專利名稱：抗P2X₇肽和表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽、表位以及由其生產(chǎn)單克隆抗體。
背景技術(shù)：
本說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的引用都不視為也不應(yīng)當(dāng)視為承認(rèn)或以任何形式暗 示該現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成澳大利亞或任何其他管轄范圍中公知常識的一部分，或者可合理地預(yù)期 該現(xiàn)有技術(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定、理解和認(rèn)為是相關(guān)的。嘌呤能(P2X)受體為ATP門控陽離子選擇性通道。每個受體由三個蛋白質(zhì)亞基 或單體構(gòu)成。迄今為止，已經(jīng)鑒定出七個編碼P2X單體的獨(dú)立基因=PZXpPZ)^ P2X3> P2X4, P2Xg、P2Xg> P2X70P2X7受體受到格外關(guān)注，因?yàn)閾?jù)了解這些受體的表達(dá)局限于具有進(jìn)行程序性細(xì)胞 死亡之潛能的細(xì)胞，例如胸腺細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。在正常的內(nèi) 穩(wěn)態(tài)中，例如在紅細(xì)胞上，存在一些P2X7受體的表達(dá)。令人感興趣的是，已在據(jù)了解不能進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞(例如腫瘤前細(xì)胞 和腫瘤細(xì)胞)上發(fā)現(xiàn)了這樣的P2)(7受體，所述受體含有一個或多個在ftx)210(根據(jù)

圖1中 的SEQ ID No:l)處具有順式異構(gòu)化的單體并且不具有ATP結(jié)合功能。此同工型受體已被 稱為“非功能性”受體。用包含順式ftx)210的肽免疫接種產(chǎn)生的抗體結(jié)合非功能性P2X7受體。但是，它 們不與能夠結(jié)合ATP的P2)(7受體結(jié)合。因此，這些抗體可用于選擇性檢測許多形式的癌和 造血系統(tǒng)癌癥以及治療這些病癥中的某些。W002/057306A1和W003/020762A1均討論了用于區(qū)分功能性P2X7受體和非功能性 P2X7受體的單克隆抗體形式的探針。單克隆抗血清具有某些在多克隆抗血清(polysera)中未發(fā)現(xiàn)的血清學(xué)特征，這 使得單克隆抗血清成為用于研究、診斷和治療的特別有價值的試劑。其中的關(guān)鍵是，與在多 克隆抗血清中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)特異性物質(zhì)的親和力相比，單克隆抗體通常具有更高的抗原親 和力。迄今為止，獲得產(chǎn)生有用量的針對活細(xì)胞上表達(dá)之非功能性P2X7受體的單克隆抗 體(尤其是可用于多種診斷和治療應(yīng)用的單克隆抗體)的雜交瘤非常困難。此外，就本發(fā) 明人所知，還未有針對活細(xì)胞上的功能性P2X7受體而產(chǎn)生的任何單克隆抗體。需要這樣的 試劑，特別是能夠區(qū)分活細(xì)胞上ATP結(jié)合和非ATP結(jié)合的P2X7受體的新抗體。此外，據(jù)本發(fā)明人所知，抗P2X7抗體一般不區(qū)分P2X7單體和由這些單體形成的三 聚化P2X7受體。鑒于所述三聚化受體特別地發(fā)現(xiàn)于晚期腫瘤組織上，因此，結(jié)合該三聚化 受體而不結(jié)合P2)(7單體的抗體對于癌癥分期是有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生與活細(xì)胞上非功能性P2)(7受體結(jié)合但不與功能性P2X7受體結(jié)合之抗體的肽和表位。所述肽還可用于產(chǎn)生與活細(xì)胞上功能性P2X7受體結(jié)合但不與非 功能性P2X7受體結(jié)合的抗體。本發(fā)明還涉及與這些肽結(jié)合的抗體、含有這些肽的組合物、 使用所述肽產(chǎn)生抗體的方法以及診斷和治療與非功能性P2)(7受體表達(dá)相關(guān)之疾病的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了 P2X7受體的表位，所述表位由以下形成P2X7受體第一 單體區(qū)域形式的第一區(qū)域；和該受體第二單體區(qū)域形式的第二區(qū)域；其中所述第一和第二 區(qū)域在該受體中由受體單體(SEQ ID No:l)的第210位殘基順式異構(gòu)化而形成；并且其中 所述第一和第二區(qū)域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許抗Ρ2)(7抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與形 成所述表位的所述第一和第二區(qū)域結(jié)合。在另一些實(shí)施方案中，提供了具有上述表位的Ρ2Χ7受體。通常，所述受體的一個 或多個單體在單體(SEQ ID Νο:1)的第210位具有順式異構(gòu)化。在另一些實(shí)施方案中，提供了與？