專利名稱：Pd-1拮抗劑的組合物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性組合物，該組合物包含與增強(qiáng)劑組合的阻止T細(xì)胞上抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，以及所述成分一起或分開(kāi)用于誘導(dǎo)疾病治療中有價(jià)值的T細(xì)胞應(yīng)答的用途。
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞對(duì)疾病狀態(tài)(諸如感染和慢性病例如癌癥)的應(yīng)答是復(fù)雜的且涉及細(xì)胞間相互作用和可溶性介導(dǎo)物(稱作細(xì)胞因子或淋巴因子)生成。T細(xì)胞活化在正常情況中依賴于T細(xì)胞受體(TCR)與經(jīng)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)呈遞的抗原性肽的接觸后的抗原特異性信號(hào)，而這種反應(yīng)的程度受自多種共刺激分子發(fā)出的正的和負(fù)的抗原不依賴性信號(hào)控制。后者通常是⑶家族的成員。相反，程序性死亡-I(PD-I)是⑶觀受體家族的成員，其在T細(xì)胞上被誘導(dǎo)時(shí)傳遞負(fù)的免疫應(yīng)答。PD-I與其配體之一(B7-H1或B7-DC) 之間的接觸誘導(dǎo)抑制性應(yīng)答，其降低T細(xì)胞擴(kuò)增和/或T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間。如此，T淋巴細(xì)胞應(yīng)答受到多種因素的調(diào)節(jié)，包括起受體作用的細(xì)胞表面分子，其中后者包括TCR復(fù)合物以及其它表面分子二者?？傊?，抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答是由兩種信號(hào)介導(dǎo)的1)TCR與在HC背景中呈遞的抗原性肽的銜接(信號(hào)1)，及幻通過(guò)不同受體/配體對(duì)之間的接觸來(lái)遞送的第二抗原不依賴性信號(hào)(信號(hào)幻。這種“第二信號(hào)”在決定T細(xì)胞應(yīng)答的類型(活化或耐受)以及該應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間方面是至關(guān)重要的，而且受來(lái)自共刺激分子，諸如B7蛋白質(zhì)家族的正和負(fù)兩種信號(hào)調(diào)節(jié)。最廣泛表征的T細(xì)胞共刺激途徑是，其中B7-1 (⑶80)和B7_2 (⑶86)各自能參與刺激性⑶觀受體和抑制性CTLA-4(⑶15 受體。與經(jīng)由T細(xì)胞受體的信號(hào)傳導(dǎo)聯(lián)合，CD28連接提高T細(xì)胞的抗原特異性增殖，增強(qiáng)細(xì)胞因子的生成，刺激分化和效應(yīng)器功能，及促進(jìn) T 細(xì)胞的存活(Lenshow 等，Annu. Rev. Immunol. ,14 :233-258(1996)； Chambers 禾口 Allison，Curr. Opin. Immunol.，9 :396-404(1997)；及 Rathmell 禾口 Thompson， Annu. Rev. Immunol.，17 :781-828 (1999))。相反，認(rèn)為經(jīng)由CTLA-4的信號(hào)傳導(dǎo)遞送抑制T 細(xì)胞增殖、IL-2生成、和細(xì)胞周期行進(jìn)的負(fù)信號(hào)(Krummel和Allison，J. Exp. Med. , 183 2533-2540(1996)；及 Walunas 等，J. Exp. Med.，183 :2541-2550 (1996))。B7 共刺激分子家族的其它成員包括 B7-H1 (Dong 等，Nature Med.，5 :1365-1369(1999)；及 Freeman 等，J. Exp. Med.，192 :1-9(2000)), B7-DC (Tseng 等，J. Exp. Med.，193 :839-846(2001)；及 Latchman 等，Nature Immunol.，2 :261-268 (2001)), B7-H2 (Wang 等，Blood，96 :2808-2813(2000)； Swallow等，Immunity，11 :423-432(1999)；及 Yoshinaga等，Nature，402 :827-832 (1999))、 B7-H3 (Chapoval 等，Nature Immunol.，2 :269-274(2001))和 B7_H4(Choi 等，J. Immunol.，
6171 :4650-4654(2003) ；Sica 等，Immunity, 18 :849-861(2003) ；Prasad 等，Immunity, 18 863-873 (2003)；及 Zang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，100 10388-10392 (2003))。 Β7-Η5 (記載于WO 2006/012232)是一種新近發(fā)現(xiàn)的Β7家族成員。Β7家族分子具有近膜IgC (恒定)結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)膜IgV (可變)結(jié)構(gòu)域。這些配體的 CD^樣受體家族共享共同的細(xì)胞外IgV樣結(jié)構(gòu)域。受體-配體對(duì)的相互作用主要經(jīng)由配體和受體的IgV結(jié)構(gòu)域中的殘基來(lái)介導(dǎo)(Schwartz等，Nature Immunol.，3 :427-434 (2002)) 通常，IgV結(jié)構(gòu)域被描述為具有兩個(gè)片層，每個(gè)含有一層β鏈(Williams和Barclay， Annu. Rev. Immunol.，6 :381-405 (1988))。CTLA-4 的前和后片層分別含有鏈 A，GFC，C 禾口 ABEDC (Ostrov等，Science, 290 :816-819 (2000))，而B(niǎo)7IgV結(jié)構(gòu)域的前和后片層分別包含鏈 AGFCC，C” 和 BEDGchwartz 等，Nature, 410 :604-608(2001) ；Stamper 等，Nature, 410 608-611(2001)；及 Ikemizu 等，Immunity, 12 :51-60 (2000)) 結(jié)晶學(xué)分析揭示了 CTLA-4/ B7結(jié)合界面受來(lái)自CTLA-4包含MYPPPY基序的CDR3類似環(huán)與B7上主要由G、F、C、C，和C” 鏈形成的表面的相互作用支配Gchwartz等，Nature，410 =604-608(2001)；及Mamper等， Nature,410 :608-611(2001)).來(lái)自氨基酸同源性、突變、和計(jì)算機(jī)建模的數(shù)據(jù)給這種基序也是CD28的主要B7結(jié)合位點(diǎn)的觀念提供了支持(Bajorath等，J. Mol. Graph. Model.，15 135-139(1997))。雖然MYPPPY基序在IC0S(B7_H2的受體)中沒(méi)有得到保留，但是研究指示具有序列FDPPPF且位于類似位置的一種相關(guān)基序是ICOS結(jié)合B7-H2的主要決定子(Wand 等，J. Exp. Med.，195 1033-1041 (2002))。B7-DC(也稱作PD-L2或0)27 是B7家族的一個(gè)相對(duì)較新的成員，而且具有與 B7-H1 (也稱作PD-L1)約34%相同的氨基酸序列。人和小鼠B7-DC直向同源物共享約70% 氨基酸同一性。雖然在多種組織中找到了 B7-H1和B7-DC轉(zhuǎn)錄物(Dong等，Nature Med.， 5 :1365-1369(1999) ； Latchman 等，Nature Immunol.，2 :261-268(2001)；及 Tamura，Blood， 97 :1809-18160001))，但是這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)譜是相當(dāng)不同的。B7-H1在極其多種組織和細(xì)胞類型上廣泛表達(dá)，而B(niǎo)7-DC表達(dá)主要限于活化的樹(shù)突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞。已經(jīng)顯示了 B7-H1 禾Π B7-DC 都結(jié)合 PD-1 (Freeman 等，J. Exp. Med.，192 1027-1034(2000))，⑶觀家族的一個(gè)遠(yuǎn)親成員，在它的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中有免疫受體基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM) (Ishida 等，EMBO J.，11 :3887-3895 (1992))。PD-1 (⑶觀受體家族的一個(gè)成員)在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC、和巨噬細(xì)胞上誘導(dǎo)性表達(dá)(Keir，et al Curr. Opin. Immunol. 19 :309-314 (2007)) PD-I被其配體連接的主要結(jié)果是抑制T細(xì)胞受體(TCR)下游的信號(hào)傳導(dǎo)。因此， 經(jīng)由PD-I的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常給T細(xì)胞提供遏制或抑制信號(hào)，導(dǎo)致降低的T細(xì)胞增殖或T細(xì)胞活化的其它降低。B7-H1是在T細(xì)胞中引起抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要PD-I配體。通過(guò)提供結(jié)合PD-I并如此阻止抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者結(jié)合PD-I的配體諸如B7-H1，由此阻止配體結(jié)合PD-I來(lái)遞送抑制性信號(hào)的藥劑，本發(fā)明解決了不想要的T細(xì)胞抑制的問(wèn)題。在任一情況中，T細(xì)胞應(yīng)答(諸如T細(xì)胞增殖或活化)受到刺激。B7-H1是主要的PD-I配體，有可能是由于其較寬的分布和較高的表達(dá)水平。PD-I 抑制只在PD-I和TCR在免疫突觸的背景中彼此極近地結(jié)合時(shí)發(fā)生。PD-I及其配體已經(jīng)成為數(shù)篇綜述的話題。B7-H1還在多種癌癥(包括乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、白血病、肺癌、
7黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、和泌尿道上皮癌)中過(guò)表達(dá)，而且已經(jīng)與不良預(yù)后聯(lián)系起來(lái)。B7-H1由多種腫瘤細(xì)胞系表達(dá)，尤其是在用干擾素Y (IFN-Y)刺激后，而且還在浸潤(rùn)腫瘤的髓樣衍生抑制細(xì)胞(MDSC)上上調(diào)。例如，PD-I在腫瘤特異性⑶8T 細(xì)胞上上調(diào)，而且與功能缺損、無(wú)反應(yīng)性、衰竭、和凋亡有關(guān)。PD-I上調(diào)還已經(jīng)與別的細(xì)胞類型(諸如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和天然殺傷T (NKT)細(xì)胞上的功能障礙性和/或遏制性表型關(guān)聯(lián)起來(lái)。通過(guò)提供經(jīng)由升高的T細(xì)胞活性來(lái)治療疾病(尤其是癌癥和感染性疾病)的治療方案，本發(fā)明利用此類分子功能。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在需要下述提高的哺乳動(dòng)物中提高T細(xì)胞應(yīng)答(例如針對(duì)抗原的)的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用降低免疫細(xì)胞(尤其是T細(xì)胞)中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物和增強(qiáng)劑，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物的T細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明的治療方案中有用的化合物包括結(jié)合及阻斷T細(xì)胞上的PD-I受體且不觸發(fā)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，結(jié)合PD-I配體以阻止它們結(jié)合PD-I的化合物，二者都行的化合物和阻止編碼PD-I或PD-I天然配體任一的基因表達(dá)的化合物。此類化合物在本文中稱作“PD-1拮抗劑”。結(jié)合PD-I天然配體的化合物包括PD-I自身、以及PD-I的活性片段、 和(在B7-H1配體的情況中)B7. 1蛋白和片段。此類拮抗劑包括蛋白質(zhì)、抗體、反義分子和小有機(jī)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞應(yīng)答大于由所述PD-I拮抗劑或所述增強(qiáng)劑任一在任一(沒(méi)有另一)的情況中施用時(shí)生成的T細(xì)胞應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中有用的化合物是結(jié)合T細(xì)胞表面分子諸如CTLA4以阻止由其天然配體的結(jié)合觸發(fā)的抑制性信號(hào)的化合物或結(jié)合所述天然配體的化合物。此類拮抗劑包括蛋白質(zhì)、抗體、反義分子和小的有機(jī)物。在一個(gè)一般的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的治療方案和組合物中有用的化合物包括結(jié)合PD-I且不觸發(fā)、誘導(dǎo)、提高、促進(jìn)和/或允許PD-I與TCR共連接的化合物。阻止經(jīng)由PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并如此起PD-I拮抗劑作用的優(yōu)選化合物包括但不限于如下的B7-DC多肽，尤其是這些的可溶性部分，包括這些的活性片段、這些的變體和同系物，以及摻入任何上述的融合蛋白，它們結(jié)合PD-I且不觸發(fā)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，B7-DC包含SEQID NO :1，2，3或4的氨基酸序列。優(yōu)選的此類化合物是摻入B7-DC可溶性結(jié)構(gòu)域(即沒(méi)有跨膜序列)的化合物。合適的B7-DC多肽片段包括含有 IgV和/或IgC域的片段或只含有IgV域的片段，后者是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，SEQ IDNO 1 的氨基酸20-121是IgV域的一個(gè)優(yōu)選例。優(yōu)選的PD-I拮抗劑還包括但不限于PD-I天然配體諸如B7-H1多肽(披露于美國(guó)專利No. 6，803，192，通過(guò)本文中的述及而完整收錄)的活性片段，尤其是這些的可溶性部分，包括這些的變體和同系物，以及摻入任何上述的融合蛋白，它們結(jié)合PD-I且不觸發(fā)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明的優(yōu)選化合物還包括但不限于結(jié)合PD-I天然配體(諸如結(jié)合B7-H1的 B7-1片段)的化合物，包括活性片段、變體和同系物，以及摻入任何上述的融合蛋白，它們結(jié)合PD-I的配體以阻止后者結(jié)合PD-I以觸發(fā)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物及其使用方法包括結(jié)合及阻斷PD-I受體的PD-I受
8體拮抗劑和結(jié)合及阻斷PD-I受體配體的不同的PD-I受體拮抗劑的組合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供如下的PD-I受體拮抗劑，其結(jié)合PD-I受體且不觸發(fā)經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且還具有結(jié)合及拮抗PD-I受體配體諸如B7-H1 (其在其它情況中會(huì)觸發(fā)經(jīng)由 PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))的能力。其它所涵蓋的PD-I受體拮抗劑包括如下的雙特異性抗體，其能結(jié)合PD-I受體和PD-I受體配體二者。在本發(fā)明中有用的化合物的優(yōu)選實(shí)施方案還包括如下的抗體，其結(jié)合PD-I或 CTLA4，由此降低或消除由這些來(lái)源介導(dǎo)的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。供本發(fā)明的方法中使用的優(yōu)選化合物還包括但不限于CTLA4的配體(諸如B7_l 和B71)的活性片段，其結(jié)合CTLA4以降低后續(xù)抑制性信號(hào)，但不結(jié)合CD^或以其它方式抑制由⑶觀進(jìn)行的正信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。阻止經(jīng)由PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并如此起PD-I拮抗劑作用的優(yōu)選化合物包括但不限于B7-DC拮抗劑，尤其是這些的可溶性部分，包括這些活性片段，這些的變體和同系物，以及摻入任何上述的融合蛋白，它們結(jié)合B7-DC。在一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC多肽、其片段或變體偶聯(lián)至其它多肽以形成融合蛋白， 其通過(guò)結(jié)合PD-I受體來(lái)拮抗PD-I受體且不引起經(jīng)由PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此降低或干擾配體結(jié)合PD-I，特別是B7-H1結(jié)合，并由此干擾經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此類融合蛋白的例子是包含SEQ ID NO :9，10，12或13的氨基酸序列的多肽，及其同系物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，B7-DC的整個(gè)或部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)是融合蛋白的一部分，其中它連接至含有免疫球蛋白Fc部分的第二多肽。這種的一個(gè)優(yōu)選例是B7-DC-Ig，尤其是這種構(gòu)建物是同二聚物的一部分的情況，其中兩個(gè)B7-DC-Ig分子彼此連接，諸如通過(guò)二硫化物連接。在具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的化合物中有用的片段由具有期望的拮抗劑活性的多肽的至少10，15，25，50，75，100，150，200或更多個(gè)連續(xù)氨基酸組成。此類片段通常還是供本發(fā)明中使用的融合蛋白的一部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在有下述需要的哺乳動(dòng)物中提高T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用一種有效的治療方案，其包含抗PD-I抗體和增強(qiáng)劑，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物中的T細(xì)胞應(yīng)答。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在有下述需要的哺乳動(dòng)物中提高T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用一種有效的治療方案，其包含免疫調(diào)控劑和增強(qiáng)劑，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物中的T細(xì)胞應(yīng)答。此類免疫調(diào)控劑包括拮抗抑制T細(xì)胞應(yīng)答的其它〔擬8家族受體(諸如CTLA4)的分子。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案使用抗CTLA4抗體和增強(qiáng)劑。別的免疫調(diào)控劑包括激發(fā)活化T細(xì)胞應(yīng)答的CD^家族受體(諸如CD^和IC0S) 的分子；拮抗抑制T細(xì)胞應(yīng)答的B7家族配體(諸如B7-H1、B7-DC、B7-H4)的分子；和激發(fā)活化T細(xì)胞應(yīng)答的B7家族配體(諸如B7. 1和B7. 2)的分子。在本發(fā)明的任何方法的別的實(shí)施方案中，PD-I拮抗劑化合物和增強(qiáng)劑的治療方案進(jìn)一步包含至少一種別的治療劑。所涵蓋的別的治療劑包括免疫調(diào)控劑。此類方法的例示性免疫調(diào)控劑包括抗PD-I和抗CTLA4抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑選自環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和環(huán)磷酰胺類似物、Sunitinib (Sutent)、抗TGF β和lmatinib (Gleevac)、有絲分裂抑制劑諸如帕立他
