟進一步包括陽離子交換層析。
14.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中從所述第一層析步驟獲得的含有所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品 的所述組分與含有所述強化溶解的添加劑相合并。
15.如權(quán)利要求14所述的工藝，其中所述強化溶解的添加劑為兩性離子。
16.權(quán)利要求1所述的工藝包括第三層析步驟，包括對從所述第二層析步驟獲得的組 分執(zhí)行離子交換層析。
17.如權(quán)利要求16所述的工藝，其中所述第二層析步驟為陰離子交換層析，所述第三層析步驟為陽離子交換層析。
18.如權(quán)利要求16所述的工藝，其中所述第二層析步驟為陽離子交換層析，所述第三 層析步驟為陰離子交換層析。
19.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中所述強化溶解的添加劑為甘氨酸。
20.如權(quán)利要求4所述的工藝，其中所述第一層析步驟包括羥磷灰石層析，其中所述非 離子聚合物的濃度足以在羥磷灰石層析條件下強化從所述IgM聚集物中分離IgM。
21.如權(quán)利要求20所述的工藝，其中所述非離子聚合物為聚乙二醇。
22.如權(quán)利要求21所述的工藝，其中所述非離子聚合物為濃度約10%的聚乙二醇。
23.如權(quán)利要求20所述的工藝，其中所述非離子聚合物為聚乙二醇，所述強化溶解的 添加劑從由兩性離子和尿素組成的群中選出。
24.如權(quán)利要求23所述的工藝，其中所述強化溶解的添加劑為甘氨酸。
25.如權(quán)利要求24所述的工藝，其中所述在第二層析步驟中使用甘氨酸，其濃度在約 0. 5M到約IM之間，其中所述工藝產(chǎn)生幾乎不含IgM聚集物的IgM，其中所述IgM的純度超 過約99%。
26.如權(quán)利要求25所述的工藝，進一步地其中在第一層析步驟的羥磷灰石層析之后收 集的組分被收集到含有濃度約IM的甘氨酸的混合物中。
全文摘要
一種蛋白質(zhì)(具體地說IgM抗體)純化方法，包括使用非離子聚合物的層析步驟(例如羥磷灰石層析，聚乙二醇作為所述聚合物)去除蛋白質(zhì)聚集物，隨后使用強化溶解的添加劑(例如尿素混合物、亞烷基二醇或兩性離子，尤其是甘氨酸)進行離子交換層析。
文檔編號C07K1/16GK102119168SQ200980130765
公開日2011年7月6日 申請日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日
發(fā)明者彼得·S·加尼翁 申請人:帕特里有限公司