專利名稱:重組人g-csf的改進(jìn)的加工的制作方法
重組人G-CSF的改進(jìn)的加工
背景技術(shù):
G-CSF是一個(gè)20kDa的糖蛋白,該糖蛋白由兩個(gè)鏈內(nèi)的二硫鍵穩(wěn)定,含有單個(gè)氧-連接的碳水化合物部分(carbohydrate moiety)。成熟的G-CSF有174個(gè)氨基酸。G-CSF 是由骨髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成的。它的主要功能是作為中性粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞的生長和分化因子。現(xiàn)有技術(shù)中還已知G-CSF活化成熟的中性粒細(xì)胞。此外,它刺激其它多種造血祖細(xì)胞的生長/分化(與另外的造血生長因子協(xié)同作用)并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。在臨床上,G-CSF被用于治療中性粒細(xì)胞水平上的缺陷(例如,由癌癥/化療、 AIDS或骨髓移植導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞減少癥)。
發(fā)明內(nèi)容
為了使用與人相同的G-CSF治療中性粒細(xì)胞減少癥患者,用編碼人野生型G-CSF 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人細(xì)胞。從所選克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化G-CSF后,觀察到大量的分泌的 G-CSF的N端被截短了 3個(gè)氨基酸。所述截短并不是克隆特異的,也不能通過改變細(xì)胞培養(yǎng)條件而消除。在上述觀察的基礎(chǔ)上,推斷出細(xì)胞中,特別是HEK293F細(xì)胞中的G-CSF前體蛋白的加工(processing)并不精確。具體地,可推斷出,為了在生理上去除所述信號(hào)肽,信號(hào)肽酶復(fù)合物并不只在預(yù)期的位點(diǎn)切割,該信號(hào)肽酶復(fù)合物還在另外一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行切割,導(dǎo)致N 端的截短。令人驚訝地發(fā)現(xiàn),如果使用了修飾的信號(hào)肽及相應(yīng)的G-CSF前體,可以減少N端的截短。因此,在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供包括信號(hào)肽和G-CSF肽的G-CSF前體,其中, 所述信號(hào)肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信號(hào)肽的序列(SEQ ID NO :4),且該序列具有至少以下突變之一-Glu29 的刪除,-Glu26 的插入,-LysllLeu 的取代,-His2IPhe 的取代,以及-Glu28Leu 的取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述G-CSF前體具有至少2個(gè)、或至少3個(gè)、或至少4 個(gè)、或所有5個(gè)上述突變。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中,所述G-CSF前體至多可以具有另外3個(gè)突變,所述突變選自插入、刪除及取代。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是編碼本發(fā)明的G-CSF前體的多核苷酸,以及與上述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是包括本發(fā)明的多核苷酸的載體,以及含有本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是真核細(xì)胞,優(yōu)選是人細(xì)胞,更優(yōu)選是HEK293細(xì)胞,更進(jìn)一步優(yōu)選是HEK293F細(xì)胞或HEK293F衍生細(xì)胞(HEK293F derived cell)0在一個(gè)實(shí)施方式中,所述轉(zhuǎn)染是瞬時(shí)的,在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述轉(zhuǎn)染是穩(wěn)定的。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是表達(dá)G-CSF的方法,該方法包括以下步驟-在合適的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;-從所述培養(yǎng)基中分離G-CSF。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,在pH為6. 8-7. 5、優(yōu)選為7. 1-7. 3、更優(yōu)選為7. 2左右的條件下進(jìn)行所述培養(yǎng)。優(yōu)選在培養(yǎng)過程中控制所述PH。在另一個(gè)實(shí)施方式中,在胰島素濃度為5-25mg/ml、優(yōu)選為15_25mg/ml、更優(yōu)選為 15-20mg/ml的條件下進(jìn)行所述培養(yǎng)。令人驚訝地,采用本發(fā)明的修飾的信號(hào)肽,所產(chǎn)生的G-CSF的截短比率極小,優(yōu)選低于分子的5%,更優(yōu)選低于總G-CSF的1%。被認(rèn)為是檢測限。優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基不含血清。大部分G-CSF的糖基化類型沒有改變,且活性與野生型G-CSF的活性相同。因此,本發(fā)明的方法產(chǎn)生了高度適于制藥應(yīng)用的G-CSF。