9塞(paclitaxel)、芳香酶抑制劑諸如來(lái)曲唑(letrozole)、Ah腺苷受體(A2AR)拮抗劑、 血管發(fā)生抑制劑、蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、多柔比星 (doxorubicin)、TLR4拮抗劑、和IL-18拮抗劑。這些藥劑中的一些降低腫瘤微環(huán)境內(nèi)的 Treg(即調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞或T-reg)數(shù)目。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和/或組合物具體涵蓋任何合適佐劑作為所述方法和/或組合物一部分的用途。依照本發(fā)明，可以在體外、離體或在體內(nèi)使T細(xì)胞接觸PD-I受體拮抗劑和/或其含有增強(qiáng)劑的組合物。使用PD-I受體拮抗劑和/或其含有增強(qiáng)劑的組合物接觸T細(xì)胞可發(fā)生于活化T細(xì)胞之前、期間或之后。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，阻止或降低經(jīng)由PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子和增強(qiáng)劑在不同時(shí)間施用，諸如在施用PD-I拮抗劑之前施用增強(qiáng)劑的情況。此類施用可以與別的治療劑聯(lián)合。在本發(fā)明的任何方法的具體實(shí)施方案中，治療方案包括在施用任何或所有PD-I 拮抗劑、抗PD-I抗體、抗CTLA4抗體、和/或別的治療劑之前至少1小時(shí)、或至少2小時(shí)、或至少3小時(shí)、或至少5小時(shí)、或至少10小時(shí)、或至少15小時(shí)、或至少20小時(shí)、或至少24小時(shí)、或至少30小時(shí)或甚至更長(zhǎng)時(shí)間施用增強(qiáng)劑。施用增強(qiáng)劑也可以發(fā)生于使用任何或所有 PD-I拮抗劑、抗PD-I抗體、抗CTLA4抗體和/或別的治療劑之后，諸如施用PD-I拮抗劑之后不超過(guò)1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、或甚至長(zhǎng)達(dá)30 小時(shí)，或者可以與施用PD-I拮抗劑聯(lián)合發(fā)生。因本發(fā)明的方法而實(shí)現(xiàn)的升高的T細(xì)胞應(yīng)答足以治療疾病，包括癌癥、病毒感染、 細(xì)菌感染和寄生蟲(chóng)感染中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。若疾病為癌癥，則此類癌癥是膀胱、腦、乳腺、宮頸、結(jié)腸直腸、食管、腎、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮膚、胃、子宮、卵巢、睪丸、或血液學(xué)癌癥中任一項(xiàng)或多項(xiàng)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括藥學(xué)可接受載體中的在本發(fā)明的方法中使用的拮抗劑組合物，而且其中所述PD-I結(jié)合分子和所述增強(qiáng)劑各自以有效生成升高的T細(xì)胞刺激的量存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括醫(yī)學(xué)試劑盒，其包含裝有一種或多種供本發(fā)明中使用的藥劑以及供稀釋用的藥用載體的容器和關(guān)于施用的用法說(shuō)明。另外，當(dāng)下述成分要在相同時(shí)間施用時(shí)，所述PD-I受體拮抗劑和增強(qiáng)劑都可以作為單一容器中成分存在于藥學(xué)可接受載體中。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示B7-DC_Ig結(jié)合PD-1。將經(jīng)標(biāo)記的B7_DC_Ig以多種濃度與組成性表達(dá) PD-I的CHO細(xì)胞系或不表達(dá)PD-I的親本CHO細(xì)胞一起溫育。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析結(jié)合。 作為探針濃度(X軸)的函數(shù)來(lái)顯示B7-DC-Ig的中值熒光強(qiáng)度(MFI) (y軸)。B7_DC_Ig結(jié)合CH0. PD-I細(xì)胞(實(shí)心圓圈)，但是不結(jié)合未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(灰色三角形)。圖2顯示B7-DC-Ig與B7-H1競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-1的結(jié)合。首先將未標(biāo)記的B7_DC_Ig以多種濃度與組成性表達(dá)PD-I的CHO細(xì)胞系一起溫育，之后將經(jīng)標(biāo)記的B7-Hl-Ig添加至細(xì)胞混合物。作為所添加的未標(biāo)記的B7-DC-Ig競(jìng)爭(zhēng)物的濃度(χ軸)的函數(shù)，顯示B7-Hl-Ig 的中值熒光強(qiáng)度(MFI) (y軸)。隨著未標(biāo)記B7-DC-Ig的濃度升高，結(jié)合CHO細(xì)胞的經(jīng)標(biāo)記 B7-Hl-Ig的量降低，從而證明了 B7-DC-Ig與B7-H1競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-I的結(jié)合。
10圖3顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中環(huán)磷酰胺(CTX或Cytoxan )和二聚物鼠 B7-DC-Ig的組合導(dǎo)致小鼠中已建立的CD6腫瘤(結(jié)腸癌瘤)根除。圖A顯示第10天用 100mg/kg的CTX處理的小鼠中腫瘤體積(mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)，而圖B顯示第10天用CTX處理，接著一天后施用第一次B7-DC-Ig的小鼠中腫瘤體積(mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)。每幅圖中的每條線代表一只小鼠。黑色箭頭代表B7-DC-Ig施用。圖C顯示平均腫瘤體積。圖4顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中CTX和二聚物鼠B7-DC_Ig的組合根除小鼠中已建立的CD6腫瘤(結(jié)腸癌瘤)及針對(duì)CD6再攻擊提供保護(hù)。用腫瘤再攻擊用CTX和B7-DC-Ig 處理的且發(fā)現(xiàn)腫瘤接種后第44天沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng)的小鼠。稍后第70天再次再攻擊小鼠。到第100天沒(méi)有小鼠展現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)。圖5顯示CTX和B7-DC_Ig處理導(dǎo)致腫瘤特異性記憶CTL的產(chǎn)生。用CD6細(xì)胞再攻擊CTX和B7-DC-Ig處理后根除了已建立的CD6皮下腫瘤的小鼠。7天后，分離脾細(xì)胞并用卵清蛋白(一種無(wú)關(guān)肽)或AHl (—種CD6特異性肽)任一脈沖。將細(xì)胞首先用抗CD8 抗體染色，接著用抗IFNy抗體細(xì)胞內(nèi)染色，之后進(jìn)行FACS分析。圖6顯示不同劑量的B7-DC_Ig與CTX組合對(duì)小鼠中已建立CD6腫瘤根除的影響。給9至11周齡的Balb/C小鼠皮下植入1E05個(gè)CD6細(xì)胞。在第9天，給小鼠IP注射 100mg/kg CTX0 24小時(shí)后，在第10天，用30，100或300ugB7-DC_Ig處理小鼠，接著每周注射2次，總共8次處理。每周兩次測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。圖7顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中CTX和抗PD-I抗體的組合導(dǎo)致小鼠中已建立CD6 腫瘤(結(jié)腸癌瘤)根除。圖A顯示未處理小鼠(即僅僅用媒介處理的小鼠)中腫瘤體積 (mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)，圖B顯示第11天開(kāi)始僅僅用抗PD-I處理(每次注射300ug， 每周3次，總共12次注射)的小鼠中腫瘤體積(mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)，而圖C顯示第11天用CTX處理及第12天第一次施用抗PD-I (每次注射300ug，每周3次，總共12次注射)的小鼠中腫瘤體積(mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)。每幅圖中的每條線代表一只小鼠。 黑色箭頭代表抗PD-I施用。圖8顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中CTX和抗CTLA4抗體的組合導(dǎo)致小鼠中已建立 CT26腫瘤(結(jié)腸癌瘤)根除。這里，圖A顯示第11天用100mg/kg CTX處理的小鼠中腫瘤體積(mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)，而圖B顯示第11天用CTX處理及第12天用抗CTLA4處理(每次注射lOOug，每周2次，總共8次注射)的小鼠中腫瘤體積(mm3)相對(duì)的腫瘤攻擊后天數(shù)。每幅圖中的每條線代表一只小鼠。黑色箭代表抗CTLA-4施用。圖9顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中給9-11周齡的Balb/C小鼠皮下植入IxlO5個(gè)CD6 細(xì)胞。在第9天，給小鼠IP注射100mg/kg CTX0 24小時(shí)后，在第10天，用IOOug B7_DC_Ig 處理小鼠。有5個(gè)組不接受任何腫瘤細(xì)胞的無(wú)處理的(nai_ve)小鼠，注射媒介，僅CTX， CTX+B7-DC-Ig或僅B7-DC-Ig。在第11天(CTX后2天)和第16天(CTX后7天)自研究取出2只無(wú)處理小鼠和4只來(lái)自其它組的小鼠供T細(xì)胞分析用。左邊小圖顯示在第11天 (CTX注射后2天)，用CTX處理的小鼠的脾中的Treg顯著低于植入腫瘤且注射媒介的小鼠。 右邊小圖顯示在第16天(CTX后7天和B7-DC-Ig處理后6天)，B7_DC_Ig顯著降低表達(dá)高 PD-I的CD4+T細(xì)胞。這在B7-DC-Ig處理的和CTX+B7-DC-Ig處理的小鼠中都有觀察到。與無(wú)處理小鼠相比，植入腫瘤細(xì)胞的小鼠趨于在引流LN中具有更多的PD-1+/CD4+T細(xì)胞。
