專利名稱：肽、pna或寡核苷酸的耐溶劑滲濾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備化合物、特別是選自肽、寡核苷酸和肽核酸的化合物的方法。
背景技術(shù)：
肽、寡核苷酸和肽核酸是生物學(xué)上的重要分子，包括由不同重復(fù)單元組成的聚合物。就肽而言，重復(fù)單元是氨基酸或其衍生物，而就寡核苷酸而言，重復(fù)單元是核苷酸或其衍生物。寡核苷酸可進(jìn)一步分成RNA寡核苷酸和DNA寡核苷酸，正如為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，參見例如 P. S. Millar,Bioconjugate Chemistry，1990，第 1 卷，第 187-191 頁。就肽核酸(PNA)而言，骨架由通過肽鍵連接的重復(fù)的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成。各種各樣的嘌呤堿基和嘧啶堿基通過亞甲基羰基鍵連接到骨架上。肽中氨基酸的序列、RNA中 RNA核苷酸的序列或DNA中DNA核苷酸的序列、或PNA中嘌呤堿基和嘧啶堿基的序列，決定生物系統(tǒng)中所述化合物的功能與作用。所述化合物通過將其重復(fù)單元偶聯(lián)在一起而合成，以得到特定序列?？墒褂帽Ｗo(hù)基在一個或更多個反應(yīng)位點(diǎn)上保護(hù)重復(fù)單元，以將偶聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)向被保護(hù)重復(fù)單元上的特定位點(diǎn)。在偶聯(lián)反應(yīng)之后可能需要脫保護(hù)反應(yīng)，以除去保護(hù)基并為隨后的偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備化合物。合成按周期順序發(fā)生，每個周期包括偶聯(lián)反應(yīng)和緊接著的脫保護(hù)反應(yīng)。在反應(yīng)之間，將過量試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物的痕跡去除至非常低的水平對于預(yù)防重復(fù)單元序列中形成的錯誤序列是必要的。當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)在液相中進(jìn)行時，該純化通常是冗長的，而且通過耗時的沉淀、結(jié)晶或色譜操作來實(shí)現(xiàn)?？色@得的用于肽、寡核苷酸和肽核酸偶聯(lián)和脫保護(hù)的化學(xué)和方法已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)記載。肽合成于1963年由于固相合成的出現(xiàn)(Merrifield RB J Am Chem Soc 8.5， (1963)2149)而得到變革。在這種方法中，序列中第一個氨基酸結(jié)合到樹脂珠上。隨后的氨基酸被偶聯(lián)到結(jié)合于樹脂的肽上，最后，當(dāng)所需肽已經(jīng)生長時，將其從樹脂上切下。重要的是，在每個偶聯(lián)反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)結(jié)束時，殘留的未反應(yīng)的受保護(hù)氨基酸、過量試劑和其他副產(chǎn)物可通過洗滌除去，包括在過濾器上洗滌樹脂，或用溶劑沖洗樹脂的填充床。固相肽合成現(xiàn)在是實(shí)驗(yàn)室和商業(yè)合成的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。寡核苷酸的合成遵循與肽相似的技術(shù)發(fā)展，如 Sanghvi，YS，Org Proc Res & Dev 4(2000) 168-169所描述的，并且依賴于固相合成，其中第一個寡核苷酸被連接到固相上。其他寡核苷酸通過偶聯(lián)反應(yīng)和脫保護(hù)反應(yīng)的循環(huán)而連接， 在反應(yīng)之間通過洗滌，包括在過濾器上洗滌樹脂，或用溶劑沖洗樹脂的填充床來進(jìn)行純化。膜法在分離科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，可適用于液相和氣相中一系列不同分子量樣品的分離(參見例如"Membrane Technology “于 Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,第4版1993，第16卷，第135-193頁)。納米過濾是使用膜的膜法，膜孔在0. 5 至5納米的范圍內(nèi)，且具有200-3，000道爾頓的MW截止值。納米過濾已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水性流體的過濾，但由于缺少適當(dāng)?shù)娜軇┓€(wěn)定性膜而尚未廣泛應(yīng)用于有機(jī)溶劑中溶質(zhì)的分離。 