專利名稱：：改良的棉籽油及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及棉株和棉籽以及由它們制備得到的具有提高的油酸水平以及降低的棕櫚酸和亞油酸水平的棉籽油的生產(chǎn)。此外，本發(fā)明描述了具有低水平的環(huán)丙烷和/或環(huán)丙烯脂肪酸和/或低水平棉酚的棉籽。本發(fā)明還描述了來源于棉花的i^atB和CPA-FAS的核苷酸和氨基酸序列，以便對(duì)，尤其是植物油含量和/或組成進(jìn)行直接改良。
背景技術(shù)：
：棉花是一種兩用作物，能同時(shí)產(chǎn)生纖維和有價(jià)值的初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品種子。通常情況下，棉籽產(chǎn)品，包括莢(%)、棉絨(9%)、棉籽油(16%)和棉籽粕(45%)代表了約15%豐帛花作物白勺農(nóng)用價(jià)值(CherryandLeffIer,Seed.In"Cotton,agronomymonographNo.24"(edsRJKohel,CFLewis)pp.511-569.CropScienceSocietyofAmerica,Madison,WI,USA,1984)，而皮棉提供了其余85%的價(jià)值中的大部分。棉籽油是從棉籽中得到的最有價(jià)值的產(chǎn)品。在食品加工中使用棉籽油具有悠久的歷史。由于棉籽油具有溫和的、中性的味道，不會(huì)掩蓋食物固有的味道，因此是快餐食品和食品服務(wù)部門中用于深度油炸的受歡迎的禾口廣泛使用的油(JonesandKing,CottonseedOil.NationalCottonseedProductsAssociations,Inc.andtheCottonFoundation，Memphis，TN，USA，1993)。棉籽油也常用作鹵汁、調(diào)料、糕點(diǎn)、人造黃油和酥油的成分。與其它植物油一樣，棉籽油的營養(yǎng)和工業(yè)價(jià)值受油中脂肪酸組成的影響，即油中各脂肪酸的相對(duì)水平，并受各脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度和不飽和程度所決定的性質(zhì)的影響。分離純化的棉籽油主要(95%)由三酰甘油(TAGs)組成，在種子發(fā)育過程中合成并沉積。TAG分子由甘油骨架上酯化三個(gè)脂肪酸成分，指定為sn-l、sn-2和sn-3位組成。簡(jiǎn)言之，棉籽中脂肪酸的重新生物合成，與其它油籽中一樣，發(fā)生于種子發(fā)育和生長(zhǎng)過程中，即成熟前的質(zhì)體的基質(zhì)中。然后脂肪酸由質(zhì)體中以?；o酶A硫酯的形式導(dǎo)出到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜系統(tǒng)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，ER)，通過酰基轉(zhuǎn)移酶的作用，在將酰基從輔酶A硫酯轉(zhuǎn)移至磷脂上后，進(jìn)行脂肪酸的修飾。然后是TAG在油質(zhì)體中的組裝及貯存。通過添加羧基將乙酰輔酶A活化為三碳中間體，丙二酰輔酶A，含生物素的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化該途徑中的第一步關(guān)鍵反應(yīng)。然后將丙二?；鶑妮o酶A轉(zhuǎn)移至作為延長(zhǎng)脂肪酸鏈載體的?；d體蛋白(ACP)上。丙二酰-ACP與第二個(gè)乙酰輔酶A縮合酶，酮基?；?ACP合成酶III(KASIII)反應(yīng)，得到四個(gè)碳鏈。由KASI催化在延長(zhǎng)的脂肪酸鏈上反復(fù)添加二碳單元，生成棕櫚酰-ACP。KASII催化棕櫚酰-ACP延長(zhǎng)為硬脂酰-ACP?？扇苄杂仓?ACPΔ9-去飽和酶將第一個(gè)雙鍵引入硬脂酰-ACP中，將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)中的油酰-ACP。延長(zhǎng)的飽和脂肪酰鏈和單不飽和油酸酯分別通過特異性硫酯酶!^atB或!^atA從ACP上去掉，使它們能夠從質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。釋放至細(xì)胞質(zhì)中的飽和脂肪酸沒有被進(jìn)一步修飾。然而，通過膜結(jié)合的去飽和作用，油酸可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上被進(jìn)一步修飾。磷酸卵磷脂(PC)結(jié)合的脂酰基作為用于ER定位的底物，脂修飾酶如脂肪酸去飽和酶2(FAD2)，其將雙鍵引入油酸中PC的sn-2位上以生成亞油酸。然后全部修飾的和未修飾的脂肪?；纬蓭в休o酶A的池(pool)。在棉花而不是其它溫帶油籽中，油酸可用作由環(huán)丙烷脂肪酸合酶催化的環(huán)丙烷化的底物以生成二氫蘋婆酸。隨后該脂肪酸去飽和生成蘋婆酸，然后在α-氧化酶作用下生成錦葵酸。最后，脂肪?；?jīng)肯尼迪(Kennedy)途徑在一系列TAG組裝酶的作用下，通過連續(xù)的甘油-3-磷酸酯化作用整合到貯存脂類中。?；?ACP硫酯酶(FatB)(EC3.1.2.14)催化?；?ACP中酰基團(tuán)和ACP之間硫酯鍵的水解，并在質(zhì)體中釋放游離脂肪酸。然后游離脂肪酸中質(zhì)體外膜中被重新酯化至輔酶A上，運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體外。！^atB屬于一類核編碼的、可溶的脂肪酸硫酯酶(FAT)，其首先被翻譯成前體蛋白。因此，質(zhì)體中FAT酶的底物特異性決定了從質(zhì)體中運(yùn)輸?shù)闹舅岬逆滈L(zhǎng)和飽和程度的范圍。基于它們的底物特異性和核苷酸序列，F(xiàn)AT酶可分為兩類，F(xiàn)atA和FatB(Jones等，PlantCell7:359-371,1995)。FatA以油酰-ACP作為底物，而FatB對(duì)不同鏈長(zhǎng)的飽和?；?ACPs顯示出較高的活性。編碼!^atB酶的基因由累積中等鏈長(zhǎng)的飽和脂肪酸的植物品種如加利福尼亞桂樹(Umbellulariacalifornica)的月桂酸(C12:0)中首次分離得到。U.californicaFatBl基因在轉(zhuǎn)基因蕓苔中的過表達(dá)產(chǎn)生了占油中總脂肪酸50%的高月桂酸酯油(Voelker等，PlantJournal9=229-241,1996)0后來的研究表明!^atB的幾個(gè)同源基因存在于植物的組織中，包括種子中，底物特異性范圍從C8O-ACP至C18:O-ACP。由常規(guī)(野生型)陸地棉(G.hirsutum)制得的棉籽油一般含有約棕櫚酸(范圍22-%)、2%硬脂酸、15%油酸(范圍13-18%)和58%亞油酸(范圍52-60%)(Cherry,J.Am.OilChem.Soc.60:360-367,1983；0‘Brien,CottonseedOil.InF.D.Gunstone(Ed.)VegetableOilsinFoodTechnology-Composition,PropertiesandUses.BlackwellPublishing,Oxford,pp.203-230，2002)。除了這些在大多數(shù)其它溫帶油籽作物中也存在脂肪酸，未氫化的棉籽油還含有低水平(0.5-1%)的環(huán)丙烷或環(huán)丙烯脂肪酸，主要是錦葵酸、蘋婆酸和二氫蘋婆酸(ShenstoneandVickery,Nature190:68-169，1961；Cherry，1983(同上))。在錦葵目和一些裸子植物的籽油中發(fā)現(xiàn)環(huán)丙烷(CPA)和環(huán)丙烯(CPE)脂肪酸。兩個(gè)無患子科品種，荔枝(Litchichinensis)和龍眼(Euphorialongan)的籽油中含高達(dá)40%的CPA脂肪酸，主要為二氫蘋婆酸(DHS)。香蘋婆(Sterculiafoetida)的籽油含高達(dá)78%的CPE脂肪酸，主要為蘋婆酸(STC)和錦葵酸(MVL)。未氫化的棉籽油含相對(duì)少量(0.5-1.0%)的CPE和CPA脂肪酸，主要在胚軸中。還發(fā)現(xiàn)在棉花根和下胚軸中也累積了低水平的STC和MVL。除了棉花以外，在大部分油籽作物中檢測(cè)不到CPA和CPE，包括棕櫚油、大豆、玉米、油菜、芥菜、向日葵、紅花、花生、亞麻籽、其它蕓苔屬等。生產(chǎn)這些稀有脂肪酸的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是由環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CPA-FAQ催化的，其在油酸的雙鍵處增加亞甲基以生成DHS(圖2)。在棉花中，大部分DHS通過CPA去飽和酶進(jìn)行去飽和生成STC，大部分STC通過α-氧化作用進(jìn)一步修飾形成MVL(圖2)。MVL是野生型棉籽油中主要的環(huán)丙烯型脂肪酸。與來自大多數(shù)其它溫帶油籽作物的油相比，棉籽油中相對(duì)高水平的飽和脂肪酸，主要是棕櫚酸，通過抵消其它更不穩(wěn)定的不飽和脂肪酸成分，有助于棉籽油的氧化穩(wěn)定性。它還具有生產(chǎn)產(chǎn)品如人造黃油和酥油所需的高熔點(diǎn)。另一方面，由于能夠提高人體與心血管心臟病(CHD)的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)的低密度脂蛋白膽固醇，高水平的棕櫚酸營養(yǎng)價(jià)值較低(Lindsey等，Exp.Biol.Med.195=261-269,1990)。除了棕櫚油，在主要商品植物油中，棉籽含有最高的棕櫚酸水平(沈％)。棕櫚酸和其它更短鏈的飽和脂肪酸被廣泛報(bào)道能夠提高血漿總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平(Kris-Etherton等，Nutrition-today(USA).28=30-38,1993)。棉籽油還含有高水平的氧化不穩(wěn)定的亞油酸，因此限制了油的貨架期，使它不適合用于某些食品。因此常規(guī)棉籽油通常經(jīng)過部分氫化加工，在該過程中多不飽和亞油酸轉(zhuǎn)化為更多穩(wěn)定的單不飽和(油酸)及飽和(硬脂酸)脂肪酸。部分氫化的結(jié)果是使部分脂肪酸的許多結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，包括雙鍵的移位。這可能導(dǎo)致形成天然存在的不飽和脂肪酸的異構(gòu)體，反式脂肪酸(TFA)的產(chǎn)生。在大多數(shù)天然存在的不飽和脂肪酸如油酸中，兩個(gè)氫原子加入位于碳鏈同側(cè)的雙鍵碳原子中，稱為順式雙鍵。然而，部分氫化重構(gòu)了某些雙鍵，使得兩個(gè)氫原子位于碳碳雙鍵的兩側(cè)，由于它是低能量形式，稱為反式構(gòu)型。因此，部分氫化產(chǎn)生反式脂肪酸，如從油酸得到反油酸。油酸和反油酸含有相同的碳原子數(shù)(C18:l)，雙鍵在相同的位置，但雙鍵的構(gòu)象將它們區(qū)分開來。含反油酸的具有反式雙鍵構(gòu)型的TAG比油酸具有更高的熔點(diǎn)。近年來，已逐漸認(rèn)識(shí)到TFA能夠顯著提高人體中低密度脂蛋白膽固醇并降低高密度脂蛋白膽固醇，因此根據(jù)從流行病學(xué)和臨床研究得出的證據(jù)，它增加了心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)(Oomen等，Lancet357:746-751，2001；Mozaffarian等，N.Engl.J.Med.3541601-1613,2006)。部分氫化還通過打開環(huán)丙烷環(huán)，將環(huán)丙烷或環(huán)丙烯脂肪酸轉(zhuǎn)化為支鏈脂肪酸，產(chǎn)生的支鏈脂肪酸中脂肪酸碳鏈的C9或ClO位上連有添加的甲基。與多不飽和脂肪酸相比，油酸在常溫貯藏溫度及烹飪和油炸食品所用的高溫下對(duì)于氧化作用是更穩(wěn)定的。用許多植物油如紅花和大豆油研究表明，與含大量多不飽和脂肪酸的油相比，高油酸植物油在儲(chǔ)存期間酸敗發(fā)展較慢，或在煎炸或其它用途中氧化分解較慢(Fuller等，J.FoodSci.31=All-Am,1966；Mounts等，J.Am.OilChem.Soc.65:624-628,1998)。如上所述，棉籽油的特征還在于含有少量的錦葵酸、蘋婆酸和二氫蘋婆酸，由油酸獲得的一組環(huán)丙烷脂肪酸。已知錦葵酸和蘋婆酸是動(dòng)物Δ9-硬脂酰輔酶A去飽和酶的強(qiáng)效抑制劑。雖然CPA和CPE脂肪酸并不穩(wěn)定且大多在油加工過程中被消除，特別是通過氫化，但在用餐中剩余的油和飼料工業(yè)中使用的全部棉籽可能對(duì)動(dòng)物的健康產(chǎn)生負(fù)面影響。以過量的棉籽飼喂養(yǎng)殖動(dòng)物，可能引起一些動(dòng)物的健康問題，并可能影響到動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量，如蛋黃和牛奶中的脂肪硬化(Johnson等，Nature214:1244-1245,1967；Roehm等，Lipids5:80-84,1970)。已開發(fā)出通過專門的部分氫化步驟滅活環(huán)丙烯型脂肪酸。Merker和Mattil,1965年報(bào)道了一種氫化方法，其中通過鎳催化劑，錦葵酸和蘋婆酸有選擇性地被還原為它們的二氫或四氫衍生物，該方法沒有顯著減少亞油酸或反式酸的形成。Hutchins等，JournalofAmericanOilChemistsSociety45:397-399,1968年發(fā)現(xiàn)通過填充床反應(yīng)器和鎳催化劑，在溫和條件下，棉籽油中的類環(huán)丙烯表現(xiàn)出選擇性氫化。然而，這些氫化過程增加了油加工的額外費(fèi)用，是不可取的。在二十世紀(jì)七十年代，加州AcalaSJ系列的棉花育種計(jì)劃(Cherry，1983(同上))將棉籽油中的棕櫚酸從23.3%降至22.7%，將油酸從16.6%升至17.3%，并將環(huán)狀脂肪酸油酸總量從0.9%降至0.8%。然而，相對(duì)于在其它油籽作物中取得的成就，這些變化只是輕微的，反映出由于對(duì)棉花性狀而不是油品質(zhì)進(jìn)行持續(xù)選擇，導(dǎo)致過窄的優(yōu)良棉花品種的遺傳基礎(chǔ)。從棉花中分離出編碼FAD2的四個(gè)不同的cDNAs(Liu等，AustralianJournalofPlantPhysiology26:101-106，1999a;Liu等，PlantPhysiol.120:339,1999b；Pirtle等，Biochim.Biophys.Acta1522:122-129，2001，全部通過引用并入于此)，其中g(shù)hFAD2_l被認(rèn)為在棉籽油的亞油酸產(chǎn)生中起重要作用?；虮磉_(dá)分析表明ghFAD2-l基因在發(fā)育的種子中特異表達(dá)，在種子發(fā)育的成熟階段中期表達(dá)量最大(Liu等，1999a(同上))。美國專利No.6974898(以參閱的方式并入于此)描述了通過RNA干擾(RNAi)的方法下調(diào)微粒體Δ12-去飽和酶(FAD》產(chǎn)生含高達(dá)77%油酸的棉籽油。Chapman等，J.Am.OilChem.Soc.78:941-947,2001,以參閱的方式并入于此，用從油菜籽中獲得的編碼非功能性的fad2突變等位基因的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化棉株，并從種子特異性菜豆蛋白啟動(dòng)子中正向表達(dá)。產(chǎn)生的約一半的43株轉(zhuǎn)基因系顯示出籽油中油酸含量略增加，為30%。在后代中，鑒定出具有更高水平的達(dá)40%油酸的種子。具有低水平棕櫚酸籽油的擬南芥fatB突變株在常溫下顯示生長(zhǎng)緩慢(Bonaventure等，PlantCell151020-1033，2003)。然而，在之前的研究中用反義基因構(gòu)建體下調(diào)擬南芥中的Ati^atB，用CaMV35S啟動(dòng)子表達(dá)反義RNA，僅觀察到在花和種子中棕櫚酸水平降低，在葉片和根中沒有下降，且無明顯的可視表型(Dormarm等，PlantPhysiol.123:637_644，2000，以參閱的方式并入于此)。在棉花中，象在許多溫帶植物中一樣，！^atB酶似乎由多基因家族編碼。Yoder等，BiochimicaetBiophysicaActa1446:403_413，1999，以參閱的方式并入于此，分離出被認(rèn)為編碼棉花中?；?ACP硫酯酶的基因組DNA序列。Wilson等，J.Am·OilChem.Soc.78:335-340,2001禾口Buhr等，PlantJ.30155-163,2002，均以參閱的方式并入于此，分別使用反義和核酶的方法降低大豆種子中的棕櫚酸。近來，基于EST法從香蘋婆中分離出CPA-FAS基因(Bao等，Proc.Natl.Acad.ki.U.S.Α.99:7172-7177,2002)。來自陸地棉的兩個(gè)EST序列通過接種鐮刀霉侵染棉花的根/胚軸，鑒定出是差異表達(dá)的(Dowd等，MolecularPlant-MicrobeInteractions.17654-667,2004,以參閱的方式并入于此)。因此，需要一種改良的棉籽油。發(fā)明概述在本發(fā)明通篇說明書中，除需其它說明，詞語“含有(comprise)”或變化形式如“含有(comprises)”或“含有(comprising)”應(yīng)被理解為表示含有所述成分或整體或成分或整體的組，但不排除任何其它成分或整體或成分或整體的組。除非另有明確說明，每個(gè)實(shí)施方案比照適用于本發(fā)明的每一個(gè)其它實(shí)施方案。此處使用的單數(shù)形式“一個(gè)，一種(a)”、“一個(gè)，一種(an)”和“這個(gè)(the)”包含復(fù)數(shù)含義，除非文中另有清楚的規(guī)定。因此，例如參考“一個(gè)突變(amutation)”包括單個(gè)突變以及兩個(gè)或多個(gè)突變；參考“一種試劑(anagent)”包括一種試劑以及兩種或多種試劑；寸寸。本發(fā)明中作者提到的出版物的目錄詳情列于說明書末尾。本發(fā)明中參考的任何之前的出版物(或來自于它的信息)，或任何已知情況不被且不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)做對(duì)之前出版物(或來自于它的信息)或已知情況形成本發(fā)明所屬領(lǐng)域的部分公知常識(shí)的承認(rèn)或允許或任何形式的建議。術(shù)語“衍生自(derivedfrom)”表示特定整體從特定來源獲得，盡管不必直接從該來源獲得。示例性氨基酸序列的指定列于表5中。核苷酸和氨基酸序列參考序列識(shí)別號(hào)(SEQIDNO)。SEQIDNos數(shù)字對(duì)應(yīng)于序列識(shí)別號(hào)<400>1(SEQIDNO1),<400>2(SEQIDNO:2)，等。序列識(shí)別號(hào)概括于表4中。序列表列于權(quán)利要求之后。本文的基因和其它遺傳物質(zhì)(例如mRNA，核酸基因構(gòu)建體等)以斜體表示，而它們的蛋白表達(dá)產(chǎn)物以非斜體形式表示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了制備改良的棉籽油的方法，包括步驟(i)獲得棉籽，(ii)從棉籽中提取油，以及(iii)回收棉籽油，其中所述棉籽油具有改良的脂肪酸組成，如棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。在一些實(shí)施方案中，棉籽油總脂肪酸含量的74%86%為油酸。在另一些實(shí)施方案中，4%10%為棕櫚酸。在其它實(shí)施方案中，4%12%為亞油酸。關(guān)于反式脂肪酸，在某些實(shí)施方案中，棉籽油具有<0.5%，優(yōu)選<0.的總脂肪酸含量的反式脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，反式脂肪酸為反油酸。在某些實(shí)施方案中，棉籽油中總脂肪酸含量的0.0.5%為環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)或環(huán)丙烯脂肪酸(CPE)。在特定的實(shí)施方案中，環(huán)丙烷或環(huán)丙烯脂肪酸為錦葵酸、蘋婆酸、二氫蘋婆酸或它們?nèi)我舛叩慕M合或三者的組合。在其它實(shí)施方案中，總脂肪酸含量中<0.5%，優(yōu)選<0.為C9或ClO位上的支鏈脂肪酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，籽油的總脂肪酸含量組成為74%86%油酸，4%10%棕櫚酸，4%12%亞油酸，反式脂肪酸環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)和環(huán)丙烯脂肪酸(CPE)總量任選為總脂肪酸含量的0.0.5%，任選彡1.0%，優(yōu)選彡0.5%，更優(yōu)選彡0.1%。在某些實(shí)施方案中，制備方法進(jìn)一步包括從棉株收獲含有棉籽的籽棉和/或軋含有棉籽的籽棉?；蛘呋虼送?，步驟(ii)包括粉碎棉籽和/或用溶劑提取粉碎的棉籽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟(iii)包括純化棉籽油。純化籽油可包括油脫膠、油脫色、油脫臭、改變油的PH值、油水解或它們的任意組合。有利地，在某些實(shí)施方案中，所述方法不包括棉籽油的氫化或部分氫化步驟。不限于任何特定的作用模式，低水平的亞油酸和相對(duì)高水平的油酸省卻了需要穩(wěn)定脂肪酸的步驟，從而避免了由某些氫化形式誘導(dǎo)的反式脂肪酸的從頭合成。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有改良的脂肪酸組成的棉籽油，其中棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。在某些實(shí)施方案中，棉籽油總脂肪酸含量的74%86%為油酸。在其它實(shí)施方案中，4%10%為棕櫚酸。在其它實(shí)施方案中，4%12%為亞油酸。在某些實(shí)施方案中，棉籽油中總脂肪酸含量的0.0.5%為環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)或環(huán)丙烯脂肪酸(CPE)。在特定的實(shí)施方案中，環(huán)丙烷或環(huán)丙烯脂肪酸為錦葵酸、蘋婆酸、二氫蘋婆酸或它們?nèi)我舛叩慕M合或三者的組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，籽油的總脂肪酸含量組成為74%86%油酸，4%10%棕櫚酸，4%12%亞油酸，反式脂肪酸環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)和環(huán)丙烯脂肪酸(CPE)總量任選為總脂肪酸含量的0.1^-0.5%,任選彡1.0%,優(yōu)選彡0.5%,更優(yōu)選彡0.1%。