11圖10顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中CTX和B7-DC_Ig的組合導(dǎo)致尾靜脈注射小鼠前列腺腫瘤細(xì)胞系的小鼠中升高的存活。自小鼠肺分離轉(zhuǎn)移自TRAMP前列腺腫瘤細(xì)胞注射的 SP-I細(xì)胞。首先經(jīng)尾靜脈注射給BIO. D2小鼠注射3xl05個(gè)SP-I細(xì)胞。在第5，12和19天， 給小鼠注射50mg/kg CTX，如所示的。在第6，13和20天，給小鼠施用5mg/kg B7_DC_Ig，如所示的。這里，“NT”指“未處理”。圖11。使用半脾注射技術(shù)給予11-13周齡的Balb/C小鼠以分離的肝轉(zhuǎn)移物。將麻醉小鼠的脾分成兩半，并夾住兩半。將CD6細(xì)胞(1E05)注射入一個(gè)半脾，并且，并在30 秒后切出該脾并夾住脾引流靜脈。在第10天，小鼠接受50mg/kg CTX的一次IP注射。M 小時(shí)后，即在第11天，以0. IXLD50(IxIO7CFU)用攜帶AHl肽(CT26的一種免疫顯性表位) 的重組李斯特氏菌(Listeria)，然后在第14和17天處理小鼠。還在第11天，然后在第18 天用B7-DC-Ig處理小鼠。監(jiān)測(cè)小鼠總體存活。定義除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與所公開(kāi)的發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。特別地，下列術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有下述含義。術(shù)語(yǔ)“抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”指具有如下效果的任何信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其消除或降低針對(duì)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答，或是通過(guò)減低T細(xì)胞增殖或是通過(guò)任何其它抑制性機(jī)制，由此免疫原性T細(xì)胞應(yīng)答的程度或持續(xù)時(shí)間降低或縮短。此類抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是由于PD-I結(jié)合天然配體，諸如B7-H1或此類配體的一些其它成員(B7-DC)結(jié)合PD-1，或者可以是由于CTLA4結(jié)合配體，諸如B7-1或B7-2。一般地，本發(fā)明的化合物降低此類抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且包括但不限于PD-I拮抗劑和CTLA4拮抗劑。術(shù)語(yǔ)“PD-1拮抗劑”意指削弱由PD-I介導(dǎo)的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何分子，PD-I見(jiàn)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC、和巨噬細(xì)胞的表面上。此類拮抗劑包括破壞由T細(xì)胞上的PD-I分子生成的任何抑制性信號(hào)的分子。在本發(fā)明的具體例中，PD-I 拮抗劑是抑制、降低、消除或以其它方式降低經(jīng)由PD-I受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。此類降低可源自(i)本發(fā)明的PD-I拮抗劑結(jié)合PD-I受體且不觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 以降低或阻斷抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；(ii)PD-l拮抗劑結(jié)合PD-I受體的配體(例如激動(dòng)劑)，從而阻止兩者的結(jié)合(例如所述激動(dòng)劑是B7-H1的情況)；(iii)PD-l拮抗劑結(jié)合或以其它方式抑制作為如下調(diào)節(jié)鏈一部分的分子的活性，該調(diào)節(jié)鏈在不受抑制時(shí)具有刺激或促進(jìn)PD-I 抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果；或(iv)PD-l拮抗劑抑制PD-I受體表達(dá)或其配體表達(dá)，尤其是通過(guò)降低或消除一種或多種編碼PD-I或其一種或多種天然配體的基因表達(dá)。如此，本發(fā)明的 PD-I拮抗劑是如下的分子，其實(shí)現(xiàn)PD-I抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低，由此提高針對(duì)一種或多種抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“CTLA4拮抗劑”意指降低CTLA4介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的抑制的化合物。例如，在T細(xì)胞，CTLA4在B7配體諸如B7-1和B7-2結(jié)合時(shí)遞送抑制性脈沖。 CTLA4拮抗劑破壞所述配體對(duì)活化的T細(xì)胞上CTLA4的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗劑是結(jié)合CTLA4以阻止配體結(jié)合的抗CTLA4抗體。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“活性片段”指天然多肽或與天然多肽具有序列同源性(例如至少80%、85%、90%、95%、98%、或99%氨基酸序列同一性)的多肽的一部分，其展現(xiàn) PD-I拮抗劑活性，例如通過(guò)結(jié)合PD-I或通過(guò)結(jié)合PD-I的配體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類
12片段會(huì)由B7-DC蛋白結(jié)合PD-I的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(E⑶)組成，諸如SEQ ID N0:3，優(yōu)選其氨基酸20至221。在PD-I多肽的情況中，活性片段會(huì)是所述多肽包含結(jié)合域的一部分，其結(jié)合PD-I的天然配體以阻止所述配體對(duì)PD-I介導(dǎo)的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激?；钚云慰梢酝ㄟ^(guò)它們與衍生它們的分子競(jìng)爭(zhēng)對(duì)天然結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合的能力來(lái)鑒定。例如，活性片段會(huì)與野生型B7-DC競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-I的結(jié)合。關(guān)于抗體，術(shù)語(yǔ)“活性片段”意指抗體的抗原結(jié)合部分，其小于完整免疫球蛋白。此類片段包括Fab和F (ab' ) 2片段，其能夠與本文中作為受體或配體公開(kāi)的任何多肽反應(yīng)及結(jié)合本文中作為受體或配體公開(kāi)的任何多肽。這些Fab和F(ab' )2片段缺少完整抗體的 Fc部分，更加快速地自循環(huán)清除，而且可具有比完整抗體要少的非特異性組織結(jié)合(Wahl 等，J. Nuc. Med. 24 :316-325 (1983))。還包括 Fv 片段(Hochman, J.等(1973) Biochemistry 12 :1130-1135 ；Sharon, J.等(1976)Biochemistry 15:1591-1594)。這些各種片段是使用常規(guī)技術(shù)生成的，諸如蛋白酶切割或化學(xué)切割(參見(jiàn)例如Rousseaux等，Meth. Enzymol.， 121 :663-69(1986))。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)PD-I拮抗劑的“可溶性部分”意指全長(zhǎng)多肽的一部分，其不包括跨膜部分或區(qū)段的任何部分。例如，關(guān)于B7-DC，可溶性部分會(huì)包括細(xì)胞外部分(有或無(wú)N端信號(hào)序列)，但是不會(huì)包括跨膜部分的任何部分(或至少不足以降低溶解度)。如此， 人B7-DC的E⑶顯示為SEQ ID NO :3，而且由全長(zhǎng)分子的IgV樣和IgC樣域二者(即全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸20-221)組成。如本文中使用的，“共刺激多肽”為在與T細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子相互作用時(shí)調(diào)控 T細(xì)胞活性的多肽。如此，T細(xì)胞的應(yīng)答可以是效應(yīng)器(例如CTL或抗體生成B細(xì)胞)應(yīng)答、為一種或多種效應(yīng)器(例如CTL或抗體生成B細(xì)胞)應(yīng)答提供幫助的輔助應(yīng)答、或阻遏應(yīng)答。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“治療方案”指對(duì)疾病的治療或用于實(shí)現(xiàn)期望的生理變化的的方法，期望的生理變化諸如升高的或降低的免疫系統(tǒng)對(duì)抗原或免疫原的應(yīng)答，諸如涉及此類應(yīng)答的一種或多種細(xì)胞的數(shù)目或活性的升高的或降低或涉及此類應(yīng)答的細(xì)胞類型的增多或減少，其中所述治療或方法包括對(duì)動(dòng)物諸如哺乳動(dòng)物尤其是人施用足夠量的所述方案的兩種或更多種化學(xué)藥劑或成分以有效治療疾病或生成所述生理變化，其中所述化學(xué)藥劑或成分一起施用，諸如作為同一組合物的一部分，或者在相同時(shí)間或在不同時(shí)間分開(kāi)且獨(dú)立施用(即每種藥劑或成分的施用與一種或多種化學(xué)藥劑或成分隔開(kāi)限定的一段時(shí)間) 且其中所述一種或多種藥劑或成分的施用實(shí)現(xiàn)比任何所述藥劑或成分單獨(dú)或孤立地施用時(shí)的結(jié)果要大的結(jié)果。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”意圖描述處于如下環(huán)境中的感興趣化合物(例如多核苷酸或多肽)，所述環(huán)境是與該化合物天然存在的環(huán)境不同的，例如與其天然環(huán)境分開(kāi)，諸如通過(guò)將肽濃縮至如下的濃度，在自然界中找不到處于該濃度的該肽?！胺蛛x的”意圖包括感興趣化合物得到實(shí)質(zhì)性富集和/或感興趣化合物得到部分或?qū)嵸|(zhì)性純化的樣品內(nèi)的化合物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”指任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，不管修飾(例如磷酸化或糖基化)。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。如本文中使用的，“變異”多肽與相應(yīng)野生型多肽的氨基酸序列相比含有至少一處氨基酸序列改變。如本文中使用的，“氨基酸序列改變”可以是例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、刪除、 或插入。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“部分”、“區(qū)段”、和“片段”在涉及多肽使用時(shí)指殘基諸如氨基酸殘基的連續(xù)序列，該序列形成更大序列的子集。