超濾膜通常具有的MW截止值在1，000至500，000道爾頓的范圍內(nèi)。最近已發(fā)展了新種類的膜，其甚至在最困難的溶劑中穩(wěn)定，如P. Vandezande, L. Ε. M. Gevers和I. F. J. Vankelecom Chem. Soc. Rev.，(2008)，第37卷，第365-405頁中所報道。這些膜可以是高分子膜或陶瓷膜、或混合基質(zhì)無機(jī)/有機(jī)膜。滲濾是液體過濾法，在該方法中，包含至少兩種溶質(zhì)的料液與膜接觸，并經(jīng)加壓以使液體的某些組分通過膜，其中至少一種溶質(zhì)比至少一種其他溶質(zhì)對膜具有更高的排斥。 將額外的液體送入膜的加壓側(cè)以補(bǔ)償透過膜的液體。滲透物和保留物中更高度保留的溶質(zhì)的濃度與保留較少的溶質(zhì)的濃度之間的比例發(fā)生動態(tài)變化，在保留物中提高而在滲透物中下降。膜分離對肽合成的應(yīng)用已被報道用于經(jīng)生物合成產(chǎn)生肽的再濃縮，如suru T， Nakao S, Kimura S, Shutou T,Sep. Sci. and Technol.，第四卷，(1994)，第 971-984 頁中所描述，或從水溶液中回收氨基酸，如Li S，Li C，Lui Y，等人，J.Mem. Sci.，第222卷0003)， 第 191-201 頁或 Wang X，Ying A, Wang W, J. Mem. Sci.，第 196 卷(2002)第 59-67 頁中報道。在US 3，772，264中報道了在肽合成過程中應(yīng)用膜從過量試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物中分離生長的肽。肽在液相中合成，以聚(乙二醇)(PEG)作為分子錨定基，用水相超濾實(shí)現(xiàn)從雜質(zhì)中分離出生長的肽鏈。所述分離需要在每個偶聯(lián)步驟之后蒸發(fā)有機(jī)溶劑、中和、然后在每次脫保護(hù)之后進(jìn)行蒸發(fā)，然后為了偶聯(lián)或脫保護(hù)，在超濾之前從水溶液中吸收水。然后，在將 PEG錨定肽再溶解到有機(jī)溶劑中以進(jìn)行下一偶聯(lián)或脫保護(hù)步驟之前，通過蒸發(fā)和/或共沸蒸餾除去水。從商業(yè)角度看，該方法的復(fù)雜性使其不合乎需要。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供用于制備選自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法；該方法包括(i)合成所述第一化合物；和(ii)分離步驟(i)中形成的第一化合物與第二化合物，該第二個化合物是第一個化合物合成的反應(yīng)副產(chǎn)物和/或用于合成第一化合物的過量試劑，其中第一和第二化合物溶解于有機(jī)溶劑中并通過使用膜的滲濾法分離，其中該膜在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，且對第一化合物提供的排斥大于對第二化合物的排斥。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于在有機(jī)溶劑中分離第一化合物與第二化合物的方法，其中(i)將第一化合物和第二化合物都溶解于所述有機(jī)溶劑中；(ii)第一化合物選自肽、寡核苷酸和肽核酸；且(iii)第二化合物是形成第一化合物反應(yīng)的副產(chǎn)物和/或用于所述反應(yīng)的試劑；其中所述分離通過使用膜的滲濾法進(jìn)行，該膜在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，且對第一化合物提供的排斥大于對第二化合物的排斥。附圖簡述

圖1顯示了從Ap A2和A3的重復(fù)單元合成肽(ρ印tide)、寡核苷酸 (oligonucleotide)或肽核酸(peptide nucleic acid)(在圖中統(tǒng)稱為"tide")的通用方法。圖2顯示了膜增強(qiáng)的肽合成的示意圖。圖3顯示了實(shí)施例2和3中描述的用于膜增強(qiáng)的肽合成的設(shè)備，和實(shí)施例4中描述的用于寡核苷酸合成的設(shè)備。圖4顯示實(shí)施例1中產(chǎn)生的五肽的HPLC色譜數(shù)據(jù)。
