專(zhuān)利名稱(chēng)：人兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(comt)測(cè)定的制作方法
人兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶OiOMT)測(cè)定
背景技術(shù)：
COMT為存在于人體許多組織中的酶。其主要功能為使起激素和神經(jīng)遞質(zhì)作用的腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺(兒茶酚胺)失活，從而促進(jìn)從身體移除這些物質(zhì)。本發(fā)明人以前已表明該酶的細(xì)胞水平由雌激素——雌二醇調(diào)節(jié)。許多化學(xué)物質(zhì)(人造的和天然存在的)都可模擬或抑制雌二醇的作用。如果進(jìn)入人體，這樣的化學(xué)物質(zhì)可導(dǎo)致對(duì)雌二醇正常作用的干擾，并在人生命的各個(gè)階段都引起健康問(wèn)題。這些化學(xué)物質(zhì)以及影響其它激素作用和新陳代謝的其它化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為內(nèi)分泌干擾物。影響雌二醇作用的化學(xué)物質(zhì)很可能是內(nèi)分泌干擾物中最重要的一類(lèi)。它們與西方男性的精子數(shù)下降以及常見(jiàn)癌癥例如乳腺癌和卵巢癌的成因有關(guān)。本發(fā)明人已表明，多氯聯(lián)苯(PCB ；公認(rèn)對(duì)人類(lèi)健康和較大范圍的環(huán)境具有極其嚴(yán)重的威脅)和各種增塑劑及相關(guān)化學(xué)物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)COMT蛋白表達(dá)水平。這些化學(xué)物質(zhì)都不與雌二醇密切相關(guān)，但它們都通過(guò)與雌二醇相同的機(jī)理調(diào)節(jié)COMT水平(Ho等，2008a, b)。 因而，測(cè)定暴露于這樣的化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞中的COMT蛋白是對(duì)該化學(xué)物質(zhì)雌激素活性的一種衡量。從未對(duì)存在于或者可能被引入環(huán)境中的大量化學(xué)物質(zhì)評(píng)估過(guò)它們干擾內(nèi)分泌的雌激素潛能。這是因?yàn)樽鳛楣J(rèn)的內(nèi)分泌干擾試驗(yàn)的二代大鼠試驗(yàn)很耗時(shí)間且非常昂貴。歐盟頒布的法規(guī)指出存在大約30，000種必須檢驗(yàn)的化學(xué)物質(zhì)。如上所述，COMT蛋白測(cè)定可能提供干擾雌激素內(nèi)分泌潛能的衡量。測(cè)定COMT蛋白的現(xiàn)有方法慢、工作量大，且受限于樣品處理能力。例如，目前人COMT蛋白濃度的測(cè)定通過(guò)使用聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)/蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法實(shí)現(xiàn)。SDS-PAGE涉及使用包含丙烯酰胺和雙丙烯酰胺(它們?yōu)樯窠?jīng)毒的) 以及十二烷基硫酸鈉(它為肺刺激物和致敏物)的緩沖液和凝膠。盡管許多實(shí)驗(yàn)室使用商用預(yù)制凝膠和制備好的緩沖液，以使工作人員暴露于這些化學(xué)物質(zhì)的程度最小，但是它們存在于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)，并且需要執(zhí)行合適的安全規(guī)程以確保安全操作和處理。SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡法耗時(shí)、繁瑣、難以準(zhǔn)確定量、相對(duì)受限于其處理樣品的能力，因而也是高成本的。評(píng)估COMT濃度的備選方法為測(cè)定COMT活性并推斷結(jié)果。這涉及利用所述酶的放射性底物，以及伴隨它們的附帶危險(xiǎn)和處理污染物的難題。因此，需要一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)并可處理很多樣品的COMT測(cè)定法。下文所述測(cè)定法克服了這些難題，因?yàn)槠湟子谑褂谩⒘畠r(jià)并具有高樣品處理能力。因此，其特別適合作為潛在雌激素內(nèi)分泌干擾物的初始篩選系統(tǒng)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供用于測(cè)定生物培養(yǎng)物、生物組織、生物液體和環(huán)境樣品中COMT蛋白水平的簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、廉價(jià)且快速的方法。