專(zhuān)利名稱(chēng)：抗體復(fù)合物、抗原檢測(cè)方法及抗體復(fù)合物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體復(fù)合物、使用抗體復(fù)合物的抗原檢測(cè)方法及抗體復(fù)合物的制造方法。
背景技術(shù)：
作為微量抗原的檢測(cè)方法，以往開(kāi)發(fā)了 ELISA等，而最近開(kāi)發(fā)出提高了檢測(cè)靈敏度的、使用被稱(chēng)作MUSTag的復(fù)合物的方法(國(guó)際公報(bào)W02006/049^9)。具體而言，作為一例，可例舉如下方法采用使作為標(biāo)記的寡核苷酸通過(guò)G蛋白與抗體結(jié)合而成的復(fù)合物，使該復(fù)合物的抗體部分與抗原結(jié)合后，將寡核苷酸切斷并回收，用PCR檢測(cè)寡核苷酸，藉此檢測(cè)抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提高M(jìn)USTag的檢測(cè)靈敏度。發(fā)明人為了提高M(jìn)USTag的檢測(cè)靈敏度而對(duì)各種條件進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如實(shí)施例所示，通過(guò)將接合體(adapter)部位與抗體交聯(lián)，從而抗原的檢測(cè)靈敏度提高。以往已知G蛋白、A蛋白或L蛋白以高親和性結(jié)合于IgG分子的Fc區(qū)域，因此該發(fā)現(xiàn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是出乎意料的，這就提示使用了 MUSTag的抗原的檢測(cè)方法中，G蛋白、A蛋白或 L蛋白與抗體的結(jié)合力不足。本發(fā)明的一種實(shí)施方式是用于檢測(cè)抗原的抗體復(fù)合物，包含作為標(biāo)記的核酸鏈、 與所述抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將所述核酸鏈和所述抗體結(jié)合的接合體部位，所述接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，所述接合體部位與所述抗體化學(xué)交聯(lián)。所述抗體復(fù)合物可以包含能切斷所述核酸鏈的切割位點(diǎn)。所述切割位點(diǎn)可以被限制酶、光照射或活性氧切斷。所述接合體部位可以含有包含親和素類(lèi)的生物素結(jié)合區(qū)和G蛋白、A蛋白或L蛋白的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)的融合蛋白，核酸鏈可以是生物素結(jié)合核酸。所述抗體可以是單克隆抗體。本發(fā)明的又一種實(shí)施方式是檢測(cè)抗原的方法，包括使所述抗原與所述任一種抗體復(fù)合物接觸，形成包含所述抗原和所述抗體復(fù)合物的抗原抗體復(fù)合物的工序；以及檢測(cè)所述寡核苷酸鏈的檢測(cè)工序。所述抗原抗體復(fù)合物可以包含所述抗體復(fù)合物，所述檢測(cè)工序可以包括在所述切割位點(diǎn)切斷并回收所述寡核苷酸鏈的工序。所述檢測(cè)工序可以包括擴(kuò)增所述寡核苷酸鏈的工序以及檢測(cè)經(jīng)擴(kuò)增的所述寡核苷酸鏈的工序。本發(fā)明的又一種實(shí)施方式是抗原的檢測(cè)用試劑盒，包含抗體復(fù)合物，該抗體復(fù)合物包含作為標(biāo)記的核酸鏈、與所述抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將所述核酸鏈和所述抗體結(jié)合的接合體部位，所述接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，所述接合體部位與所述抗體化學(xué)交聯(lián)。所述抗體復(fù)合物可以包含能切斷所述核酸鏈的切割位點(diǎn)。所述切割位點(diǎn)可以被限制酶、光照射或活性氧切斷。所述接合體部位含有包含親和素類(lèi)的生物素結(jié)合區(qū)和G蛋白、A蛋白或L蛋白的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)的融合蛋白，核酸鏈可以是生物素結(jié)合核酸。所述抗體可以是單克隆抗體。==相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用==本申請(qǐng)主張基于2008年6月30日向日本特許廳提交的特愿2008-171512的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用該基礎(chǔ)申請(qǐng)而將其包括在本說(shuō)明書(shū)中。


圖1是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的純化后的G蛋白/鏈霉親和素/His-tag融合蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果的照片。圖2是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中使用交聯(lián)型MUSTag來(lái)檢測(cè)各種抗原濃度中的抗原的結(jié)果的圖。圖3是將本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中使用交聯(lián)型MUSTag來(lái)檢測(cè)各種抗原濃度中的抗原的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后的圖。圖4是表示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中使用采用多種交聯(lián)劑制成的交聯(lián)型MUSTag來(lái)檢測(cè)各種抗原濃度中的抗原的結(jié)果的圖以及將檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后的圖。