圖1顯示了用TargetP程序?qū)哂幸吧托盘?hào)肽的人野生型G-CSF的分析。圖2顯示了用TargetP程序?qū)哂蠸P9信號(hào)肽的人野生型G-CSF的分析。圖3顯示了用TargetP程序?qū)哂蠸PlO信號(hào)肽的人野生型G-CSF的分析。圖4顯示了采用構(gòu)建體的HEK293F細(xì)胞中成熟G-CSF蛋白的表達(dá),所述構(gòu)建體分別編碼具有野生型信號(hào)肽(表達(dá)水平是100% )、SP9信號(hào)肽或SPlO信號(hào)肽的前體蛋白。圖5顯示了具有SP9信號(hào)肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸測序(Edman降解法)的色譜圖。圖如-如對(duì)應(yīng)于殘基1-5。下面的表格中給出了所述氨基酸序列分析的總結(jié)ο圖6顯示了具有SPlO信號(hào)肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸測序(Edman降解法)的色譜圖。對(duì)應(yīng)于殘基1-5。下面的表格中給出了所述氨基酸序列分析的
總結(jié)O圖7顯示了格拉諾賽特(GRAN0CYTE)的氨基末端氨基酸測序(Edman降解法)的色譜圖。圖6a_6e對(duì)應(yīng)于殘基1-5。下面的表格中給出了所述氨基酸序列分析的總結(jié)。圖8顯示了具有野生型信號(hào)肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸測序(Edman 降解法)的色譜圖。圖7a_7e對(duì)應(yīng)于殘基1-5。下面的表格中給出了所述氨基酸序列分析的總結(jié)。圖9顯示了從用G-CSF SP9穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆分離中得到的兩個(gè)示例性的克隆中全長G-CSF的比率的比較。所述剩余的非全長片斷主要包括N端被截短3個(gè)氨基酸的G-CSF。 全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短彡相關(guān),這是該分析的檢測下限。圖10顯示了在攪拌釜反應(yīng)器中,用不同培養(yǎng)pH培養(yǎng)的克隆1的實(shí)施例中全長
4G-CSF的比率的比較??寺?從用G-CSF SP9載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆分離中得到。所述剩余的非全長片斷主要包括N端被截短3個(gè)氨基酸的G-CSF。搖瓶中的克隆1的參比培養(yǎng)(沒有控制pH)中的全長G-CSF的比率表示于第一個(gè)灰色的棒中。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短< 相關(guān),這是該分析的檢測下限。圖11顯示了在攪拌釜反應(yīng)器中,用不同培養(yǎng)pH培養(yǎng)的克隆2的實(shí)施例中全長 G-CSF的比率的比較??寺?從用G-CSF SP9載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆分離中得到。所述剩余的非全長片斷主要包括N端被截短3個(gè)氨基酸的G-CSF。搖瓶中的克隆2的參比培養(yǎng)(沒有控制pH)中的全長G-CSF的比率表示于第一個(gè)灰色的棒中。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短< 相關(guān),這是該分析的檢測下限。圖12顯示了具有不同胰島素濃度的培養(yǎng)基中,克隆2的實(shí)施例中全長G-CSF的比率的比較??寺?從用G-CSF SP9載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆分離中得到。所述剩余的非全長片斷主要包括N端被截短3個(gè)氨基酸的G-CSF。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短< 相關(guān),這是該分析的檢測下限。圖13顯示了在大規(guī)模的高細(xì)胞密度模式下培養(yǎng)、并在不同時(shí)間采集的克隆2的實(shí)施例中全長G-CSF的比率的比較,其中,培養(yǎng)基中含15mg/L的胰島素,沒有控制pH??寺? 從用G-CSF SP9載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆分離中得到。所述剩余的非全長片斷主要包括N端被截短3個(gè)氨基酸的G-CSF。全長G-CSF的比率為99%處的線與N端的截短彡相關(guān),這是該分析的檢測下限。