本發(fā)明的其它方面為新型抗體、多肽和多核苷酸。在另外的方面，本發(fā)明提供包含可用于測(cè)定的材料的試劑盒。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述新型表位(NE)構(gòu)建體的線性結(jié)構(gòu)。圖2闡述COMT測(cè)定的實(shí)施方案可如何進(jìn)行。圖3顯示COMT測(cè)定的實(shí)施方案如何運(yùn)作。該測(cè)定中的顏色強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知濃度樣品中的COMT濃度成反比。圖4提供新型表位(NE)的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖5顯示通過(guò)抗-NE抗體和抗-COMT抗體檢測(cè)HEK293細(xì)胞中的重組MB-COMT-NE 蛋白。圖6顯示通過(guò)抗-NE抗體和抗-COMT抗體免疫沉淀(IP)和檢測(cè)HEK293細(xì)胞中重組MB-COMT-NE蛋白的結(jié)果。圖7顯示大腸桿菌中的重組MB-COMT-NE蛋白的考馬斯藍(lán)蛋白染色。圖8顯示通過(guò)抗-NE抗體、抗-COMT抗體和抗-GST抗體檢測(cè)重組GST-MB_C0MT_NE 蛋白。圖9顯示測(cè)定抗-NE抗體親和結(jié)合至修飾NE表位的斑點(diǎn)印跡測(cè)定結(jié)果。還顯示了保守(類(lèi)別內(nèi))氨基酸取代的實(shí)例的表格，可進(jìn)行所述取代以產(chǎn)生潛在具有基本相同抗原特性(例如結(jié)合抗-NE-表位)的其它NE-表位變體。圖10顯示在MCF-7細(xì)胞裂解物中的COMT競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定的實(shí)例。圖11顯示COMT EIA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)例。序列簡(jiǎn)述SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO 引物。SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO發(fā)明詳述COMT為在鎂(Mg)存在下催化甲基從輔酶S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)移至兒茶酚的一個(gè)羥基上的遍在酶。其正常生理作用是兒茶酚胺(例如內(nèi)分泌劑、神經(jīng)遞質(zhì)劑和升壓劑)、多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素的甲基化，而甲基化是這些化合物分解代謝的一部分。以前，本發(fā)明人確認(rèn)了人COMT基因的轉(zhuǎn)錄由雌二醇以涉及雌二醇α-受體的非經(jīng)典方式強(qiáng)而有效地調(diào)節(jié)(Xie等，1999 Jiang等，200 。COMT可能在包括雌激素誘導(dǎo)的癌癥、 帕金森病、抑郁癥、精神分裂癥和高血壓(Bonifcicio等，2007 ；Tom等，1998 ；Lewandowski, 2007 ；Houston, 2007)在內(nèi)的不同人類(lèi)病癥的病理生理學(xué)中起重要。這是因?yàn)镃OMT甲基化其它底物，例如兒茶酚雌激素(例如致癌的4-羥基雌二醇)、黑色素新陳代謝中的吲哚中間體、生物異源兒茶酚(例如致癌的類(lèi)黃酮)以及藥物(例如左旋多巴)。另外，COMT的表達(dá)不僅受雌二醇的影響，還受化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大但具有模擬或拮抗雌二醇作用的能力的化合物的影響。在該類(lèi)別中的化合物為例如多氯聯(lián)苯(PCB)和增塑劑例如鄰苯二甲酸二異己基酯以及相關(guān)化合物例如辛基苯酚(Ho等，2008a，b)。此外，應(yīng)注
:1為18個(gè)氨基酸的新型表位(NE)。2為用于含BamHI限制位點(diǎn)的人S-COMT cDNA的正向引物。3為用于含BamHI限制位點(diǎn)的人MB-COMT cDNA的正向引物。4為用于編碼NE序列和EcoRI限制位點(diǎn)的S-COMT和MB-COMT的反向5為用于含BamHI限制位點(diǎn)的COMT-表位的正向引物。6為用于COMT-表位并編碼NE序列和EcoRI限制位點(diǎn)的反向引物。7為人COMT的殘基80-98，其為MB-同工型和S-同工型所共有。8為18個(gè)氨基酸的新型表位(NE)的變體#1。9為18個(gè)氨基酸的新型表位(NE)的變體#2。