具體實(shí)施例方式以下例舉實(shí)施例對(duì)基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。對(duì)實(shí)施方式和實(shí)施例沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，采用J. Sambrook，Ε. F. Fritsch&T. Maniatis (編)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(Molecular cloning, a laboratory manual)(第 3 版)， 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Press)，紐約冷泉港，(2001) ；F. M. Ausubel, R. Brent, R. Ε. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (IS )，IfIS^i 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Molecular Biology)，約翰韋利森公司(John ffiley&Sons Ltd.)等標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方案(protocol)集中記載的方法或者對(duì)其進(jìn)行修飾或改變后的方法。使用市售的試劑盒或測(cè)定裝置的情況下，如無(wú)特別說(shuō)明，則采用它們附帶的試驗(yàn)方案。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)及其技術(shù)思想通過(guò)本說(shuō)明書(shū)的記載而為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的記載，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員即可容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記載的發(fā)明的實(shí)施方式及具體實(shí)施例等表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，是為了例舉或說(shuō)明而示出的，本發(fā)明并不限定于此。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，在本說(shuō)明書(shū)中揭示的本發(fā)明的思想及范圍內(nèi)，可以基于本說(shuō)明書(shū)的記載進(jìn)行各種改變及修飾。==交聯(lián)型抗體復(fù)合物==本發(fā)明的抗體復(fù)合物包含作為標(biāo)記的核酸鏈、與作為檢測(cè)對(duì)象的抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將核酸鏈和抗體結(jié)合的接合體部位，接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，接合體部位與抗體化學(xué)交聯(lián)。作為標(biāo)記的核酸鏈可以是DNA也可以是RNA，因?yàn)榭墒箼z測(cè)變得容易，所以較好是 DNA。其長(zhǎng)度沒(méi)有限制，優(yōu)選為較短，以使切割或檢測(cè)時(shí)酶等容易作用，但為了易于檢測(cè)，較好是十幾個(gè)堿基 幾十個(gè)堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸。另外，可以是單鏈或雙鏈，從穩(wěn)定性的角度來(lái)看較好是雙鏈。為了通過(guò)PCR等檢測(cè)該核酸鏈，核酸鏈的堿基序列較好是盡可能為特異性的。
抗體復(fù)合物所包含的核酸鏈和抗體通過(guò)接合體部位結(jié)合。藉此，可進(jìn)一步提高寡核苷酸復(fù)合抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高所得復(fù)合物的產(chǎn)率，并且還可獲得提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效果等效果。該接合體部位如果包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)， 則其它構(gòu)成無(wú)特別限制。 因此，接合體部位可以包含G蛋白、A蛋白或L蛋白的蛋白本身，也可以包含它們的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)和其它肽的融合蛋白。應(yīng)予說(shuō)明，這里，G蛋白、A蛋白或L蛋白不僅可以是野生型蛋白，也可以是具有免疫球蛋白結(jié)合活性的突變型蛋白。例如，G蛋白(GenBank登錄號(hào)cDNA :X06173，蛋白質(zhì):CAA29540)的情形，免疫球蛋白結(jié)合區(qū)是第303-357位、第373-427位、第443-497位氨基酸的區(qū)域；A蛋白(GenBank 登錄號(hào)cDNA :M18264,蛋白質(zhì)·Μ· ~)的情形，免疫球蛋白結(jié)合區(qū)是第39-88位、第 100-149位、第158-207位、第216-265位、第274-323位氨基酸的區(qū)域；L蛋白(GenBank 登錄號(hào)cDNA:M86697，蛋白質(zhì)AAA25612)的情形，免疫球蛋白結(jié)合區(qū)是第115-173位、第 185-245位、第257-317位、第3四_389位、第400-462位氨基酸的區(qū)域。接合體部位還可以包含制造時(shí)所需的標(biāo)簽(tag)。標(biāo)簽的種類(lèi)無(wú)特別限制，可以是 GST-tag或MBP-tag、myC-tag或flag-tag等，從因能結(jié)合于低分子的鎳而在化學(xué)交聯(lián)工序中沒(méi)有影響的角度來(lái)看，標(biāo)簽較好是Hi s-tag。