2&受體表位相結(jié)合的抗體，所述表位由以下形 成Ρ2Χ7受體第一單體區(qū)域形式的第一區(qū)域；和該受體第二單體區(qū)域形式的第二區(qū)域；其 中所述第一和第二區(qū)域在該受體中由受體單體(SEQ ID No :1)的第210位殘基順式異構(gòu)化 形成；并且其中所述第一和第二區(qū)域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許該抗體的抗原結(jié) 合位點(diǎn)與形成所述表位的所述第一和第二區(qū)域結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，提供了一種與抗體結(jié)合的采用上述表位形式的免疫復(fù)合物。在另一個實(shí)施方案中，提供了包含N端區(qū)域和C端區(qū)域的肽，所述N端和C端區(qū)域 各自通過N端和C端殘基來定義，其中-所述N端區(qū)域包含序列HNYTTRNIL(SEQ ID NO 2)或其至少4個殘基的片段；-所述C端區(qū)域包含脯氨酸、丙氨酸或甘氨酸的C端殘基；其中所述N端區(qū)域的C端殘基與所述C端區(qū)域的N端殘基共價相連；其中所述C端區(qū)域的C端殘基通過長約10至40埃的接頭與其他肽相連；并且其中所述其他肽由序列KTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGKFD(SEQ ID NO :6)或其至 少4個殘基的片段組成。在另一個實(shí)施方案中，提供了由式(A) (Xn) (B)定義的肽，其中-(A)是氨基酸序列GHNYTTRNILP(SEQ ID NO 8)或其至少4個氨基酸的片段-(Xn)是長10至40埃的接頭，所述接頭由一個或多個氨基酸殘基組成；-(B)是氨基酸序列AKYYKENNVEK(SEQ ID NO 9)或其至少4個氨基酸的片段。在另一些實(shí)施方案中，提供了具有下列序列的肽 GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(SEQ ID NO: 10)。在另一些實(shí)施方案中，提供了一種與抗體結(jié)合的上文所述肽形式的免疫復(fù)合物。 通常，所述抗體結(jié)合非功能性P2X7受體但不結(jié)合功能性P2X7受體。在另一些實(shí)施方案中，提供了上述肽用于生產(chǎn)用于與非功能性P2X7受體結(jié)合的抗 體的用途。在又一些實(shí)施方案中，提供了上述抗體用于確定個體是否患有癌癥的用途。在又一些實(shí)施方案中，提供了上述抗體用于治療患有癌癥的個體的用途。在又一些實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，其包含上述抗體，以及任選的-如上所述的肽；
所述試劑盒包含用于診斷或治療癌癥的書面說明。
具體實(shí)施例方式下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的某些實(shí)施方案。雖然與實(shí)施方案一起描述了本發(fā)明，但 是應(yīng)當(dāng)理解并不意味著將本發(fā)明局限于這些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明旨在覆蓋所有替代方 式、修改和等同方案，其可包含在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，許多類似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材 料均可用于實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明絕不局限于所述的方法和材料。應(yīng)當(dāng)理解，本說明書所公開和定義的本發(fā)明擴(kuò)展到由所述文本或附圖提及或可從 中顯而易見得出的兩個或更多個單個特征的所有替代性組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本 發(fā)明的多個替代方面。除了上下文另有需要，否則，本文中使用的術(shù)語“包括”和該術(shù)語的變化形式(如 “包含”、“含有”和“包含有”)并不旨在排除其他添加物、組分、整數(shù)或步驟。本文中引用的所有專利和出版物均全文通過弓I用并入本文。在做出本發(fā)明時，可用的針對活細(xì)胞上表達(dá)的非功能性？2&受體的抗P2X7抗血清 全部都是多克隆的。本發(fā)明人已鑒定了專門在非ATP結(jié)合的P2X7受體(也稱為“非功能性受體”)上 表達(dá)的表位。已發(fā)現(xiàn)該表位和形成它的肽可用于產(chǎn)生與活細(xì)胞上所表達(dá)的非功能性？2&受 體相結(jié)合的單克隆抗體?；罴?xì)胞結(jié)合是非常重要的，因?yàn)榉枪δ苄訮2X7受體在細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞)中或 上的表達(dá)被認(rèn)為是許多癌癥(例如上皮癌癥及其他病癥)的生物標(biāo)志物。因此，利用結(jié)合 活細(xì)胞的單克隆抗體可提供抗體本身形式或者抗體-細(xì)胞毒劑綴合物形式的針對多種以 非功能性P2X7受體表達(dá)為特征之疾病的全身性治療劑。