實(shí)施例實(shí)施例1為了正確的蛋白加工,對(duì)所述G-CSF前體肽進(jìn)行的優(yōu)化所述野生型的人G-CSF的亞型b的cDNA已在GenBank數(shù)據(jù)庫中公開(NM_172219)。 基本上,具有任何源自NM_172219的序列的任何G-CSF前體蛋白都可用于本發(fā)明的信號(hào)肽序列的修飾。在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中,所述前體蛋白具有下文所示的如SEQ ID NO 1 (GenBank NP_757373)的序列MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP未加工的野生型G-CSF前體蛋白(SEQ ID NO :1)包括204個(gè)氨基酸,其中包括 30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。已經(jīng)公開了所述加工是發(fā)生于Ala30和Thr31殘基之間(GenBank NP_757373)。最近的文獻(xiàn)記載了所述真核生物的信號(hào)肽的共有序列及信號(hào)肽酶復(fù)合物的功能 (Rapoport,2007, Nature 450(29),663-669 ;Tuteja,2005, Arch Biochem Biophys 441, 107-111 ;Dalbey 等,1997,Protein Science 6,1129-1138)。將G-CSF信號(hào)肽的氨基酸序列與上述提出的共有信號(hào)肽的特征進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)有若干氨基酸殘基與所提出的模型不符。具體地,所提出的位于信號(hào)肽C-末端的Ala-X-Ala 基序被存在于G-CSF前體肽中的、帶電荷的氨基酸(Glu29)阻斷,而所述基序被認(rèn)為是精確切割的關(guān)鍵。此外,所述帶電荷的殘基Lysll及His21位于該信號(hào)肽的疏水區(qū),因而與該模型的要求不一致。用 SignalP 禾口 TargetP 軟件(www. cbs. dtu. dk/services ; Emanue Is son 2007, Nature Protocols 2,953-971)對(duì)所述野生型的G-CSF信號(hào)肽進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬(in silico)分析。所述軟件顯示,預(yù)測加工會(huì)發(fā)生在正確的G-CSF的N端(Thrfl),但還會(huì)發(fā)生在其它幾個(gè)位點(diǎn)(圖1)。然而,該軟件并未預(yù)測到在截短位點(diǎn)(Gly34)處的加工。實(shí)施例2根據(jù)上述假定的信號(hào)肽酶模型,用計(jì)算機(jī)模擬所述野生型的G-CSF信號(hào)肽的模型,其中,對(duì)該信號(hào)肽的氨基酸序列進(jìn)行了最低限度的改變。再次用SignalP和TargetP軟件分析所得切割位點(diǎn)。計(jì)算機(jī)模擬的少數(shù)模型,如稱為SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的模型中,預(yù)測到G-CSF的加工僅發(fā)生在正確的位點(diǎn)(Thrfl),而這可以認(rèn)為是潛在的優(yōu)化的信號(hào)肽(SP9 G-CSF及SPlO G-CSF切割位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)模擬分析分別參見圖2及圖3)。一些這樣的構(gòu)建體被選中用于基因合成(GeneArt,Regensburg,德國)。所述合成的、分別編碼SP9 G-CSF和SPlO G-CSF肽的基因被克隆至真核表達(dá)載體中,用于轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞。實(shí)施例3SP9 G-CSF 前體蛋白所述SP9 G-CSF前體蛋白產(chǎn)生于野生型的人G-CSF前體蛋白(SEQ ID N0:1)的信號(hào)肽序列。具體地,野生型信號(hào)肽在四位的谷氨酸(Glu29)被去除并插入到沈位(Glu26)。 在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中,所述SP9G-CSF前體蛋白具有下文所示的、如SEQ ID NO 2的序列MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWETVQATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP實(shí)施例4SPlO G-CSF 前體蛋白所述SPlO G-CSF前體蛋白產(chǎn)生于野生型的人G-CSF前體蛋白(SEQ ID NO 1)的信號(hào)肽序列。具體地,通過將11位的賴氨酸取代為亮氨酸(LysllLeu)、將組氨酸21取代為苯丙氨酸(His21Phe)、將谷氨酰胺觀取代為亮氨酸(Gli^SLeu)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中,所述SPlO G-CSF肽具有下文所示的、如SEQ ID NO 3的序列MAGPATQSPMLLMALQLLLWFSALWTVLEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP必須注意到,盡管信號(hào)肽有所改變,成熟的G-CSF肽保持了野生型(SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3,31-204 位的殘基)。