接合體部位所包含的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)與抗體直接結(jié)合，但與核酸鏈既可以直接結(jié)合也可以間接結(jié)合。間接結(jié)合的情況下，可以想到例如以下各種形態(tài)親和素類(lèi)的生物素結(jié)合區(qū)和G蛋白、A蛋白或L蛋白的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)通過(guò)接頭(linker)化合物而結(jié)合、 或形成融合蛋白，另一方面，核酸鏈與生物素結(jié)合，且生物素結(jié)合區(qū)與生物素結(jié)合的情況; 免疫球蛋白結(jié)合區(qū)和核酸鏈均與生物素結(jié)合，且這些生物素彼此通過(guò)親和素類(lèi)結(jié)合的情況等。作為接頭化合物，可使用例如4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(Sulfo · SMCC)等。這里，因?yàn)橛H和素類(lèi)通常形成同型四聚體，每1個(gè)亞單位具有1個(gè)生物素結(jié)合區(qū)， 所以整個(gè)蛋白具有4個(gè)生物素結(jié)合區(qū)，但對(duì)于本發(fā)明所用的生物素結(jié)合區(qū)而言，只要具有1 個(gè)亞單位即可，或者也可以形成四聚體。但是，為了形成將作為標(biāo)記的核酸鏈暴露在溶液中的結(jié)構(gòu)，較好是在1分子G蛋白上結(jié)合1分子的核酸鏈，為此，較好是使用不形成四聚體而僅有1個(gè)生物素結(jié)合區(qū)那樣的單體的親和素類(lèi)突變體。至今為止對(duì)成為單體的親和素類(lèi)突變體進(jìn)行了大量的研究，但大多都不成功(Qureshi, M. H.，和Wong，S. L (2002). Protein Expr Purif 25卷，409-415頁(yè)；Laitinen，0. H.等，(2003). J Biol Chem 278卷，4010-4014 頁(yè))。但是，本發(fā)明中，如實(shí)施例所示，通過(guò)使用具有鏈霉親和素的第39-183位氨基酸序列的肽，可制成不喪失與生物素的結(jié)合活性的突變體。親和素類(lèi)是指親和素、鏈霉親和素或中性親和素(二 -一卜，7· m > )等生物素結(jié)合蛋白。例如，親和素(RefSeq登錄號(hào)cDNA =NM 205320，蛋白質(zhì)=NP 990651)和中性親和素(序列與親和素相同，經(jīng)過(guò)脫糖基處理)的情形，生物素結(jié)合區(qū)是第觀(guān)-146位氨基酸的區(qū)域；鏈霉親和素(GenBank登錄號(hào)cDNA :X03591，蛋白質(zhì)的情形，生物素結(jié)合區(qū)是第39-156位氨基酸的區(qū)域。接合體部位與抗體化學(xué)交聯(lián)，但對(duì)于交聯(lián)的種類(lèi)無(wú)特別限制?？衫e例如氨基間交聯(lián)、羧基間交聯(lián)、巰基間交聯(lián)等。接合體部位中，與抗體交聯(lián)的氨基酸殘基無(wú)特別限制，較好是與抗體直接結(jié)合的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)中的殘基?？贵w只要能與作為檢測(cè)對(duì)象的抗原特異性結(jié)合，則既可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。抗體的種類(lèi)無(wú)特別限制，例如可以是IgG也可以是IgM，但必須是接合體部位所包含的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)結(jié)合的種類(lèi)的抗體。如上所述，在包含核酸鏈、抗體及將核酸鏈和抗體結(jié)合的接合體部位的抗體復(fù)合物中，通過(guò)將接合體部位與抗體交聯(lián)而制成交聯(lián)型抗體復(fù)合物，從而使抗原的檢測(cè)靈敏度
顯者提尚。上述抗體復(fù)合物可以包含能切斷核酸鏈的切割位點(diǎn)。該切割位點(diǎn)可以設(shè)置在核酸、抗體、接合體部位中的任意一個(gè)上，其特性根據(jù)設(shè)置部位而不同，例如，設(shè)置在核酸上時(shí)，是利用限制酶的切割位點(diǎn)；設(shè)置在抗體或蛋白的接合體上時(shí)，是利用蛋白酶的切割位點(diǎn)；設(shè)置交聯(lián)劑(crosslinker) O價(jià)的交聯(lián)劑等)作為接合體時(shí)，是利用光照射或活性氧的切割位點(diǎn)。但是，從簡(jiǎn)便性和特異性方面考慮，較好是在核酸鏈上設(shè)置利用限制酶的切割位點(diǎn)ο另外，為了使核酸鏈作為標(biāo)記起作用，可使其與放射性同位素、熒光染料、酶等標(biāo)記物結(jié)合。==交聯(lián)型抗體復(fù)合物的制造方法==包含核酸鏈、抗體及將核酸鏈和抗體結(jié)合的接合體部位的交聯(lián)型抗體復(fù)合物只要制造成包含這些構(gòu)成要素即可，無(wú)特別限制。例如可以首先使作為標(biāo)記部分的核酸鏈結(jié)合于接合體部位，接著將接合體部位固定于抗體而制成抗體復(fù)合物，然后用化學(xué)交聯(lián)劑將接合體部位與抗體交聯(lián)。使核酸鏈直接結(jié)合于接合體部位的情況下，可以結(jié)合于接合體部位的任何位置， 例如可以用氨基或巰基修飾核酸鏈的末端，用合適的交聯(lián)劑使其與接合體部位中的氨基、 羧基、巰基等官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)而結(jié)合。另外，使核酸鏈間接結(jié)合于接合體部位的情況下，可以使接合體部分與親和素類(lèi)的生物素結(jié)合區(qū)結(jié)合，將核酸鏈生物素化，通過(guò)常規(guī)方法將兩者混合，藉此使核酸鏈結(jié)合于接合體部分?；蛘?