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了棉籽油中具有改良脂肪酸組成的棉籽，其中棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。在某些實(shí)施方案中，棉籽油總脂肪酸含量的74%86%為油酸。在其它實(shí)施方案中，4%10%為棕櫚酸。在其它實(shí)施方案中，4%12%為亞油酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，棉籽油中總脂肪酸含量的0.0.5%為環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，棉籽具有降低水平的棉酚，其中棉籽中棉酚的水平相對(duì)于棉花品種Coker中的棉酚水平下降了至少10%。在優(yōu)選實(shí)施方案中，籽油的總脂肪酸含量組成為74%86%油酸，4%10%棕櫚酸，4%12%亞油酸，反式脂肪酸環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)和環(huán)丙烯脂肪酸(CPE)總量任選為總脂肪酸含量的0.0.5%，任選彡1.0%，優(yōu)選彡0.5%，更優(yōu)選彡0.1%。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了棉籽或由它們獲得的棉籽油，其中棉籽為轉(zhuǎn)基因的，其基因基因構(gòu)建體編碼抑制選自FAD2、FatB-2和CPA-FAS-2的兩個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的RNA分子。在某些實(shí)施方案中，所述基因?yàn)間hFAD2-l、gh!^atB-2和ghCPA_FAS_2。在一個(gè)例舉的實(shí)施方案中，所述基因基因構(gòu)建體包括圖12中所示的MonoCott結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述棉籽為轉(zhuǎn)基因的，其基因基因構(gòu)建體編碼抑制兩個(gè)基因ghFAD2-l和ghi^atB-2表達(dá)RNA分子。在另一個(gè)例舉的實(shí)施方案中，所述棉籽為陸地棉或海島棉的棉籽。本發(fā)明的另一方面描述了生產(chǎn)本發(fā)明所述棉籽的方法，包括從棉株收獲籽棉并軋籽棉，由此獲得棉籽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括播種本發(fā)明所述的棉籽并使棉籽生長(zhǎng)成棉株。本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生本發(fā)明所述棉籽的棉株以及從所述棉株獲得的皮棉。依據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提供了鑒定棉籽油中具有改良的脂肪酸成分的棉籽的方法，包括⑴獲得轉(zhuǎn)基因棉籽，(ii)測(cè)定棉籽油的脂肪酸成分，以及(iii)挑取棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸的棉籽。在某些實(shí)施方案中，步驟(i)的棉籽為轉(zhuǎn)基因的，其基因基因構(gòu)建體編碼抑制兩個(gè)基因ghFAD2-l和ghi^atB-〗或三個(gè)基因ghFAD2-l、ghFatB-2和ghCPA_FAS_2表達(dá)的RNA分子。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括挑取棉籽油中具有改良的脂肪酸組成的棉籽，其中棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括由所述棉籽獲得棉株的步驟，以及將所述棉株與優(yōu)選具有不同遺傳背景的第二個(gè)棉株雜交的步驟。因此，本說明書提供了本文所述棉籽的在制備分離油或棉籽粕中的應(yīng)用，以及棉籽作為動(dòng)物飼料或在生產(chǎn)食品或燃料中的應(yīng)用。設(shè)想將所述棉籽油用于提高食品的油酸含量或降低棕櫚酸含量?；蛘呋虼送?，所述棉籽油用于降低食品中或由動(dòng)物攝入的飽和脂肪酸或反式脂肪酸水平。應(yīng)理解為這是相對(duì)于等量的未改良棉籽、油或棉籽粕的應(yīng)用。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有此處所述棉籽油為食物成分的食品。本發(fā)明的另一方面提供了制備油炸食品的方法，包括在本文所述的棉籽油中油炸食品。所述目標(biāo)產(chǎn)品可用于治療，本發(fā)明提供治療或預(yù)防個(gè)體疾病的方法，包括對(duì)個(gè)體口服給藥本文所述的棉籽油、棉籽或食品。在某些實(shí)施方案中，所述疾病為肥胖、心臟病、高血清三酰甘油含量(highserumTAGcontent)、高血清膽固醇、高血清低密度脂蛋白、低血清高密度脂蛋白、高血壓、癌癥、糖尿病或它們的任意組合。包括任何受益于本發(fā)明方法或組合物的個(gè)體。術(shù)語“個(gè)體”包括但不限于人類、非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、家畜動(dòng)物、伴侶動(dòng)物(companionanimals)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、圈養(yǎng)野生動(dòng)物、爬行類和兩棲類、魚類、鳥類和其它生物。不管是否為人類或非人類生物的個(gè)體均可作為患病體、個(gè)人、個(gè)體、動(dòng)物、宿主或受體。在特定的實(shí)施方案中，所述個(gè)體為人。在某一方面，本發(fā)明描述了編碼嵌合基因沉默核酸的核酸分子，所述基因沉默核酸降低棉株中來自棉FatB4SFAD2和棉CPA-FAS的兩個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述基因沉默核酸降低棉FAD2-1和棉i^atB-2，或棉FAD2-1和棉i^atB-2和CPA-FAS-2的基因表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子包括(i)如SEQIDNO17所示的連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，或與其具有90%序列同一性或在嚴(yán)格雜交條件下與其互補(bǔ)序列雜交的序列，或(ii)缺失編碼CPA-FAS-2多肽的序列的(i)的核酸分子的突變體或它們的互補(bǔ)形式。在一個(gè)例舉的實(shí)施方案中，所述基因沉默核酸分子為發(fā)夾RNA。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子在基因基因構(gòu)建體中提供。在某些實(shí)施方案中，所述基因基因構(gòu)建體包括核酸并進(jìn)一步包括圖12中所示的結(jié)構(gòu)或圖13中所示的A、E、F、G和H片段的序列，或它們的功能突變體。在其它實(shí)施方案中，提供含有目的核酸的植物或其組織或細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子用于降低棉株中棉FAD2-1和棉i^atB-2和/或棉CPA-FAS-2基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明提供含有降低水平的選自棉FAD2、棉!^atB和CPA-FAS的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因的改良的棉株或由其獲得的棉籽，優(yōu)選含有兩個(gè)或多個(gè)所述基因或全部三個(gè)基因，其中所含棉籽油或由其獲得的棉籽油具有提高的油酸水平以及降低的棕櫚酸和亞油酸水平。在另一實(shí)施方案中，棉籽油顯示降低的環(huán)丙烷和/或環(huán)丙烯脂肪酸，或棉子酚水平。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有編碼具有棉!^atB活性的多肽，或其功能性片段或其突變體或其互補(bǔ)形式的核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列選自由下列組成的組(i)與SEQIDNO:5或7所示的核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；(ii)編碼與SEQIDNO:6或7所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽的核苷酸序列；(iii)在至少中度嚴(yán)格雜交條件下，與來自于SEQIDNO5或7的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列；(iv)與(i)、(ii)或(iii)互補(bǔ)的核苷酸序列；以及(ν)含有SEQIDNO5的548-843位上的核苷酸的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，核酸特別是RNA或其功能性突變體或其片段為正義、反義、核酶、共抑制或雙鏈RNA或其它基因沉默試劑。因此，本發(fā)明提供含有表達(dá)的且能降低棉!^tB基因表達(dá)的上述(i)(ν)任一片段的反義或共抑制分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供的分離的探針或引物含有來自于SEQIDNO:5或SEQIDNO7或它們互補(bǔ)形式的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供含有編碼具有棉CPA-FAS活性的多肽，或其功能性片段或其突變體或其互補(bǔ)形式的核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列選自由下列組成的組(i)與SEQIDNO:10、12或14所示的核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；(ii)編碼與SEQIDNO:11,13或15所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽的核苷酸序列；(iii)在至少中度嚴(yán)格雜交條件下，與來自于SEQIDNO:10、12或14的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列；(iv)與(i)、(ii)或(iii)互補(bǔ)的核苷酸序列；以及(ν)含有如圖13的B片段中所示序列的CPA-FAS-2的442個(gè)核苷酸的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，核酸特別是RNA或其功能性突變體或其片段為正義、反義、核酶、共抑制或雙鏈RNA或其它基因沉默試劑。因此，本發(fā)明提供含有上述(i)(ν)任一片段的反義或共抑制分子，所述片段是表達(dá)得到的并能降低棉CPA-FAS-2基因的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的探針或引物為含有來自于SEQIDNO10,SEQIDNO:12或SEQIDNO14或它們的互補(bǔ)形式的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。以上概述不是且不應(yīng)該以任何方式被看作是對(duì)本發(fā)明所有實(shí)施方案的詳盡描述。圖1為發(fā)育棉籽中脂肪酸合成的簡(jiǎn)化示意圖，示出了重要的酶催化步驟1.酮酰合酶III(KASIII)，2.酮酰合酶I(KASI)，3.酮酰合酶II(KASII)，4.Δ9-硬脂酰-ACP去飽和酶(SAD)，5.油酰基-ACP硫酯酶，6.酰基-ACP硫酯酶，7.Δ12-油脂去飽和酶(FAD2)，8.環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CPA-FAS)，9.環(huán)丙烷脂肪酸去飽和酶(CPA-FAD)，10.α-氧化酶。DHS二氫蘋婆酸；STC，蘋婆酸；MVL，錦葵酸。圖2為發(fā)育棉籽中環(huán)丙烷(CPA)和環(huán)丙烯(CPE)脂肪酸的生物合成示意圖。油酸為環(huán)丙烷脂肪酸合酶的脂肪酸底物(CPA-FAQ。S-腺苷-L-甲硫氨酸是亞甲基供體，油酸的環(huán)丙烷化由CPA-FAS催化，生成二氫蘋婆酸(DHS)。DHS可進(jìn)一步通過CPA去飽和酶進(jìn)行去飽和修飾，生成蘋婆酸(STC)。隨后，由氧化酶催化STC的α-氧化作用生成錦葵酸(MVL)。圖3為ghFAD2-l基因?qū)?yīng)的cDNA核苷酸序列，以及預(yù)測(cè)的編碼ghFAD2_l多肽前體的氨基酸序列。蛋白編碼區(qū)是從核苷酸第73位1227位(TAA終止密碼子)。圖4為棉花酰基-ACP硫酯酶(ghi^itB-2)cDNA的核苷酸序列，以及預(yù)測(cè)的由cDNA編碼的前體ghhtB-2多肽的氨基酸序列。蛋白編碼區(qū)是從核苷酸第210位1472位(TAG終止密碼子)。圖5為棉花?；?ACP硫酯酶(ghi^itB-3)cDNA的核苷酸序列，以及預(yù)測(cè)的由cDNA編碼的前體ghi^atB-3多肽的氨基酸序列。蛋白編碼區(qū)是從核苷酸第97位(TAG終止密碼子)。圖6為實(shí)施例4中EST序列CD486555的DNA序列。圖7為ghCPA-FAS-Ι的DNA序列及推定的其編碼的多肽。圖8為ghCPA-FAS-2的DNA序列及推定的其編碼的多肽。圖9為ghCPA-FAS-3的DNA序列及推定的其編碼的多肽。圖10為棉花中的CPA-FAS基因的Southern印跡分析。用HindIII消化來自不同的二倍體或四倍體棉花品種的基因組總DNAs。1道，海島棉(A+D基因組)；2道，陸地棉品種岱字棉-16(A+D基因組)；3道，陸地棉品種Sicala-V4(A+D基因組)；4道，草棉(A基因組)；5道，雷蒙德氏棉(D基因組)。圖11為棉花中表達(dá)的ghCPA-FAS-1(A)ghCPA_FAS_2(B)基因的RNANorthern印跡分析。雜交至膜上的RNA樣品來自于1道，子葉；2，胚軸；3，葉片；4，根；59，分別為開花后第25、30、35、40、45天發(fā)育的棉花胚；10，胚軸。圖12為棉花中用于產(chǎn)生三重基因沉默的嵌合轉(zhuǎn)基因(MonoCott基因構(gòu)建體)。圖11中詳細(xì)描述了標(biāo)記在該基因構(gòu)建體頂部的片段的DNA序列。(縮寫LB:T-DNA左側(cè)；LecP大豆凝集素啟動(dòng)子；ghFAD2-l棉花微粒體油酰Δ12去飽和酶cDNA；ghCPA-FAS-2棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶；ghhtB-1棉花棕櫚酰-ACP硫酯酶；Iec-T大豆凝集素終止子；RB2=T-T-DNA右側(cè)2；Sl地三葉草矮化病毒片段1啟動(dòng)子；S3地三葉草矮化病毒片段3終止子；NPTII新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。還標(biāo)注了形成RNAi結(jié)構(gòu)中cDNA全長(zhǎng)及選擇的各靶基因的大小)。圖13為用于形成圖12中所示RNAi結(jié)構(gòu)的DNA序列。片段A為種子特異性Lecl啟動(dòng)子；片段B為3個(gè)靶基因的嵌合片段，包括ghFAD2-l(下劃線)、ghCPA-FAS-2(斜體)和gh!^tB-2(粗體)；片段C為用于分離反向重復(fù)序列的ghFAD2-l內(nèi)含子。片段D為片段B的反向重復(fù)序列；片段E為凝集素基因轉(zhuǎn)錄終止子/多腺苷酸化序列；片段F為控制可選擇標(biāo)記基因(F+G+H)表達(dá)的si啟動(dòng)子；片段G為帶有可作為選擇標(biāo)記的卡那霉素抗性的NPTII蠆白編碼區(qū)；片段H，s3轉(zhuǎn)錄終止子/多腺苷酸化序列.圖14圖表所示為棕櫚酸和油酸在DCS9-34的三代種子中的累積量T2代種子為初級(jí)轉(zhuǎn)基因系的后代(A);Τ3代種子為選擇的T2代株的后代(B)和T4代種子為選擇的T3代株的后代(C)。圖15圖表所示為切下的各棉花種子胚軸中總脂肪酸的累積量。DCS9-34為具有HO、LP和低環(huán)狀脂肪酸特征的MonoCott系；Coker315為常規(guī)的或?qū)φ彰藁?。發(fā)明詳述本發(fā)明基于改良棉株的生產(chǎn)，其中所述棉株用嵌合發(fā)夾RNA基因沉默基因構(gòu)建體進(jìn)行修飾。穩(wěn)定后代的特征是，含有的油具有高品質(zhì)，包括比對(duì)照及一般從商用棉花品種中提取的棉籽油具有顯著更低的棕櫚酸和亞油酸水平，以及顯著更高的油酸水平。CPA-FAS-2基因表達(dá)的下降促使棉籽油中環(huán)丙烯型脂肪酸水平以及CPA和/或CPE的降低。雖然使用了發(fā)夾RNA基因沉默基因構(gòu)建體本闡述本發(fā)明，但不限于此，其它的如本文描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法也可用于生產(chǎn)本發(fā)明所公開的優(yōu)勢(shì)棉株和由其衍生的產(chǎn)品。本發(fā)明中提到的棉籽油為內(nèi)源棉籽油，其由來自于本發(fā)明所述改良的棉株的棉籽中提取得到。因此，本發(fā)明不涉及以實(shí)質(zhì)上改變脂肪酸組成的方式對(duì)提取后棉籽油的改良。本發(fā)明包括基因活性及結(jié)構(gòu)的修飾以及嵌合基因的應(yīng)用。本文使用的術(shù)語“基因”包括任何脫氧核糖核酸序列，其包括編碼蛋白編碼區(qū)或在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄但不翻譯的區(qū)，以及相關(guān)的非編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)。這些相關(guān)區(qū)一般位于距離5'和3'端每一側(cè)約21Λ的鄰近編碼區(qū)或轉(zhuǎn)錄區(qū)的位置上。在這方面，基因可包括天然與給定基因相關(guān)的調(diào)控信號(hào)如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和/或多腺苷酸化信號(hào)或異源調(diào)控信號(hào)，在這種情況下，基因?yàn)榍逗稀盎颉?。位于編碼區(qū)5'端且存在于mRNA上的序列為5'非翻譯序列。位于3'端或編碼區(qū)下游且存在于mRNA上的序列為3'非翻譯序列。術(shù)語“基因”包括cDNA及基因的基因組形式。本文使用的“棉花FAD2-1基因”、“ghFAD2_l基因”等為棉花中編碼油酰-Δ12-去飽和酶的核苷酸序列，其表達(dá)于發(fā)育的棉籽中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地將ghFAD2-l基因與編碼其它油酰-Δ12-去飽和酶或其它蛋白的基因區(qū)分開，特別是與ghFAD2-2基因，例如SEQIDNO』6區(qū)分開。棉花FAD2-1基因包括天然存在的等位基因或棉花中存在的突變體，包括那些由四倍體棉花A和D基因組編碼的基因以及非天然存在的可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行基因修飾而產(chǎn)生的突變體。天然存在的棉花ghFAD2-l的突變體的實(shí)例，其序列如SEQIDNO:所示，具有與SEQIDNO:1全長(zhǎng)序列約96%的序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ghFAD2-l基因是指存在于棉花中或分離自棉花或由其衍生的核酸分子，包括具有與SEQIDNO1所示的cDNA序列的蛋白編碼區(qū)約90%序列同一性的核苷酸。本文使用的“棉花htB-2基因”、“ghhtB-2基因”等為棉花中編碼?；?ACP硫酯酶的核苷酸序列，其表達(dá)于發(fā)育的棉籽中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地將ghhtB-2基因與編碼其它?；?ACP硫酯酶或其它蛋白的基因區(qū)分開，特別是與ghhtB-1基因，例如SEQIDN0:3或與ghi^itB-3基因，例如SEQIDNO:7區(qū)分開。棉花i^atB-2基因包括天然存在的等位基因或棉花中存在的突變，包括那些由四倍體棉花A和D基因組編碼的基因以及非天然存在的可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行基因修飾而產(chǎn)生的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ghhtB-2基因指存在于棉花中或分離自棉花或由其衍生的核酸分子，包括具有與SEQIDNO5所示的cDNA序列的蛋白編碼區(qū)約90%序列同一性的核苷酸。本文使用的“棉花CPA-FAS-2基因”、“ghCPA_FAS_2基因”等為棉花中編碼CPA脂肪酸合酶的核苷酸序列，其表達(dá)于發(fā)育的棉籽中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地將ghCPA-FAS-2基因與編碼其它CPA脂肪酸合酶或其它蛋白的基因區(qū)分開，特別是與ghCPA-FAS-1基因，例如SEQIDNO:10或與ghCPA-FAS-3基因，例如SEQIDN0:14區(qū)分開。棉花CPA-FAS-2基因包括天然存在的等位基因或棉花中存在的突變，包括那些由四倍體棉花A和D基因組編碼的基因以及非天然存在的可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行基因修飾而產(chǎn)生的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ghCPA-FAS-2基因指存在于棉花中或分離自棉花或由其衍生的核酸分子，包括具有與SEQIDNO12所示的cDNA序列的蛋白編碼區(qū)約90%序列同一性的核苷酸。含有轉(zhuǎn)錄區(qū)的基因的基因組形式或其克隆可被稱為“內(nèi)含子”或“間隔區(qū)(interveningregions)”或“間隔序列(interveningsequences)”的非編碼序列隔開。本文使用的“內(nèi)含子”為基因片段，其作為初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄的一部分但不存在于成熟的mRNA分子中。從核或初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中去掉或“剪接出(splicedout)”內(nèi)含子；因此內(nèi)含子在信使RNA(mRNA)中是不存在的。內(nèi)含子可含有調(diào)控元件如增強(qiáng)子。本文使用的“外顯子”為與RNA序列相對(duì)應(yīng)的DNA區(qū)，存在于成熟mRNA中或RNA分子不翻譯的成熟RNA分子中。mRNA在翻譯過程中發(fā)揮作用，確定新生多肽的氨基酸序列或順序。術(shù)語“基因”包括編碼全部或部分本發(fā)明所述蛋白的合成的或融合分子以及上述任一的互補(bǔ)核苷酸序列?？