:10為18個(gè)氨基酸的新型表位(NE)的變體#3。意到的是，人基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通常是復(fù)雜的，且其它非雌激素物質(zhì)也可能夠通過(guò)其它直接和間接途徑來(lái)充分調(diào)節(jié)COMT基因的轉(zhuǎn)錄。在動(dòng)物和人的不同生理狀態(tài)下都發(fā)現(xiàn)COMT活性的改變。COMT在腫瘤形成中可能起病因作用(Ho等，2008a, b ；Thompson等，2000)。該測(cè)定可用于測(cè)量來(lái)自各種組織和細(xì)胞的提取物以及體液中的人COMT蛋白濃度。因?yàn)楦鞣NCOMT誘導(dǎo)物和抑制劑(例如異源雌激素(xenoestrogen)和現(xiàn)有藥物(例如用于治療帕金森病的恩他卡朋(Entacapone)和托卡朋(Tolcapone)))以及作為不良事件影響COMT表達(dá)的藥物可影響COMT表達(dá)，所以該測(cè)定可用于評(píng)估這樣的化合物的作用。如上所述，作為環(huán)境污染物存在的多種化合物例如PCB、增塑劑和異源雌激素影響COMT表達(dá) (Ho等，2008a，b)。因而該測(cè)定還可用于評(píng)估這樣的化合物的作用。此外，環(huán)保主義者對(duì)工業(yè)污染物影響日益增加的擔(dān)憂(yōu)已促使歐盟通過(guò)立法(生效于2008年(REACH法規(guī)))要求制造商評(píng)估其工藝中所用化學(xué)物質(zhì)干擾內(nèi)分泌的作用。目前，名單達(dá)到約30，000種化學(xué)物質(zhì)。COMT測(cè)定連同表達(dá)COMT和雌二醇受體的人細(xì)胞系(例如MCF-7細(xì)胞)將提供廉價(jià)的雌激素活性初篩。本發(fā)明人的研究使COMT測(cè)定以及對(duì)人COMT基因調(diào)節(jié)的詳細(xì)研究(Xie等，1999 ； Jiang等，200 與闡明涉及自發(fā)性帕金森病病因的因素相關(guān)聯(lián)，以試圖解釋與女性相比該疾病發(fā)病率稍微偏向男性的原因。這已引起對(duì)使用COMT測(cè)定以評(píng)估內(nèi)分泌干擾物潛能的可能性的認(rèn)識(shí)(Ho等，2008a，b)。本發(fā)明的ELISA易于使用。其具有高度的特異性和靈敏度，測(cè)定內(nèi)和測(cè)定間變異系數(shù)小，并且利用對(duì)人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)低且容易處理的化學(xué)物質(zhì)。因此，其成本效益比低。其在樣品處理方面靈活，并且可用于處理少量或大量的樣品。這實(shí)現(xiàn)首次獲得以低成本且簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確地在大量樣品中測(cè)量人COMT蛋白表達(dá)的能力。本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了與任何人類(lèi)蛋白均不具有同源性(<30% )的新型18個(gè)氨基酸的肽序列(新型表位，NE)(圖1)，并將其作為蛋白檢測(cè)的標(biāo)記克隆至天然COMT中。關(guān)于測(cè)定如何運(yùn)作的實(shí)例示于圖2和圖3中。已制備了兩種抗體(抗-COMT和抗-NE)(其中一種為獨(dú)特的(抗-NE))和兩種蛋白(C0MT和C0MT-NE)(其中一種為獨(dú)特的(COMT-NE))。使用 COMT-NE的備選方式是使用COMT-表位-NE。用于洗滌和顯色的各種化學(xué)物質(zhì)以及帶有綴合至抗體的酶的第三抗體(例如HRP綴合的抗-IgG)可購(gòu)自許多供應(yīng)商。它們?yōu)橥ǔ？色@得的。測(cè)定的優(yōu)選實(shí)施方案可使用塑料96孔板，其中用預(yù)定固定量的抗-COMT包被孔，所述抗-COMT結(jié)合至各個(gè)孔的底部。在8個(gè)孔中加入預(yù)定固定量的COMT和固定量的C0MT-NE， 使得可從這些孔得到的結(jié)果制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。在剩余的孔中加入固定量的COMT-NE和未知 COMT濃度的樣品。標(biāo)準(zhǔn)COMT孔顯現(xiàn)的顏色使剩余孔中COMT的未知濃度得以被測(cè)定。進(jìn)行測(cè)定的步驟示于圖2。顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中的COMT蛋白濃度成反比(圖3)。在某些實(shí)施方案中，用于定性或定量檢測(cè)樣品中的兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT) 的方法包括a)提供帶有預(yù)定量的抗-COMT抗體的包被表面；b)使樣品與包被表面接觸，以使樣品中可能存在的COMT結(jié)合至包被表面；c)使預(yù)定量的可檢測(cè)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)重組COMT-NE綴合物(S_C0MT_NE)與包被表面接觸，以結(jié)合至包被表面；