，也可以預(yù)先將接合體部分和核酸鏈等都生物素化，通過(guò)常規(guī)方法將該接合體部分與核酸鏈混合，同時(shí)添加親和素類(lèi)，藉此使核酸鏈通過(guò)親和素類(lèi)結(jié)合于接合體部分。接著，通過(guò)常規(guī)方法將接合體部分/核酸鏈結(jié)合體與抗體混合，藉此可獲得抗體復(fù)合物。最后，用化學(xué)交聯(lián)劑處理該抗體復(fù)合物，藉此將抗體復(fù)合物中的接合體部位與抗體交聯(lián)。作為交聯(lián)劑，可使用庚二亞氨酸二甲酯(dimethylpimelimidate，DMP)、辛二亞氨酸二甲酯(dimethyl suberimidate, DMS)、雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯 (Bis[Sulfosuccinimidyl] suberate, BS3)等，為了提高交聯(lián)的效率，使抗體復(fù)合物_接合體部位更特異性地交聯(lián)，較好是使用DMP。==使用交聯(lián)型抗體復(fù)合物的抗原檢測(cè)方法==使由此制成的交聯(lián)型抗體復(fù)合物與作為檢測(cè)對(duì)象的抗原接觸，形成抗原抗體復(fù)合物。對(duì)于作為檢測(cè)對(duì)象的抗原，其種類(lèi)、存在形式等無(wú)特別限制，只要能用抗體來(lái)識(shí)別，則是蛋白質(zhì)、糖、核酸均可，既可以是純化物也可以是提取物。另外，可以存在于病毒或細(xì)胞，此時(shí)，可以將病毒或細(xì)胞直接用于檢測(cè)。因此，被檢試樣可以是例如生物體成分(組織或血液)或其提取物、食用肉類(lèi)或蔬菜等食品類(lèi)、土壤或河水等?？乖贵w復(fù)合物的制造方法無(wú)特別限制，可以使抗原在支撐物上固定化或不固定化，例如，通過(guò)將抗原在支撐物上固定化，使交聯(lián)型抗體復(fù)合物結(jié)合于抗原，從而使交聯(lián)型抗體復(fù)合物結(jié)合于支撐物。然后，通過(guò)用緩沖液洗滌，可除去未反應(yīng)的交聯(lián)型抗體復(fù)合物， 可獲得高純度的抗原抗體復(fù)合物。該支撐物可使用塑料的底面或珠(E)等。此外， 要將抗原固定化于支撐物，既可以使抗原直接結(jié)合于支撐物，也可以使抗原間接結(jié)合于支撐物。直接結(jié)合的情況下，只要使含抗原的緩沖液與支撐物接觸即可；間接結(jié)合的情況下， 只要預(yù)先使抗原所結(jié)合的物質(zhì)(例如抗體等)結(jié)合于支撐物，這時(shí)再使含抗原的緩沖液與支撐物接觸即可。為了提高特異性，較好是后者的間接結(jié)合。為了檢測(cè)結(jié)合于抗原的交聯(lián)型抗體復(fù)合物，可以連同容器一起通過(guò)PCR等來(lái)檢測(cè)交聯(lián)型抗體復(fù)合物中的核酸，但為了簡(jiǎn)化檢測(cè)操作，較好是回收核酸。核酸可以連同交聯(lián)型抗體復(fù)合物一起回收，例如可按照常規(guī)方法通過(guò)使抗原和抗體解離來(lái)回收交聯(lián)型抗體復(fù)合物?；蛘咭部梢灾换厥蘸怂?，實(shí)施酸處理、堿處理、熱處理、蛋白酶處理等來(lái)使交聯(lián)型抗體復(fù)合物變性或分解即可。但是，通過(guò)這樣過(guò)于激烈的處理，無(wú)法通過(guò)HRP等的酶反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，為了進(jìn)行 PCR，需要純化核酸，以使Taq聚合酶等酶能工作。因此，較好是在交聯(lián)型抗體復(fù)合物上設(shè)置可通過(guò)限制酶處理或光處理等柔和的處理將核酸鏈切斷的切割位點(diǎn)。于是，為了進(jìn)行核酸鏈的檢測(cè)，在該切割位點(diǎn)處將核酸鏈從抗原抗體復(fù)合物上切斷并回收。通過(guò)該回收工序，可在核酸鏈檢測(cè)前進(jìn)行濃縮，即使是更少量的核酸鏈也能檢測(cè)出來(lái)。對(duì)如上所述回收的核酸鏈進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法無(wú)特別限制，核酸鏈上結(jié)合有放射線(xiàn)同位素、熒光染料、酶等標(biāo)記時(shí)也可以檢測(cè)該標(biāo)記。但是，從檢測(cè)靈敏度的角度來(lái)看，較好是將核酸鏈擴(kuò)增后進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增方法按照常規(guī)方法即可，可使用PCR法、LAMP法、ICAN法等。另外，檢測(cè)也只要采用電泳法等常規(guī)方法即可。應(yīng)予說(shuō)明，為了同時(shí)檢測(cè)多種抗原，通過(guò)使用包含與各抗原特異性結(jié)合的抗體以及與抗原的種類(lèi)一一對(duì)應(yīng)的核酸鏈的抗體復(fù)合物，可使各抗原與各核酸鏈相對(duì)應(yīng)。這樣，通過(guò)檢測(cè)各核酸鏈，可分別檢測(cè)各抗原。此時(shí)，為了獲得與各抗原相對(duì)應(yīng)的特異性抗體復(fù)合物，需要在分別形成各抗體復(fù)合物后預(yù)先進(jìn)行純化，使用時(shí)將抗體復(fù)合物分別混合即可。對(duì)于與不同抗原相對(duì)應(yīng)的核酸鏈，既可以通過(guò)改變序列來(lái)使其具有特異性，也可以通過(guò)改變長(zhǎng)度來(lái)使其具有特異性。后者的情況下，也可以使DNA擴(kuò)增用引物能通用。另外，通過(guò)用不同種類(lèi)的標(biāo)記(例如酶的情況下如堿性磷酸酶和HRP)對(duì)核酸鏈進(jìn)行標(biāo)記，也可使其具有特異性。==抗原檢測(cè)用試劑盒==為了使采用本發(fā)明的交聯(lián)型抗體復(fù)合物的抗原檢測(cè)變得容易，可以將必要的試劑制成試劑盒以作為抗原檢測(cè)用試劑盒。該試劑盒包含抗體復(fù)合物，該抗體復(fù)合物包含作為標(biāo)記的核酸鏈、與作為檢測(cè)對(duì)象的抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將核酸鏈和抗體結(jié)合的接合體部位。這里，接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，接合體部位與抗體化學(xué)交聯(lián)。