蓪⒒?qū)脒m合的載體中用于細(xì)胞中染色體外存在或整合至宿主基因組中。本文使用的“嵌合基因”指任何不在其天然位置上的基因。嵌合基因一般包括天然狀態(tài)下不在一起的調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄序列或蛋白編碼序列。因此，嵌合基因可包括不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或一致來源但以不同于天然方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。本文使用的術(shù)語“內(nèi)源的”指在與所研究的植株處于相同發(fā)育階段的未修飾的植株中正常存在的或發(fā)生的物質(zhì)。“內(nèi)源基因”指在生物體基因組中天然位置上的天然基因。本文使用的“重組核酸分子”指通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建或修飾的核酸分子。術(shù)語“外來多核苷酸”或“外源多核苷酸”或“異源多核苷酸”等是指通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞基因組中的任何核酸。這些包括相對(duì)于天然存在的基因，在細(xì)胞中導(dǎo)入的基因含有某些修飾(例如，突變，選擇標(biāo)記基因的存在等)的基因序列。外來或外源基因可以是插入非天然生物體中的基因?！稗D(zhuǎn)基因”是指基因通過轉(zhuǎn)化過程導(dǎo)入基因組中。術(shù)語“遺傳修飾”包括通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)將基因?qū)爰?xì)胞，突變細(xì)胞中的基因，改變或調(diào)解細(xì)胞或生物體或它們的后代中的基因。多核苷酸本發(fā)明涉及不同的多核苷酸。本文使用的“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”表示核苷酸的聚合物，其可以是DNA或RNA或它們的組合，包括mRNA、cRNA、cDNA、tRNA、siRNA、shRNA和hpRNA。它可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的細(xì)胞、基因組或合成來源的DNA或RNA，例如在自動(dòng)合成儀上生成的，可與碳水化合物、脂、蛋白或其它物質(zhì)結(jié)合，用熒光或其它基團(tuán)標(biāo)記，或附著在固體支持物上形成特定活性，或包括一個(gè)或多個(gè)自然界中沒有發(fā)現(xiàn)的修飾的核苷酸。所述聚合物可以是單鏈、完整雙鏈或部分雙鏈。部分雙鏈RNA分子的實(shí)例為發(fā)夾RNA(hpRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)或自我互補(bǔ)RNA，其包括通過核苷酸和其互補(bǔ)序列之間堿基配對(duì)形成的雙鏈莖，以及共價(jià)結(jié)合所述核苷酸和其互補(bǔ)序列的環(huán)狀序列。本文使用的堿基配對(duì)是指核苷酸之間的標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)，包括G:U堿基對(duì)。“互補(bǔ)”表示兩個(gè)多核苷酸能夠沿著它們?nèi)L(zhǎng)的一部分或沿著一個(gè)全長(zhǎng)或兩個(gè)全長(zhǎng)進(jìn)行堿基配對(duì)(雜交)?！半s交的多核苷酸”表示多核苷酸實(shí)際上與其互補(bǔ)序列堿基配對(duì)。本文的術(shù)語“多核苷酸”可與術(shù)語“核酸”互換使用。通過“分離的，，表示物質(zhì)完全或基本上從其天然狀態(tài)下共同存在的成分中釋放出來。本文使用的“分離的多核苷酸”或“分離的核酸分子”表示多核苷酸從其天然狀態(tài)下共同存在的或連接的相同類型的多核苷酸序列中至少部分地分離出來，優(yōu)選地完全或基本上釋放出來。例如，“分離的多核苷酸”包括將核苷酸從天然狀態(tài)下其側(cè)翼序列中純化或分離出來，例如將DNA片段從相鄰片段的序列中去掉。優(yōu)選地，所述分離的多核苷酸至少90%不含其它成分，如蛋白、碳水化合物、脂等。本文使用的術(shù)語“重組多核苷酸”指多核苷酸通過核酸操作在體外形成自然界中沒有發(fā)現(xiàn)的形式。例如，重組核酸可以是表達(dá)載體的形式。通常，這類表達(dá)載體含有與核苷酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸。本發(fā)明涉及寡核苷酸的應(yīng)用。本文使用的“寡核苷酸”為長(zhǎng)達(dá)50個(gè)核苷酸的多核苷酸。它們可以是RNA、DNA或它們的組合或二者之一的衍生物。寡核苷酸一般為1030個(gè)核苷酸的相對(duì)短的單鏈分子，一般為1525個(gè)核苷酸長(zhǎng)。當(dāng)用作探針或擴(kuò)增反應(yīng)中的引物時(shí)，該寡核苷酸的最小長(zhǎng)度為在寡核苷酸和互補(bǔ)的靶核酸分子之間形成所需穩(wěn)定雜交的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，所述寡核苷酸為至少15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至少18個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至少19個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為至少20個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選為至少25個(gè)核苷酸長(zhǎng)。用作探針的多核苷酸一般與檢測(cè)標(biāo)記如放射性同位素、酶、生物素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光分子共軛連接。本發(fā)明的寡核苷酸在檢測(cè)ghFAD2-l、gh!^itB-2和ghCPA_FAS_2的等位基因或與其它目標(biāo)性狀，例如改良的油組成有關(guān)的基因的方法中是有用的。例如核酸雜交的方法，在許多實(shí)例中包括通過合適的聚合酶(PCR中使用)延伸寡核苷酸引物。本發(fā)明的寡核苷酸突變體包括不同大小的分子，和/或例如本發(fā)明所述的能夠與棉花基因組相近的序列進(jìn)行雜交的特異性寡核苷酸分子。例如，只要能與靶區(qū)域雜交，突變可包括其它的核苷酸(如1、2、3、4或更多)或減少的核苷酸。此外，只要不影響寡核苷酸與靶區(qū)域的雜交能力，可將幾個(gè)核苷酸進(jìn)行取代。此外，可將突變體設(shè)計(jì)成50個(gè)以內(nèi)的核苷酸，其能夠與本發(fā)明所述的寡核苷酸與植物基因組雜交的區(qū)域相近的序列進(jìn)行雜交。術(shù)語“多核苷酸突變體”和“突變體”等是指具有與對(duì)照多核苷酸序列大體一致的多核苷酸或它們的互補(bǔ)形式。這些術(shù)語還包括通過添加、缺失或取代至少一個(gè)核苷酸所形成的區(qū)別于對(duì)照多核苷酸的多核苷酸。因此，術(shù)語“多核苷酸突變體”和“突變體”包括其序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被不同的核苷酸通過添加或缺失或取代所形成的多核苷酸。在這方面，本領(lǐng)域熟知，對(duì)照核苷酸可通過某些變化包括突變、添加、缺失和取代，據(jù)此改變的多核苷酸仍保持了參照的多核苷酸的功能或活性。因此，這些術(shù)語包括編碼具有酶活性或其它調(diào)節(jié)活性的多肽的多核苷酸，或能用作篩選探針或其它雜交試劑的多核苷酸。特別是，這其中包括編碼相同多肽或氨基酸序列但由于冗余的遺傳密碼子而具有不同核苷酸序列的多核苷酸。術(shù)語“多核苷酸突變體”和“突變體”還包括自然發(fā)生的等位基因突變。所謂“對(duì)應(yīng)(correspondsto)”或“對(duì)應(yīng)于(correspondingto)”是指多核苷酸(a)具有與對(duì)照多核苷酸序列的全部或大部分大體一致的或與其互補(bǔ)的核苷酸序列或(b)編碼與肽或蛋白中氨基酸序列一致的氨基酸序列。該詞還包括其范圍內(nèi)，具有與對(duì)照肽或蛋白中氨基酸序列大體一致的氨基酸序列的肽或多肽。用于描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間序列關(guān)系的術(shù)語包括“對(duì)照序列”、“比較窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分?jǐn)?shù)”、“基本一致”和“一致”，是根據(jù)核苷酸或氨基酸殘基或全長(zhǎng)的最小數(shù)目定義的。本文的“序列同一性”和“同一性”可互換使用，表示基于核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸窗口比較得出的序列一致的程度。因此，“序列同一性百分?jǐn)?shù)”是通過窗口比較兩個(gè)最佳排列的序列計(jì)算得到的，確定出現(xiàn)在兩條序列中的相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、U)或相同氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、GIy、VaI、Leu、lie、Phe、Tyr、Tip、Lys、Arg、His、Asp、GIu、Asn、GInXys和Met)位置的數(shù)量，生成匹配位置的數(shù)量，用窗口比較得出的總位置數(shù)(即，窗口大小)除匹配位置數(shù)，將得到的結(jié)果乘以100得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。通過空位(GAP)(NeedlemanandWunsch,JMoI.Biol.48:443-4531970)分析(GCG程序)，空位生成罰分(gapcreationpenalty)=5，空位延伸罰分(gapextensionpenalty)=0.3，確定多核苷酸同一性百分?jǐn)?shù)。除非另有說明，查詢序列的長(zhǎng)度至少有45個(gè)核苷酸，GAP分析跨越至少45個(gè)核苷酸對(duì)齊的兩條序列。優(yōu)選地，查詢序列的長(zhǎng)度至少有150個(gè)核苷酸，GAP分析跨越至少150個(gè)核苷酸對(duì)齊的兩條序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長(zhǎng)度至少有300個(gè)核苷酸，GAP分析跨越在各種情況下，至少300個(gè)、或至少400個(gè)、或至少500個(gè)或至少600個(gè)核苷酸對(duì)齊的兩條序列。BLAST程序可參考例如Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389,1997公開的程序。序列分析的詳細(xì)內(nèi)容可參考Unit19.3ofAusubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonsInc,1994-1998,第15當(dāng)序列同一性為至少90%，特別為至少95%，更特別為一致時(shí)，核苷酸或氨基酸序列為“基本一致”。很清楚地是當(dāng)描述RNA序列基本相似時(shí)，或相當(dāng)于，與DNA序列具有一定程度的同一性時(shí)，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。關(guān)于確定的多核苷酸，同一性百分?jǐn)?shù)的數(shù)值高于上述提供的數(shù)值將作為優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，應(yīng)用時(shí)根據(jù)同一性百分?jǐn)?shù)的最小數(shù)值，優(yōu)選多核苷酸含有的多核苷酸序列具有與相關(guān)的以SEQIDNO命名的序列至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu)選至少99.1%、更優(yōu)選至少99.2%、更優(yōu)選至少99.3%、更優(yōu)選至少99.4%、更優(yōu)選至少99.5%,更優(yōu)選至少99.6%、更優(yōu)選至少99.7%、更優(yōu)選至少99.8%，和甚至更優(yōu)選至少99.9%的同一性。優(yōu)選地，編碼具有g(shù)hFAD2_l、ghFatB-2或ghCPA_FAS_2活性的多肽的本發(fā)明的多核苷酸，其長(zhǎng)度大于800、優(yōu)選大于900和更優(yōu)選大于1000個(gè)核苷酸。與天然存在的分子相比，本發(fā)明的多核苷酸可具有一個(gè)或多個(gè)由核苷酸殘基的缺失、插入或取代而形成的突變體。突變體可以是天然存在(即，分離自天然來源)或合成(例如，通過在核酸上進(jìn)行定點(diǎn)突變)。本發(fā)明用雜交條件的嚴(yán)格性限定兩條多核苷酸的互補(bǔ)程度。本文使用的“嚴(yán)格性”是指雜交和洗滌過程中的溫度和離子強(qiáng)度條件、特定有機(jī)溶劑的存在或缺少。嚴(yán)格性越高，靶核苷酸序列和標(biāo)記的多核苷酸序列(探針)之間的互補(bǔ)程度越高?！皣?yán)格條件”是指在溫度和離子強(qiáng)度的條件下，只有具有互補(bǔ)程度高的堿基的核苷酸序列能夠雜交。本文使用的術(shù)語“在低嚴(yán)格性、中度嚴(yán)格性、高嚴(yán)格性或非常高嚴(yán)格性條件下雜交”描述的是雜交禾口洗漆的條件。雜交反應(yīng)可參考Ausubel等，(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons，NY,6.3.1-6.3.6.，1989。參考書中描述了水法和非水法，可擇一使用。本文提到的特殊條件如下1)低嚴(yán)格雜交條件為45°C下，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后50-55°C下在0.2XSSC,0.1%SDS中洗兩次；2)中度嚴(yán)格雜交條件為45°C下，在6XSSC中雜交，然后60C下在0.2XSSC，0.1%SDS中洗一次或多次；幻高嚴(yán)格雜交條件為45°C下，在6XSSC中雜交，然后65°C下在0.2XSSC，0.1%SDS中洗一次或多次；以及4)非常高嚴(yán)格雜交條件為65°C下，在0.5M硫酸鈉緩沖液，7%SDS中雜交，然后65°C下在0.2XSSC，0.SDS中洗一次或多次。多月太術(shù)語“多肽”和“蛋白”一般可互換使用。本文使用的術(shù)語“蛋白”和“多肽”還包括本發(fā)明所述多肽的變異體、突變體、修飾物、類似物和/或衍生物。本文使用的“基本純化的多肽”是指已經(jīng)從在自然狀態(tài)下與其相連的脂、核酸、其它肽和其它分子中分離出來。優(yōu)選地，基本純化的多肽為至少90%從自然狀態(tài)下與其相連的其它成分中釋放出來。所謂“重組多肽”是指使用重組技術(shù)，即通過在細(xì)胞，優(yōu)選為植物細(xì)胞，更優(yōu)選為谷類植物細(xì)胞中表達(dá)重組多核苷酸而生成的多肽。多肽相對(duì)于另一條多肽的同一性百分?jǐn)?shù)可通過GAP(NeedlemanandWunsch,1970{同上))分析(GCG程序)，空位生成罰分=5，空位延伸罰分=0.3而確定。查詢序列的長(zhǎng)度為至少15個(gè)氨基酸，GAP分析跨越至少15個(gè)氨基酸對(duì)齊的兩條序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長(zhǎng)度為至少50個(gè)氨基酸，GAP分析跨越至少50個(gè)氨基酸對(duì)齊的兩條序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長(zhǎng)度為至少100個(gè)氨基酸，GAP分析跨越至少100個(gè)氨基酸對(duì)齊的兩條序列。甚至更優(yōu)選地，查詢序列的長(zhǎng)度為至少250個(gè)氨基酸，GAP分析跨越至少250個(gè)氨基酸對(duì)齊的兩條序列。本文使用的多肽的“生物活性”片段為本發(fā)明所述多肽的一部分，小于全長(zhǎng)，其保持了全長(zhǎng)多肽的活性。只要生物活性片段保持了確定的活性，它們可以是任何大小，但優(yōu)選至少200或至少250個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。關(guān)于確定的多肽，同一性百分?jǐn)?shù)的數(shù)值高于上述提供的數(shù)值將作為優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，應(yīng)用時(shí)根據(jù)同一性百分?jǐn)?shù)的最小數(shù)值，優(yōu)選多肽含有的氨基酸序列具有與相關(guān)的以SEQIDNO命名的序列至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu)選至少99.1%、更優(yōu)選至少99.2%、更優(yōu)選至少99.3%、更優(yōu)選至少99.4%、更優(yōu)選至少99.5%、更優(yōu)選至少99.6%、更優(yōu)選至少99.7%、更優(yōu)選至少99.8%，和甚至更優(yōu)選至少99.9%的同一性。本發(fā)明所述多肽的氨基酸序列突變體可通過向本發(fā)明所述核酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嵬蛔凅w，或體外合成所需的多肽而制備得到。這類突變包括，例如在氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代。若使最終的多肽產(chǎn)物具有想要的特征，可進(jìn)行缺失、插入和取代的組合以得到最終的基因構(gòu)建體。可使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備突變(改變的)肽。例如，可將本發(fā)明所述的多核苷酸進(jìn)行體外誘變。這類體外誘變技術(shù)包括將多核苷酸亞克隆至合適的載體中，轉(zhuǎn)化載體至“突變”株如大腸桿菌XL-I紅(Stratagene)中并傳代所述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌至適當(dāng)?shù)拇鷶?shù)。在另一個(gè)實(shí)例中，將本發(fā)明所述的多核苷酸進(jìn)行DNA洗牌(DNAshuffling)，該技術(shù)由Harayama，TrendsBiotechnol.16:76_82，1998進(jìn)行了大致描述。這些DNA洗牌技術(shù)可包括與本發(fā)明相關(guān)的那些基因，如除了棉花，來自于其它植物品種的基因，和/或包括來自于相同植物編碼相似蛋白的不同基因。由突變的/改變的DNA得到的產(chǎn)物可采用本發(fā)明所述的技術(shù)容易地篩選，以確定它們是否具有，例如FAD2活性。在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變體中，突變位點(diǎn)的定位及突變的性質(zhì)取決于要被改性的特征。突變位點(diǎn)可逐一修飾或串聯(lián)修飾，例如通過(1)先選擇用保守氨基酸取代，然后根據(jù)想要得到的結(jié)果選用更激進(jìn)的方法，(2)缺失靶殘基，或(3)在相鄰的位點(diǎn)插入其它殘基。通常氨基酸序列缺失的數(shù)目范圍是約115個(gè)殘基，更優(yōu)選約110個(gè)殘基，一般約15個(gè)連續(xù)殘基。取代突變?nèi)コ嚯姆肿又械闹辽僖粋€(gè)氨基酸殘基并使不同的殘基插入該位置。取代誘變的目標(biāo)位點(diǎn)包括鑒定的活性位點(diǎn)。其它目標(biāo)位點(diǎn)是那些在不同株或品種中獲得的相同的特定殘基。這些位置可能對(duì)生物活性很重要。這些位點(diǎn)，特別是落在至少三個(gè)其它相同保守的位點(diǎn)中的那些，優(yōu)選以相對(duì)保守的方式進(jìn)行取代。這類保守的取代如表5中所示，標(biāo)題為“示例性取代”。本發(fā)明的多肽可通過不同的方式制備，包括天然多肽的生產(chǎn)和回收，重組多肽的生產(chǎn)和回收。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的多肽是通過在有效產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞，并回收多肽而制備得到的。優(yōu)選的用于培養(yǎng)的細(xì)胞為本發(fā)明所述的重組細(xì)胞。本發(fā)明提到的元件是可操作連接或結(jié)合的?！翱刹僮鬟B接”或“可操作結(jié)合”等是指在功能關(guān)系中的多核苷酸元件的連接。一般地，可操作連接的核酸序列是連續(xù)連接的，必要時(shí)在閱讀框中加入兩個(gè)連續(xù)的蛋白編碼區(qū)。當(dāng)RNA聚合酶將兩條編碼序列轉(zhuǎn)錄為單一RNA時(shí)，編碼序列與另一條編碼序列“可操作連接”，如果進(jìn)行翻譯，則隨后該單一RNA被翻譯為具有來自兩條編碼序列氨基酸的單一多肽。只要表達(dá)的序列最終加工得到想要的蛋白，編碼序列不必是彼此連續(xù)的。本文使用的術(shù)語“順式作用序列”、“順式作用元件”或“順式調(diào)控區(qū)”或“調(diào)控區(qū)”或類似的術(shù)語應(yīng)被理解為當(dāng)位于適當(dāng)?shù)奈恢貌⑴c可表達(dá)的基因序列相連時(shí)，能夠至少部分地調(diào)節(jié)基因序列表達(dá)的任何核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，順式調(diào)控區(qū)能夠在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上激活、沉默、增強(qiáng)、抑制或其它改變基因序列表達(dá)和/或細(xì)胞型特異性和/或發(fā)育特異性(developmentalspecificity)水平。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，順式作用序列為能夠增強(qiáng)或刺激可表達(dá)基因序列表達(dá)的激活序列。將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件與可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸“可操作連接”表示將所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸(例如，編碼蛋白的多核苷酸或其它轉(zhuǎn)錄物)置于啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制下，然后控制所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。