還可提供以非功能性P2X7受體表 達(dá)為特征的疾病的體內(nèi)成像和診斷或監(jiān)測。本發(fā)明人已從本文另外描述的詳細(xì)分子建模觀察到，該表位僅在？2&受體(即由 P2X7單體形成的三聚體)上發(fā)現(xiàn)。更特別地，該表位跨越三聚P2X7受體中的相鄰？2&單 體。因此，沒有排列成非功能性三聚化受體的各P2X7單體不含有該表位。這有利地允許人 們對腫瘤進(jìn)行分級。這對于既結(jié)合單體P2X7又結(jié)合三聚化受體的抗體來說更困難。出于解釋本說明書的目的，一般性適用下列定義，只要適用，以單數(shù)形式使用的術(shù) 語也包括復(fù)數(shù)含義，并且反之亦然。如果所述的任何定義與通過引用并入本文的任何文獻(xiàn) 相矛盾，則采用下文所述的定義?！班堰誓苁荏w”泛指使用嘌呤(例如ATP)作為配體的受體?！癙2X7受體”泛指由三個蛋白質(zhì)亞基或單體形成的嘌呤能受體，所述單體的至少 一個具有基本上如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。P2X7由三個單體形成，因此其為“三 聚物”或“三聚化”。"P2X7受體”可以是如下所述的功能性或非功能性受體?！癙SA受體” 涵蓋P2X7受體的天然變體，例如，其中P2X7單體是剪接變體、等位變體和同工型，包括形成 P2X7受體的天然截短或分泌形式的單體(例如由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列組成的形式或其截短形 式)、天然變體形式(例如選擇性剪接形式)和天然等位變體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案 中，本文公開的天然序列P2X7單體多肽是成熟的或全長天然序列多肽，其包含SEQ ID NO1所示的全長氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，P2X7受體可以是經(jīng)修飾的氨基酸序列，例如 SEQ IDNO=I中所示序列中的多個氨基酸可以被替換、缺失或可插入殘基?！肮δ苄訮2X7受體”泛指具有結(jié)合ATP之結(jié)合位點(diǎn)或裂隙的P2X7受體形式。當(dāng)結(jié) 合ATP時，該受體形成孔樣結(jié)構(gòu)，其使得鈣離子能夠進(jìn)入胞質(zhì)溶膠內(nèi)，其后果之一可能是程 序性細(xì)胞死亡。在正常體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中，功能性P2X7受體的表達(dá)一般局限于進(jìn)行程序性細(xì)胞死 亡的細(xì)胞，例如胸腺細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。在紅細(xì)胞上也可有功 能性P2X7受體的一些表達(dá)?！胺枪δ苄訮2X7受體”泛指其中一個或多個單體在ftx)210 (根據(jù)SEQID NO :1)處 具有順式異構(gòu)化的P2X7受體形式。該異構(gòu)化可來源于任何分子事件，其導(dǎo)致單體錯誤折疊， 包括例如單體一級序列的突變或者異常的翻譯后加工。異構(gòu)化的后果之一是受體不能結(jié)合 ATP0在這些情況下，受體不能形成孔，這限制了鈣離子可進(jìn)入胞質(zhì)溶膠的程度。非功能性 P2X7受體在多種上皮癌和造血系統(tǒng)癌癥中表達(dá)?！翱贵w”或“免疫球蛋白”或“Ig”是Y球蛋白，其存在于血液或脊椎動物的其他體 液中，其在免疫系統(tǒng)中起到結(jié)合抗原并由此識別和/或中和外來物質(zhì)的作用?？贵w一般是異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu) 成。每條L鏈通過一個共價二硫鍵與H鏈相連。取決于H鏈的同種型，兩條H鏈通過一個 或多個二硫鍵彼此相連。每條H鏈和L鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫橋。H鏈和L鏈定義了特定的Ig結(jié)構(gòu)域。更特別地，每條H鏈在N端具有可變結(jié)構(gòu)域 (Vh)，其后對于α和Y鏈各自是三個恒定結(jié)構(gòu)域(Ch)，對于μ和ε同種型是四個Ch結(jié)構(gòu) 域。每條L鏈在N端具有可變結(jié)構(gòu)域(\)，其后在其另一端是恒定結(jié)構(gòu)域(CJ。\與V1^i 齊，Q與重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)對齊。抗體可劃分為不同的種類或同種型。免疫球蛋白分五類IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM，其分別具有命名為α、δ、ε、Y和μ的重鏈。γ和α類又根據(jù)Ch序列和功能中相 對小的差異分為若干亞類，例如入表達(dá)下列亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2?？?根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列將來自任何脊椎動物物種的L鏈劃歸為兩種明顯不同的 類型之一，稱為κ和入。恒定結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c部分，其包含通過二硫鍵連接在一起的兩條H鏈的羧基端部 分?？