例如，若多肽進(jìn)行任何常見(jiàn)內(nèi)肽酶諸如胰蛋白酶或糜蛋白酶處理，則源自此類處理的寡肽會(huì)呈現(xiàn)起始多肽的部分、區(qū)段或片段。多肽的“片段”如此指多肽的任何子集，其是比全長(zhǎng)蛋白質(zhì)要短的多肽。通常，片段的長(zhǎng)度會(huì)是五個(gè)或更多個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽(或其片段)的衍生物、類似物或同系物可以是⑴如下的，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)替代，且此類替代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)如下的，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基，或(iii)如下的，其中成熟多肽與另一化合物融合，諸如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(iv)如下的，其中別的氨基酸融合至成熟多肽，諸如前導(dǎo)或分泌序列或?yàn)榧兓墒於嚯幕蚯暗鞍?proprotein)序列而采用的序列。根據(jù)本文中的教導(dǎo)，此類衍生物和類似物被認(rèn)為是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。如本文中使用的，“效價(jià)”指每個(gè)分子可得的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目。依照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“百分比同一性，，或“百分比相同，，在涉及序列時(shí)意指將要比較的序列(“比較序列”)與描述的或主張的序列(“參照序列”)比對(duì)后，將序列與主張的或描述的序列比較。然后依照下面的公式確定％同一性百分比同一性=100[1_(C/R)]其中C為參照序列與比較序列之間比對(duì)的長(zhǎng)度上參照序列與比較序列之間差異的數(shù)目，其中(i)參照序列中在比較序列中沒(méi)有相應(yīng)比對(duì)堿基或氨基酸的每個(gè)堿基或氨基酸和(ii)參照序列中的每個(gè)缺口和(iii)參照序列中與比較序列中的比對(duì)堿基或氨基酸不同的每個(gè)比對(duì)堿基或氨基酸構(gòu)成差異；而R為在與比較序列比對(duì)的長(zhǎng)度上參照序列中的堿基或氨基酸的數(shù)目，其中參照序列中創(chuàng)建的任何缺口也作為堿基或氨基酸來(lái)計(jì)數(shù)。若比較序列和參照序列之間有如上所述計(jì)算得到的百分比同一性大約等于或大于規(guī)定的最小百分比同一性的比對(duì)，則比較序列與參照序列具有規(guī)定的最小百分比同一性，即使可能有如上計(jì)算得到的百分比同一性小于規(guī)定的百分比同一性的比對(duì)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“保守性氨基酸”意指為如下的替代，其中替代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，而“非保守性”氨基酸替代為如下的替代，其中替代的氨基酸的電荷、疏水性、或體積有顯著改變。非保守性替代在它們維持下述各項(xiàng)的效果方面會(huì)更加顯著不同(a)替代區(qū)域中肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如作為片層或螺旋構(gòu)象；(b)分子在靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈的體積。保守性氨基酸替代的例子包括那些其中替代在下述五組之一內(nèi)的1)小的、脂肪族的、非極性的或微極性的殘基(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly)； 2)極性的、帶負(fù)電荷的殘基及其酰胺(Asp，Asn，GlU，Gln)；極性的、帶正電荷的殘基(His， Arg, Lys)；大的、脂肪族的、非極性的殘基(Met, Leu, lie, Val, Cys)；和大的、芳香族的殘基 (Phe, Tyr, Trp) 0非保守性氨基酸替代的例子是那些其中1)親水性殘基(例如絲氨酰或蘇氨酰)替代(或被替代)疏水性殘基(例如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨酰、或丙氨酰)；幻半胱氨酸或脯氨酸替代(或被替代)任何其它殘基；幻具有正電性側(cè)鏈的殘基(例
14如賴氨酰、精氨酰、或組氨酰)替代(或被替代)負(fù)電性殘基(例如谷氨?；蛱於滨?； 或4)具有大側(cè)鏈的殘基(例如苯丙氨酸)替代(或被替代)沒(méi)有側(cè)鏈的殘基(例如甘氨酸)。術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“宿主”、“受試者”、和“患者”在本文中可互換使用，而且指哺乳動(dòng)物， 包括但不限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物例如人，以及嚙齒類動(dòng)物諸如小鼠和大鼠，及其它實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”意指足以治療、抑制、或減輕所治療疾病狀態(tài)的一種或多種癥狀或以其它方式提供想要的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果(尤其是增強(qiáng)針對(duì)選定抗原的T細(xì)胞應(yīng)答)的劑量。精確的劑量會(huì)隨多種因素而變化，諸如受試者依賴性變量(例如年齡、免疫系統(tǒng)健康、等)、疾病、和所施用的治療。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、等等。此類介質(zhì)和藥劑對(duì)藥學(xué)活性物質(zhì)的使用是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容，涵蓋其在治療性組合物中的使用。 補(bǔ)充性活性化合物也可摻入組合物。術(shù)語(yǔ)“抗體”意圖包括完整分子以及其包括抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段二者。完整抗體結(jié)構(gòu)常常以H2L2給出，而且指抗體通常包含2條輕(L)氨基酸鏈和2條重(H)氨基酸鏈的實(shí)情。這兩種鏈都具有能夠與結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原靶相互作用的區(qū)。與靶相互作用的區(qū)稱作“可變”或“V”區(qū)，而且以來(lái)自抗原特異性不同的抗體的氨基酸序列的差異來(lái)表征。H或L鏈任一的可變區(qū)含有能夠特異性結(jié)合抗原靶的氨基酸序列。這些序列內(nèi)是因它們?cè)谔禺愋圆煌目贵w間的極度可變性而稱作“高變”的較小序列。此類高變區(qū)也稱作“互補(bǔ)決定區(qū)”或 “⑶R”區(qū)。這些⑶R區(qū)負(fù)責(zé)抗體對(duì)特定抗原決定簇結(jié)構(gòu)的基本特異性。⑶R呈現(xiàn)可變區(qū)內(nèi)的非連續(xù)氨基酸段，但是不管物種，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵氨基酸序列在可變重和輕鏈區(qū)內(nèi)的位置定位具有可變鏈氨基酸序列內(nèi)的相似定位。所有抗體的可變重和輕鏈各具有3個(gè)CDR 區(qū)，各輕(L)鏈和重(H)鏈的每個(gè)⑶R區(qū)彼此不相連(稱作Li、L2、L3、HI、H2、H3)。公認(rèn)的 CDR 區(qū)記載于 Kabat et al，J. Biol. Chem. 252 :6609-6616 (1977)。依照本發(fā)明公開(kāi)的抗體還可以是完全合成的，其中抗體的多肽鏈?zhǔn)呛铣傻?，而且可能為結(jié)合本文中作為受體公開(kāi)的多肽而優(yōu)化。此類抗體可以是嵌合的或人源化的抗體，而且可以是結(jié)構(gòu)上完整四聚物的，或者可以是二聚物的且只包含一條重鏈和一條輕鏈。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物中治療疾病的治療方案或聯(lián)合療法，其包含降低或消除T細(xì)胞優(yōu)選人T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，該化合物與增強(qiáng)劑聯(lián)合施用以提高免疫應(yīng)答。本發(fā)明的方法還涉及廣譜免疫調(diào)控劑及其組合物的使用。一般地，這些方法引起的升高的T細(xì)胞應(yīng)答大于單獨(dú)施用相同劑量的所述PD-I拮抗劑或所述增強(qiáng)劑任一引起的任何升高的T細(xì)胞應(yīng)答。所公開(kāi)的組合物和方案可用于刺激或增強(qiáng)涉及T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。如此，本發(fā)明的方法在治療如下疾病狀況中最有用，該疾病狀況會(huì)受益于T細(xì)胞活性的升高及其中升高的T細(xì)胞應(yīng)答是治療所述疾病所必需的或足夠的，即使該疾病不是由降低的T細(xì)胞應(yīng)答特異性引起的或加重的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，要治療或預(yù)防的疾病的類型是惡性腫瘤或由受到攻擊(即由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行的)的細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)