在構(gòu)建異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合中，一般優(yōu)選將啟動(dòng)子或其變體置于離可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與其天然情況下啟動(dòng)子和蛋白編碼區(qū)之間的距離相同的位置上；即，從中獲得啟動(dòng)子的基因上。本領(lǐng)域已知，只要不喪失功能，可調(diào)節(jié)距離上的變化。同樣，位于調(diào)控序列元件控制下的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸，其調(diào)控序列元件(例如，操縱子、增強(qiáng)子等)的優(yōu)選位置為天然情況下所述元件的位置；即，在調(diào)控序列元件作用下得到所述基因。本文使用的“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”通常是指RNA編碼區(qū)(5')上游的基因區(qū)域，其控制靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的起始和轉(zhuǎn)錄水平?！皢?dòng)子”包括典型基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，包括TATA盒和CCAAT盒序列，以及根據(jù)發(fā)育和/或環(huán)境刺激，或以組織特異性或細(xì)胞型特異性的方式改變基因表達(dá)的其它調(diào)控元件(即，上游激活序列，增強(qiáng)子和沉默基因)。通常，但不是必須的(例如，某些PoIIII啟動(dòng)子)啟動(dòng)子，位于結(jié)構(gòu)基因的上游，調(diào)控其表達(dá)。此外，含有啟動(dòng)子的調(diào)控元件通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的21Λ位置上。啟動(dòng)子可含有其它特異性調(diào)控元件，位于起始位點(diǎn)更遠(yuǎn)的位置上，以進(jìn)一步增強(qiáng)在細(xì)胞中的表達(dá)，和/或改變與其可操作連接的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的時(shí)間或誘導(dǎo)性?！敖M成型啟動(dòng)子”是指能夠指導(dǎo)植物中許多或全部組織的可操作連接的轉(zhuǎn)錄序列表達(dá)的啟動(dòng)子。本文使用的術(shù)語組成型不是指基因在所有細(xì)胞類型中以相同的水平表達(dá)，而是表示基因在廣泛的細(xì)胞類型中表達(dá)，盡管經(jīng)常檢測(cè)到水平差異。本文使用的“選擇性表達(dá)”是指幾乎只在植物的特定器官中表達(dá)，例如，胚乳、胚、葉片、果實(shí)、莖或根。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選擇性地或優(yōu)先地在植物發(fā)育的種子中表達(dá)，優(yōu)選為棉花。該術(shù)語還可以指在器官的特定發(fā)育階段表達(dá)，如在胚發(fā)生的早期、中期或晚期或成熟的不同階段，或指通過某些環(huán)境條件或處理誘導(dǎo)的表達(dá)。因此，選擇性表達(dá)可以與組成型表達(dá)相比較，其是指在植物經(jīng)歷的大部分或全部條件下在植物的許多或全部組織中的表達(dá)。選擇性表達(dá)還可在植物的特定組織、器官或發(fā)育階段中形成基因表達(dá)產(chǎn)物的區(qū)室化。特定亞細(xì)胞，如質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)、液泡或質(zhì)外體中的區(qū)室化作用，可通過基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有的適合的信號(hào)而實(shí)現(xiàn)，例如信號(hào)肽，運(yùn)輸?shù)剿璧募?xì)胞室，或在半自主的細(xì)胞器中(質(zhì)體線粒體)通過將轉(zhuǎn)基因與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列直接整合到細(xì)胞器基因組中。“組織特異性啟動(dòng)子”或“器官特異性啟動(dòng)子”是指相對(duì)于許多其它組織或器官，優(yōu)先表達(dá)于一種組織或器官中，優(yōu)選植物中大多數(shù)的組織或器官中。一般地，啟動(dòng)子在特定組織或器官中以10倍與其它組織或器官中的水平進(jìn)行表達(dá)。一個(gè)示例性的組織特異性啟動(dòng)子為凝集素基因的啟動(dòng)子(SEQIDNO:16)，其優(yōu)選在雙子葉植物如棉花的發(fā)育的種子中表達(dá)。其它種子特異性啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所熟知的。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可以來源于被轉(zhuǎn)化的宿主植物或其它來源，其中該區(qū)域在宿主植物中行使功能。其它來源包括土壤桿菌T-DNA基因，如合成胭脂堿、章魚堿(octapine)、甘露堿或其它冠癭堿基因的啟動(dòng)子(例如，見美國專利No.5，459，252，Conkling等；WO91/13992，AdvancedTechnologies)；病毒啟動(dòng)子(包括宿主特異性病毒)，或部分或全合成的啟動(dòng)子。大量在單子葉和雙子葉植物中行使功能的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域熟知的(例如，見Greve，J.MoI.Appl.Genet.，1:499-511,1983；Salomon等，EMBOJ.，3:141-146,1984；Garfinkel等，Cell,27:143-153,1983；Barker等，PlantMoI.Biol,2235-350,1983)；包括各種分離自植物和病毒如花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(CaMV35S，19S)。許多組織特異性啟動(dòng)子區(qū)域是已知的。其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，它們優(yōu)先在特定組織中或在特定生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)錄，包括那些編碼油菜籽蛋白(napin)、種子ACP、玉米蛋白或其它種子貯藏蛋白。檢測(cè)啟動(dòng)子活性的方法不限于Medberry等，PlantCell,4=185-192,1992,Medberry等，PlantJ.3:619-626,1993,Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ndEd).ColdSpringHarbourLaboratory,ColdSpringHarbour,N.Y.I989andMcPherson等，(美國專利No.5，164，316)中公開的方法。另外地或其它地，所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子，其能夠驅(qū)動(dòng)導(dǎo)入的多核苷酸在植物適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段的表達(dá)?？墒褂玫钠渌樖阶饔眯蛄邪ㄞD(zhuǎn)錄和/或翻譯增強(qiáng)子。增強(qiáng)子區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括ATG翻譯起始密碼子及相鄰序列。當(dāng)增強(qiáng)子中含有起始密碼子時(shí)，起始密碼子應(yīng)與外來的或外源的多核苷酸的編碼序列的閱讀框在一起，確保翻譯時(shí)全序列的翻譯。翻譯起始區(qū)可以來源于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，或來自于外來的或外源的多核苷酸。所述序列還可以來源于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的選擇性啟動(dòng)子，且能夠進(jìn)行特異性修飾以增強(qiáng)mRNA的翻譯。本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)可包括3‘非翻譯序列的從約501000個(gè)核苷酸堿基對(duì)，其可含有轉(zhuǎn)錄終止序列。3'非翻譯序列可含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，其可含有或不含有多腺苷酸化信號(hào)和然后其它能夠影響mRNA加工的調(diào)控信號(hào)。多腺苷酸化信號(hào)的作用是添加多腺苷酸尾巴至mRNA前體的3'末端。多腺苷酸化信號(hào)的識(shí)別通常為類似于常規(guī)形式5'-AATAAA-3'的形式，盡管變化形式并不少見。不含多腺苷酸化信號(hào)的轉(zhuǎn)錄終止序列包括含有四個(gè)或更多的胸腺嘧啶脫氧核苷的PolI或PolIIIRNA聚合酶終止子。適當(dāng)?shù)?'非翻譯序列實(shí)例為來自凝集素基因(SEQIDNO:20)、地下三葉草病毒的S3基因(SEQIDNO23)或根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶(nos)基因的含有多腺苷酸化信號(hào)的3'轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(Bevan等，Nucl.AcidRes.,11:369,1983)0適當(dāng)?shù)?'非翻譯序列還可來自于植物基因如馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因、大豆貯藏蛋白基因和小亞基核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的3'末端，還可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它3'元件。由于插入轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和起始編碼序列之間的DNA序列，S卩非翻譯的5'前導(dǎo)序列(5'UTR)能影響翻譯和轉(zhuǎn)錄時(shí)基因的表達(dá)，我們還可使用特定的前導(dǎo)序列。適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列包括那些含有能夠指導(dǎo)外來的或內(nèi)源DNA序列最佳表達(dá)的序列。例如，含有共有序列的前導(dǎo)序列，其能夠增強(qiáng)或保持mRNA的穩(wěn)定性和防止不適當(dāng)?shù)钠鹗挤g，例如Joshi，Nucl.AcidRes.15:6643,1987中所描述的。另外，靶序列可用于將外來的或外源的多核苷酸編碼的酶定位至胞內(nèi)室，例如定位至葉綠體，在植物細(xì)胞內(nèi)或胞外環(huán)境。例如，編碼運(yùn)輸或信號(hào)肽序列的核酸序列通過可操作連接與編碼本發(fā)明酶的序列相連，在進(jìn)行翻譯時(shí)，運(yùn)輸或信號(hào)肽能夠?qū)⒚皋D(zhuǎn)運(yùn)至特定的胞內(nèi)或胞外目的地，然后在翻譯后被任意去掉。運(yùn)輸或信號(hào)肽使轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白易于通過胞內(nèi)膜，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、泡、質(zhì)體、線粒體和質(zhì)膜的膜。例如，靶序列能夠指導(dǎo)目的蛋白到特定的細(xì)胞器，如液泡或質(zhì)體(例如，葉綠體)上，而不到細(xì)胞質(zhì)中。因此，本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包括編碼質(zhì)體運(yùn)輸肽的核酸序列，其可操作地連接于啟動(dòng)子區(qū)和外來的或外源多核苷酸之間。編碼這類信號(hào)肽的序列通常存在于天然存在的基因中且可以使用，例如本文描述的ghFatB基因中。載體本發(fā)明包括載體在操縱或轉(zhuǎn)移基因基因構(gòu)建體中的應(yīng)用。所謂“載體”表示核酸分子，優(yōu)選來自于例如質(zhì)粒、噬菌體或植物病毒的DNA分子，核酸序列可以插入或克隆至載體中。優(yōu)選載體為雙鏈DNA且含有一個(gè)或多個(gè)唯一的限制位點(diǎn)，能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，所述宿主細(xì)胞包括靶細(xì)胞或組織或祖細(xì)胞或其組織，或能夠整合至宿主的基因組中，使克隆的序列能夠復(fù)制。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即載體作為存在于染色體外的實(shí)體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如線性或環(huán)狀質(zhì)粒，染色體外元件、微型染色體或人工染色體。所述載體可含有任何用以確保自我復(fù)制的手段。另外，所述載體可以是一個(gè)，當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，整合至受體細(xì)胞的基因組中并隨其所整合的染色體一起復(fù)制。載體系統(tǒng)可包括單一載體或質(zhì)粒，兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，它們共同含有導(dǎo)入宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)座子基因組中的總DNA。載體的選擇一般取決于載體與其所要導(dǎo)入的細(xì)胞的相容性。所述載體還含有選擇標(biāo)記如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因或其它能用于篩選正確轉(zhuǎn)化子的基因。這類基因的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明的核酸基因構(gòu)建體可導(dǎo)入到載體如質(zhì)粒中。質(zhì)粒載體一般含有其它的核酸序列，該序列使表達(dá)盒在原核及真核細(xì)胞中易于篩選、擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化，例如PUC載體、pSK載體、pGEM載體、pSP載體、pBS載體或含有一個(gè)或多個(gè)T-DNA區(qū)的二元載體。其它的核酸序列包括用于使載體能夠自主復(fù)制的復(fù)制起始位點(diǎn)，，選擇性標(biāo)記基因，優(yōu)選編碼抗生素或除草劑抗性基因，為多個(gè)位點(diǎn)提供的唯一的多克隆位點(diǎn)以插入在核酸基因構(gòu)建體中編碼的核酸序列或基因，以及增強(qiáng)原核和真核(特別是植物)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列。所謂“標(biāo)記基因”表示能夠?qū)⒉煌谋硇蛡鬟f給表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞的基因，從而使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與不具有該標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開來。選擇性標(biāo)記基因的特征在于，我們能夠基于對(duì)選擇試劑(例如，除草劑、抗生素、輻射、熱或其它破壞未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的處理)的抗性進(jìn)行“篩選”。篩選標(biāo)記基因(或報(bào)告基因)的特征在于，我們能夠通過觀察或測(cè)試，即通過“篩選”(例如，β-葡萄糖醛酸酶、熒光酶、GFP或其它在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中不存在酶活性的酶)進(jìn)行鑒定。所述標(biāo)記基因和目的核苷酸序列不必是連接的。一個(gè)選擇標(biāo)記基因的實(shí)例是圖12中所示的Sl-NptII-S3終止子基因，包括SEQIDNOs:21_23。為方便轉(zhuǎn)化的鑒定，理想的核酸基因構(gòu)建體包括選擇或篩選標(biāo)記基因，或除此之外，外來的或外源多核苷酸。實(shí)際選擇的標(biāo)記不是至關(guān)重要的，主要是它能夠與選擇的植物細(xì)胞一起發(fā)揮作用(即，選擇性)。所述標(biāo)記基因和外來的或外源目的多核苷酸不必是連接的，因?yàn)槔缑枋鲇诿绹鴮＠鸑o.4，399，216中的未連接的基因的共轉(zhuǎn)化也是植物轉(zhuǎn)化中一種有效的方法。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例為具有抗生素抗性，如氨芐青霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性，優(yōu)選卡那霉素抗性的標(biāo)記物。典型的用于篩選植物轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記包括但不限于，編碼潮霉素B抗性的hyg基因，具有卡那霉素、巴龍霉素、G418抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll)基因；來自大鼠肝臟的具有耐受來自于除草劑的谷胱甘肽抗性的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，例如EP-A256223中描述的；過表達(dá)后具有谷氨酰胺合酶抑制劑如草胺膦，例如W087/05327中描述的抗性的谷氨酰胺合酶基因，具有選擇性試劑草胺膦，例如EP-A275957中描述的抗性的來自于綠色產(chǎn)色鏈霉菌的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，具有耐N-膦?；谆拾彼幔鏗inchee等，Biotech.6915,1988中描述的編碼5_烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，具有雙丙氨磷，例如W091/02071中描述的抗性的bar基因；具有溴草腈(Stalker等，Science,242419,1988)抗性的如來自克雷伯氏菌的bxn腈水解酶基因；具有甲氨蝶呤(Thillet等，J.Biol.Chem.26312500，1988)抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因；具有咪唑啉酮、磺酰脲類或其它ALS-抑制化學(xué)物質(zhì)(EP-A-1M204)抗性的乙酰乳酸合酶突變基因(ALQ；具有5-甲基色氨酸抗性的鄰氨基苯甲酸合酶突變基因；或具有除草劑抗性的茅草枯脫鹵素酶(dalapondehalogenase)基因。優(yōu)選的篩選標(biāo)記包括但不限于編碼β-葡萄糖醛縮酶(⑶幻的UidA基因，各種發(fā)色底物是已知的，編碼牛乳糖的基因，各種發(fā)色底物是已知的，水母發(fā)光蛋白基因(Prasher等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1261259-68，1985)，可用于鈣敏感的生物發(fā)光檢測(cè)；綠色熒光蛋白基因(Niedz等，PlantCellReports,14=403,1995.)或其衍生物；熒光酶(Iuc)基因(Ow等，Science，234:856，1986)，可用于生物發(fā)光檢測(cè)和其它本領(lǐng)域已知的用途。本發(fā)明中使用的“報(bào)告分子”表示分子的化學(xué)性質(zhì)提供了可分析識(shí)別的信號(hào)，通過對(duì)照蛋白產(chǎn)物，有利于檢測(cè)啟動(dòng)子的活性。改變基因表達(dá)的方法蛋白水平，例如，植物發(fā)育種子中的油合成過程中所包含的酶可通過提高植物細(xì)胞中編碼所述蛋白的核苷酸序列的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，或降低植物中編碼所述蛋白基因的表達(dá)水平，得到改良的油組成的成熟種子。基因的表達(dá)水平可通過改變其在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如通過引入可操作連接的，且在胞內(nèi)發(fā)揮功能的含有編碼序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的合成的基因基因構(gòu)建體。大多數(shù)的轉(zhuǎn)化子可進(jìn)行選擇或篩選，選擇或篩選那些受轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)鄰近的內(nèi)源序列影響而引起的可觀水平和./或特異性的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。可觀的轉(zhuǎn)基因水平和模式帶來了大致修飾的油組成?？赏ㄟ^簡(jiǎn)單測(cè)試來自轉(zhuǎn)化子的籽油進(jìn)行測(cè)定。另外，可對(duì)大量的誘變谷物或繁育植株進(jìn)行篩選，獲得具有改變的油含量或組成的單株系。減少基因表達(dá)可通過向植物細(xì)胞中導(dǎo)入和轉(zhuǎn)錄“基因沉默嵌合基因”而實(shí)現(xiàn)。所述基因沉默嵌合基因可穩(wěn)定地導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組中，優(yōu)選核基因組中，或可以瞬間導(dǎo)入，例如病毒載體上。本文使用的“基因沉默效應(yīng)”是指減少靶核酸在植物細(xì)胞中的表達(dá)，這可以通過導(dǎo)入沉默RNA而實(shí)現(xiàn)。這種減少可能是包括經(jīng)由染色質(zhì)重塑的甲基化轉(zhuǎn)錄減少的結(jié)果，，或包括經(jīng)由RNA降解，RNA分子的轉(zhuǎn)錄后修飾減少結(jié)果，，或經(jīng)由兩種途徑?；虺聊ㄈ∠泻怂峄蚧虻谋磉_(dá)，并且部分影響到基因表達(dá)的程度或持續(xù)時(shí)間。充分的證據(jù)表明沉默RNA存在時(shí)的靶核酸表達(dá)水平比缺少沉默RNA時(shí)的靶核酸表達(dá)水平低。表達(dá)水平可降低至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%，或至少約80%，或至少約90%,或至少約95%，或至少約99%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子中棉花ghCPA-FAS-2基因的表達(dá)相對(duì)于缺少基因沉默嵌合DNA的種子降低至少約60%，更優(yōu)選至少80%。