d)使抗-NE抗體接觸包被表面，其中當(dāng)S-COMT-NE已預(yù)先結(jié)合至包被表面的抗-COMT抗體時(shí)，抗-NE抗體結(jié)合至S-COMT-NE上的NE表位；e)使包被表面與酶標(biāo)記抗體接觸，其中當(dāng)抗-NE抗體已預(yù)先結(jié)合至與抗-COMT抗體結(jié)合的S-COMT-NE時(shí)，酶標(biāo)記抗體結(jié)合至抗-NE抗體；f)使包被表面與指示結(jié)合至包被表面的酶標(biāo)記抗體的存在情況的化學(xué)酶標(biāo)記指示劑接觸；以及g)基于結(jié)合至包被表面的酶標(biāo)記抗體的存在情況或量，確定樣品中COMT的存在情況或樣品中存在的COMT的量。由于COMT蛋白水平可被COMT誘導(dǎo)物和抑制劑以及其它化合物例如異源雌激素、 PCB和增塑劑改變(Ho等，2008a, b)，因此本發(fā)明可用于以快速且簡(jiǎn)單的方式測(cè)定這樣的化合物的作用。本發(fā)明的方法可使用用于定性或定量檢測(cè)樣品中COMT的診斷試劑盒進(jìn)行。作為實(shí)例，試劑盒可包含COMT特異性結(jié)合劑(例如抗體)。試劑盒還可包含一種或多種其它組分，例如固相支持體(例如微量滴定多孔板)、標(biāo)準(zhǔn)品、測(cè)定稀釋液、洗滌緩沖液、粘合蓋板和/或使用試劑盒實(shí)施本發(fā)明方法的說(shuō)明書(shū)(例如印刷資料或壓印的)。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含抗-NE和/或COMT-NE以及抗-NE和/或COMT-NE的使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的試劑盒還可在一個(gè)或多個(gè)容器中包含用于本文所述方法的試劑。試劑盒可單獨(dú)或組合地包含特定的內(nèi)部對(duì)照和/或探針(probe)、緩沖液和/或賦形劑。每種試劑以適于存量?jī)?chǔ)存的固體形式或液體緩沖液提供。試劑盒還可包含用于從例如宿主生物體或環(huán)境樣品獲得樣品的工具。本發(fā)明提供用于測(cè)定目標(biāo)樣品例如生物培養(yǎng)物、組織提取物、生物液體和環(huán)境樣品中的COMT蛋白水平的簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、廉價(jià)且快速的方法。目前測(cè)定人COMT濃度的方法包括繁瑣的聚丙烯酰胺電泳/蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法和放射性酶學(xué)測(cè)定法。本新型ELISA測(cè)定法將代替這些復(fù)雜且耗時(shí)的現(xiàn)有方法。實(shí)施例1 免疫肽(新型表位，NE)的設(shè)計(jì)和制備1.產(chǎn)生隨機(jī)的18-氨基酸肽序列，其在氨基末端以“酪氨酸(Tyr) ”開(kāi)始，并由以下所列10種親水氨基酸組成蘇氨酸(Thr)、絲氨酸Ger)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、 谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、賴(lài)氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)。2.使用可獲得自 http://www. ncbi. nlm. nih. rov/Renome/seq/BlastGen/ BlastGen. cri ？ tax id = 9606的公眾可用的程序(BLAST)進(jìn)行基于計(jì)算機(jī)的搜索，以確保所產(chǎn)生的肽序列與任何人蛋白均不具有同源性(至少< 30% )。3. " 吏用http //npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa automat, pi ？ page =npsa nn. html (Institut de Biologie et Chimie des Proteines, France)的計(jì)算機(jī)程序"HNN Secondary Structure Prediction Method (HNN 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法)，，對(duì)肽可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以尋找具有最無(wú)序二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽(圖4)。選擇具有以下序列的18-聚體“TKENPRSNQEESYDDNES" (SEQ ID NO :1)。4.通過(guò)“Alta Bioscience, United Kingdom，，合成并純化具有設(shè)計(jì)序列的肽用于免疫以產(chǎn)生和純化特異性抗體，并將該肽命名為NE (新型表位)。5.將對(duì)應(yīng)于NE的cDNA序列遺傳地綴合至真核系統(tǒng)或細(xì)菌系統(tǒng)的蛋白表達(dá)載體中