贵w的效應(yīng)物功能(例如ADCC)由Fc區(qū)域中的序列所決定，該區(qū)域也是某些類型細(xì)胞 上所發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)所識別的部分。Vh和\配對一起形成“可變區(qū)，，或“可變結(jié)構(gòu)域”，其包含抗體重鏈或輕鏈的氨基 端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變結(jié)構(gòu)域可稱為“VH”。輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域可稱為“VL”。V結(jié)構(gòu)域含 有影響抗原結(jié)合并限定特定抗體對其特定抗原之特異性的“抗原結(jié)合位點(diǎn)”，其。V區(qū)域跨 越約110個氨基酸殘基，由相對不變的稱為框架區(qū)(FR)(通常約4個)的15-30個氨基酸 的片段組成，所述框架區(qū)被稱為“高變區(qū)”(一般約3個)的變化極大的較短區(qū)域間隔開，所 述“高變區(qū)”各自長9-12個氨基酸。FR大多采取β片層構(gòu)型，所述高變區(qū)形成連接β片 層結(jié)構(gòu)(有時構(gòu)成其一部分)的環(huán)。“高變區(qū)”指抗體可變結(jié)構(gòu)域中在序列上具有高度可變性和/或在結(jié)構(gòu)上形成限 定環(huán)的區(qū)域。一般來說，抗體包含六個高變區(qū)；VH中有3個(H1、H2、H3)，VL中有3個(Li、 L2、L3)。
“框架”或“FR”殘基是除了本文定義的高變區(qū)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?！巴暾被颉罢麄€”抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)以及Q和至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域^^、^^ 的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或
其氨基酸序列變體?！鞍勺兘Y(jié)構(gòu)域的完整抗體片段”包括Fab、Fab'、F(ab'片段；雙功能 抗體(diabodies)；線性抗體、單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。"Fab片段”由整個L鏈和H鏈之可變結(jié)構(gòu)域(Vh)以及一條重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu) 域(ChI)組成。每個Fab片段對于抗原結(jié)合而言是單價的，即其具有單個抗體結(jié)合位點(diǎn)。"Fab'片段”與Fab片段的不同在于，前者在ChI結(jié)構(gòu)域的羧基端具有另外的幾個 殘基(包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)。Fab' -SH在本文中表示恒定結(jié)構(gòu)域 的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab'。"F(ab' )2片段”大致相當(dāng)于兩個二硫鍵連接的Fab片段，其具有二價抗原結(jié)合活 性，并且仍能夠交聯(lián)抗原。“Fv”是含有完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此片段由緊密非共價連 接的一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFV)類型中，一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可通過 柔性肽接頭共價連接，使得輕鏈和重鏈可以類似于兩條鏈Fv類型中的“二聚化”結(jié)構(gòu)相結(jié) 合。這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生六個高度可變的環(huán)(來自H鏈和L鏈的各3個環(huán))，其提供了 用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并將抗原結(jié)合特異性賦予抗體?！皢捂淔v〃(還縮寫為“sFv”或“scFv” )是包含相連形成單個多肽鏈之Vh和\ 抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，所述scFv多肽還包含Vh和\結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其 使得scFv能夠形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)?！皢慰勺兘Y(jié)構(gòu)域”是Fv的一半(僅包含三個抗原特異性的OTR)，其具有識別和結(jié) 合抗原的能力，盡管比整個結(jié)合位點(diǎn)的親和力低?！