靶核酸可以是參與油生物合成，油累積的基因，如參與TAG組裝的基因，包括但不限于?；D(zhuǎn)移酶或Kennedey途徑中的其它酶，或參與油代謝的基因，或可以是任何其它內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)基因或外源基因，如病毒基因，其可能不存在于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因時(shí)的植物細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改良棉株內(nèi)源性油的方法，包括生產(chǎn)其基因基因構(gòu)建體中含有脂肪酸生物合成基因或其基因片段的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因棉株，其中所述基因或基因片段與啟動(dòng)子序列可操作連接，能夠在棉株的種子中表達(dá)所述基因或基因片段，其中所述脂肪酸生物合成基因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)FAD2去飽和酶、FatB硫酯酶和CPA-FAS-2脂肪酸合酶基因。本文所述降低的基因表達(dá)提高了內(nèi)源性油和提取油的脂肪酸含量。反義RNA分子根據(jù)本發(fā)明，反義技術(shù)可用于降低基因表達(dá)。術(shù)語“反義RNA”應(yīng)理解為至少與特定的mRNA分子部分互補(bǔ)，且能夠降低編碼mRNA基因的表達(dá)的RNA分子。這種降低一般以序列依賴的方式發(fā)生，被認(rèn)為通過干擾轉(zhuǎn)錄后事件，如mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，mRNA穩(wěn)定性或翻譯抑制發(fā)生。反義方法的使用是本領(lǐng)域熟知的(見例如HartmarmandEndres,ManualofAntisenseMethodology，Kluwer，1999)。反義技術(shù)在植物中的使用見Bourque，PlantScience,105125-149,1995andSenior,Biotech.Genet.Engin.Revs.15:79-119,1998.Bourque，1995(同上)中的描述，其中列舉了大量的反義序列用于植物系統(tǒng)中基因失活的實(shí)例。她還指出，實(shí)現(xiàn)任何酶活性的100%抑制可能不是必須的，因?yàn)椴糠忠种聘菀捉o系統(tǒng)帶來可檢測(cè)到的變化。knior，1998(同上)指出，反義方法現(xiàn)在是基因表達(dá)操作中非常完善的技術(shù)。本文使用的術(shù)語“在生理?xiàng)l件下雜交的反義核苷酸”表示在細(xì)胞的正常條件下，所述核苷酸(其為全部或部分單鏈)至少能夠與要被抑制的基因的RNA產(chǎn)物形成雙鏈多核苷酸，一般地，所述mRNA編碼如本發(fā)明所述的蛋白。反義分子可包括對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因的序列或影響控制基因表達(dá)或剪切事件的序列。例如，反義序列可對(duì)應(yīng)于靶基因編碼，或5'-非翻譯區(qū)(UTR)或3'-UTR或它們的組合。它可以是與內(nèi)含子序列部分互補(bǔ)的，其在轉(zhuǎn)錄過程中或轉(zhuǎn)錄后被剪切掉，但優(yōu)選僅與靶基因的內(nèi)含子序列互補(bǔ)。鑒于UTRs通常具有很大的不同，需要大基因抑制特異性來靶向到這些區(qū)域。反義序列的長(zhǎng)度應(yīng)為至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選至少25或30或50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少100、200、500或1000個(gè)核苷酸，至要抑制的基因全長(zhǎng)的最大值。可使用與整條基因轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的全長(zhǎng)序列。長(zhǎng)度最優(yōu)選為1002000個(gè)核苷酸。反義序列與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的相似度應(yīng)為至少90%，更優(yōu)選95100%。優(yōu)選的反義序列包括至少30個(gè)與任何來自SEQIDNOs:1、5或12序列互補(bǔ)的連續(xù)的核苷酸。反義RNA分子當(dāng)然可以包括用于穩(wěn)定分子的不相關(guān)序列?？蓪?dòng)子序列在“反義”方向上加入到靶基因區(qū)中，生成表達(dá)反義RNA的基因基因構(gòu)建體，本文是指相對(duì)于植物細(xì)胞的靶基因中序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯(如果發(fā)生)方向的相反方向。因此，本發(fā)明還提供編碼所述反義RNA的核酸分子如嵌合DNA，包括含有所述核酸分子的細(xì)胞、組織、器官、植株、種子，特別是棉株或棉籽等。核酶本文使用的術(shù)語“核酶”是指特異性識(shí)別不同RNA底物并催化其斷裂的RNA分子。一般地，核酶含有一段與靶RNA序列互補(bǔ)的核苷酸，能夠使核酶在生理?xiàng)l件下與靶RNA特異性雜交，例如在核酶作用的細(xì)胞中，本文提到的酶區(qū)為“催化域”。本發(fā)明中特別有用的核酶類型是錘頭狀核酶(HaseloffandGerlach,Nature3；34:585-591，1988，Perriman等Gene,113:157-163,1992)和發(fā)夾核酶(Shippy等，MoIBiotech.12:117-129,1999)。DNA編碼的核酶可采用本領(lǐng)域熟知的方法合成，且可整合至基因基因構(gòu)建體或表達(dá)載體中，在目的細(xì)胞中表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供核酸分子如編碼核酶的嵌合DNA，包括含有所述核酸分子的細(xì)胞、組織、器官、植株、谷類等。DNA編碼的核酶一般插入到細(xì)胞中受啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)控制的表達(dá)盒中。任何潛在的靶RNA中的核酶特異切割位點(diǎn)可通過檢測(cè)含有三核苷酸序列GUA、GUU和GUC的核酶切割位點(diǎn)的靶分子而識(shí)別。一旦識(shí)別，對(duì)應(yīng)于切割位點(diǎn)的靶基因5'和3'區(qū)的約第5和20位核糖核苷酸之間的短RNA序列可通過預(yù)測(cè)的使寡核苷酸序列不適合的結(jié)構(gòu)特征如二級(jí)結(jié)構(gòu)而測(cè)定。使用核酶時(shí)，應(yīng)選自由錘頭狀核酶、發(fā)夾核酶、斧頭狀核酶、紐特衛(wèi)星核酶、四膜蟲核酶和核糖核酸酶P核酶組成的組，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法基于靶基因的序列而設(shè)計(jì)(例如，見美國專利No.5，741，679)。也可采用核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)，通過測(cè)試候選目標(biāo)與互補(bǔ)寡核苷酸雜交的容易程度來評(píng)價(jià)候選目標(biāo)的適合性。與本文所述的反義多核苷酸一樣，本發(fā)明的核酶在“生理?xiàng)l件”下應(yīng)該能夠與靶核酸分子(例如SEQIDNOs:1、5或12)雜交，即在細(xì)胞中，特別是植物細(xì)胞如小麥或大麥細(xì)胞中的那些條件。RNA干擾/二倍體RNA(duplexRNA)本文使用的“人工導(dǎo)入dsRNA分子”是指導(dǎo)入dsRNA分子，其可通過在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄編碼如dsRNA分子的嵌合基因而制備，然而不是指將單鏈RNA分子反向插入到真核或植物細(xì)胞的dsRNA中。RNA干擾(RNAi)特別適于降低基因表達(dá)或抑制特定蛋白的產(chǎn)生。雖然不希望受到理論限制，但Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.ScLU.S.Α.9513959-13964，1998已經(jīng)提出了一種模型，用于解釋dsRNA能夠用于降低基因表達(dá)或蛋白產(chǎn)生的機(jī)制。該技術(shù)依賴于存在的dsRNA分子，其含有的序列與目的基因或其部分的mRNA基本一致。方便地，dsRNA可由重組載體或宿主細(xì)胞中的單一啟動(dòng)子制備得到，其中正義和反義序列轉(zhuǎn)錄生成發(fā)夾RNA，其中正義和反義序列雜交形成帶有間插序列(interveningsequence)或空位區(qū)(spacerregion)的dsRNA區(qū)，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此發(fā)夾RNA含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明適合的dsRNA分子的設(shè)計(jì)和制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做到的，特別參考Waterhouse等，1998(同上)，Smith等，Nature，407:319-320，2000，WO99/53050，W099/49029和WO01/34815。因此，本發(fā)明還提供核酸分子，如編碼二倍體RNA如本發(fā)明發(fā)夾RNA的嵌合DNA，包括含有所述核酸分子的細(xì)胞、組織、器官、植物、種子，特別是棉株或棉籽等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合DNA具有圖12中所示的結(jié)構(gòu)，含有圖13中所示的序列，本文提到的MonoCott結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中，導(dǎo)入DNA，它指導(dǎo)與被滅活的靶基因同源的至少部分雙鏈RNA產(chǎn)物的合成。因此，DNA包括正義和反義序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)，能夠雜交生成雙鏈RNA區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，正義和反義序列被含有內(nèi)含子的間隔區(qū)分開，當(dāng)轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)被剪切。優(yōu)選的內(nèi)含子是來自ghFAD2-l基因的內(nèi)含子，例如SEQIDNO18。這種排列能夠形成高效的基因沉默(Smith等，2000(同上))。雙鏈區(qū)可包含一個(gè)或兩個(gè)RNA分子，轉(zhuǎn)錄自一個(gè)DNA區(qū)或兩個(gè)DNA區(qū)。dsRNA可被歸于長(zhǎng)hpRNA，具有長(zhǎng)的可大部分互補(bǔ)的正義和反義區(qū)，但不必完全互補(bǔ)(一般形成的堿基對(duì)區(qū)彡約IOObp，優(yōu)選范圍在200IOOObp之間)。hpRNA其雙鏈部分的大小還可以彡約30約50bp，或約30約IOObp(見W004/073390，通過引用并入于此)。雙鏈RNA區(qū)的存在被認(rèn)為引發(fā)內(nèi)源植物系統(tǒng)的反應(yīng)，將雙鏈RNA加工成2124個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸，并用這些寡核苷酸進(jìn)行靶植物基因同源RNA轉(zhuǎn)錄物的序列特異性切割，有效地降低或減弱靶基因的活性。24每條進(jìn)行雜交的正義和反義序列的長(zhǎng)度應(yīng)至少為19個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選為至少27或30或50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少100、200或500個(gè)核苷酸，至完整基因轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)序列。最優(yōu)選長(zhǎng)度為1002000個(gè)核苷酸。正義和反義序列與靶轉(zhuǎn)錄物的相似度應(yīng)至少為85%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選95100%。序列越長(zhǎng)，對(duì)全序列同一性的要求越低。當(dāng)然RNA分子可含有不相關(guān)的序列，其可用于穩(wěn)定所述分子。所述RNA分子可以是不同序列定位的不同靶RNAs的雜合體，可降低>1個(gè)靶基因的表達(dá)，或它可以是對(duì)應(yīng)于相關(guān)靶基因家族如多基因家族的一條序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA分子靶向至少三個(gè)不同的靶基因，更優(yōu)選為棉花中的ghFAD2-l、gh!^itB-2和ghCPA_FAS_2基因。優(yōu)選dsRNA中使用的序列對(duì)應(yīng)于靶基因的外顯子序列，可對(duì)應(yīng)于5'和/或3'非翻譯序列或蛋白編碼序列或任何它們的組合。用于表達(dá)生成dsRNA結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子可以是任何類型的啟動(dòng)子，只要獲得的dsRNA對(duì)于要破壞的細(xì)胞譜系中的基因產(chǎn)物是特異性的。另外，啟動(dòng)子可以是譜系特異性的，它只表達(dá)于特定發(fā)育譜系的細(xì)胞中。這可能是有利的，當(dāng)觀察到某些重疊與表達(dá)于非靶細(xì)胞譜系中的基因是同源的。啟動(dòng)子還可以是受外界調(diào)控因子或胞內(nèi)環(huán)境因子誘導(dǎo)的。一般地，RNA分子是在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的。后者的實(shí)例包括tRNA或snRNA啟動(dòng)子。實(shí)施例5中提供了編碼dsRNA分子的基因基因構(gòu)建體的實(shí)例，可用于下調(diào)棉籽中用于改良油組成的多肽的產(chǎn)生。其它的沉默RNA可以是“未腺苷酸化的RNA”，含有至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，與靶基因RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少95%的序列同一性，如W001/U8M或US6423885(均通過引用并入于此)中描述的。然而，另一種類型的沉默RNA是描述于W003/076619(通過引用并入于此)中的RNA分子，含有至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，具有與靶核酸或其互補(bǔ)序列的序列95%的序列同一性，進(jìn)一步含有W003/076619中描述的大部分雙鏈區(qū)。微RNA調(diào)節(jié)是從基因調(diào)節(jié)進(jìn)化而來的RNA沉默途徑的一條特殊支鏈，與傳統(tǒng)RNAi/PTGS不同。微RNA是一類特殊的小RNAs，在以部分反向重復(fù)為特征組織的類基因元件中進(jìn)行編碼。當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，微RNA基因產(chǎn)生部分堿基對(duì)莖-環(huán)前體RNAs，隨后加工得到微RNAs。加工的RNAs—般長(zhǎng)度為21個(gè)或2123個(gè)連續(xù)的核苷酸，具有與靶基因RNA轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)序列的21個(gè)連續(xù)的核苷酸至少95%的序列同一性。釋放的miRNAs整合至含Argonaute蛋白的特殊亞族的類RISC復(fù)合物上，產(chǎn)生序列特異的基因抑制(見，例如MillarandWaterhouse,FundIntegrGenomics,5129-135,2005;Pasquinelli等，CurrOpinGenetDevelop15:200-205,2005；AlmeidaandAllshire,TrendsCellBiol.15:251-258,2005，通過引用并入于此)。共抑制另一種可用于特異性降低基因表達(dá)的分子生物方法是共抑制。共抑制的機(jī)制還不是很清楚，但認(rèn)為它包含轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)，在這方面可能與許多反義抑制的實(shí)例非常相似。它包括將基因或其片段的額外拷貝在啟動(dòng)子表達(dá)的“正向”上導(dǎo)入植物中，本文是指與靶基因序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯(如果發(fā)生)相同的方向上，正義片段的大小對(duì)應(yīng)于靶基因區(qū)，它與靶基因的同源程度同上述反義序列。在某些實(shí)施例中，基因序列的額外拷貝干擾了植物靶基因的表達(dá)。參考專利WO97/20936和歐洲專利0465572中實(shí)現(xiàn)的共抑制的方法。反義、共抑制或雙鏈RNA分子還含有大雙鏈RNA區(qū)，優(yōu)選含有核定位信號(hào)，如WO03/076619中描述的。這些用于降低基因表達(dá)的技術(shù)中的任一種可用于協(xié)同降低多基因活性。例如，通過定位基因共有的區(qū)，一個(gè)RNA分子可由相關(guān)的基因家族定位。另外，不相關(guān)的基因可通過包括于一條RNA分子中的多個(gè)區(qū)來定位，每個(gè)區(qū)定位不同的基因。這可以通過在單一啟動(dòng)子的控制下融合多個(gè)區(qū)而實(shí)現(xiàn)，如實(shí)施例5。將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法/轉(zhuǎn)化可采用許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將核酸分子導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”表示生物體基因型的改變，例如細(xì)菌或植物，通過導(dǎo)入外來的或外源核酸。所謂“轉(zhuǎn)化體”表示改變的生物體。本文使用的“轉(zhuǎn)基因”是指導(dǎo)入外來的或外源基因或序列的遺傳修飾的植物，其中內(nèi)源基因組通過整合進(jìn)行補(bǔ)充或修飾，或以非整合的可復(fù)制形式穩(wěn)定的存在。所謂“轉(zhuǎn)基因”是指導(dǎo)入到植物基因組中的外來的或外源基因或序列。所述核酸分子可穩(wěn)定地整合至植物基因組中，或作為染色體外元件進(jìn)行復(fù)制。所謂“基因組”表示細(xì)胞、植物或植物部位的總遺傳物質(zhì)，包括染色體DNA、質(zhì)體DNA、線粒體DNA和染色體外DNA分子。本文使用的與植物材料有關(guān)的術(shù)語“再生”表示從植物細(xì)胞、植物細(xì)胞群、植物部位，例如胚、胚鱗、原生質(zhì)體、愈傷組織或其它組織生長(zhǎng)成為完整的、分化的植物，但不包括從種子生長(zhǎng)得到的植物。轉(zhuǎn)化技術(shù)的特殊選擇由轉(zhuǎn)化特定植物品種的效率以及實(shí)施發(fā)明的操作者的經(jīng)驗(yàn)和在本發(fā)明中選用特定方法的喜好而確定。顯而易見，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，假使能夠達(dá)到可接受的核酸轉(zhuǎn)化水平，將核酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化體系的特殊選擇不是必須的或限于本發(fā)明。用于改良植物的轉(zhuǎn)化體系的操作指南參考Birch，ArmRevPlantPhysiolPlantMoIBiol.48:297-326,19970原則上，適于轉(zhuǎn)化的雙子葉植物和單子葉植物都能夠通過將本發(fā)明的核酸基因構(gòu)建體導(dǎo)入到受體細(xì)胞中并生長(zhǎng)成為新的具有和表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的植株而進(jìn)行改良。已表明可以使用根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)T-DNA(Ti)質(zhì)粒在雙子葉植物如棉花、馬鈴薯、番茄和豆類或單子葉植物如谷類，包括小麥、大麥、水稻、玉米、燕麥、黑麥和高粱中導(dǎo)入并表達(dá)外來的或外源多核苷酸(參見，例如Umbeck，美國專利No.5，004,863和國際申請(qǐng)PCT/US93/02480)。本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以使用含Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞中。用根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)，最有利的是使用農(nóng)桿菌的非抗癌株作為載體，使轉(zhuǎn)化組織可以具有正常的非抗癌差異。優(yōu)選農(nóng)桿菌具有二元Ti質(zhì)粒體系。該二元體系包括⑴具有對(duì)將轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)導(dǎo)入到植物中必須的毒力區(qū)的第一Ti質(zhì)粒，以及(2)嵌合質(zhì)粒。所述嵌合質(zhì)粒含有至少一個(gè)與要轉(zhuǎn)移的核酸側(cè)接的野生型Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)的邊界區(qū)。已表明二元Ti質(zhì)粒體系對(duì)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是有效的，例如DeFramond,Biotechnology,1262,1983和Hoekema等，Nature，303:179，1983中所述。尤其是因?yàn)闊o需整合Ti質(zhì)粒至農(nóng)桿菌中，該二元體系是優(yōu)選的。