7的目標(biāo)人COMT基因中。實(shí)施例2 =COMT和NE抗體生產(chǎn)i.免疫接種動(dòng)物產(chǎn)生NE抗體在動(dòng)物(例如新西蘭兔)中針對(duì)全長(zhǎng)新型合成表位(NE)產(chǎn)生NE抗體。如(Kyte 和Doolittle，1982)所述，利用蛋白的親水性分析選擇這些表位。使用多位點(diǎn)注射方案用該抗原多賴(lài)氨酸肽和弗氏佐劑注射動(dòng)物。在初次免疫6周后從動(dòng)物中取全血樣品，并檢驗(yàn) NE抗體的存在情況。以每月一次的間隔重復(fù)注射，直至產(chǎn)生假定的抗體。ii.人COMT抗體的免疫接種和親和純化如我們先前的出版物(Jiang等，2003)中所述，在動(dòng)物(例如綿羊)中針對(duì)人COMT 肽的線性表位產(chǎn)生COMT抗體。利用蛋白的親水性圖(Kyte和Doolittle，1982)選擇對(duì)應(yīng)于殘基80-98 (DTYCEQKEWAMNV⑶KKGK) (SEQ ID NO 7)的寡肽，該寡肽為COMT的MB-同工型和S-同工型所共有。1.使用多位點(diǎn)注射方案用在賴(lài)氨酸網(wǎng)(lysine web)上的該抗原肽和弗氏佐劑注射綿羊。2.在初次免疫2個(gè)月后從綿羊中取全血樣品，并在單向放射免疫-擴(kuò)散測(cè)定中使用該線性抗原肽作為參比抗原檢驗(yàn)COMT抗體的存在情況。以每月一次的間隔重復(fù)注射，直至產(chǎn)生抗體。3.自動(dòng)物中收集抗血清后，將其用pH 8. 0、含25mM NaCl和0. 02% NaR的20mM Tris-HCl透析過(guò)夜。于室溫恒定攪拌下，將所產(chǎn)生的抗血清與抗原肽一起在受控孔玻璃珠 (Iml)上保溫1小時(shí)。4.將珠粒與抗血清注入小色譜柱(5ml)中。在從珠粒中排出液體后，將柱用pH 5.3的磷酸緩沖鹽溶液(IOOml)洗脫，直至洗脫液中檢測(cè)不到蛋白。5.最后，將柱用IOX Iml等分的0. IM pH 2. 3的甘氨酸緩沖液洗脫。立即調(diào)節(jié)每毫升的洗脫液至PH 7，然后將具有最高蛋白濃度的流分合并。iii. NE抗體的提取和純化1.在從動(dòng)物中收集抗血清后，將其用pH 8. 0、含25mM NaCl和0. 02% NaN3的20mM Tris-HCl透析過(guò)夜。將透析后的抗血清上樣到DEAE柱中，每個(gè)柱的大小為血清體積的5 倍。將 DEAE 柱用 3 倍床體積的 20mM Tris-HCl，pH 8. 0，25mM NaCl 和 0. 02% NaN3 洗滌。 收集IgG峰(在^Onm吸光度下從柱中出現(xiàn)的首個(gè)峰)。2.于室溫恒定攪拌下，將等分的兔IgG(IOml)與合成的抗原肽一起在受控孔玻璃珠(Iml)上保溫1小時(shí)(hr)。3.將珠粒和兔IgG注入小柱(5ml)中。在從珠粒中排出所有液體后，將珠粒用pH 7. 0的PBS(IOOml)洗滌，直至洗脫液的UV吸光度O80nm)類(lèi)似于PBS的。4.最后，將柱用IOX Iml等分的pH 2. 5的0. IM甘氨酸洗脫。立即用IM Tris調(diào)節(jié)每個(gè)洗脫流分至PH 7.0。將含最高蛋白濃度的流分合并。iv. NE抗體的表征以?xún)煞N方式實(shí)現(xiàn)抗體的表征。首先，在兔中產(chǎn)生抗體，因此該抗體最初與該動(dòng)物在其壽命期間所產(chǎn)生的所有其它抗體一起存在于血清中。如上節(jié)所述，通過(guò)其與附著于控制孔玻璃珠的NE抗原結(jié)合的能力，將該抗體從該高度復(fù)雜的抗體混合物中純化出來(lái)。這種至抗原的結(jié)合與徹底洗脫同時(shí)發(fā)生，徹底洗脫除去包括其它非NE抗體的其它血清蛋白。其次，通過(guò)SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡法檢驗(yàn)純化的抗體。將純化的抗-NE用作第一檢測(cè)抗體，對(duì)來(lái)自?xún)煞N類(lèi)型的HEK293細(xì)胞的提取物進(jìn)行SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡。第一種類(lèi)型的HEK293細(xì)胞為普遍可獲得的野生型。這些細(xì)胞容易表達(dá)COMT蛋白，其易被在SDS-PAGE/ 蛋白質(zhì)印跡中用作第一抗體的抗-COMT抗體檢測(cè)到(Jiang等，200 。第二種類(lèi)型的HEK293 細(xì)胞已被遺傳改造為表達(dá)COMT-NE蛋白。當(dāng)將純化的抗-NE用作第一檢測(cè)抗體時(shí)，在蛋白質(zhì)印跡上僅檢測(cè)到COMT-NE蛋白，而檢測(cè)不到存在于正常HEK293提取物中的COMT或任何其它蛋白(圖5)。