半p功能抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，其片段在同一多肽鏈 (VH-VL)中包含與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過下列方式制備小 抗體片段在Vh與\結(jié)構(gòu)域之間使用短接頭(約5-10個殘基)構(gòu)建sFv片段(見前段)， 使得形成V結(jié)構(gòu)域的鏈間而非鏈內(nèi)配對，得到二價片段，即具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙功能抗體可以是二價的或雙特異性的。雙特異性雙功能抗體是兩個“交換” sFv 片段的異二聚體，其中兩個抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。三功能抗體 (triabodies)和四功能抗體(tetrabodies)也是本領(lǐng)域中一般已知的?！胺蛛x的抗體”是已經(jīng)鑒定并已與其之前存在的環(huán)境中組分分離和/或從其中回收 的抗體。雜質(zhì)組分是會干擾抗體治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素及其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì) 溶質(zhì)?！叭丝贵w”指具有對應(yīng)于人所產(chǎn)生抗體之氨基酸序列的氨基酸序列的抗體。人抗體 可使用本領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)產(chǎn)生，包括噬菌體展示文庫。人抗體可以通過向已經(jīng)修飾 從而在應(yīng)答于抗原激發(fā)時產(chǎn)生此種抗體而其自身的內(nèi)源基因座已失活的轉(zhuǎn)基因動物施用 這些抗原來制備。非人(例如嚙齒動物)抗體的“人源化”形式是含有來源于非人抗體之盡可能少的序列的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自接 納抗體高變區(qū)的殘基被具有所需抗體特異性、親和性和能力的來自非人物種(例如小鼠、 大鼠、兔或非人靈長類)(供者抗體)之高變區(qū)的殘基所替代。在一些情況下，人免疫球蛋 白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基所替代。此外，人源化抗體還可包含未在受者抗體 或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能。一般說來，人源化抗體 會包含至少一個以及通常兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高可變 環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，并且所有或基本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列 的FR。人源化抗體任選地還會包含免疫球蛋白(通常為人免疫球蛋白)恒定區(qū)(Fe)的至 少一部分?！皢慰寺】贵w”是指由基本上同一抗體群體獲得的抗體，S卩，除可能少量存在的天 然突變外，包含所述群體的各個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，其針對抗原上 的單個抗原位點(diǎn)或決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢還在于它們可以合成而 不被其他抗體污染。單克隆抗體可以通過雜交瘤方法來制備。“單克隆抗體”也可利用所述 技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離出來。術(shù)語“抗P2X7受體抗體”或“結(jié)合P2X7受體的抗體”是指能夠結(jié)合P2X7受體的抗 體，其親和力足夠使得所述抗體可作為靶向？2\受體(通常為非功能性P2X7受體)的診 斷劑和/或治療劑。優(yōu)選地，P2X7受體抗體結(jié)合不相關(guān)的P2X7受體蛋白的程度小于該抗體 與P2X7受體結(jié)合程度的約10%，例如通過放射性免疫測定(RIA)所測得的。在某些實(shí)施方 案中，結(jié)合P2X7受體的抗體具有< 1μΜ、< 100nM、< 10nM、< InM或<0. InM的解離常數(shù) (Kd)?？狗枪δ苄驭?Χ7受體的抗體通常是具有這些血清學(xué)特征中的一些或全部特征并且 結(jié)合非功能性Ρ2)(7受體但不結(jié)合功能性Ρ2Χ7受體的抗體?！坝H和力成熟”抗體是在其一個或多個高變區(qū)中具有一個或多個改變并導(dǎo)致抗體 對抗原之親和力提高(與不具有這些改變的親本抗體相比)的抗體。優(yōu)選的親和力成熟抗 體將具有針對靶抗原的納摩爾每升或甚至皮摩爾每升的親和力。親和力成熟抗體由本領(lǐng)域 已知的方法產(chǎn)生?！白钄唷笨贵w或“拮抗劑”抗體是抑制或降低其所結(jié)合之抗原的生物活性的抗體。優(yōu) 選的阻斷抗體或拮抗劑抗體基本上或完全抑制抗原的生物活性。本文使用的“激動劑抗體”是模擬目的多肽至少一種功能活性的抗體。“結(jié)合親和力”泛指分子(例如抗體)的單個結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗 原)之間的非共價相互作用的總和強(qiáng)度。