有關(guān)農(nóng)桿菌使用的方法包括但不限于用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織如種子、根尖或分生組織用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，或植物接種如Bechtold等，CR.Acad.Sci.Paris,316:1194，1993中描述的花浸蘸法。該法基于農(nóng)桿菌細(xì)胞懸浮液的浸潤(rùn)。另外，可以使用農(nóng)桿菌的根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒作為載體導(dǎo)入嵌合基因構(gòu)建體。通過導(dǎo)入外源核酸轉(zhuǎn)化棉株的方法以及通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生從細(xì)胞再生植株的方法是本領(lǐng)域熟知的。將核酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物細(xì)胞的其它方法為通過電穿孔或小粒子高速轟擊滲透(又稱粒子轟擊或基因槍法)，將需導(dǎo)入的核酸包含于小珠或粒子的基質(zhì)中或其表面，例如Klein等，Nature,327:70，1987中所述。本文使用的“誘導(dǎo)突變”是人工誘導(dǎo)基因變異，其可由化學(xué)、輻射或基于生物的誘變所致，例如轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入。優(yōu)選的突變?yōu)闊o效突變?nèi)绶钦x突變、移碼突變、插入突變或使目的基因完全失活的剪切位點(diǎn)變異。核苷酸插入的衍生物包括5'和3'末端融合以及單或多核苷酸插入序列內(nèi)部。插入的核苷酸序列變異是指將一個(gè)或多個(gè)核苷酸導(dǎo)入核苷酸序列中得到的那些，可通過隨機(jī)插入用適當(dāng)?shù)姆椒êY選得到的產(chǎn)物獲得。缺失變異的特征是從序列中除去一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，相對(duì)于野生型基因，突變基因只有核苷酸序列的單一插入或缺失。取代型核苷酸變異是指那些其序列中至少有一個(gè)核苷酸被去掉并由不同的核苷酸插入到該位置。相對(duì)于野生型基因，突變基因中取代的核苷酸數(shù)目?jī)?yōu)選最大為10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選最大為9、8、7、6、5、4、3或2，或僅1個(gè)核苷酸。這類取代可以是“沉默的”，取代并不改變由密碼子定義的氨基酸。另外，設(shè)計(jì)保守取代物將一個(gè)氨基酸改變成另一個(gè)相似作用的氨基酸。本文使用的術(shù)語“突變”不包括沉默的核苷酸取代，其并不影響到基因的活性，因此，僅包括影響到基因活性的基因序列的改變。術(shù)語“多態(tài)性”是指包括這類沉默的核苷酸取代的任何核苷酸序列的變化。誘變可通過化學(xué)的或輻射方法實(shí)現(xiàn)，例如用本領(lǐng)域熟知的EMS或疊氮化鈉(ZwarandChandler,Planta197=39-48,1995)處理種子，或Y照射。突變體的分離可通過篩選突變的植株或種子而實(shí)現(xiàn)。在多倍體植物如棉花中，優(yōu)選在缺少一種酶活性的基因型中進(jìn)行篩選，找到完全沒有功能活性的突變體。另外，可使用“定向誘導(dǎo)基因組局部突變(tilling)”技術(shù)對(duì)使用如試劑EMS誘變的群體進(jìn)行鑒定(SladeandKnauf，TransgenicRes.14:109-115,2005)。然后通過將突變株與理想基因背景的植株雜交將突變導(dǎo)入理想基因背景中，進(jìn)行適當(dāng)數(shù)量的回交，去掉最初不需要的親本背景。本發(fā)明明確延伸到生產(chǎn)或鑒定這類植物或由這類植物產(chǎn)生的種子的方法。生產(chǎn)本發(fā)明植物的過程可包括誘變和/或篩選步驟如定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes,TILLING)。在第一步中，導(dǎo)入的突變?nèi)缬没瘜W(xué)誘變劑或輻射處理細(xì)胞、種子、花粉或其它植物部位在植物群體中誘導(dǎo)新的單堿基對(duì)改變，然后將植物傳代使突變能夠穩(wěn)定地遺傳。提取DNA，保存全部群體成員的種子，建立資源庫，便于今后能夠重復(fù)獲得。TILLING測(cè)定，設(shè)計(jì)PCR引物特異擴(kuò)增單一的目的基因。如果靶序列是基因家族中的一員或多倍體基因組中的一部分，特異性是尤其重要的。其次，染色標(biāo)記的引物可用于擴(kuò)增匯集多個(gè)個(gè)體DNA的PCR產(chǎn)物。將這些PCR產(chǎn)物變性并退火，生成錯(cuò)配的堿基對(duì)。錯(cuò)配或異源雙鏈表示天然存在的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)(即，群體中的幾株可能帶有相同的多態(tài)性)和誘導(dǎo)的SNPs(即，僅極少數(shù)個(gè)別株可能顯示突變)。異源雙鏈形成后，應(yīng)用識(shí)別并切割錯(cuò)配的DNA的核酸內(nèi)切酶如CelI，是在TILLING群體中發(fā)現(xiàn)新SNPs的關(guān)鍵。采用該方法，篩選到數(shù)以千計(jì)的帶有單一堿基變化的植株以及在基因或基因組的特定區(qū)域中帶有少量插入或缺失(130bp)的植株。進(jìn)行測(cè)試的基因片段大小范圍是0.31.61Λ。建立8倍池，各測(cè)試為1.41Λ(去掉因噪音引起的SNP檢測(cè)有困難的片段末端)和96道，該組合使每個(gè)單一測(cè)試篩選到基因組DNA的數(shù)以百萬個(gè)堿基對(duì)，使TILLING成為高通量技術(shù)。TILLING進(jìn)一步描述于SladeandKnauf，2005(同上)，andHenikoff等，PlantPhysiol.135:630_636，2004，通過引用并入于此。除了能夠高效檢測(cè)突變，高通量TILLING技術(shù)還能夠理想地檢測(cè)自然多態(tài)性。因此，通過與已知序列進(jìn)行異源雜交詢問(interrogating)未知的同源DNA，確定多態(tài)位點(diǎn)的數(shù)量和位置?？蓹z測(cè)到核苷酸的變化和少量插入及缺失，包括至少某些重復(fù)數(shù)量的多態(tài)性。這被稱為Ecotilling技術(shù)(Comai等，PlantJ.37:778-786,2004)。本文使用的術(shù)語“遺傳連接的”是指一個(gè)標(biāo)記基因座和第二個(gè)基因座在染色體上足夠靠近，它們?cè)?gt;50%的減數(shù)分裂中共同遺傳，例如不是隨機(jī)的。該定義包括形成相同基因一部分的標(biāo)記基因座和第二個(gè)基因座的位置。此外，該定義包括用于目的性狀的具有多態(tài)性的標(biāo)記基因座的位置(換言之，標(biāo)記基因座直接與表型“相連”)。因此，觀察到的每代基因座之間的重組百分?jǐn)?shù)(厘摩(cM))為<50。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，染色體上遺傳連接的基因座的距離可以是45、35、25、15、10、5、4、3、2、1或不到洲。優(yōu)選地，標(biāo)記基因座的距離為<5cM或2cM，更優(yōu)選為約OcM。本文使用的“其它遺傳標(biāo)記”可以是任何與棉株的期望性狀有關(guān)的分子。這些標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括與基因決定性狀如抗病、產(chǎn)量、植物多態(tài)、籽棉質(zhì)量，有關(guān)的分子標(biāo)記。能夠檢測(cè)目的基因的等位基因的本領(lǐng)域已知的任何分子生物技術(shù)可用于本發(fā)明的方法中。這些方法包括但不限于，使用核酸擴(kuò)增、核酸測(cè)序、用適合的標(biāo)記探針進(jìn)行核酸雜交、單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、異源分析(HET)、化學(xué)切割分析(CCM)、催化核酸切割或它們的組合。本發(fā)明還包括使用分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)與等位基因有關(guān)的多態(tài)性。所述方法包括限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和微衛(wèi)星(簡(jiǎn)單重復(fù)序列，SSR)多態(tài)性的檢測(cè)或分析。緊密相連的標(biāo)記可通過本領(lǐng)域熟知的方法容易地獲得，如分群分析法。“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“PCR”)是指在反應(yīng)中，用由“上游”和“下游”引物組成的“引物對(duì)”或“引物組”以及聚合反應(yīng)的催化劑，如DNA聚合酶，一般為熱穩(wěn)定的聚合酶，生成目標(biāo)多核苷酸的重復(fù)拷貝。PCR方法為本領(lǐng)域已知的方法，例如“PCR”(McPhersonandMoller(Ed),BIOSScientificPublishersLtd,Oxford,2000)中描述的。PCR可以從表達(dá)SSII基因的植物細(xì)胞中分離的mRNA反轉(zhuǎn)錄或從植株中分離的基因組DNA得到的cDNA上進(jìn)行。本文中的引物是能夠以序列特異的方式與靶序列進(jìn)行雜交并在PCR過程中延伸的寡核苷酸序列。擴(kuò)增子或PCR產(chǎn)物或PCR片段或擴(kuò)增產(chǎn)物為含有引物和新合成的靶序列拷貝的延伸產(chǎn)物。引物可以與靶序列完全匹配或含有內(nèi)部錯(cuò)配堿基，能夠在特定的靶序列中引入限制酶或催化核酸識(shí)別/斷裂位點(diǎn)。引物還可含有易于捕獲或檢測(cè)擴(kuò)增子的額外序列和/或含有修飾的或標(biāo)記的核苷酸。DNA的熱變性重復(fù)循環(huán)，互補(bǔ)序列引物的退火及在聚合酶作用下，退火引物的延伸形成靶序列的指數(shù)擴(kuò)增。術(shù)語目的基因或靶序列或模板是指進(jìn)行擴(kuò)增的核酸序列。核苷酸序列直接測(cè)序的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如Ausubel等(同上)和Sambrook等，1989(同上)中描述的。測(cè)序可采用任何適合的方法進(jìn)行，例如雙脫氧測(cè)序、化學(xué)測(cè)序或它們的變化形式。直接測(cè)序具有確定特定序列的任何堿基對(duì)變化的優(yōu)勢(shì)。植物本文使用的術(shù)語“植物”為名詞，是指全部植物或植物界的任何成員，作為形容詞使用時(shí)是指存在于、來自、衍生自或與植物相關(guān)的任何物質(zhì)，例如植物器官(例如葉子、莖、根、花)、單細(xì)胞(例如花粉)、種子、植物細(xì)胞等。由小植株和發(fā)芽的種子產(chǎn)生的根和芽也包括在“植物”中。本文使用的術(shù)語“植物部位”是指由植物獲得的一個(gè)或多個(gè)植物組織或器官，其含有植物的基因組DNA。植物部位包括營養(yǎng)結(jié)構(gòu)(例如葉、莖)、根、花器官/結(jié)構(gòu)、種子(包括胚、子葉和種皮)、植物組織(例如維管組織、基本組織等)、細(xì)胞及其后代。本文使用的術(shù)語“植物細(xì)胞”是指從植物中獲得的或植物中的細(xì)胞，包括原生質(zhì)體或其它來自植物的細(xì)胞、產(chǎn)配子細(xì)胞和可再生為植株的細(xì)胞。植物細(xì)胞可以是培養(yǎng)物中的細(xì)胞。所謂“植物組織”是指植物中分化的組織或來自植物(“外植體”)或由未成熟的或成熟的胚、種子、根、芽、果實(shí)、塊莖、花粉、腫瘤組織如冠癭以及培養(yǎng)物中植物細(xì)胞的聚合物的各種形式如愈傷組織獲得的未分化的組織。典型的種子中的或來自種子的植物組織為子葉、胚和胚軸。因此，本發(fā)明包括植物和植物部位以及它們的產(chǎn)品，特別是含有改良的油組成的種子。本文使用的術(shù)語“種子”是指植物“成熟的種子”，或是準(zhǔn)備從植物中收獲的種子或是已經(jīng)從植物中收獲的種子，如本領(lǐng)域中通常商業(yè)收獲的種子或產(chǎn)生于植物受精后和種子休眠期之前以及收獲前的作為“發(fā)育的種子”。本文使用的“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有在相同品種、種類或栽培品種的野生型植物中未發(fā)現(xiàn)基因基因構(gòu)建體的植物。也就是說，轉(zhuǎn)基因植物(轉(zhuǎn)化植物)含有在轉(zhuǎn)化前它們不含有的遺傳物質(zhì)(轉(zhuǎn)基因)。轉(zhuǎn)基因可包括由植物細(xì)胞、另一個(gè)植物細(xì)胞或非植物來源獲得的或來自于它們的基因序列或合成的序列。一般地，轉(zhuǎn)基因通過人工操作，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的任何轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物中。優(yōu)選遺傳物質(zhì)穩(wěn)定地整合至植物基因組中。導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)可包括天然存在于相同品種中但重新排序或元件不同排列的序列。含有這種序列的植物本文歸于“轉(zhuǎn)基因植物”?！胺寝D(zhuǎn)基因植物”是指沒有通過重組DNA技術(shù)導(dǎo)入遺傳物質(zhì)進(jìn)行遺傳修飾的植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每一個(gè)被導(dǎo)入(轉(zhuǎn)基因)基因的轉(zhuǎn)基因植物為純合子，因此它們的后代不需分離所需的表型。本文使用的術(shù)語“相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物”是指與轉(zhuǎn)基因植物同基因的但不含目的轉(zhuǎn)基因的植物。優(yōu)選地，相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物為相同品種或種類，作為目的轉(zhuǎn)基因植物的原始株或缺少所述基因構(gòu)建體的同胞株系，通常稱為“分離子”，或以“空質(zhì)粒”基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的相同品種或種類的植物，可以是非轉(zhuǎn)基因植物。本文使用的“野生型”是指根據(jù)本發(fā)明沒有被修飾的細(xì)胞、組織或植物。野生型細(xì)胞、組織或植物可用作對(duì)照，比較外源核酸的表達(dá)水平或本文描述的細(xì)胞、組織或植物的性狀修飾的程度和性質(zhì)。一般的野生型棉花品種為“Coker，，。本發(fā)明上下文所述的轉(zhuǎn)基因植物包括用重組技術(shù)進(jìn)行遺傳修飾的植物后代，其中所述后代含有目的轉(zhuǎn)基因。所述后代可以是初代轉(zhuǎn)基因植物自花受精或?qū)⒅参锱c另一株相同品種的植物雜交得到的。調(diào)節(jié)本文所述的所需植物或植物器官中的至少一個(gè)蛋白/酶的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因植物部位包括所述轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和細(xì)胞，例如培養(yǎng)的組織、愈傷組織和原生質(zhì)體?？墒褂脦追N方法中的任何一種確定轉(zhuǎn)化植物中轉(zhuǎn)基因的存在。例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)化植物的獨(dú)有的序列，通過凝膠電泳或其它方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。用常規(guī)方法從植物中提取DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，用引物擴(kuò)增特定DNA，DNA的存在能將轉(zhuǎn)化植物和未轉(zhuǎn)化植物區(qū)分開來。例如，引物可設(shè)計(jì)成擴(kuò)增讀入所述結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化載體的DNA區(qū)并根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)反向引物。這些引物僅擴(kuò)增成功轉(zhuǎn)化的植物的片段。另一種確定陽性轉(zhuǎn)化體的方法是本領(lǐng)域熟知的Southern印跡。還可鑒別轉(zhuǎn)化的植物，即通過它們的表型與非轉(zhuǎn)化或野生型植物區(qū)分開來，例如可選擇性標(biāo)記基因的存在，或植物種子改良的油組成的表型，或相關(guān)的表型如改變的酶活性。本文使用的“發(fā)芽”是指吸脹后根尖從種皮中出現(xiàn)。“發(fā)芽率”是指吸脹后經(jīng)過一段時(shí)間，例如14或21天，群體中發(fā)芽的種子百分?jǐn)?shù)。數(shù)天后可對(duì)種子群體進(jìn)行評(píng)估，確定發(fā)芽率。根據(jù)本發(fā)明的種子，本文使用的術(shù)語“發(fā)芽率大致相同”是指轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽率至少為同基因野生型種子的80%。本發(fā)明提供的或設(shè)計(jì)的使用的植物包括被子植物，既包括單子葉植物，又包括雙子葉植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明植物為作物(例如谷類和豆類(pulses)、玉米、小麥、馬鈴薯、木薯(tapioca)、水稻、高粱、小米、木薯(cassava)、大麥或豌豆)或其它豆類(legumes)0可種植所述植物用于生產(chǎn)可食性根、塊莖、葉、莖、花或果實(shí)。優(yōu)選地，所述植物為棉花。谷類植物的實(shí)例包括但不限于，小麥、大麥、水稻、玉米(玉米(corn))、高粱、燕麥和黑麥。在一個(gè)實(shí)施方案中，棉株為DCS9系(實(shí)施例7)的后代，且基因組中相同位置上含有相同的轉(zhuǎn)基因。參考“棉株”是指任何棉屬的植株，或相關(guān)的野生型、原始品種、種質(zhì)、栽培品種或它們的變化形式。例如，棉株包括品種如脈似棉(G.anapoides)、異常棉(G.anomalum)、亞洲棉(G.arboreum)、亞雷西棉(G.areysianum)、旱地棉(G.aridum)、辣根棉(G.armourianum)、澳洲棉(G.australe)、海島棉(G.barbadense)、澳洲棉(G.barbosanum)、貝納狄爾棉(G.benadirense)、比克氏棉(G.bickii)、G.briccetti、綠頂棉(G.capitis-viridis)、敏殼棉(G.costulatum)、G.cunningharnii、達(dá)爾文氏棉(G.darwinii)、戴維遜氏棉(G.davidsonii)、林地棉(G.enthyle)、矮小棉(G.exiguum)>擬似棉(G.gossypioides)、哈克尼西棉(G.harknessii)、草棉(G.herbaceum)、陸地棉(G.hirsutum)、灰白棉(G.incanum)、克勞茨基棉(G.klotzschianum)、茅葉棉(G.Iaxum)、裂片棉(G.Iobatum)、倫敦德里棉(G.Iondonderriense)、長(zhǎng)萼棉(G.Iongicalyx)、馬全特氏棉(G.marchantii)、黃褐棉(G.mustelinum)、南華棉(G.nandewarense)、納爾遜氏棉(G.nelsonii)、Gnobile、稀毛棉(G.pilosum)、G.populifoliurn、小麗棉(G.pulchellum)、雷蒙德氏棉(G.raimondii)、魯賓遜氏棉(G.robinsonii)、G.rotundifoliurn>G.schwendimantii、索馬里棉(Gsomalense)、蘇丹棉(G.soudanense)、馬篤克氏端(G.stocksii)、斯特提棉(G.sturtianum)、瑟伯氏棉(G.thurberi)、帝汶棉(G.timorense)、毛棉(G.tomentosum)、三裂棉(G.trilobum)、三葉棉(G.triphyllum)禾口G.vindis.特殊的品種為陸地棉(gh)和海島棉(gb)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一個(gè)適宜的品種、栽培品種或突變體可以是遺傳修飾的并通過標(biāo)準(zhǔn)培育技術(shù)培養(yǎng)成相關(guān)種類或品種。提及的“原始體”是指作為植物來源的任何種類、品種、栽培品種或種質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，最具有商業(yè)用途的棉花是通過原始二倍體親本之間的雜交自然產(chǎn)生的四倍體?；诒疚牡拿枋觯绢I(lǐng)域技術(shù)人員易于在一個(gè)或多個(gè)二倍體或四倍體棉株中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法，在轉(zhuǎn)基因植株之間產(chǎn)生有性雜種。本文使用的術(shù)語“衍生種、種質(zhì)或品種”應(yīng)理解為用所述棉花種類、品種、栽培品種或種質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)的雜交方法、重組DNA技術(shù)、組織培養(yǎng)、誘變或所述方法的任一或多個(gè)組合產(chǎn)生的任何植物種類、種質(zhì)或品種。特別地，在不同的重要棉花品種如海島棉和陸地棉之間進(jìn)行種間雜交，及在特定二倍體品種之間進(jìn)行種間雜交，以及生產(chǎn)這些種間雜種為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。本文使用的術(shù)語“棉花”是指棉屬的任何品種，優(yōu)選品種為陸地棉或海島棉。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)膶?duì)照或參照植株為大體上非轉(zhuǎn)化的同基因棉株，與“測(cè)試”株采用相同的處理。棉籽油可通過其中的CPE和/或CPA脂肪酸的存在區(qū)分開來。糧食生產(chǎn)另一方面，本發(fā)明提供棉株和棉籽以及從籽粒中獲得的含油產(chǎn)品，特別是棉籽油，對(duì)于糧食生產(chǎn)或飼料生產(chǎn)是有用的，與野生型籽粒相比，所述籽粒具有改良的籽油組成。優(yōu)選獲得籽粒的植株在發(fā)育過程中，籽粒中具有降低的ghFAD2-l、ghFatB-2和ghCPA_FAS_2活性水平。本發(fā)明的棉籽油在糧食生產(chǎn)中，特別在商業(yè)糧食生產(chǎn)中是有用的。