其它抗體復(fù)合物的形態(tài)如“交聯(lián)型抗體復(fù)合物”項(xiàng)中所述。該試劑盒中除了交聯(lián)型抗體復(fù)合物外還可以包含其它構(gòu)成成分，可以包含各種緩沖液、引物或酶等檢測(cè)用試劑。實(shí)施例下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行具體說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍不受下述實(shí)施例的限定。= = G蛋白/鏈霉親和素/His-tag融合蛋白的制作==首先制作G蛋白/鏈霉親和素/His-tag融合蛋白(下稱(chēng)融合蛋白)。首先，作為包含G蛋白中的與IgG抗體Fc區(qū)域的結(jié)合區(qū)域的部分，通過(guò)基于磷酸基部位無(wú)保護(hù)法的化學(xué)合成法來(lái)合成編碼序列號(hào)1 (G蛋白全長(zhǎng)，GenBank登錄號(hào)僅1382幻所示的氨基酸序列中的第2 位 第268位的氨基酸序列區(qū)(序列號(hào)2)的DNA(序列號(hào)3所示的堿基序列中的第1259位 第1381位的堿基序列(序列號(hào)4))；以及，作為包含鏈霉親和素中的與生物素的結(jié)合區(qū)域的部分，通過(guò)基于磷酸基部位無(wú)保護(hù)法的化學(xué)合成法來(lái)合成編碼序列號(hào)5 (鏈霉親和素全長(zhǎng)，GenBank登錄號(hào)X03591)所示的氨基酸序列中的第39位 第183位的氨基酸序列區(qū)(序列號(hào)6)的DNA(序列號(hào)7所示的堿基序列中的第164位 第598位的堿基序列區(qū)(序列號(hào)8))。此時(shí)，根據(jù)需要使以片段的形式合成的各雙鏈DNA結(jié)合，制成全長(zhǎng)DNA。 然后，分別以各合成好的DNA為模板，用下述引物以<95°C 30秒_55°C 30秒_72°C 30秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)〉的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，擴(kuò)增各雙鏈DNA。應(yīng)予說(shuō)明，設(shè)計(jì)各引物，使得通過(guò)PCR 得到的DNA片段的兩端(小寫(xiě)字體部分的堿基序列)具有限制酶識(shí)別位點(diǎn)。G蛋白引物F:5' -CATATGCACTTACAAATTAATCCTTAA-3‘(序列號(hào) 9)G蛋白引物R 5' -GAATTCGGATCCTTCACCGTCAACACCGTTG-3'(序列號(hào) 10)鏈霉親和素引物F:5' -GAATTCAAGCTTGCCGGCATCACCGGCACCTG-3'(序列號(hào) 11)鏈霉親和素引物R 5' -CTGCAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCG-3 ‘(序列號(hào) 12)用EcoRI切割所得DNA片段后，通過(guò)連接(ligation)使其結(jié)合，再次用G蛋白引物F和鏈霉親和素引物R進(jìn)行PCR，擴(kuò)增融合DNA片段。接著，使用用于合成與His-tag的融合蛋白的細(xì)菌用表達(dá)載體pCR2. 1(英杰 (Invitrogen)公司)，用NdeI切割擴(kuò)增后的融合DNA片段，插入該載體的NdeI位點(diǎn)。如上所述構(gòu)建成具有編碼G蛋白/鏈霉親和素/His-tag融合蛋白(序列號(hào)13)的堿基序列(序列號(hào)14)的重組載體。將該重組載體導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，使大腸桿菌溶菌，用固相化有鎳螯合物的瓊脂糖珠(品名Ni-NTA agarose，公司名凱杰(QIAGEN)，產(chǎn)品編號(hào) 30210)來(lái)純化G蛋白/鏈霉親和素/His-tag融合蛋白。純化后的蛋白的分析結(jié)果的一例 (采用SDS-PAGE的分析)示于圖1。==寡核苷酸的生物素化==以插入了具有序列號(hào)15的序列(131個(gè)堿基)的DNA的pcDNA3 (英杰公司制)作為模板DNA，用包含生物素化引物(5-MUSTagBio)的下述引物(序列號(hào)16和17)以<95°C60 秒-55°C 60秒-72°C 30秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán) > 的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，由此合成5’末端被生物素化的寡核苷酸鏈#1 (序列號(hào)15)。
#1 5，-[生物素]-CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCT ATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCACCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGCACACCAAACGTGGCTTGCC-3，( 序列號(hào)1 同樣地，以插入了具有序列號(hào)18的序列的DNA的pcDNA3(英杰公司制)作為模板， 用相同的引物(序列號(hào)16、17)來(lái)合成5’末端被生物素化的寡核苷酸鏈#7 (序列號(hào)18)。