實(shí)施例5用編碼SP9 G-CSF及SPlO G-CSCF的表達(dá)載體進(jìn)行的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分別用編碼SP9 G-CSF或SPlO G-CSF的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞。3天后收集上清液。用ELISA測定G-CSF的分泌。數(shù)據(jù)顯示,其表達(dá)水平與具有野生型信號(hào)肽的 G-CSF相當(dāng),或甚至具有更高的表達(dá)水平(圖4)。將G-CSF純化至高純度。采用與野生型G-CSF相同的方案而不對(duì)方案作任何改變,分別對(duì)兩種產(chǎn)物SP9 G-CSF及SPlO G-CSF進(jìn)行純化。實(shí)施例6用Edman降解法(TopLab,Martinsried,德國)測定野生型G-CSF、商品化的產(chǎn)品格拉諾賽特(Chugai的專利CA1341389,產(chǎn)生于CHO細(xì)胞中的G-CSF)、SP9 G-CSF及SPlO G-CSF的氨基末端序列。令人驚訝地是,兩個(gè)表達(dá)產(chǎn)物SP9 G-CSF及SPlO G-CSF的數(shù)據(jù)顯示出僅有正確的N端而沒有任何截短(圖5和圖6)。格拉諾賽特中也觀察到相同的結(jié)果 (圖7)。與此相反,盡管用SignalP或TargetP進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測的結(jié)果是僅有一個(gè)切割位點(diǎn)(數(shù)據(jù)未給出),具有野生型信號(hào)肽的G-CSF以及其它幾種設(shè)計(jì)的構(gòu)建體中,觀察到了所述截短(圖8)。實(shí)施例7用細(xì)胞增殖測定法來測定SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的活性,并將其活性與格拉諾賽特的活性進(jìn)行比較。SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的細(xì)胞增殖活性優(yōu)于格拉諾賽特的活性。實(shí)施例8GluC消化后,用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI T0F)肽質(zhì)量指紋譜分析測定SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的糖基化。反射譜顯示,HEK293F細(xì)胞中產(chǎn)生的SP9 G-CSF或SPlO G-CSF與野生型G-CSF相比沒有任何差別。實(shí)施例9對(duì)用編碼SP9 G-CSF的表達(dá)載體進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所得克隆的評(píng)估用編碼SP9 G-CSF的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞。轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后,分離同種克隆(homogeneous clones) 0在不同的發(fā)酵規(guī)模下分析所選克隆的上清液。為實(shí)現(xiàn)該目的, 從采集的上清液中,將G-CSF純化至高純度,并針對(duì)它們的氨基末端序列、糖基化類型及活性進(jìn)行評(píng)估。觀察到,盡管由SP9 G-CSF得到的上清液中并未觀察到N端3個(gè)氨基酸的截短(所述上清液是從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染庫(pool)分析所得),但對(duì)于某些克隆,并不能完全抑制所述3個(gè)氨基酸的截短。該效應(yīng)是克隆依賴性的,且進(jìn)一步依賴于培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)條件。所述克隆依賴性(圖9)暗示了 G-CSF信號(hào)肽序列的修飾導(dǎo)致所述SP9 G-CSF載體在很大程度上支持所述信號(hào)肽的正確切割;盡管100%的正確切割仍受制于克隆的特異性代謝。干預(yù)克隆特異性代謝的主要手段是優(yōu)化培養(yǎng)條件的應(yīng)用。用2個(gè)示例性的克隆來評(píng)估培養(yǎng)pH對(duì)G-CSF信號(hào)肽序列正確切割的影響。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的攪拌釜反應(yīng)器中培養(yǎng)這2個(gè)克隆,各反應(yīng)器確定的pH值為6. 6、6. 8、7. 0及7. 2。將含有G-CSF的上清液純化至高純度,并針對(duì)它們的氨基末端序列進(jìn)行評(píng)估(圖10和圖11)。 對(duì)于兩個(gè)示例性的克隆,都觀察到通過將G-CSF克隆的細(xì)胞培養(yǎng)的pH控制在7. 2,可以實(shí)現(xiàn)所述信號(hào)肽序列的正確加工,所述信號(hào)肽序列的正確加工使全長G-CSF的比率> 99%。所述> 99%的值與測序方法的檢測下限為相符。實(shí)施例10在一個(gè)克隆的實(shí)施例中完成不控制pH及培養(yǎng)基中含不同濃度胰島素的搖瓶培養(yǎng)。所述胰島素濃度在5mg/L胰島素到20mg/L胰島素的范圍內(nèi)變化。將含有G-CSF的上清液純化至高純度,并針對(duì)它們的氨基末端序列進(jìn)行評(píng)估(圖12)。