所述糧食生產(chǎn)可包括在糧食生產(chǎn)中將棉籽油作為一種成分與其它成分混合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，理想的用于糧食生產(chǎn)中的棉籽油具有本文所述的改良的組成。用標(biāo)準(zhǔn)方法可容易地從本發(fā)明潔凈的、脫絨的和脫殼的籽粒中分離出油，例如高溫蒸煮、壓榨、用螺旋壓力機(jī)制粉(高壓)和/或用溶劑、蒸汽和/或高壓力提取油的方法。棉籽的油成分或棉籽油中的任何脂肪酸成分可通過本文描述的或本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行測(cè)定。還可使用Folch等，J.Biol.Chem.226:497，1957中描述的方法或其它描述的變化形式(見例如Liu等，2002(同上))。棉籽油的脂肪酸成分和/或組成可使用針對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸的氣液色譜法，通過比較標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和待測(cè)樣品的脂肪酸甲酯的峰和保留時(shí)間，以及通過整合得到的峰，方便地進(jìn)行測(cè)定，然而，本發(fā)明不限于測(cè)定棉籽油的含量和/或組成的方法，特別是測(cè)定脂肪酸或其它脂類含量的方法。油幾乎完全由三?；视?TAGs)組成，三?；视桶セ礁视凸羌苌系娜齻€(gè)脂肪酸。為測(cè)定油的TAG含量，油可以通過如固相萃取(SPE)在硅膠盒上進(jìn)行純化。TAG組成可通過反相高分辨率液相色譜法(HPLC)，用折光檢測(cè)器以丙腈為流動(dòng)相進(jìn)行定性檢測(cè)。從純化的油中，制備得到脂肪酸甲酯(FAMEs)，如用冷的含KOH的甲醇溶液進(jìn)行甲基化，通過毛細(xì)管氣相色譜法(GC)，用高極性柱分析產(chǎn)生的酯。根據(jù)脂肪酸的組成，可通過計(jì)算機(jī)程序，用棉籽油的三酰基甘油中脂肪酸的一般分布計(jì)算得出理論的TAG組成。根據(jù)理論和實(shí)驗(yàn)(HPLC)的三?；视徒M成得出數(shù)學(xué)公式，將得到的值與含有基于不同標(biāo)準(zhǔn)油分析得出的數(shù)據(jù)組的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。食品本發(fā)明還包括用棉籽油產(chǎn)品生產(chǎn)的食物、飲料或藥物制劑。本發(fā)明植物或由其得到的含油或籽棉的產(chǎn)品可用于各種供人使用或消費(fèi)的各種應(yīng)用。本文使用的“人”是指人類(Homosapiens)0棉籽油可方便地用于食品加工過程，特別是油炸食品。油可被添加到食品中如人造黃油、起酥油、沙拉醬、蛋黃醬、乳制品如冰淇淋、酸奶或奶酪中，或作為一種成分加入到其它食品或食品原料，如面包、蛋糕、餅干、糕點(diǎn)、早餐谷類食品、通心粉、面條或調(diào)味汁中。本發(fā)明植物的其它可食用的部位可作為食物供人類食用或作為動(dòng)物飼料使用。例如，葉、莖、根、塊莖、果實(shí)、豆莢或提取物或含有本發(fā)明細(xì)胞的任何部位，可供人類或動(dòng)物食用。改良含油量及組成的本發(fā)明植物及其部位可作為動(dòng)物飼料使用，例如作為豬、牛、馬、家禽如小雞和其它動(dòng)物的飼料。食品或飲料或藥物制劑可以進(jìn)行包裝以備出售或?yàn)樯⒀b的形式。本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述食物、飲料或藥物制劑方法，以及制備這些食物或飲料的配方或說明。該方法可包括破碎、提取、加工、烹飪、油炸、裝罐、包裝或其它本領(lǐng)域已知的處理步驟。所述方法或配方或說明可包括加工本發(fā)明油和/或與其它食物成分混合的處理步驟，如將所述混合物或產(chǎn)品加熱或烘烤至，例如至少100°c。該方法可包括包裝產(chǎn)品的步驟，使其易于出售。方法本發(fā)明產(chǎn)品可配制成藥用組合物，其可按照常規(guī)藥劑配制技術(shù)制備。例如，參見Remington‘sPharmaceuticalSciences，18thEd.(1990，MackPublishing，Company,Easton，PA，U.S.A.)。所述組合物可含有活性劑或藥用衍生活性劑。除了一種活性物質(zhì)，這些組合物可包括藥用賦形劑、載體、緩沖系、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域熟知的物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)無毒，且不影響活性成分的效力。載體可采用多種形式，這取決于給藥所需的制劑形式。對(duì)于口服給藥而言，可將化合物配制成液體制劑，如膠囊。在制備口服劑型的組合物中，可采用任何常用的藥用介質(zhì)，例如水、乙二醇、油類、酒精、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑等口服液制劑的介質(zhì)(例如，懸浮液、酏劑和溶液)；或載體如淀粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑?；钚詣﹥?yōu)選按照治療有效的量給藥。實(shí)際給藥量和速率以及給藥時(shí)間取決于需要治療的病情的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方，例如給藥劑量、時(shí)間等的確定是普通醫(yī)生或?qū)＜业穆氊?zé)，通常需要考慮待治療的疾病，患者個(gè)體的癥狀、給藥地點(diǎn)、給藥方法及醫(yī)生熟知的其它因素。技術(shù)和方案的實(shí)例可參見Remington'sPharmaceuticalkiences，(同上)。工業(yè)用途植物產(chǎn)品，優(yōu)選油，可用于生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品，例如乙醇。通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1示例方法和材料RNA的分離將用液氮冷凍的2g棉花胚或葉片組織用研缽和研杵研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至含22ml冷提取緩沖液的燒杯中并不斷攪拌。所述提取緩沖液含200mMTris-HClpH8.5,1.5%十二烷基硫酸鋰，300mMLiCl，IOmMNa2EDTA,脫氧膽酸鈉，諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40。然后加入5%不溶的PVP，90mM巰基乙醇，IOmMDTT(二硫蘇糖醇)，0.1%DEPC，在轉(zhuǎn)移至Corex管之前攪拌lOmin。然后加入3M醋酸銨18.并混勻。4°C，6，000xrpm離心20min。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，用1/10體積的3MNaAc,pH5.2和1/2終體積的冷異丙醇沉淀，離心前在_20°C下貯藏lh，然后用轉(zhuǎn)子6，OOOxrpm離心30min。將沉淀重新懸浮于ImldH2O中并轉(zhuǎn)移至兩個(gè)Eppendorf管(每管500μ1)中。用等體積的苯/氯仿/異戊醇溶液05241)提取懸浮液，4°C離心5min分離所述相。將上方水層小心轉(zhuǎn)移至新Eppendorf管中，按上述方法再次用氯仿提取。向水樣中加入二分之一體積的5MLiClJg勻，置于冰上3hs，然后4°C12,OOOxrpm離心15min。沉淀重懸于50μ1dH20中。最后，加入5μINaAc和138μ1冷乙醇沉淀RNA樣品，在干冰上孵育30min，然后4°C離心15min。真空干燥所述RNA沉淀，然后溶于30μ1不含核糖核酸酶的H2O中。棉籽cDNA文庫的構(gòu)建用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)，按照廠商說明，從上述制備的總RNA中分離出棉花多聚腺苷酸RNA。用cDNA合成試劑盒(Pharmacia)，按照廠商說明，以15μg多聚腺苷酸RNA為起始物制備cDNA。用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)㈦p鏈cDNA產(chǎn)物的平末端與EcoRI/NotI接頭連接。然后去掉過量的未連接的接頭，將cDNA克隆至噬菌體載體LambdaZAPII(Stratagene,USA)中，用市售包裝系統(tǒng)(Stratagene，USA)，按照廠商說明進(jìn)行包裝。本文所述的cDNA文庫在總計(jì)約1.5XIO7噬斑形成單位(pfu)/ml非擴(kuò)增文庫中，一般含約92%的重組噬菌體顆粒。噬斑純化陽性雜交的噬斑后，用ExAssist/SOLR系統(tǒng)(Stratagene，USA)，按照廠商說明，從λΖΑΡΙΙ載體上切除pBluescriptSK(-)噬菌粒。所有其它方法如凝膠電泳，轉(zhuǎn)移核酸至膜進(jìn)行雜交，標(biāo)記DNA探針的制備和cDNA文庫的篩選為標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel等，(同上))。除非另有說明，其它雜交條件如Khandjian，Bio/Technology,5165-167，1987中所述的條件，通過引用并入于此，在42°C下，用50mMTris-HClpH7.5,IMNaCl，50%甲酰胺，IOxDenhardt‘s液，10%硫酸葡聚糖，1%SDS，0.焦磷酸鈉，0.lmg/ml鯡魚精DNA。然后在65°C下，在0.2xSSC,0.SDS中短暫洗滌，然后在65°C下，在0.2xSSC,0.1%SDS中進(jìn)一步洗滌兩次，每次15min(高嚴(yán)格性)。實(shí)施例2從棉花中分離FAD2基因從棉花中分離出四個(gè)不同的FAD2基因，每一個(gè)基因編碼可能的微粒體油酰-Δ12去飽和酶，該去飽和酶能將油酸去飽和生成亞油酸(Liu等，1999a(同上)，Liuφ,1999b(±)；Kargiotidouφ,JournalofExperimentalBotany20085P(8)2043-2056，2008，均通過引用并入于此)。第一個(gè)基因稱為ghFAD2_l，大概在活性油生物合成的同時(shí)，特異表達(dá)于發(fā)育的種子中(Liu等1999a(同上))。兩條ghFAD2-l核苷酸序列描述于此(SEQIDNos1和，它們?nèi)L(zhǎng)具有96%的同一性，因此，可能代表對(duì)應(yīng)于不同的等位基因的cDNAs或更可能是對(duì)應(yīng)于四倍體棉花中同源FAD2-1基因的cDNAs。第二個(gè)基因，ghFAD2-2，(登錄號(hào)Y101U)具有低的組成型表達(dá)水平，且在種子發(fā)育過程始終以低水平表達(dá)(Pirtle等，2001(同上))。ghFAD2_2的核苷酸序列(SEQIDNo26)具有g(shù)hFAD2_l(SEQIDNo1)中央序列一半的約72%的序列同一性。第三個(gè)和第四個(gè)成員是ghFAD2-3(登錄號(hào)AF331163)和ghFAD2_4(登錄號(hào)AY279314)，它們?cè)谌~子和其它棉花組織中比在種子中表達(dá)量更高(Kargiotidou等，2008(同上))。ghFAD2_3和ghFAD2_4與ghFAD2_l(SEQIDNo1)序列具有約72%的序列同一性?；谶@些觀察以及之前由RNAi下調(diào)的ghFAD2-l(Liu等，PlantPhysiol.1291732-1743,2002；美國專利No.6974898)產(chǎn)生的高油酸棉籽油，認(rèn)為該基因編碼棉籽中主要的FAD2活性。因此，選擇具有SEQIDNo1的第5邪4位核苷酸的ghFAD2_l基因構(gòu)建下調(diào)基因表達(dá)的RNAi結(jié)構(gòu)。這與Liu等，2002(同上)描述的區(qū)域相同，其對(duì)ghFAD2_l具有特異性。同樣地，可選擇該基因的其它區(qū)域。例如，美國專利似.6974898使用81^402-15'-UTR的92bp區(qū)，以及Liu等，2002(同上)，使用該基因轉(zhuǎn)錄部位5'端的540bp。FAD2-1的核苷酸和氨基酸序列如圖3中所示。實(shí)施例3棉花FATB基因的分離按照以下方法從培育的棉籽cDNA文庫(實(shí)施例1)中鑒別和分離出棉花中編碼與FatB同源的蛋白的兩個(gè)cDNA克隆。對(duì)應(yīng)于ghi^atB-Ι基因第一外顯子的約480bp的PCR片段(Yoder等，1999(同上)；登錄號(hào)AF076535)，用正向(正義)和反向(反義)引物5'-atggttgctactgctgtgac-3‘(SEQIDNO29禾口5‘-ctgtaaatgattcattagtgt-3‘(SEQIDNO30)，以從發(fā)育的棉花胚中獲得的RNA為模板，擴(kuò)增SEQIDNO3的210713位上的核苷酸序列。該P(yáng)CR片段用于在高嚴(yán)格條件下檢測(cè)cDNA文庫，分離出兩個(gè)不同的類!^atBcDNAs。它們被命名為ghi^itB-2和ghi^itB-3。由于5'和3'端具有非翻譯區(qū)，兩條序列顯示為cDNAs全長(zhǎng)序列。ghFatB-2cDNA長(zhǎng)為1647bp(SEQIDNO:5)，預(yù)測(cè)編碼的蛋白為421個(gè)氨基酸(SEQIDNO:6)，其包括用于將蛋白轉(zhuǎn)移至質(zhì)體中的信號(hào)序列。ghi^tB-3cDNA長(zhǎng)為1498bp(SEQIDNO:7)，預(yù)測(cè)編碼的蛋白為419個(gè)氨基酸(SEQIDNO8)。預(yù)測(cè)的ghi^itB-2和ghi^itB-3的氨基酸序列與幾個(gè)報(bào)道的!^atB硫酯酶，如來自擬南芥和大豆(登錄號(hào)DQ418764)以及芥菜(DQ856315)的那些具有全長(zhǎng)75%的序列同一性，而與來自雙子葉植物，如擬南芥(AK176105).的!^atA硫酯酶僅有3040%的同源性。由ghi^itB-2和ghi^itB-3編碼區(qū)編碼的推測(cè)的多肽彼此間顯示出89%的同一性。由于它們的3'UTR序列大不相同，認(rèn)為它們衍生自棉花!^站8基因家族的兩個(gè)不同的基因。Pirtle等，PlantCellPhysiology，40155-163，1999，通過引用并入于此(cDNA登錄號(hào)AF034266；結(jié)構(gòu)基因AF076535).分離出編碼!^atB的cDNA及其相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因。與之前分離的ghFatB-1(Yoder等，1999(同上)；登錄號(hào)AF076535)相比，ghFatB-2具有約87%的同一性，ghFatB-3具有約84%的同一性。正如所有的?；?ACP硫酯酶具有的特征，棉花!^atB硫酯酶在N-末端具有運(yùn)輸肽序列，指導(dǎo)蛋白進(jìn)入質(zhì)體中。確切的運(yùn)輸肽切割位點(diǎn)是未知的，但推測(cè)其位于植物I^atB序列特有的高度保守的疏水區(qū)的起始位置上(Jones等，1995(同上))。圖4和圖5分別示出TghFatB-2和ghFatB-3的核苷酸序列以及推測(cè)的多肽序列。之前推測(cè)植物FatB基因?yàn)榻M成型表達(dá)(Dormann等，Arch.Biochem.Biophys.316612-618,1995)。與此相一致地是，表達(dá)分析表明ghhtB-l基因表達(dá)于胚、幼苗和成熟棉株的葉片(Pirtle等，1999(同上))中。由于能夠從上述棉籽的cDNA文庫中分離出，認(rèn)為ghi^itB-2和ghi^itB-3表達(dá)于發(fā)育的種子中，也可能是其它組織中。ghi^itB-2在種子中的表達(dá)水平高于ghhtB-3，因此認(rèn)為前者編碼棉籽中主要的!^atB活性。然而，為確定是ghFatB-2基因而非其它的兩個(gè)基因編碼棉籽中主要的!^atB活性，有必要表明它的滅活將導(dǎo)致硫酯酶活性降低以及從質(zhì)體中釋放的棕櫚酸減少。也可能是需要將所述基因的兩個(gè)或三個(gè)組合沉默，降低棕櫚酸水平。因此，用具有來自ghi^itB-2的SEQIDNO5的458843位上的核苷酸序列形成基因沉默結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4編碼棉花環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CPA-FAS)基因的克隆CPA-FAS催化環(huán)丙烷脂肪酸制備中的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，將油酸轉(zhuǎn)化成DHS。用尖孢鐮刀菌感染棉花的根和胚軸后，鑒別出陸地棉的兩個(gè)EST序列是差異表達(dá)的。其中一個(gè)EST序列，CD486555用作探針篩選由培育的棉籽形成的cDNA文庫(實(shí)施例1)以及由來自棉花根部的RNA形成的第二個(gè)cDNA文庫。探針DNA的序列如圖6中所示(SEQIDNO9)。在高嚴(yán)格條件下與探針雜交后，兩個(gè)不同的帶有獨(dú)特的5'和3'UTR序列的全長(zhǎng)cDNAs從由棉花根部RNA形成的cDNA文庫中分離出來。第三個(gè)cDNA克隆從棉籽cDNA文庫中分離出來。分別命名為ghCPA-FAS-l、ghCPA-FAS-2和ghCPA_FAS_3。其DNA序列及預(yù)測(cè)的編碼多肽的氨基酸序列如圖79中所示(SEQIDNO1015)。推得的ghCPA-FAS多肽各含有865873個(gè)氨基酸，計(jì)算分子量為約99kDa。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的CPA-FAS酶具有活性，這可能表明成熟的蛋白被認(rèn)為不具有5'信號(hào)肽。與來自香蘋婆的CPA-FAS以及根據(jù)基因組序列推測(cè)的來自擬南芥(登錄號(hào)AT23510)和水稻(AK069115)的同源蛋白近似，編碼的ghCPA-FAS蛋白具有融合C-末端結(jié)構(gòu)域的N-末端FAD-結(jié)合域，與各種甲基轉(zhuǎn)移酶具有同源性。與預(yù)測(cè)的蛋白CPA-FAS活性相一致。在N-末端，ghCPA-FAS蛋白的前20個(gè)氨基酸似乎為疏水的，認(rèn)為其與膜錨定有關(guān)。將推得的三個(gè)不同的ghCPA-FAScDNAs的氨基酸序列與來自香蘋婆、擬南芥和水稻的同源DNA序列相比較，檢測(cè)到ghCPA-FAS-1(AY574036)和ghCPA_FAS_2(AY574037)具有97%的氨基酸同一性，與ghCPA-FAS-3(AY574038)僅有6465%的同一性。相比之下，ghCPA-FAS-3顯示出更高的序列特異性，與擬南芥At23510基因的氨基酸具有74%的同一性，與At23530的氨基酸具有75%的同一性。這表明ghCPA_FAS_3在棉花物種形成以前演化分離。已知擬南芥和水稻不累積CPA或CPE脂肪酸，因此測(cè)定這些植物中CPA-FAS基因的功能。用ghCPA-FAS-Ι的蛋白編碼區(qū)作為探針通過Southern印跡分析研究棉花CPA-FAS基因的基因組組成。在HindIII消化的二倍體棉花DNA中檢測(cè)到至少三條雜交帶，而在四倍體棉花中為兩倍的雜交帶(圖10)。得出的結(jié)論是，三個(gè)ghCPA-FAS基因中的每一個(gè)基因由二倍體棉花中的單一基因座表示，在四倍體棉花中為兩個(gè)同源的基因座。這表明異源四倍體棉花含有存在于A-和D-基因組二倍體前體中的三個(gè)基因中的各基因的兩個(gè)拷貝。分析棉花CPA-FAS基因的表達(dá)，尋找棉花組織中的差異表達(dá)。如圖11所示，對(duì)從開花后各時(shí)期的不同棉花組織包括根、胚軸、葉片和發(fā)育的胚中提取的總RNA的分析表明ghCPA-FAS-Ι轉(zhuǎn)錄水平在根和子葉中較高，但在葉片和發(fā)育的胚中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)，而檢測(cè)到ghCPA-FAS-2在所有測(cè)試的組織，除了葉片中表達(dá)。在發(fā)育的胚中，ghCPA-FAS-2在胚中的最高轉(zhuǎn)錄水平是在種子發(fā)育的中間時(shí)期，開花后約2040天。這是發(fā)育的棉花胚中產(chǎn)生油的主要時(shí)期。因此，預(yù)測(cè)ghCPA-FAS-2在決定棉籽中環(huán)丙烯脂肪酸的生物合成中起關(guān)鍵作用，是用于下調(diào)以降低棉籽油中CPA和CPE脂肪酸的候選目標(biāo)基因。實(shí)施例5同時(shí)下調(diào)棉籽中GHFAD2-1、GHCPA-FAS-2和GHFATB-2的基因基因構(gòu)建體按照以下方法生成用于RNAi介導(dǎo)的降低基因表達(dá)的表達(dá)嵌合發(fā)夾RNA分子的基因基因構(gòu)建體。設(shè)計(jì)RNAi沉默結(jié)構(gòu)，同時(shí)定位三個(gè)不同的基因，以達(dá)到最大程度地降低棉籽油中棕櫚酸和環(huán)丙烷脂肪酸，同時(shí)最大程度地提高油酸的目的。所述結(jié)構(gòu)如圖12所示，含有由ghFAD2-l的!350bp、ghCPA-FAS-2的442bp和ghFatB_l的!358bp融合在一起組成的反向嵌合重復(fù)序列。該嵌合序列的反向重復(fù)單元被來自ghi^ad2-l基因的長(zhǎng)度為1120bp的內(nèi)含子1間隔開，具有完整的5'和3'外顯子/內(nèi)含子邊界(圖13，片段C)。內(nèi)含子作為間隔區(qū)，穩(wěn)定所述反向重復(fù)序列，因此使質(zhì)粒載體中的反向重復(fù)序列在大腸桿菌中易于克隆。為實(shí)現(xiàn)種子的特異表達(dá)，將反向重復(fù)序列置于大豆凝集素啟動(dòng)子(Lec-P)和轉(zhuǎn)錄終止子/多腺苷酸序列(Lec-T)(Cho等，PlantMolecularBiologyReporter13:255-269,1995)的調(diào)控之下。發(fā)夾RNA-表達(dá)基因位于靠近選擇性標(biāo)記基因的3'端位置上，所述選擇性標(biāo)記基因包括NPTII蛋白編碼區(qū)，其受地三葉草矮病毒啟動(dòng)子(Scl-P)和終止子(&3-T)調(diào)控。使用的特異序列如圖13所示(SEQIDN0s:1623)。該基因基因構(gòu)建體命名為MonoCott結(jié)構(gòu)。還生成了第二個(gè)基因基因構(gòu)建體，稱為L(zhǎng)Y-2。除了ghCPA-FAS-2基因的442bp片段被編碼杜松烯羥化酶的棉花基因區(qū)取代，該酶是培育的種子中棉酚合成所必須的酶，其與MonoCott結(jié)構(gòu)相同。