圖5顯示實(shí)施例1中產(chǎn)生的五肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖6顯示實(shí)施例2中產(chǎn)生的五肽的HPLC色譜數(shù)據(jù)。圖7顯示實(shí)施例2中產(chǎn)生的五肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖8顯示實(shí)施例3中產(chǎn)生的五肽的HPLC數(shù)據(jù)。圖9顯示實(shí)施例3中產(chǎn)生的五肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖10顯示實(shí)施例4中產(chǎn)生的二聚寡核苷酸的NMR數(shù)據(jù)。圖11顯示實(shí)施例4中產(chǎn)生的二聚寡核苷酸的NMR數(shù)據(jù)。各種實(shí)施方案的描述本文所使用的術(shù)語“肽”另外包括肽衍生物。肽衍生物的實(shí)例為包含一個或更多個合成的或化學(xué)修飾的氨基酸、一個或更多個保護(hù)基或位于肽鏈一端或兩端的端基的肽。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，肽包含小于200個氨基酸殘基。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，肽包含小于100個氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，肽包含小于50個氨基酸殘基。本文所使用的術(shù)語“寡核苷酸”另外包括寡核苷酸衍生物，例如包含一個或更多個合成的或化學(xué)修飾的寡核苷酸、一個或更多個保護(hù)基，或一個或更多個位于寡核苷酸鏈末端的端基的寡核苷酸。本文所使用的術(shù)語“肽核酸”或“PNA”另外包括肽核酸衍生物，例如包含一個或更多個化學(xué)修飾的嘌呤堿基或嘧啶堿基、一個或更多個保護(hù)基、或一個或更多個位于肽核酸鏈末端的端基的肽核酸。依照本發(fā)明，第一化合物通過滲濾與第二化合物分離。滲濾可以兩種操作模式進(jìn)行。第一種操作模式是恒定容量滲濾，其中新鮮溶劑被送入滲濾系統(tǒng)，其進(jìn)料速率與滲透物從系統(tǒng)中排出的速率相同，從而維持系統(tǒng)中的恒定容量。第二種操作模式是可變?nèi)萘繚B濾， 其中過濾容量通過從系統(tǒng)中排出滲透物而減少，且在額外滲透物被排出之前定期向系統(tǒng)加入新鮮溶劑以增加系統(tǒng)容量。適當(dāng)?shù)氖?，第一化合物具有大?00道爾頓的分子量。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，第一化合物具有大于300道爾頓的分子量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一化合物具有大于500道爾頓的分子量。第二化合物是形成第一化合物的合成反應(yīng)的副產(chǎn)物，或是用于所述反應(yīng)的試劑。 可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的合成第一化合物的任何適宜的方法。該合成反應(yīng)可以是偶聯(lián)反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)。適宜的是，合成在液相中進(jìn)行。具體而言，合成可在有機(jī)溶劑存在下進(jìn)行，該有機(jī)溶劑可以與用于滲濾的有機(jī)溶劑相同或不同。在一種實(shí)施方案中，該方法包括在分離之后修飾第一化合物。例如，第一化合物可通過進(jìn)行一個或更多個額外的偶聯(lián)和/或脫保護(hù)步驟而被修飾。經(jīng)修飾的化合物隨后可被提純，特別是使用本發(fā)明的滲濾法提純。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括多個連續(xù)的偶聯(lián)、脫保護(hù)和分離步驟，從而促進(jìn)各種各樣的肽、寡核苷酸和肽核酸的合成。本發(fā)明中供使用的適宜的膜包括高分子膜和陶瓷膜，和混合的高分子膜/無機(jī)膜。膜排斥氏是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通術(shù)語且可如下定義
(C ΛRi = I--Tl X100%(1)
I CA. J
其中Cim =滲透物中樣品i的濃度，該滲透物是已穿透膜的液體，而Cim =保留物中樣品i的濃度，該保留物是尚未穿透膜的液體。若R(第一化合物)>R(第二化合物)， 則認(rèn)為該膜適用于本發(fā)明?？捎扇魏尉酆衔锊牧匣蛱沾刹牧闲纬杀景l(fā)明的膜，其提供能夠優(yōu)先把所述tide 與至少一種反應(yīng)副產(chǎn)物或試劑分離的分離層。優(yōu)選膜由選自適用于制造微濾膜、超濾膜、納米濾膜或反滲透膜的聚合物材料的材料形成或包含所述材料，所述材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚苯醚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亞胺、 聚醚酰亞胺、醋酸纖維素、聚苯胺、聚吡咯及它們的混合物。所述膜可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)包括燒結(jié)、拉伸、徑跡蝕刻、模板浙濾、界面聚合或相轉(zhuǎn)化來制造。