除非另外指明，否則本文使用的“結(jié)合親和力”表 示內(nèi)在結(jié)合親和力，其反映結(jié)合配對成員(例如抗體和抗原)之間的1 1相互作用。分 子X與其配偶體Y的親和力一般可由解離常數(shù)(Kd)表示。親和力可通過本領(lǐng)域已知的普 通方法來測定，包括本文中所述的那些。低親和力抗體一般緩慢結(jié)合抗原，并且傾向于容易 地解離，而高親和力抗體則通常更快地結(jié)合抗原并且傾向于保持結(jié)合更長時間。測量結(jié)合 親和力的多種方法是本領(lǐng)域中已知的，其中的任何方法都可用于本發(fā)明目的?！氨砦弧狈褐缚贵w之抗原結(jié)合位點(diǎn)所結(jié)合的抗原部分。表位可以是“線性的”，其意 為形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體CDR的高變環(huán)結(jié)合一級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。在某些實(shí)施 方案中，所述表位是“構(gòu)象表位”，即其中CDR的高變環(huán)結(jié)合三級或四級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在 的殘基。
在一個實(shí)施方案中，提供了 P2X7受體的表位，該表位由以下形成-P2X7受體第一單體區(qū)域形式的第一區(qū)域；和-所述受體第二單體區(qū)域形式的第二區(qū)域；其中所述第一和第二區(qū)域通過所述受 體單體(SEQ ID NO 1)的第210位處殘基的順式異構(gòu)化在該受體中形成；并且其中所述第一和第二區(qū)域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許抗P2X7抗體的抗原 結(jié)合位點(diǎn)與形成所述表位的所述第一和第二區(qū)域結(jié)合。通常，所述表位是構(gòu)象表位。在這些實(shí)施方案中，所述第一和第二區(qū)域各自定義了 分子空間，其各自包含SEQ ID NO :1中的一個或多個殘基。通常，所述第一區(qū)域定義了包 含SEQ ID NO :1中一個或多個殘基的分子空間，其暴露用于結(jié)合抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其是 具有SEQ ID N0:1所示序列之單體的ftx)210順式異構(gòu)化的結(jié)果。這些殘基包括Gly200、 His201、Asn202、Tyr203、Thr204、Thr205、Arg206、Asn207、Ile208、Leu209 和 Pro210。在 一個實(shí)施方案中，所述第一區(qū)域包含這些殘基中的至少一個。通常，所述第一區(qū)域包含這些 殘基中的至少4個，但是其可以更少，例如2個或3個，這取決于所述第二區(qū)域中存在多少 殘基。在一個實(shí)施方案中，所述第一區(qū)域包含下表1中所示的至少1對殘基表 權(quán)利要求
1.結(jié)合P2X7受體表位的抗體，所述表位由下列形成 -P2X7受體第一單體區(qū)域形式的第一區(qū)域；和-所述受體第二單體區(qū)域形式的第二區(qū)域；其中所述第一和第二區(qū)域通過所述受體單體SEQ ID NO :1第210位殘基的順式異構(gòu)化 在該受體中形成；并且其中所述第一和第二區(qū)域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許所述抗體的抗原結(jié)合位 點(diǎn)與形成所述表位的所述第一和第二區(qū)域結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述第一區(qū)域包含SEQID NO 1的下列一個或多個殘 基Gly 200，His 201，Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr205, Arg 206，Asn 207，lie 208 和 Leu 209。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其中所述第一區(qū)域還包含SEQID NO :1的下列一個或多個 殘基=Arg 125，Lys 193，Phe 275 和 Arg 294。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述第一區(qū)域包含SEQID No=I的下列序列之一 Gly 200 至 Tyr 203，His 201 至 Thr 204， Asn 202 至 Thr 205， Tyr 203 至 Arg 206， Thr 204 至 Asn 207， Thr 205 至 Ile 208， Arg 206 至 Leu 209。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其中所述第二區(qū)域包含下列一個或多個殘基 Lys 297,Tyr 298,Tyr 299、Lys 300、Glu301、Asn 301、Asn 303,Val 304,Glu 305 和 Lys 306。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的抗體，其中所述第二區(qū)域還包含Arg307和/或Lys 311。