#7 5，-[生物素]-CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCT ATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAACCGACAATTGCATGAAGAACTCGCACATTGACGTCAATAATGACGTA TGTTCCCACCACCAAACGTGGCTTGCC-3，(序列號(hào) 18)<PCR用引物的序列〉5-MUSTag 引物 Bio-F 5'-[生物素]-CACTGCTTACTGGCTTATCGAAA-3'(序列號(hào) 16)3-MUSTag 引物 R:5' -GGCAAGCCACGTTTGGTG-3 ‘(序列號(hào) 17)==交聯(lián)型抗體復(fù)合物的制造==(1)寡核苷酸和抗體向融合蛋白的結(jié)合在微量離心管中添加結(jié)合緩沖液(0. 2M硼酸鹽(Borate) pH 9. 0,0. 5麗aCl，0. ImM EDTA，0. 05% 單癸酸酯(Monocaprate)) 243. 4 μ 1、融合蛋白 6. 6 μ 1 (IOOpmol)、生物素化寡核苷酸(對(duì)于IFN-Y及IL-12而言是#1，對(duì)于EGF及IL-15而言是#7) 40 μ 1 (IOOpmol)， 室溫下旋轉(zhuǎn)0. 5小時(shí)并同時(shí)使生物素化寡核苷酸與融合蛋白的鏈霉親和素部位結(jié)合。然后添加下述抗體(0. 5mg/ml)60y l(200pmol)，室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)并同時(shí)使抗體與融合蛋白的 G蛋白部位結(jié)合。<抗體的種類(lèi)>抗hEGF抗體種類(lèi)山羊多克隆的(goat polyclonal)，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào) AF236，濃度0. 5mg/mL抗hIFN-γ抗體種類(lèi)山羊多克隆的，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)AF_285_NA，濃度 0. 5mg/mL抗hIL_12p70抗體種類(lèi)小鼠IgGl，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)MAB611 (clone 24945)，濃度0. 5mg/mL抗hIL-15 抗體種類(lèi)小鼠 IgGl，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào):MAB247 (clone 34593)， 濃度0. 5mg/mL(2)交聯(lián)反應(yīng)以與反應(yīng)溶液相同的量(約350μ 1)添加臨使用前用偶聯(lián)緩沖液調(diào)整至6mM的 DMP (Pierce, #21667, MW 259. 177)并混合，室溫下靜置 1 小時(shí)。添加 IM Tris (pH 7.4)以使終濃度達(dá)到50mM，室溫下靜置15分鐘，使交聯(lián)反應(yīng)停止后，用0. 45 μ m PTFE濾器(制品名=Millex冊(cè)，公司名密理博(Millipore)，產(chǎn)品編號(hào)SLFHR04NL)過(guò)濾。最后以下述條件通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法分離反應(yīng)液，回收分子量最大的峰的組分，將其作為MUSTag溶液。溶液中的MUSTag的濃度以制造中所用的抗體為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)用ELISA進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。<凝膠過(guò)濾色譜法的條件>機(jī)器制品名SMART system，公司名原法瑪西亞(Pharmacia)(現(xiàn)通用醫(yī)療(GE Healthcare)，制造中止品)柱制品名=Superdex 200PC 3. 2/30，公司名通用醫(yī)療，產(chǎn)品編號(hào):17-1089-01緩沖液10mMTris-HCl pH 7. 4,0. 5M NaCl,0. ImM EDTA，0. 05%單癸酸酯流速100yl/min(3)抗原與MUSTag的結(jié)合將分別針對(duì)EGF、IFN-y , IL-12、IL-15的下述捕捉用抗體采用固相化用緩沖液 (0. 05M NaHCO3-Na2CO3緩沖液(pH 9. 6)、0· 02%疊氮化鈉)調(diào)整至2 μ g/mL的濃度，在96孔板的各孔內(nèi)添加50μ 1，于4°C靜置過(guò)夜，藉此將捕捉用抗體固相化于板。固相化后，棄掉孔內(nèi)的液體，添加1%BSA/PBS 50μ1，室溫下靜置60分鐘，進(jìn)行板的封閉。然后，添加如下調(diào)整的8級(jí)濃度的各抗原50 μ 1并混合，室溫下靜置60分鐘，使其與固相化于板上的捕捉用抗體結(jié)合?？贵w結(jié)合后，棄掉孔內(nèi)的溶液，添加25 μ 1的用MUSTag稀釋液(1% BSA/0. 05% Tween 20/0. 45Μ NaCl/50mMN￡i2HP04-NaH2P04 緩沖液(ρΗ 7. 4))調(diào)整至 8ng/mL 的濃度的交聯(lián)MUSTag、以及作為對(duì)照的未交聯(lián)的MUSTag，室溫下放置60分鐘，使其與抗原結(jié)合。然后， 用第一洗滌緩沖液(0. 5M NaCl/0. 05% Tween20/20mM Tris-HCl (pH 7. 4)) 300 μ L洗滌各孔 1次，用第二洗滌緩沖液(0. 05% Tween 20/PBS 300 μ L)洗滌各孔3次。<捕捉用抗體的種類(lèi)>抗hEGF抗體種類(lèi)小鼠IgGl，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào):MAB636 (clone 10827)，保存濃度0. 5mg/mL抗hIFN- γ抗體種類(lèi)小鼠IgG2A，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)MAB^52 (clone Κ3· 53)，保存濃度0. 