更優(yōu)選，膜可經(jīng)交聯(lián)或處理以便提高其在反應(yīng)溶劑中的穩(wěn)定性。特別值得提及的是WO 2007/125367中描述的膜，該申請的內(nèi)容在此引入作為參考。在一種實(shí)施方案中，所述膜是包含支持體和薄的選擇性滲透層的復(fù)合材料，且其無孔選擇性滲透層由以下材料形成或包含以下材料，該材料選自改性聚硅氧烷基彈性體包括聚二甲硅氧烷(PDMS)基彈性體、乙烯-丙烯二烯烴(EPDM)基彈性體、聚降冰片烯基彈性體、聚辛烯基彈性體、聚氨酯基彈性體、丁二烯和丁腈橡膠基彈性體、天然橡膠、丁基橡膠基彈性體、氯丁橡膠(Neoprene)基彈性體、環(huán)氧氯丙烷彈性體、聚丙烯酸酯彈性體、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)基彈性體、聚醚嵌段酰胺(PEBAX)、聚氨酯彈性體、交聯(lián)聚醚、聚酰胺、聚苯胺、聚吡咯及它們的混合物。在另一實(shí)施方案中，所述膜由無機(jī)材料使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)例如燒結(jié)、浙濾或溶膠-凝膠法來制備，所述無機(jī)材料例如(作為非限定性的實(shí)例)碳化硅、二氧化硅、氧化鋯、鈦氧化物或沸石。由hopor GmbH(德國)提供的無機(jī)膜在本發(fā)明中優(yōu)選供使用。在另一實(shí)施方案中，所述膜包含其中分散有粉狀固體形式的有機(jī)或無機(jī)基質(zhì)的高分子膜，其中所述基質(zhì)的量多達(dá)該高分子膜的20wt%。碳分子篩基質(zhì)可如美國專利 6，585，802號中描述的經(jīng)熱分解任何適當(dāng)材料來制備。美國專利6，755，900號中描述的沸石也可作為無機(jī)基質(zhì)使用?？墒褂媒饘傺趸锢缍趸?、氧化鋅和二氧化硅，例如可從 Degussa AG(Germany)以其Aerosol和AdNano商標(biāo)獲得的材料。可使用混合的金屬氧化物，例如氧化鈰、氧化鋯和氧化鎂的混合物。優(yōu)選的基質(zhì)將是直徑小于1. O微米的微粒，優(yōu)選直徑小于0. 1微米的微粒，優(yōu)選直徑小于0. 01微米的微粒。第一化合物可通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)作用被連接至支持體例如聚合物、樹狀大分子、樹模石、超支化聚合物、或無機(jī)或有機(jī)納米顆粒上，該支持體作為可溶性分子錨起作用以容許第一化合物在本發(fā)明的反應(yīng)階段和滲濾階段期間于溶液中停留，并提供增大的分子體積以增強(qiáng)膜排斥。作為分子錨使用的適宜聚合物包括包含雜原子官能的縮聚基質(zhì)或聚合基質(zhì)。這些雜原子官能可包含氧、氮，或可包含超過一個雜原子，例如酰胺基。本發(fā)明中使用的聚合物實(shí)例包括聚亞烷基二醇，其包括聚乙二醇、聚己酸內(nèi)酯、用檸檬酸酯化了的聚乙二醇、聚乙二醇和琥珀酸的共聚物、乙烯吡咯烷酮和丙烯酸或b-羥基-丙烯酸乙酯的共聚物； 或丙烯酰胺和醋酸乙烯酯的共聚物。供本發(fā)明使用的適宜樹狀大分子包括聚(酰胺胺) [poly (aminoamine)]，也被稱為PAMAM樹狀大分子；含磷樹狀大分子；據(jù)聚賴氨酸樹狀大分子；和可具有表面官能團(tuán)包括-0H、-NH2、-PEG和COOH的聚丙烯亞胺(PPI)樹狀大分子。納米微粒可從商業(yè)來源獲得或經(jīng)原位合成以提供受控的尺寸，且適宜的納米微?？蓙碜許i02、 TiO2或其他有機(jī)材料或無機(jī)材料。US 3，772，264報道了用于連接氨基酸和肽至分子錨上的適當(dāng)化學(xué)法。Bonora 等人 Bioconjugate Chem.，(1997)第 8 卷 ￠)，第 793-797 頁，描述了用于連接核苷酸和寡核苷酸至分子錨上的化學(xué)法。Christensen等人J Pept. Sci. (1995) May-Jun5I (3)第175-83頁描述用于連接肽核酸至分子錨上的適宜技術(shù)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)例如US 3，772，264中報道的那些技術(shù)，可以容易完成從支持體上脫除第一化合物。用于肽的偶聯(lián)反應(yīng)與脫保護(hù)反應(yīng)的適宜化學(xué)法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如參見 Amino Acid and Peptide Synthesis,2nd Edn, J Jones, Oxford University Press 2002，或 khroder-Lubbke，The Peptides, New York 1967。