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述第二區(qū)域包含SEQID No=I的下列序列之一 Lys 297 至 Lys 300,Tyr 298 至 Glu 301， Tyr 299 至 Asn 301， Lys 300 至 Asn 303， Glu 301 至 Val 304， Asn 301 至 Glu 305， Asn 303 至 Lys 306。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其中所述第一區(qū)域含有比所述第二區(qū)域多的殘基。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其中所述第一區(qū)域含有約4至約10個殘基。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其中所述第二區(qū)域含有比所述第一區(qū)域多的殘基。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其中所述第二區(qū)域含有約4至約10個殘基。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其中所述第一和第二區(qū)域間隔約10埃。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，其為基本上經(jīng)純化或分離的形式。
14.P2X7受體的表位，所述表位由以下形成 -P2X7受體第一單體區(qū)域形式的第一區(qū)域；和 -所述受體第二單體區(qū)域形式的第二區(qū)域；其中所述第一和第二區(qū)域通過所述受體單體SEQ ID NO :1第210位殘基的順式異構(gòu)化 在所述受體中形成；并且其中所述第一和第二區(qū)域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許抗P2X7抗體的抗原結(jié)合 位點(diǎn)與形成所述表位的所述第一和第二區(qū)域結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的表位，其為基本上經(jīng)純化或分離的形式。
16.P2X7受體，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的表位。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的受體，其中并非該受體所有的單體都在單體210位殘基具有順 式異構(gòu)化。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的受體，其中所述受體單體中的2個在210位殘基具有順式異構(gòu)化。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的受體，其中所述受體單體中的1個在210位殘基具有順式異構(gòu)化。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的受體，其為基本上經(jīng)純化或分離的形式。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)之抗體形式的免疫復(fù)合物，其結(jié)合至P2X7受體上的表位。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫復(fù)合物，其中所述受體的所有表位均與抗體結(jié)I=I O
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫復(fù)合物，其中所述受體中少于三個表位被抗體纟口口。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫復(fù)合物，其中所述復(fù)合物含有比受體更多的抗 體分子。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫復(fù)合物，其中所述復(fù)合物含有比受體更少的抗 體分子。
26.—種肽，其含有N端區(qū)域和C端區(qū)域，所述N端和C端區(qū)域各自通過N端和C端殘 基而限定，其中-所述N端區(qū)域包含序列HNYTTRNIL(SFQ ID NO 2)或其至少4個殘基的片段； -所述C端區(qū)域包含脯氨酸、丙氨酸或甘氨酸的C端殘基； 其中所述N端區(qū)域的C端殘基共價連接至所述C端區(qū)域的N端殘基； 其中所述C端區(qū)域的C端殘基通過長約10至30埃的接頭連接至其他肽；并且 其中所述其他肽由序列 KTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGKFD 或 其至少4個殘基的片段組成。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈的肽，其中所述N端區(qū)域包含序列HNYTTRNIL(SEQID NO 2)。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述N端區(qū)域包含序列GHNYTTRNIL(SEQID NO 3)。