NE抗體的特異性通過(guò)免疫吸附后對(duì)COMT和NE表位的交叉檢測(cè)來(lái)評(píng)估。由連接至瓊脂糖蛋白G的抗-COMT抗體結(jié)合的蛋白與抗-NE發(fā)生交叉反應(yīng)，反之亦然。將來(lái)自過(guò)表達(dá)COMT-NE的HEK293細(xì)胞的總細(xì)胞裂解物與COMT抗體在4°C下保溫過(guò)夜以形成免疫復(fù)合體，從而捕獲內(nèi)源性COMT和COMT-NE蛋白兩者。來(lái)自無(wú)COMT-NE表達(dá)的野生型HEK293細(xì)胞的裂解物作為陰性對(duì)照平行進(jìn)行。當(dāng)該COMT-NE蛋白從瓊脂糖蛋白G-抗-COMT解吸附后，在利用SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡對(duì)其進(jìn)行分析時(shí)，該COMT-NE蛋白與抗-NE交叉反應(yīng)(圖 6)。最后，當(dāng)將來(lái)自未用NE抗原免疫接種的兔的兔抗體用作SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡中的第一檢測(cè)抗體時(shí)，使用正常HEK293提取物或遺傳改造的HEK293提取物檢測(cè)不到條帶。因此，當(dāng)暴露于HEK293細(xì)胞提取物中存在的所有蛋白時(shí)，純化的兔抗體僅檢測(cè) C0MT-NE，并且如上所述，只有來(lái)自用NE抗原免疫的兔的抗體才能檢測(cè)改造為具有NE的 COMT蛋白。實(shí)施例3 人COMT-NE重組蛋白的制備1 COMT 是指全長(zhǎng)的 S-COMT 和 MB-C0MT 兩者；2 COMT-表位是指抗-COMT抗體所識(shí)別的19-氨基酸片段(SEQ ID NO 7)。i.全長(zhǎng)人COMT-NE的分子克隆按照制造商的方案，使用專(zhuān)門(mén)為在人COMT的3’ -端插入NE cDNA片段設(shè)計(jì)的引物對(duì)，通過(guò)一步RT-PCR(Titan One Tube RT-PCR Kit, Roche)由分離自人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系(CRL-2^6 ；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection (ATCC)))的總 RNA 產(chǎn)生全長(zhǎng)人 COMT cDNA。為產(chǎn)生用于定向克隆到表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3. 1(+) Jnvitrogen或pGEX_6pl ；GE Healthcare)中的BamHI-COMT-NE-EcoRI cDNA片段，通過(guò)二次PCR插入限制酶切位點(diǎn) (BamHI和EcoRI)，所述二次PCR使用用于含BamHI限制位點(diǎn)的人S-COMT的正向引物(5’_C GCGGATCCGCCACCATGGGTGACACCAAGGAGCAGCGC-3，) (SEQ ID NO :2)或用于人 MB-C0MT 的正向引物(5，-CGCGGATCCGCCACCATGCCGGAGGCCCCGCCTCTGC-3’ ) (SEQ ID NO :3)以及含 NE 序列和 EcoRI 限制位點(diǎn)的反向引物(5，-CTGGAATTCTCAGCTTTCGTTATCATCATAGCTTTCTTCCTGGTT GCTACGCGGGTTTTCTTTGGTGGGCCCTGCTTCGCTGCCTGGGC-3’ ) (SEQ ID NO :4)。將COMT DNA 插入物(BamHI-COMT-NE-EcoRI)和空載體(pcDNA3. 1 (+)或 pGEX-6pl)分別通過(guò)過(guò)量限制酶(BamHI和EcoRI)于37°C下消化lhr。在這之后，將消化的混合物通過(guò)1. 3%瓊脂糖凝膠電泳在IOOV下持續(xù)Ihr進(jìn)行分析。將對(duì)應(yīng)于COMT-NE 的所得片段切下并純化(Gel Extraction Kit，Viogene)，然后使用T4DNA連接酶連接至pcDNA3. 1 (+)或pGEX-6pl載體。在4°C下保溫過(guò)夜進(jìn)行連接反應(yīng)。ii. COMT-表位-NE的分子克隆通過(guò)PCR從人COMT cDNA產(chǎn)生用于定向克隆到表達(dá)質(zhì)粒(pGEX_6pl ； GE Healthcare)中的 COMT-表位-NE 插入物(BamHI-COMT-表位-NE-EcoRI)，所述人 COMT cDNA來(lái)自從人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系分離的總RNA。