15(helminth)、或其它細(xì)胞內(nèi)微生物病原體引起的慢性感染性疾病。使用所公開(kāi)的組合物活化T細(xì)胞也有利于治療或預(yù)防以免疫遏制為特征的狀況。依照本發(fā)明，T細(xì)胞應(yīng)答可通過(guò)結(jié)合T細(xì)胞表面上的受體的分子和結(jié)合此類受體之配體的分子來(lái)調(diào)節(jié)。在PD-I的情況中，結(jié)合PD-I以降低其抑制效果的分子和/或結(jié)合一種或多種PD-I配體以降低其結(jié)合PD-I的能力的分子具有如下的效果，即降低PD-I抑制 T細(xì)胞應(yīng)答的能力，由此提高這種應(yīng)答及其免疫學(xué)效應(yīng)。A. PD-I受體拮抗劑提供了含有PD-I受體拮抗劑的組合物，其包括結(jié)合及阻斷PD-I的配體以干擾或抑制所述配體結(jié)合PD-I受體，或者直接結(jié)合及阻斷PD-I受體且不誘導(dǎo)經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物或藥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-I受體拮抗劑直接結(jié)合PD-I受體且不觸發(fā)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且還結(jié)合PD-I受體的配體以降低或抑制配體觸發(fā)經(jīng)由PD-I 受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)降低結(jié)合PD-I受體及觸發(fā)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的配體的數(shù)目和/或量， 更少的細(xì)胞受到由PD-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)遞送的負(fù)信號(hào)所致的削弱，而且能實(shí)現(xiàn)更有力的免疫應(yīng)答。依照本發(fā)明，PD-I信號(hào)傳導(dǎo)要求結(jié)合與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)呈遞的肽抗原密切接近的PD-I配體(諸如B7-H1或B7-DC)(參見(jiàn)例如FreemanProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105 :10275-10276 (2008)) ο因此，阻止T細(xì)胞膜上PD-I和TCR共連接的蛋白質(zhì)、抗體或小分子是本發(fā)明涵蓋的有用PD-I拮抗劑。例示性PD-I受體拮抗劑包括但不限于B7-DC多肽，包括這些的同系物和變體，以及任何上述的活性片段，和摻入任何這些的融合蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含B7-DC的可溶性部分，其偶聯(lián)至抗體諸如人IgG的Fc部分，但是不摻入人B7-DC 的整個(gè)或部分跨膜部分。PD-I受體拮抗劑也可以是小分子拮抗劑或抗體，其通過(guò)結(jié)合PD-I 的配體或PD-I自身來(lái)降低或干擾PD-I受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，尤其是此類結(jié)合后沒(méi)有PD-I與TCR 的共連接，由此不觸發(fā)經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況。本文中提供的PD-I受體拮抗劑作為免疫應(yīng)答刺激性治療劑在體內(nèi)和離體一般是有用的。一般而言，所公開(kāi)的拮抗劑組合物對(duì)于治療具有或傾向于任何如下疾病或病癥的受試者是有用的，其中受試者的免疫系統(tǒng)針對(duì)所述疾病或病癥發(fā)起免疫應(yīng)答。1. B7-DC 多肽在某些實(shí)施方案中，B7-DC蛋白可用作PD-I受體拮抗劑。B7-DC是PD-I的一種天然配體且以比B7-H1要高的親和力結(jié)合PD-I，而且如此能抑制B7-H1 =PD-I相互作用。合適的B7-DC多肽(包括其變體、同系物和片段)可得自下述全長(zhǎng)人B7-DC多肽，有(SEQ ID NO 1)或無(wú)(SEQ ID NO 2)內(nèi)源信號(hào)肽。MIFLLLMLSL ELQLHQIML FTVTVPKELY IIEHGSNVTL ECNFDTGSHV NLGAITASLQ 60KVENDTSPHR ERATLLEEQL PLGKASFHIP QVQVRDEGQY QCIIIYGVAff DYKYLTLKVK 120ASYRKINTHI LKVPETDEVE LTCQATGYPL AEVSWPNVSV PANTSHSRTP EGLYQVTSVL 180RLKPPPGRNF SCVFWNTHVR ELTLASIDLQ SQMEPRTHPT WLLHIFIPFC IIAFIFIATV 240IALRKQLCQK LYSSKDTTKR PVTTTKREVN SAI273(SEQIDN0:1)LFTVTVPKEL YIIEHGSNVT LECNFDTGSH VNLGAITASL QKVENDTSPH RERATLLEEQ 60
16LPLGKASFHI PQVQVRDEGQ YQCIIIYGVA WDYKYLTLKV KASYRKINTH ILKVPETDEV 120ELTCQATGYP LAEVSWPNVS VPANTSHSRT PEGLYQVTSV LRLKPPPGRN FSCVFWNTHV 180RELTLASIDL QSQMEPRTHP TffLLHIFIPF CIIAFIFIAT VIALRKQLCQ KLYSSKDTTK 240RPVTTTKREV NSAI254(SEQ ID NO 2)B7分子家族(包括B7-DC)在細(xì)胞表面處表達(dá)，有一個(gè)近膜恒定IgC域和一個(gè)遠(yuǎn)膜IgV域。這些配體的受體共享共同的胞外IgV樣域。受體-配體對(duì)的相互作用主要經(jīng)由配體和受體的IgV域中的殘基來(lái)介導(dǎo)。通常，IgV域被描述為具有兩個(gè)片層，每個(gè)含有一層β鏈。這些β鏈稱作A’、B、C、C’、C”、D、E、F和G。此類多肽的結(jié)構(gòu)記載于文獻(xiàn)(參見(jiàn) Molnar 等，Crystal structure of thecomplex between programmed death-1(PD-I) and its ligand PD-L2，PNAS, Vol.105，pp.10483-10488(29July 2008))。B7-DC(—種跨膜蛋白)以其單體形式包含IgV和IgC域，它們構(gòu)成分子的細(xì)胞外部分(細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或ECD)，其中IgV樣域完全或部分負(fù)責(zé)PD-I結(jié)合以及本發(fā)明方法中敘述的其它功能。對(duì)于人蛋白，IgV域的特征在于它擁有連接B和F鏈(見(jiàn)上文)的二硫鍵，這看來(lái)是多種IgV域特征性的，而且擁有與B7-1和B7-2 二者的IgV域(參見(jiàn)Molnar 等(2008)，見(jiàn)上文)相似的三維結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC變體多肽在一個(gè)或多個(gè)這些β鏈內(nèi)含有氨基酸改變 (即替代、刪除或插入)，為任何可能組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC變體在Α’、C、C’、 C”、D、E、F或Gi3鏈內(nèi)含有一處或多處氨基酸改變(即替代、刪除或插入)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，B7-DC變體在Gi3鏈內(nèi)含有一處或多處氨基酸改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的IgC和IgV域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的IgV域。人和小鼠B7-DC蛋白含有短的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域、單一跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)Ig域；一個(gè)近膜IgC域和一個(gè)遠(yuǎn)膜IgV域。變異B7-DC 多肽的有用片段包括可溶性片段?？扇苄訠7-DC片段為可以自生成細(xì)胞脫落、分泌或以其它方式提取的B7-DC片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的整個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。B7-DC的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括鼠或人B7-DC的氨基酸約20至約氨基酸221或其活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的IgC和IgV域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的IgV域。認(rèn)為PD-I信號(hào)傳導(dǎo)要求結(jié)合與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)呈遞的肽抗原密切接近的 PD-I 配體(通常是 B7-H1) (Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105 10275-10276 (2008) ) 0因此，阻止T細(xì)胞膜上PD-I和TCR共連接的蛋白質(zhì)、抗體或小分子是本發(fā)明涵蓋的有用PD-I拮抗劑。在本發(fā)明的方法和組合物中有用的PD-I拮抗劑包括摻入E⑶的B7-DC蛋白片段?；蛘撸珺7-DC的片段包括包含IgV或IgV樣域的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，優(yōu)選氨基酸 20-221，更優(yōu)選20-121，其足以結(jié)合PD-I受體以干擾或阻止或以其它方式降低經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，B7-DC片段與B7-H1競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-I受體的纟口口。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段可以含有多肽中對(duì)于結(jié)合PD-I而言重要的區(qū)。這些多肽片段可用于競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-I的結(jié)合及阻止天然B7-DC結(jié)合PD-1。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)