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述N端區(qū)域包含序列DFPGHNYTTRNIL(SEQ ID NO 4)。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中對于SEQID NO :2至4中任一項(xiàng)而言 D殘基可保守性替換為E、N或Q殘基；F殘基可保守性替換為Y或W殘基； G殘基可保守性替換為A、V、L或I殘基； H殘基可保守性替換為K或R殘基； N殘基可保守性替換為D、E或Q殘基； Y殘基可保守性替換為F或W殘基； T殘基可保守性替換為C、S或M殘基； R殘基可保守性替換為H或K殘基； I殘基可保守性替換為G、A、V或L殘基；以及 L殘基可保守性替換為G、A、V或I殘基。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述N端區(qū)域包含序列 MPACCSCSDVFQYETNKVTRIQSMNYGTIKWFFHVIIFSYVCFALVSDKL YQRKEPVISSVHTKVKGIAEVKEEIVENGVKKLVHSVFDTADYTFPLQGN SFFVMTNFLKTEGQEQRLCPEYPTRRTLCSSDRGCKKGWMDPQSKGIQTG RCWHEGNQKTCEVSAWCPIEAVEEAPRPALLNSAENFTVLIKNNIDFPG HNYTTRNIL(SEQ ID NO :5)。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述N端區(qū)域包含序列SEQID NO. 5中的序 列，所述序歹Ij SEQ ID NO. 5在C端包含HNYTTRNIL。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述C端區(qū)域的C端殘基是脯氨酸。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述脯氨酸處于順式構(gòu)象。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述C端區(qū)域由脯氨酸、甘氨酸或丙氨酸組成。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述C端區(qū)域由脯氨酸組成。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述接頭是一個或多個氨基酸殘基。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述接頭是一個或兩個氨基酸。
39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽，其中所述所述氨基酸殘基選自甘氨酸和丙氨酸。
40.由式㈧0(η)⑶定義的肽，其中-(A)是GHNYTTRNILP的氨基酸序列或其至少4個氨基酸的片段； -(Xn)是長10至30埃的接頭，所述接頭由一個或多個氨基酸殘基組成； -(B)是AKYYKENNVEK的氨基酸序列或其至少4個氨基酸的片段。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的肽，其中所述肽具有下列序列GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK。
42.與根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽相結(jié)合的抗體。
43.與抗體相結(jié)合的根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽的形式的免疫復(fù)合物。
44.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽用于生產(chǎn)結(jié)合非功能性P2X7受體之抗體的用途。
45.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體用于確定個體是否患有癌癥的用途。
46.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體用于治療患癌癥個體的用途。
47.一種試劑盒，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體，以及任選地包含 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽；所述試劑盒包含用于診斷或治療癌癥的書面說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及對癌癥中所涉及的非功能性P2X7受體上新表位的鑒定。該表位包含來自該三亞基受體內(nèi)兩個相鄰單體的區(qū)域。描述了結(jié)合該表位的抗體以及產(chǎn)生所述抗體的肽。所述抗體和肽可用于診斷和治療癌癥。
文檔編號C07K14/05GK102143978SQ200980134521
公開日2011年8月3日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者A·基得利-拜爾德, J·A·巴登 申請人:生物權(quán)威國際有限公司