通過(guò)二次PCR插入限制酶切位點(diǎn)(BamHI和EcoRI)，所述二次PCR使用用于含BamHI限制位點(diǎn)的COMT-表位的正向引物(5，-CGCGGATCCAGCGTGCTGGAGGCCATTGAC-3，) (SEQ ID NO 5)和含 NE 序列和 EcoRI 限制位點(diǎn)的反向引物(5，-CTGGAATTCTCAGCTTTCGTTATCATCATAGCTTTCTTCCTGGTTGCTACGCGGGTT TTCTTTGGTAATCACGGCGTCCACGATCTTGCC-3，)(SEQ ID NO :6)。COMT-表位對(duì)應(yīng)于人 COMT 殘基 80-98 (DTYCEQKEWAMNVGDKKGK) (SEQ ID NO :7)，其為 MB-同工型和 S-同工型所共有。理想的是，使用NE-表位-“TKENPRSNQEESYDDNES”(SEQ ID NO 1),但任選的是，可使用變體， 只要抗-NE-表位仍結(jié)合變體即可。這樣的變體可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生，并且特征在于具有保守氨基酸取代，其不會(huì)特異地改變18-聚體的抗原特性。例如，在蛋白和肽中不常見(jiàn)或從未出現(xiàn)的氨基酸以及合成氨基酸可取代NE-表位的氨基酸，只要具有取代氨基酸的NE-表位基本上仍保留與氨基酸未被取代的NE-表位相同的抗原特性即可。在蛋白和肽中不常見(jiàn)或從未出現(xiàn)的氨基酸以及合成氨基酸的實(shí)例通常包括但不限于鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、羥脯氨酸、高絲氨酸、苯基甘氨酸、?；撬?、碘化酪氨酸、2，4_ 二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、 3-氨基丙酸、正亮氨酸、正纈氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β -丙氨酸、氟代氨基酸、設(shè)計(jì)氨基酸(designer amino acid)(例如β -甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸)以及氨基酸類(lèi)似物。在蛋白和肽中不常見(jiàn)或從未出現(xiàn)的氨基酸以及合成氨基酸還包括具有衍生側(cè)基的氨基酸。此外， 蛋白中的任何氨基酸可為D (右旋)型或L(左旋)型。本發(fā)明NE-表位的蛋白序列的等位變體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。氨基酸通?？煞殖梢韵骂?lèi)別非極性、不帶電荷的極性、堿性和酸性。其中本發(fā)明 NE-表位的某一類(lèi)別的氨基酸被相同類(lèi)別的另一種氨基酸置換的保守取代落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要具有取代的NE-表位基本上仍保留與不具有取代的NE-表位相同的抗原特性 (例如結(jié)合至抗-NE-表位)即可。在本發(fā)明范圍之內(nèi)考慮編碼在序列中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的NE-表位的分離多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼NE-表位變體的分離的多核苷酸包括以下核酸序列其能在嚴(yán)格條件下與編碼NE-表位的核酸序列雜交，并且編碼與針對(duì)NE-表位的抗體結(jié)合的NE-表位變體。下表1提供屬于各個(gè)類(lèi)別的氨基酸實(shí)例的列表。
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權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含(1)具有TKENPRSNQEESYDDNES的氨基酸序列的NE-表位，或者(2)與針對(duì)NE-表位的抗體結(jié)合的NE-表位變體，其中所述NE-表位變體與NE-表位的序列具有至少約60% -80%、優(yōu)選約80% -90%、更優(yōu)選約90% -95%的序列同一性；或者所述NE-表位變體通過(guò)氨基酸序列中的一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失或插入衍生自 NE-表位。
2.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽包含NE-表位。
3.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽還包含COMT-表位。
4.權(quán)利要求3的多肽，所述多肽為MB-C0MT-NE。
5.權(quán)利要求3的多肽，所述多肽為S-C0MT-NE。
6.一種針對(duì)如權(quán)利要求1所限定的NE-表位或其變體的抗體。
7.一種包括權(quán)利要求6的抗體的測(cè)定。
8.一種包括權(quán)利要求1的多肽的測(cè)定。