為生成LY-2，將來自編碼(+)-δ-杜松烯-8-羥化酶的ghCAD_H基因(登錄號(hào)AF332974)的40Ibp的DNA片段，對(duì)應(yīng)于SEQIDNOJ8的14201821的核苷酸序列，用引物Sl:5'-cctgagaggttcttgactgatcatg-3‘(SEQIDNO:31)和Al:5'-gettatgatgtataataaacacattat-3‘(SEQIDNO:32)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用該片段取代MonoCott結(jié)構(gòu)中的ghCPA-FAS-2部分，生成LY-2。實(shí)施例6用MonoCott結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化棉花將MonoCott和LY-2基因基因構(gòu)建體分別插入二元載體中并導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGLl株中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌用于轉(zhuǎn)化棉花品種Coker315，如Liu等，2002(同上)中描述的。簡(jiǎn)言之，從10天大的無菌生長(zhǎng)的棉花幼苗上剪切子葉作為外植體，感染并與根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體共培養(yǎng)兩天。然后在含0.lmg/12，4-D、0.lmg/1激動(dòng)素、50mg/l硫酸卡那霉素和25mg/l頭&_月虧白勺(MurashigeandSkoog,PhysiologiaPlantarum.15:473-497,1962)上篩選六周。然后將來自子葉外植體的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含5mg/l6-(γ，γ-二甲基烯丙基氨基)_嘌呤核苷Oip)、0.lmg/1萘乙酸(NAA)、25mg/l卡那霉素和250mg/l頭孢噻肟的MS培養(yǎng)基中在下再培養(yǎng)六周。培養(yǎng)約六周十周后開始形成體細(xì)胞胚，轉(zhuǎn)移至新鮮的但不添加植物激素或抗生素的平皿中，直至它們發(fā)芽。隨后，當(dāng)葉片和根發(fā)育出來后，將從體細(xì)胞胚發(fā)育來的小植株轉(zhuǎn)移至土壤中并置于溫室中，生長(zhǎng)溫度28/20°C(晝/夜)。用MonoCottRNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化六個(gè)單獨(dú)的棉花系由愈傷組織再生，正常地在溫室中發(fā)育成熟、開花并產(chǎn)生種子。轉(zhuǎn)基因株和非轉(zhuǎn)基因(野生型)親本株Coker315之間無明顯的表型差別。用LY-2RNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化十個(gè)單獨(dú)的棉花系由愈傷組織再生并以類似的方式處理。實(shí)施例7棉花轉(zhuǎn)化株的表型分析從由原代T1代轉(zhuǎn)基因植株獲得的T2代種子中切下成熟種子子葉的約1/8部分，每一部分用FAME和GC-MS進(jìn)行脂肪酸成分分析。用Bligh等，CanadianJournalofBiochemistryandPhysiology37:911-917,1959的方法分離總脂類，用如Liu等，2002(同上)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法制備脂肪酸甲酯(FAMEs)。隨后用氣相色譜(GC)分離FAMEs，采用配有合適GC毛細(xì)管柱(30mX0.25mm)的Agilent6890GC。參照FAME標(biāo)準(zhǔn)物鑒定脂肪酸。轉(zhuǎn)基因系DCS9-34的籽粒，其脂肪酸成分中油酸水平顯著提高，同時(shí)棕櫚酸和環(huán)丙烷脂肪酸水平降低。篩選該轉(zhuǎn)基因系，培育為純合子。后代籽油中脂肪酸成分的遺傳性數(shù)據(jù)示于表1。如表1中所示，DCS9-34系的籽油中油酸含量提高至約75%80%，棕櫚酸含量降至10%以下。在以前研究的高油酸系(Liu等，2002(同上))中，由于RNAi介導(dǎo)的下調(diào)ghFAD2-l(Liu等，2002(同上))的多效性，籽油中棕櫚酸水平降至總脂肪酸的16%。MonoCott結(jié)構(gòu)引起的棕櫚酸含量進(jìn)一步降至7%，可能是由于ghFAD2-l和ghi^tB_2的聯(lián)合下調(diào)效應(yīng)。用MonoCott結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的其它植物中觀察到類似的表型，但程度更低。在由原代轉(zhuǎn)基因DCS9-34株獲得的T2代種子中，十粒種子中有三粒是無效分離子。因此，分離的轉(zhuǎn)基因?yàn)槊系聽栠z傳模式的單一主導(dǎo)基因。在T3代植株中，15粒種子中有3粒為無效/不含轉(zhuǎn)基因的分離子。在30粒分析的T4種子中，沒有發(fā)現(xiàn)無效的種子；因此，這些代表了純合群體。T2和T3種子子葉的僅約1/8用于脂肪酸分析，由于它們主要存在于種子的幼根中，因此未檢測(cè)到環(huán)狀脂肪酸。又如圖14所示，三代中的每一代的脂肪酸成分的特征是提高的油酸和降低的棕櫚酸水平。這些水平是持續(xù)且在雜合或純合的轉(zhuǎn)基因植物中穩(wěn)定遺傳，如表2所示。這種關(guān)系清楚地表明同時(shí)定位三個(gè)基因ghFAD2-l、ghCPA-FAS-2和ghFcttB-2的MonoCottRNAi結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了脂肪酸成分的基因改變的穩(wěn)定遺傳。在LY-2轉(zhuǎn)基因種子中，油酸水平也提高至80%以上，在一些種子中高于85%。在許多種子中的棕櫚酸水平為約7%，亞油酸水平為約610%(表2)。這些改變的水平作為孟德爾基因座隨轉(zhuǎn)基因一起穩(wěn)定地遺傳(表2)。環(huán)丙烷脂肪酸，包括DHS、STC和MVL，在成熟棉籽的棉花子葉中的水平不明顯，但在成熟種子的胚軸中濃集。為分析轉(zhuǎn)基因系中的環(huán)丙烷脂肪酸水平，切下胚軸，進(jìn)行脂肪酸成分的分析。DCS9-34胚軸的全部脂肪酸含量，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株Coker315以及用LY-2結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系列于表3中，如圖15中所示。分析LY-2轉(zhuǎn)化的種子。如上所示，LY-2轉(zhuǎn)化的種子顯示出與DCS9-34轉(zhuǎn)化的種子相似的改良的低棕櫚酸水平和高油酸水平。如表3中所示，未轉(zhuǎn)化的棉花胚軸，代表為未轉(zhuǎn)化的Coker315，含總的環(huán)丙烷脂肪酸為總脂肪酸水平的11.5%(23個(gè)隨機(jī)種子樣品的平均值)。在LY-2種子中，得到基本升高的油酸，其為CPA-FAS酶的底物，三個(gè)環(huán)丙烷脂肪酸各為DHS、STC和MVL，以及與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比，基本升高的總環(huán)丙烷脂肪酸百分?jǐn)?shù)。這與MonoCott系，DCS9-34形成鮮明對(duì)照，DCS9-34的三種環(huán)丙烷脂肪酸基本降低，在26個(gè)隨機(jī)篩選的種子中，其總的環(huán)狀脂肪酸水平平均僅為3.8%。這表明與野生型相比，總的環(huán)丙烷脂肪酸降低了彡60%，與LY-2轉(zhuǎn)基因種子相比，降低了彡80%·本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，除了那些具體描述，可以對(duì)本發(fā)明作一些修改和改進(jìn)。應(yīng)理解，本發(fā)明包括所有的這些修改和改進(jìn)。本發(fā)明還包括說明書中所述的所有步驟、特征、組成和化合物的單個(gè)或集合，以及任意所述步驟或特征的兩個(gè)或多個(gè)組合。表1三代中轉(zhuǎn)基因系DCS9-34棉籽中的籽油脂肪酸組成。高于20%的棕櫚酸含量的種子為無效分離子，基本與野生型水平相同。代種子編碼%棕櫚酸%硬脂酸%油酸%亞油酸總％(16:0)(18:0)(18:1)(18:2)CPFAsT2124.11.813.358.5ND222.01.813.460.4ND311.81.663.721.6ND49.31.673.414.6ND59.81.770.616.7ND622.51.817.056.6ND711.31.664.820.9ND89.51.870.017.6ND98.51.675.413.3ND1010.91.672.314.1NDT318.62.276.612.0ND29.52.273.414.5ND38.92.673.614.5ND47.42.480.09.8ND522.82.415.058.8ND67.62.381.08.7ND79.32.473.414.4ND88.02.576.712.3ND98.92.678.79.2ND109.02.674.313.7ND117.92.978.610.2ND1223.22.815.657.4ND139.02.674.213.7ND147.82.279.510.1ND1523.22.714.958.4NDT418.32.374.212.60.228.22.575.611.20.438.12.574.911.90.248.72.372.913.60.258.02.575.311.60.368.22.375.211.80.277.82.676.310.70.3S7.62.476.611.00.298.22.775.111.40.3108.32.574.412.40.2118.02.575.611.50.2128.22.475.511.20.2137.42.576.511.30.2147.82.476.311.30.0157.82.675.212,10.3168.32.274.512.40.3178.22.374.612.30.3188.32.374.112.80.2198.52.373.912.60.權(quán)利要求1.在其棉籽油中具有改良的脂肪酸成分的棉籽，其中棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。2.如權(quán)利要求1所述的棉籽，其中棉籽油中總脂肪酸含量的74%86%為油酸。3.如權(quán)利要求1或2所述的棉籽，其中4%10%為棕櫚酸。4.如權(quán)利要求1、2或3所述的棉籽，其中4%12%為亞油酸。5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的棉籽，其中總脂肪酸含量中反式脂肪酸<0.5%，優(yōu)選<0.1%。6.如權(quán)利要求5所述的棉籽，其中所述反式脂肪酸為反油酸。7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的棉籽，其中棉籽油中總脂肪酸含量的0.0.5%為環(huán)丙烷脂肪酸(CPA)或環(huán)丙烯脂肪酸(CPE)或其組合。8.如權(quán)利要求7所述的棉籽，其中所述環(huán)丙烷或環(huán)丙烯脂肪酸為錦葵酸、萍婆酸、二氫萍婆酸或它們?nèi)我鈨烧叩慕M合或三者的組合。9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的棉籽，其中總脂肪酸含量中<0.5%，優(yōu)選<0.的為在C9或ClO上帶有支鏈的脂肪酸。10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的棉籽，其中棉籽進(jìn)一步具有降低的棉酚水平，其中棉籽中棉酚的水平相對(duì)于棉花品種Coker中棉酚的水平至少降低10%。11.如權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的棉籽或由它們獲得的棉籽油，其中棉籽為轉(zhuǎn)基因的，其基因基因構(gòu)建體編碼抑制ghFAD2-l和ghi^atB-2兩個(gè)基因或ghFAD2_l、ghFatB-2和ghCPA-FAS-2三個(gè)基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)RNA分子。12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的棉籽，其為陸地棉或海島棉的棉籽。13.制備改良的棉籽油的方法，該方法包括步驟(i)獲得如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽，()從棉籽中提取油，以及(iii)回收棉籽油，其中所述棉籽油具有改良的脂肪酸組成，如棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟(i)進(jìn)一步包括從棉株中收獲含有棉籽的籽棉和/或從含有棉籽的籽棉中軋出棉籽，和/或其中步驟(ii)包括壓碎棉籽，和/或其中步驟(iii)包括純化棉籽油，和/或其中所述方法不包括氫化棉籽油的步驟。15.從權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽中回收的或通過權(quán)利要求13或14所述方法制備的棉籽油。16.制備權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述棉籽的方法，包括從棉株收獲籽棉并進(jìn)行軋棉，由此得到棉籽。17.獲得棉株的方法，包括播種權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽并使棉籽生長(zhǎng)為棉株。18.能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述棉籽的棉株。19.從權(quán)利要求18的棉株中獲得的皮棉。20.鑒定棉籽油中具有改良的脂肪酸成分的棉籽的方法，包括(i)獲得轉(zhuǎn)基因棉籽，()測(cè)定棉籽油的脂肪酸組成，以及(iii)挑取棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸的棉籽。21.如權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟(i)之前，用基因基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞并再生出轉(zhuǎn)基因棉株。22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟(i)的棉籽為轉(zhuǎn)基因的，其基因基因構(gòu)建體編碼抑制ghFAD2-l和ghFatB-2兩個(gè)基因或ghFAD2_l、ghFatB_2和ghCPA_FAS_2三個(gè)基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)RNA分子。23.如權(quán)利要求16、17或20-22任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括挑取棉籽油中具有改良的脂肪酸組成或具有權(quán)利要求2-12任一項(xiàng)所述的特征的棉籽，其中棉籽油中總脂肪酸含量的72%88%為油酸，4%16%為棕櫚酸，4%15%為亞油酸。24.權(quán)利要求16、17或20-23任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括從所述棉籽獲得棉株的步驟，以及將所述棉株與優(yōu)選具有不同遺傳背景的第二個(gè)棉株雜交的步驟。25.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽在生產(chǎn)分離油或棉籽粕中的應(yīng)用。26.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽或由其制備的棉籽粕作為動(dòng)物飼料的應(yīng)用。27.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽油在生產(chǎn)食品或燃料中的應(yīng)用。28.如權(quán)利要求27所述的應(yīng)用，其為增加食品的油酸含量或降低棕櫚酸含量。29.如權(quán)利要求25-任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其為增加食品中單飽和脂肪酸的水平，或降低飽和脂肪酸或反式脂肪酸的水平，或增加動(dòng)物對(duì)單飽和脂肪酸的攝入量，或降低動(dòng)物對(duì)飽和脂肪酸或反式脂肪酸的攝入量。30.含有權(quán)利要求11或15所述棉籽油作為食物成分的食品。31.制備油炸食品的方法，該方法包括在權(quán)利要求11或15所述的棉籽油中油炸食品。32.治療或預(yù)防個(gè)體疾病的方法，包括使個(gè)體口服權(quán)利要求11或15所述的棉籽油，權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的棉籽或權(quán)利要求30所述的食品，其中所述疾病優(yōu)選為肥胖、心臟病、高血清三酰甘油含量(highserumTAGcontent)、高血清膽固醇、高血清低密度脂蛋白、低血清高密度脂蛋白、高血壓、癌癥、糖尿病或它們的任意組合。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中個(gè)體為人。34.編碼基因沉默核酸的嵌合核酸分子，其中基因沉默核酸降低棉株中兩種或多種選自棉!^atBjiIFAD2和棉CPA-FAS基因的表達(dá)。35.如權(quán)利要求34所述的嵌合核酸分子，其中基因沉默核酸降低棉FAD2-1和棉FatB-2或棉FAD2-1、棉FatB_2和CPA-FAS-2基因的表達(dá)。36.如權(quán)利要求34或35所述的嵌合核酸分子，包括(i)如SEQIDNO:17所示的連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，或與其具有90%序列同一性或在嚴(yán)格雜交條件下與其互補(bǔ)序列雜交的序列，或(ii)缺失編碼CPA-FAS-2多肽或其片段的序列的(i)的核酸分子的突變體。37.如權(quán)利要求34-36任一項(xiàng)所述的嵌合核酸分子，其中基因沉默核酸分子為發(fā)夾RNA。38.含有權(quán)利要求34-36任一項(xiàng)所述核酸的嵌合基因基因構(gòu)建體，并進(jìn)一步含有圖12中所示的結(jié)構(gòu)或圖13中所示的A、E、F、G和H片段的序列，或它們的功能突變體。39.含有權(quán)利要求34-37任一項(xiàng)所述嵌合核酸分子或權(quán)利要求38所述嵌合核酸基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。40.含有權(quán)利要求34-37任一項(xiàng)所述嵌合核酸分子或權(quán)利要求38所述嵌合核酸基因構(gòu)建體的植物或其組織或細(xì)胞。41.如權(quán)利要求34-37任一項(xiàng)所述嵌合核酸分子或權(quán)利要求38所述嵌合核酸基因構(gòu)建體在降低棉株的棉FAD2-1和棉i^atB-2和/或棉CPA-FAS-2基因表達(dá)中的應(yīng)用。42.含有降低水平的選自棉FAD2、棉!^itB和CPA-FAS的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因的改良的棉株或由其獲得的棉籽，優(yōu)選含有兩個(gè)或多個(gè)所述基因或全部三個(gè)基因，其中所含棉籽油或由其獲得的棉籽油具有提高的油酸水平以及降低的棕櫚酸和亞油酸水平。43.權(quán)利要求42所述的棉株或棉籽，其棉籽油顯示出降低的環(huán)丙烯和/或環(huán)丙烷脂肪酸或棉酚水平。44.含有編碼具有棉!^atB活性的多肽，或其功能性片段或其突變體或其互補(bǔ)形式的核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列選自下組(i)與SEQIDNO:5或7所示的核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；()編碼與SEQIDNO:6或7所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽序列的核苷酸序列；(iii)在至少中度嚴(yán)格雜交條件下，與來源于SEQIDNO:5或7的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列；(iv)與(i)、(ii)或(iii)互補(bǔ)的核苷酸序列，如反義、核酶或雙鏈RNA或其它基因沉默因子；(ν)含有SEQIDNO5的548-843核苷酸的核苷酸序列；以及(vi)含有來源于SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或它們的互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的分離的探針或引物。45.含有編碼具有棉CPA-FAS活性的多肽，或其功能性片段或其突變體或其互補(bǔ)形式的核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列選自下組(i)與SEQIDNO:10、12或14所示的核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；()編碼與SEQIDNO:11、13或15所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的多肽序列的核苷酸序列；(iii)在至少中度嚴(yán)格雜交條件下，與來源于SEQIDNO10、12或14的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列；(iv)與(i)、(ii)或(iii)互補(bǔ)的核苷酸序列，如反義、核酶或雙鏈RNA或其它基因沉默因子；(ν)含有編碼如圖13的B片段中所示序列的CPA-FAS-2的442個(gè)核苷酸的核苷酸序列；以及(vi)含有來源于SEQIDNO10,SEQIDN0:12或SEQIDNO:14或它們的互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的分離的探針或引物。全文摘要本發(fā)明涉及棉株和棉籽以及由它們制備得到的具有提高的油酸水平以及降低的棕櫚酸和亞油酸水平的棉籽油的生產(chǎn)。此外，本發(fā)明描述了具有降低的環(huán)丙烷和/或環(huán)丙烯脂肪酸水平和/或降低的棉酚水平的棉籽。本發(fā)明還描述了來源于棉花的FatB和CPA-FAS的核苷酸和氨基酸序列，以便對(duì)，尤其是植物油含量和/或組成進(jìn)行直接改良。文檔編號(hào)C07H13/06GK102202498SQ200980134226公開日2011年9月28日申請(qǐng)日期2009年7月21日優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日發(fā)明者柳青,艾倫·格拉漢姆·格林,蘇林德·帕爾·辛申請(qǐng)人:澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織