用于寡核苷酸的偶聯(lián)反應(yīng)與脫保護(hù)反應(yīng)的適宜化學(xué)法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如參見P. S. Millar, Bioconjugate Chemistry, (1990)，第 1 卷，第 187-191 頁和 CB. Reese Org. Biomol. Chem. (2005)第 3 卷， 第3851-3868頁。用于肽核酸偶聯(lián)反應(yīng)與脫保護(hù)反應(yīng)的適宜化學(xué)法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如參見 B. Hyrup 與 P. E. Nielsen Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996)，第 4 卷，第1期，第5-23頁。術(shù)語“有機(jī)溶劑”將為一般技術(shù)讀者所完全理解，包括例如分子量小于300道爾頓的有機(jī)液體。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語溶劑還包括溶劑的混合物。作為非限定性實(shí)例，溶劑包括芳香族化合物、烷烴、酮、二醇、氯化的溶劑、酯、醚、 胺、腈、醛、酚、酰胺、羧酸、醇、呋喃和偶極非質(zhì)子溶劑，及它們的混合物以及它們與水的混合物。作為非限定性實(shí)例，溶劑的具體實(shí)例包括甲苯、二甲苯、苯、苯乙烯、苯甲醚、氯苯、 二氯苯、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基醚酮(MEK)、甲基異丁基酮(MIBK)、丙酮、乙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、己烷、環(huán)己烷、二甲氧基乙烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二乙醚、己二腈、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N，N-二甲基乙酰胺、二噁烷、硝基甲烷、硝基苯、吡啶、二硫化碳、四氫呋喃、甲基四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、乙腈、及它們的混合物以及它們與水的混合物。合成流程與儀器實(shí)施例1-3闡明五肽的合成。所使用的流程如圖2所示。所采用的儀器如圖3所示。該儀器不但用于進(jìn)行排斥試驗(yàn)，還用于進(jìn)行合成。偶聯(lián)步驟與脫保護(hù)步驟兩者都于大氣壓力下在反應(yīng)容器(加料槽)內(nèi)進(jìn)行。循環(huán)泵使反應(yīng)溶液通過膜濾芯再循環(huán)并自始至終確保良好的液體混合。在每個反應(yīng)完成時，使用至約對系統(tǒng)加壓。透過膜產(chǎn)生的溶劑流通過經(jīng)HPLC泵從溶劑貯器向反應(yīng)容器(加料槽)補(bǔ)給的恒定新鮮溶劑(DMF)流來達(dá)到平衡。在每一反應(yīng)/洗滌周期應(yīng)用相同的程序。讓肽在可溶性聚合分子錨上裝配以增加膜對其的保留。選擇PEG作為高分子支持體。下列縮寫在實(shí)施例中使用二氯曱烷DCM二異丙基碳化二亞胺DIC二異丙基乙胺DIPEA二曱基甲酰胺DMFΝ-α-Fmoc-L-丙氣酸Fmoc-AlaN-a-Fmoc-二-叔丁氧基羰基-L-精氨酸Fmoc-Arg(Boc)2N-a-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯Fmoc-Asp(OtBu)N-a-Fmoc-N-t-Boc-L-賴氣酸Fmoc-Lys(Boc)N-a-Fmoc-O-叔丁基-L-酪氣酸Fmoc-Tyr(tBu)N-a-Fmoc-L-繳氣酸Fmoc-Val4-羥曱基笨氧基乙酸HMPAN-羥基笨并三唑HOBt
六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷合磷鐐
PyBOP乙腈MeCN三乙胺TEA4-二曱基氣基嘧啶DMAP三氯曱烷CHCl3曱醇MeOHN-曱基咪唑NMI乙賧乙酯EtOAC二氯乙酸DCA三氟醋酸吡啶錨PyTFA叔丁基氫過氧化物TBHP實(shí)施例1具有Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr序列的模型肽使用高分子膜經(jīng)膜增強(qiáng)的肽合成 (MEPS)而制備。選擇該序列是為了包含最大的常用受保護(hù)氨基酸之一 Fmoc-Tyr (tBu)與最小的受保護(hù)疏水性氨基酸之一 Fmoc-Ala。使用化學(xué)交聯(lián)的聚酰亞胺膜(DuraMem ，MET Ltd, UK，其被認(rèn)為可用描述于PCT/GB2007/050218中的技術(shù)制備)進(jìn)行膜分離步驟。對 MeO-PEG-Inker-肽的排斥對于偶聯(lián)步驟為 100%，對于脫保護(hù)步驟> 99. 7%。甲基化氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NHJ的合成