9.一種包括權(quán)利要求2的多肽的測(cè)定。
10.一種包括權(quán)利要求3的多肽的測(cè)定。
11.一種包括權(quán)利要求4的多肽的測(cè)定。
12.一種包括權(quán)利要求5的多肽的測(cè)定。
13.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)編碼具有TKENPRSNQEESYDDNES氨基酸序列的NE-表位的核酸序列，(2)編碼與針對(duì)NE-表位的抗體結(jié)合的NE-表位變體的核酸序列，其中所述NE-表位變體與NE-表位的序列具有至少約60% -80%、優(yōu)選約80% -90%,更優(yōu)選約90% -95%的序列同一性；或所述NE-表位變體通過(guò)氨基酸序列中的一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失或插入衍生自NE-表位，或者(3)以下核酸序列其在嚴(yán)格條件下與(1)或O)中限定的核酸序列雜交，并且編碼與針對(duì)NE-表位的抗體結(jié)合的NE-表位變體。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼NE-表位的序列。
15.權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸還包含編碼COMT-表位的序列。
16.權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼MB-COMT-NE的序列。
17.權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼S-COMT-NE的序列。
18.一種用于檢測(cè)樣品中的COMT的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求6的抗體和所述抗體的使用說(shuō)明書(shū)。
19.一種用于檢測(cè)樣品中的COMT的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求2的多肽和所述多肽的使用說(shuō)明書(shū)。
20.一種用于定性或定量檢測(cè)樣品中的兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的方法，所述方法包括a)提供用預(yù)定量的抗-COMT抗體包被的表面；b)使樣品與所述包被表面接觸，以使樣品中可能存在的COMT結(jié)合至所述包被表面；c)使預(yù)定量的可檢測(cè)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)重組COMT-NE綴合物(S-COMT-NE)與所述包被表面接觸，以結(jié)合至所述包被表面；d)使抗-NE抗體與所述包被表面接觸，其中當(dāng)S-COMT-NE已預(yù)先結(jié)合至所述包被表面的抗-COMT抗體時(shí)，抗-NE抗體結(jié)合至S-COMT-NE上的NE表位；e)使所述包被表面與酶標(biāo)記抗體接觸，其中當(dāng)抗-NE抗體已預(yù)先結(jié)合至與抗-COMT抗體結(jié)合的S-COMT-NE時(shí)，所述酶標(biāo)記抗體結(jié)合至抗-NE抗體；f)使所述包被表面與指示結(jié)合至所述包被表面的所述酶標(biāo)記抗體的存在情況的化學(xué)酶標(biāo)記指示劑接觸；以及g)基于結(jié)合至所述包被表面的酶標(biāo)記抗體的存在情況或量，確定樣品中COMT的存在情況或樣品中存在的COMT的量。
21.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的分離的多肽或權(quán)利要求6的抗體在制備用于檢測(cè)樣品中的COMT的試劑盒中的用途。
全文摘要
本文公開(kāi)了定量樣品中兒茶酚胺-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)蛋白的量的測(cè)定(測(cè)定法)，所述樣品為例如來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物、體液、組織的提取物以及環(huán)境樣品。其在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA系統(tǒng)中將新型試劑(抗-NE、COMT-NE或COMT-表位-NE)與先前所述的兩種試劑(抗-COMT和COMT)聯(lián)合使用以實(shí)現(xiàn)此目的。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102203119SQ200980138401
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者D·B·拉姆斯登, 何樹(shù)良, 何永樂(lè) 申請(qǐng)人:香港大學(xué)