5mg/mL抗hIL-12抗體種類(lèi)山羊多克隆的，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)AF_219_NA，保存濃度0. 5mg/mL抗hIL-15 抗體種類(lèi)小鼠 IgGl，公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào):MAB647 (clone 34505)， 保存濃度0. 5mg/mL〈抗原的調(diào)整〉下面，各抗原的稀釋中使用抗原稀釋液(1% BSA/PBS)。將rhEGF的原液(公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)236_EG，保存濃度200 μ g/mL)稀釋 100000倍，調(diào)整至2000pg/mL。進(jìn)一步將稀釋抗原液以10倍的倍數(shù)逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?個(gè)等級(jí)的10倍稀釋系列，包括陰性對(duì)照(Opg/mL，僅有抗原稀釋液)在內(nèi)準(zhǔn)備了 8種濃度0000， 200,20,2,0. 2,0. 02,0. 002，0[pg/mL])的抗原。將rhIFN- γ的原液(公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)285_IF，保存濃度100 μ g/mL)稀釋 5000倍，調(diào)整至20000pg/mL。進(jìn)一步將稀釋抗原液以5倍的倍數(shù)逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?個(gè)等級(jí)的5倍稀釋系列，包括陰性對(duì)照(Opg/mL，僅有抗原稀釋液)在內(nèi)準(zhǔn)備了 8種濃度(20000， 4000，800，160，32，6. 4，1. 28,0 [pg/mL])的抗原。
將rhIL-12的原液(公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)219_IL，保存濃度:10μ g/mL)用1% BSA/PBS稀釋250倍，調(diào)整至40000pg/mL。進(jìn)一步將稀釋抗原液以5倍的倍數(shù)逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?個(gè)等級(jí)的5倍稀釋系列，包括陰性對(duì)照(Opg/mL，僅有抗原稀釋液)在內(nèi)準(zhǔn)備了 8種濃度(40000,8000,1600,320,64,12. 8,2. 56,0[pg/mL])的抗原。將rhIL-15的原液(公司名R&D，產(chǎn)品編號(hào)247_IL，保存濃度10μ g/mL)稀釋 2500倍，調(diào)整至4000pg/mL。進(jìn)一步將稀釋抗原液以5倍的倍數(shù)逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?個(gè)等級(jí)的 5倍稀釋系列，包括陰性對(duì)照(Opg/mL，僅有抗原稀釋液)在內(nèi)準(zhǔn)備了 8種濃度0000，800， 160，32，6. 4，1. 28，0. 256，0 [pg/mL])的抗原。(4)寡核苷酸鏈的檢測(cè)將洗滌后的各孔的溶液完全除去，添加EcoRI酶溶液(7. 5單位/mLEcORI/50mM NaCl/lOmM MgCl2/10mM Tris-HCl (pH 7. 4)) 30 μ L (EcoRI 含量 0. 225 單位 / 孔)，室溫下反應(yīng)15分鐘，切斷抗體復(fù)合物的寡核苷酸鏈。回收反應(yīng)后的上清，對(duì)于該上清3 μ 1，用下述引物和探針(弓丨物序列在#1和#7中可以通用)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。應(yīng)予說(shuō)明，PCR以<95°C、 15min的預(yù)熱后，將95°C、15sec-60°C、Imin進(jìn)行35個(gè)循環(huán) > 的條件進(jìn)行。反應(yīng)開(kāi)始后對(duì)每一個(gè)循環(huán)分別測(cè)定隨著利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行的DNA鏈的合成反應(yīng)而變化的熒光量，從而對(duì)抗原的各稀釋系列的每一個(gè)孔分別觀(guān)察能否檢測(cè)出擴(kuò)增片段以及擴(kuò)增量的變化?！磳?shí)時(shí)PCR用引物、探針的序列〉正向引物5，-GGGCGGCTGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA-3，(序列號(hào)19)反向引物5，-GGCAAGCCACGTTTGGTG-3，(序列號(hào)20)#1 的探針5，-CCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTT-3，(序列號(hào) 21)#7 的探針5，-ACCGACAATTGCATGAAGAACTC-3，(序列號(hào) 22)(5)所得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化和分析上述檢測(cè)方法中，抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果用Ct值(通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)量所需要的循環(huán)數(shù))表示。其結(jié)果示于圖2。此外，對(duì)于各檢測(cè)結(jié)果，從空白的Ct值的平均值中減去各抗原濃度下的Ct值而求出差值(ACt)，藉此進(jìn)行各標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)化。其結(jié)果示于圖3。