用于制備MeO-PEG-NH2的程序在流程1中說明
權(quán)利要求
1.用于制備選自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法，該方法包括(i)合成所述第一化合物；并(ii)分離步驟(i)中形成的第一化合物與第二化合物，該第二化合物是第一化合物合成的反應(yīng)副產(chǎn)物和/或用于合成第一化合物的過量試劑，其中第一化合物和第二化合物溶解在有機(jī)溶劑中，并使用在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定的膜通過滲濾法分離，且該膜所提供的對第一化合物的排斥大于對第二化合物的排斥。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中第一化合物通過液相合成來合成。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中液相是有機(jī)溶劑。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中所述有機(jī)溶劑與用于滲濾的有機(jī)溶劑相同。
5.按照權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述合成涉及一個或更多個偶聯(lián)反應(yīng)或脫保護(hù)反應(yīng)。
6.按照任一前述權(quán)利要求的方法，其另外包括在分離之后修飾第一化合物。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其包括在分離之后對第一化合物進(jìn)行一個或更多個偶聯(lián)反應(yīng)和/或脫保護(hù)反應(yīng)。
8.按照權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的方法，其另外包括使用如權(quán)利要求1的步驟(ii)中所定義的滲濾法來純化修飾的化合物。
9.按照任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述膜是高分子膜。
10.按照權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述膜是陶瓷膜。
11.按照權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述膜是混合基質(zhì)有機(jī)/無機(jī)膜。
12.按照任一前述權(quán)利要求的方法，其中第一化合物連接到支持體上。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述支持體是高分子支持體。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述支持體包括樹狀高分子或超支化聚合物。
15.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述支持體是有機(jī)或無機(jī)納米微粒。
16.按照權(quán)利要求1的方法，其中第一化合物的分子量大于500道爾頓。
17.濾過膜用于制備選自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的用途；該方法包括(i)合成第一化合物；(ii)從有機(jī)溶劑和第二化合物中分離于步驟(i)中形成的第一化合物，該第二化合物是第一化合物合成的反應(yīng)副產(chǎn)物和/或用于合成第一化合物的過量試劑，其中第一化合物和第二化合物溶解在有機(jī)溶劑中并使用在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定的膜通過滲濾法分離，且該膜提供的對第一化合物的排斥大于對第二化合物的排斥。
18.基本上如本文任一實(shí)施例或圖中所描述的方法。
全文摘要
按照本發(fā)明，提供用于制備選自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法。該方法包括合成第一化合物，然后用滲濾法把在步驟(i)中形成的第一化合物與第二化合物分離，該第二化合物是第一化合物合成的反應(yīng)副產(chǎn)物和/或用于合成第一化合物的過量試劑。用于滲濾法的膜在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定并且所提供的對第一化合物的排斥大于對第二化合物的排斥。
文檔編號C07H21/00GK102216320SQ200980140616
公開日2011年10月12日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者A·G·萊文斯頓, E·W·塔特, L·G·皮瓦, P·R·J·加夫尼, R·J·利瑟巴羅, 瓦斯康切勒斯 R·坎波斯, S·W·J·蘇 申請人:帝國創(chuàng)新有限公司