在所評(píng)估的克隆的實(shí)施例中,可以觀察到,在不控制pH的培養(yǎng)條件下,將培養(yǎng)基中的胰島素濃度優(yōu)化至15-20mg/L 胰島素的范圍內(nèi),可引起所述信號(hào)肽序列的正確加工。 在一個(gè)克隆的實(shí)施例中,完成利用灌流模式供應(yīng)培養(yǎng)基的大規(guī)模的高細(xì)胞密度培養(yǎng)。不控制所述培養(yǎng)的PH,培養(yǎng)過程中,該pH在6. 8到7. 2之間變化。培養(yǎng)基中的胰島素濃度被調(diào)節(jié)至優(yōu)化的濃度(15mg/L胰島素)。將來自挑選出的4個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的含有G-CSF 的上清液純化至高純度,所述時(shí)間點(diǎn)為培養(yǎng)的第6、7、17及21天,并針對(duì)它們的氨基末端序列進(jìn)行評(píng)估(圖13)。所有經(jīng)分析的上清液中都實(shí)現(xiàn)了所述信號(hào)肽序列的正確加工,使得全長G-CSF的比率> 99%,而該現(xiàn)象與細(xì)胞密度和G-CSF的產(chǎn)率無關(guān)。因而,優(yōu)化的胰島素濃度(15mg/L)的應(yīng)用對(duì)于避免大規(guī)模的高細(xì)胞密度培養(yǎng)中的N端截短十分有效。
權(quán)利要求
1.一種包括信號(hào)肽和G-CSF肽的G-CSF前體,其中,所述信號(hào)肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信號(hào)肽的序列,所述序列具有至少以下突變之一-Glu29的刪除, -Glu26的插入, -LysllLeu 的取代, -His2IPhe的取代,以及 -Glu28Leu 的取代。
2.如權(quán)利要求1所述的G-CSF前體,其中,所述G-CSF前體具有至少2個(gè)、或至少3個(gè)、 或至少4個(gè)、或所有5個(gè)權(quán)利要求1所述的突變。
3.如權(quán)利要求1或2所述的G-CSF前體,其中,所述G-CSF前體在所述信號(hào)肽中至多具有另外3個(gè)突變,所述突變選自插入、刪除及取代。
4.一種編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的G-CSF前體的多核苷酸。
5.一種與權(quán)利要求4所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
6.一種包括權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸的載體。
7.一種含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸、或權(quán)利要求6所述的載體的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,其中,所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是真核細(xì)胞,優(yōu)選是人細(xì)胞,更優(yōu)選是HEK293細(xì)胞,更進(jìn)一步優(yōu)選是HEK293F細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7或8所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,其中,所述轉(zhuǎn)染是瞬時(shí)的。
10.如權(quán)利要求7或8所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,其中,所述轉(zhuǎn)染是穩(wěn)定的。
11.一種表達(dá)G-CSF的方法,所述方法包括以下步驟-在合適的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞; -從所述培養(yǎng)基中分離G-CSF。
12.如權(quán)利要求11所述的方法,其中,在pH為6.8-7. 5、優(yōu)選為7. 1-7. 3的范圍內(nèi)進(jìn)行所述培養(yǎng)。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法,其中,在胰島素濃度為5-25mg/ml、優(yōu)選為 15-25mg/ml、更優(yōu)選為15-20mg/ml的范圍內(nèi)進(jìn)行所述培養(yǎng)。
14.如權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)所述的方法,其中,所述培養(yǎng)基不含血清。
全文摘要
一種包括信號(hào)肽和G-CSF肽的G-CSF前體,其中,所述信號(hào)肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信號(hào)肽的序列,且該序列具有至少以下突變之一Glu29的刪除、Glu26的插入、Lys11Leu的取代、His21Phe的取代,以及Glu28Leu的取代。
文檔編號(hào)C07K14/535GK102164955SQ200980137913
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月2日
發(fā)明者伊麗莎白·卡薩特蒙特, 卡羅拉·施羅德, 彼得·索勒曼尼, 邁克爾·萊納爾 申請(qǐng)人:奧克塔法馬生物制藥股份有限公司