這里，以ACt達(dá)到各測(cè)定體系中的空白的測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3. 3倍時(shí)的抗原濃度作為低濃度側(cè)的檢測(cè)限，將(使用有交聯(lián)的MUSTag時(shí)的低濃度側(cè)的檢測(cè)限的抗原濃度)/ (使用無(wú)交聯(lián)的MUSTag時(shí)的低濃度側(cè)的檢測(cè)限的抗原濃度)作為檢測(cè)靈敏度(將使用無(wú)交聯(lián)的MUSTag時(shí)的靈敏度設(shè)為1)。同樣地，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將各抗原濃度下的ACt轉(zhuǎn)換成濃度時(shí)，算出當(dāng)轉(zhuǎn)換后的值的變差系數(shù)(C. V.)達(dá)到20%時(shí)的濃度，將其作為高濃度側(cè)的定量限。使用各細(xì)胞因子時(shí)的低濃度側(cè)的檢測(cè)限、檢測(cè)靈敏度及高濃度側(cè)的定量限示于表 1。[表1]
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)抗原的抗體復(fù)合物，其特征在于，包含作為標(biāo)記的核酸鏈、與所述抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將所述核酸鏈和所述抗體結(jié)合的接合體部位，所述接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)， 所述接合體部位與所述抗體化學(xué)交聯(lián)。
2.權(quán)利要求1所述的抗體復(fù)合物，其特征在于，包含能切斷所述核酸鏈的切割位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求2所述的抗體復(fù)合物，其特征在于，所述切割位點(diǎn)被限制酶、光照射或活性氧切斷。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的抗體復(fù)合物，其特征在于， 所述接合體部位含有融合蛋白，該融合蛋白包含親和素類(lèi)的生物素結(jié)合區(qū)；以及G蛋白、A蛋白或L蛋白的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，核酸鏈?zhǔn)巧锼亟Y(jié)合核酸。
5.權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的抗體復(fù)合物，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
6.檢測(cè)抗原的方法，其特征在于，包括使所述抗原與權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的抗體復(fù)合物接觸，形成包含所述抗原和所述抗體復(fù)合物的抗原抗體復(fù)合物的工序；以及檢測(cè)所述寡核苷酸鏈的檢測(cè)工序。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗原抗體復(fù)合物包含權(quán)利要求2或3所述的抗體復(fù)合物， 所述檢測(cè)工序包括在所述切割位點(diǎn)切斷并回收所述寡核苷酸鏈的工序。
8.權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于， 所述檢測(cè)工序包括擴(kuò)增所述寡核苷酸鏈的工序；以及檢測(cè)擴(kuò)增后的所述寡核苷酸鏈的工序。
9.抗原的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，包含抗體復(fù)合物，該抗體復(fù)合物包含作為標(biāo)記的核酸鏈、與所述抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將所述核酸鏈和所述抗體結(jié)合的接合體部位，所述接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)， 所述接合體部位與所述抗體化學(xué)交聯(lián)。
10.權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體復(fù)合物包含能切斷所述核酸鏈的切割位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述切割位點(diǎn)被限制酶、光照射或活性氧切斷。
12.權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于， 所述接合體部位含有融合蛋白，該融合蛋白包含親和素類(lèi)的生物素結(jié)合區(qū)；以及G蛋白、A蛋白或L蛋白的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)，核酸鏈?zhǔn)巧锼亟Y(jié)合核酸。
13.權(quán)利要求9 12中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
為了提高M(jìn)USTag的檢測(cè)靈敏度，本發(fā)明提供一種抗體復(fù)合物，該抗體復(fù)合物包含作為標(biāo)記的核酸鏈、與抗原特異性結(jié)合的抗體、以及將核酸鏈和抗體結(jié)合的接合體部位，在該抗體復(fù)合物中，使接合體部位包含G蛋白、A蛋白或L蛋白中的任一種的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)并使其與抗體結(jié)合，將接合體部位與抗體化學(xué)交聯(lián)，從而制成交聯(lián)型抗體復(fù)合物。
文檔編號(hào)C07K16/46GK102159592SQ20098013411
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
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