17PD-I的結(jié)合，這些片段可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，因?yàn)橐种艬7-H1和B7-DC與PD-I的相互作用抑制在其它情況中會(huì)發(fā)生的對(duì)免疫應(yīng)答的遏制。小鼠或人B7-DC的會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PD-I的多肽片段可含有例如氨基酸101-108或110-114。與所述野生型B7-DC的片段缺失情況下野生型B7-DC對(duì)PD-I的結(jié)合水平相比，野生型B7-DC對(duì)PD-I的結(jié)合通常被抑制至少50%、 60%,70%,75%,80%,90%,95%,或超過(guò)95%。在本發(fā)明的方法和/或組合物中有用的例示性B7-DC片段包括但絕不限于下述B7-DC細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域人B7-DC細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)LFTVTVPKEL YIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASL QKVENDTSPHRERATLLEEQ60LPLGKASFHI PQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEV120ELTCQATGYP LAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHV180RELTLASIDL QSQMEPRTHPTff202(SEQ ID NO 3)和小鼠B7-DC ECD LFTVTAPKEV YTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQ60LPLGKALFHI PSVQVRDSGQYRCLVICGMWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEV120QLTCQARGYP LAEVSffQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHM180KELTSAIIDP LSRMEPKVPRTff202(SEQ ID NO 4)獼猴 B7-DC ECD LFTVTVPKEL YIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASL QKVENDTSPHRERATLLEEQ60LPLGKASFHI PQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKV KASYRKINTHILKVPETDEV120ELTCQATGYP LAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSV LRLKPPPGRNFSCVFWNTHV180RELTLASIDL QSQMEPRTHPTff202(Seq ID NO :15)在本發(fā)明的方法和組合物中有用的眾多其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物序列提供于Onlamoon
等，Immunology, Vol. 124，pp. 277-293(2008)。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的PD-I拮抗劑還包括融合蛋白(如下文描述的)，其包含第一和第二多肽部分，其中所述融合蛋白或至少其第一多肽部分擁有PD-I拮抗劑活性，尤其是所述融合蛋白結(jié)合及阻斷PD-I或結(jié)合及阻斷PD-I之配體的情況。此類融合蛋白的第一多肽部分可包含本文中其它地方敘述的在本發(fā)明的方法中用作PD-I拮抗劑的任何PD-I拮抗劑多肽或其PD-I結(jié)合片段，或由其組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在此類融合蛋白中，所述第一多肽部分在所述第二多肽部分的N端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)構(gòu)成所述第一和第二多肽部分的氨基酸以外的寡肽，所述第一多肽部分連接至所述第二多肽部分，其中所述連接氨基酸沒(méi)有實(shí)質(zhì)性降低所述融合蛋白的PD-I拮抗劑活性。在一種優(yōu)選的二聚物融合蛋白中，二聚物源自兩條Ig重鏈的CH區(qū)中的Cys殘基的共價(jià)鍵合，該Cys殘基與二聚化的正常Ig重鏈中二硫化物連接的Cys殘基相同。例行用作融合蛋白結(jié)合配偶的多種多肽序列是本領(lǐng)域公知的。有用的多肽結(jié)合配偶的例子包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、多組氨酸、myc、血凝素、Flag 標(biāo)簽(Kodak，New Haven, CT)、麥芽糖E結(jié)合蛋白和蛋白A。又一個(gè)實(shí)施方案提供一種四聚物構(gòu)建物，該構(gòu)建物具有BirA底物，其融合至變異B7-DC多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。用于生成四聚物構(gòu)建物的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn) Pertovas 等，J. Exp. Med.，203 :2281 (2006))。例示性小鼠B7-DC融合蛋白含有小鼠B7-DC的氨基酸20-221，其融合至小鼠 IgG2a(CAA49868)的氨基酸237-469。在一個(gè)非限制性例子中，人B7-DC融合蛋白含有人 B7-DC的氨基酸20-221，其融合至人IgGl (AAA02914)的氨基酸對(duì)5_476。用于B7-DC融合蛋白的信號(hào)肽包括內(nèi)源信號(hào)肽或任何其它信號(hào)肽，其促進(jìn)宿主分泌融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一多肽會(huì)只包括IgV域。其它實(shí)施方案可包含IgG抗體諸如IgGl的鉸鏈和Fc 域，不存在可變區(qū)。其它實(shí)施方案包括使用IgG2或IgG4的鉸鏈和Fc區(qū)，尤其是具有N297Q 或其它降低效應(yīng)器功能的突變。依照本發(fā)明的方法和組合物，可用作PD-I拮抗劑的多肽或可用作PD-I拮抗劑的融合蛋白的第一多肽部分包含與SEQ ID NO :1的氨基酸1-221、優(yōu)選SEQ ID N0:1的氨基酸20-221、或SEQ ID NO :1的氨基酸沈_221，或者SEQ IDNO :3或4的氨基酸1-202、更優(yōu)選SEQ ID NO :1的氨基酸20-121或SEQ ID NO :3或4的氨基酸1-102具有至少60%、或至少65 %、或至少70 %、或至少75 %、或至少80 %、或至少85 %、或至少90 %、或至少95 %、 或至少99%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用作PD-I拮抗劑的多肽或可用作PD-I拮抗劑的融合蛋白的第一多肽部分由SEQ ID NO 1的氨基酸1-221組成，或由SEQ ID NO 1的氨基酸20-221 組成，或由SEQ ID NO :1的氨基酸沈-221組成，或由SEQ IDNO :3或4的氨基酸1-202組成。在一個(gè)實(shí)施方案(SEQ ID NO 2)中，它不包含SEQ ID NO 1的氨基酸1-19。在其它具體的例子中，PD-I拮抗劑多肽或PD-I拮抗劑融合蛋白的第一多肽部分包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列20-121，優(yōu)選地其中它包含其殘基110-114處的氨基酸序列WDYKY，或者包含SEQ ID NO :3的氨基酸1-102，優(yōu)選地其中它包含其殘基91-95處的氨基酸序列WDYKY。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類百分比同一性是通過(guò)依賴如本文中別處定義的保守性氨基酸替代實(shí)現(xiàn)的。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，PD-I拮抗劑多肽或PD-I拮抗劑融合蛋白的第一多肽部分不包含SEQ ID NO :1的氨基酸1-19，或者不包含跨膜結(jié)構(gòu)域的任何部分，尤其是不包含整個(gè)此類結(jié)構(gòu)域，或者不包含PD-I配體或其它PD-I拮抗劑蛋白的胞內(nèi)(或可溶性)結(jié)構(gòu)域的任何部分，尤其是不包含整個(gè)此類結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類拮抗劑或第一多肽部分只包含SEQ IDNO 1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(E⑶)，而且如此只包含所述序列的多肽的可溶性部分或所述可溶性部分的片段。在其它此類實(shí)施方案中，PD-I拮抗劑多肽或PD-I拮抗劑融合蛋白的第一多肽部分包含PD-I配體的IgV域或IgV樣域或其PD-I結(jié)合片段，或者由PD-I配體的IgV域或IgV 樣域或其PD-I結(jié)合片段組成。在具體的例子中，此類PD-I配體是野生型B7-DC或B7-H1 分子，優(yōu)選小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人野生型B7-DC或B7-H1分子。在其它此類實(shí)施方案中，PD-I拮抗劑多肽或PD-I拮抗劑融合蛋白的第一多肽部分，PD-I配體的IgV域或IgV樣域的PD-I結(jié)合片段，尤其是IgV域或IgV樣域的情況，由 SEQ ID NO 1的氨基酸20-121或SEQ ID NO 3的氨基酸1-102組成。本發(fā)明的PD-I拮抗劑還包括SEQ ID NO 1 (人全長(zhǎng))氨基酸20-121或SEQID NO:
193 (細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或E⑶)氨基酸1-102的PD-I結(jié)合片段。在其具體實(shí)施方案中，所述多肽或PD-I結(jié)合片段還摻入SEQ ID N0:1殘基 110-114處的氨基酸WDYKY或SEQ ID NO :3殘基91-95處的WDYKY。作為非限制性例子，此類PD-I結(jié)合片段包含SEQ ID NO :1氨基酸20-121序列的至少10個(gè)、或至少20個(gè)、或至少 30個(gè)、或至少40個(gè)、或至少50個(gè)、或至少60個(gè)、或至少70個(gè)、或至少75個(gè)、或至少80個(gè)、 或至少85個(gè)、或至少90個(gè)、或至少95個(gè)、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸，其中每一種此類PD-I 結(jié)合片段的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案會(huì)包含SEQ ID NO :1殘基110-114處找到的氨基酸WDYKY 或SEQ ID NO 3殘基91-95處找到的WDYKY作為子片段。本發(fā)明具體涵蓋的其它優(yōu)選多肽和PD-I結(jié)合片段包括SEQ ID NO :1(人全長(zhǎng))氨基酸20-121及其PD-I結(jié)合片段的多肽序列，其中在此類多肽或PD-I結(jié)合片段中，殘基42 和/或102處存在半胱氨酸，優(yōu)選這兩個(gè)位置都有半胱氨酸，和/或其中殘基21處存在苯丙氨酸，和/或其中殘基觀處存在谷氨酸，和/或其中蘇氨酸，和/或其中殘基60處存在谷氨酰胺，和/或其中殘基101處存在谷氨酸，和/或其中殘基103處存在異亮氨酸，和/或其中殘基105處存在異亮氨酸，和/或其中殘基107處存在甘氨酸，和/或其中殘基108處存在纈氨酸，和/或其中殘基110處存在色氨酸，和/或其中殘基111處存在天冬氨酸，和/ 或其中殘基112處存在酪氨酸，和/或其中殘基113處存在賴氨酸，和/或其中殘基114處存在酪氨酸，前提是在PD-I結(jié)合片段的情況中，所述片段大得足以包括此類氨基酸位置。本發(fā)明具體涵蓋的別的優(yōu)選多肽和PD-I結(jié)合片段包括SEQ ID N0:3(人E⑶)或 SEQ ID N0:4(小鼠E⑶)氨基酸1_102及其PD-I結(jié)合片段的多肽序列，其中在此類多肽或 PD-I結(jié)合片段中，殘基23和/或83處存在半胱氨酸，優(yōu)選這兩個(gè)位置都有半胱氨酸，和/ 或其中殘基2處存在苯丙氨酸，和/或其中殘基9處存在谷氨酸，和/或其中殘基37處存在蘇氨酸或精氨酸，優(yōu)選蘇氨酸，和/或其中殘基41處存在谷氨酰胺，和/或其中殘基82 處存在精氨酸，和/或其中殘基84處存在亮氨酸，和/或其中殘基86處存在異亮氨酸，和/ 或其中殘基88處存在甘氨酸，和/或其中殘基89處存在丙氨酸，和/或其中殘基91處存在色氨酸，和/或其中殘基92處存在天冬氨酸，和/或其中殘基93處存在酪氨酸，和/或其中殘基94處存在賴氨酸，和/或其中殘基95處存在酪氨酸，前提是在PD-I結(jié)合片段的情況中，所述片段大得足以包括此類氨基酸位置。在別的實(shí)施方案中，任何上述多肽還可摻入取自B7-DC或B7-H1多肽(諸如小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的，優(yōu)選人的)信號(hào)、跨膜或C端域的部分或片段，例如1至10個(gè)連續(xù)氨基酸的。 此類多肽和/或PD-I結(jié)合片段還可存在于本發(fā)明的任何融合蛋白中，例如此類多肽或PD-I結(jié)合片段呈現(xiàn)此類融合蛋白之“第一多肽”的情況。 在具體的例子中，在本發(fā)明的治療方案中與增強(qiáng)劑組合使用的分子包含SEQ ID NO :1的氨基酸20-221的PD-I結(jié)合片段。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，所述片段來(lái)自SEQ ID NO :1的氨基酸20-121，優(yōu)選所述片段含有SEQ ID NO :1氨基酸110-114的情況。在一些實(shí)施方案中，存在一個(gè)以上此類片段(如本文中別處描述的)，而且所述分子包含B7-DC蛋白的至少2，3，4，5或更多個(gè)片段，尤其是所述片段是SEQ ID NO 1氨基酸20-221的一部分或包含SEQ IDNO :1氨基酸20-221 —部分的情況。在其一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)所述片段來(lái)自SEQ ID NO :1的氨基酸20-121，更優(yōu)選其中至少一個(gè)所述片段包括SEQ ID NO
201的氨基酸110-114(即序列WDYKY(SEQ ID NO :14))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-I結(jié)合片段在長(zhǎng)度上包含至少10個(gè)、或至少25個(gè)、或至少50個(gè)、或至少75個(gè)、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。內(nèi)源人信號(hào)肽具有如下序列MIFLLLMLSL ELQLHQIAA (SEQ IDNO 5)，而且呈現(xiàn)SEQ ID NO 1的頭19個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，B7-DC的多肽片段可包括內(nèi)源或異源信號(hào)肽的1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)連續(xù)氨基酸(其可用于通過(guò)在經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)及自經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌來(lái)生成重組B7-DC多肽)。還會(huì)領(lǐng)會(huì)，有用的B7-DC多肽可包括B7-DC跨膜結(jié)構(gòu)域的1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)連續(xù)氨基酸和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的1，2，3，4，5，6，7，8， 9或10個(gè)連續(xù)氨基酸或其組合，前提是B7-DC片段保留拮抗PD-I受體的能力。PD-I-/-小鼠的表型為在體內(nèi)PD-I是免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)物提供了直接證據(jù)。 在PD-I缺失下，C57BL/6背景上的小鼠緩慢發(fā)生狼瘡樣腎小球腎炎和進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎 (Nishimura 等，Immunity, 11 141-151 (1999))。BALB/c 背景上的 PD-I-/-小鼠迅速發(fā)生致命的自身免疫性擴(kuò)張型心肌病(Nishimura等，Science. 291 =319-322 (2001)) 0然而，實(shí)質(zhì)性證據(jù)指示B7-DC能發(fā)揮共刺激活化T細(xì)胞應(yīng)答的功能。在亞最佳TCR信號(hào)存在下，在體外B7-DC引起升高的增殖和細(xì)胞因子生成(Tseng等，J.Exp. Med. 193 :839-846 (2001))。 另一方面，體外研究指示B7-DC在T細(xì)胞應(yīng)答中的負(fù)調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞上PD-I以外的別的 B7-DC受體的表達(dá)最好地解釋了這些表面上矛盾的數(shù)據(jù)。因此，B7-DC蛋白、其變體、片段和融合物可具有如下優(yōu)點(diǎn)，即在通過(guò)阻止PD-I介導(dǎo)的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答之外，通過(guò)結(jié)合活化T細(xì)胞的未知受體來(lái)直接增強(qiáng) T細(xì)胞應(yīng)答。2. B7-H1 多肽在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的治療方案中與增強(qiáng)劑組合使用的化合物是或包含哺乳動(dòng)物B7-H1 (優(yōu)選來(lái)自小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人)的片段，其中所述片段結(jié)合及阻斷PD-I但不導(dǎo)致經(jīng)由PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且所述片段長(zhǎng)度為至少10個(gè)、或至少20個(gè)、 或至少30個(gè)、或至少40個(gè)、或至少50個(gè)、或至少60個(gè)、或至少70個(gè)、或至少80個(gè)、或至少 90個(gè)、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，片段的長(zhǎng)度可以是可變的，只要它具有結(jié)合PD-I但不生成導(dǎo)致T細(xì)胞增殖降低的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。此類B7-H1片段還可用作本發(fā)明融合蛋白第一多肽部分的一部分。B7-H1序列如下人B7-H1 多肽(SEQ ID NO 16)MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIECDKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNMLQADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGYTTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENHLVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK小鼠B7_H1(SEQ ID NO :17)MRIFAGIIFT ACCHLLRAFT ITAPKDLYVV EYGSNVTMECDEQVIQFVAG EEDLKPQHSN FRGRASLPKD QLLKGNMLQADYKRITLKV NAPYRKINQR ISVDPATSEH ELICQAEGYP
KFPVEKQLDL MLIVYWEME60
ITDVKLQDAG VYRCMISYGG120
PKAEVIffTSS DHQVLSGKTT180
TAELVIPELP LAHPPNERTH240
KQSDTHLEET290
RFPVERELDL LALVVYWEKE60
ITDVKLQDAG VYCCIISYGG120
EAEVIffTNSD HQPVSGKRSV280TTSRTEGMLL NVTSSLRVNA TANDVFYCTF WRSQPGQNHT AELIIPELPA THPPQNRTHW 240VLLGS ILLFL IVVSTVLLFL RKQVRMLDVE KCGVEDTSSK NRNDTQFEET290獼猴(Macacamulatta) PD-L 1 (SEQ ID NO :18)MRIFAVFIFT IYffHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGS匪TIEC RFPVEKQLGL60TSLIVYffEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSN YRQRAQLLKD QLSLGNAALR 120ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE180HELTCQAEGY PKAEVIffTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL LNVTSTLRIN 240TTANEIFYCI FRRLGPEENH TAELVIPELP LALPPNERTH LVILGAIFLL300LGVALTFIFY LRKGRMMDMK KSGIRVTNSK KQRDTQLEET340B7-Hl-Ig蛋白記載于W0/2001/014557 (公布于2001年3月1日)和 W0/2002/079499 (公布于 2002 年 10 月 10 日)。3. PD-I和其它多肽本發(fā)明的其它有用多肽包括那些結(jié)合PD-I受體之配體的多肽。這些包括PD-I 受體蛋白或其可溶性片段，其能結(jié)合PD-I配體諸如B7-H1或B7-DC，及阻止結(jié)合內(nèi)源PD-I 受體，由此阻止抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。B7-H1還顯示出結(jié)合蛋白B7. l(Butte等，Immunity， Vol.27, pp. 111-122(2007))。此類片段還包括如下的PD-I蛋白可溶性E⑶部分，其包括提高對(duì)天然配體的結(jié)合的突變諸如A99L突變(Molnar等，Crystal structure of the complex between programmeddeath-l(PD-1)and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, PP. 10483-10488 (29July2008))。如下的B7_l或可溶性其片段也是有用的，其能結(jié)合B7-H1 配體及阻止結(jié)合內(nèi)源PD-I受體，由此阻止抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本發(fā)明的方法中有用的PD-I多肽如下人PD-I(SEQ ID NO 19)MQIPQAPWPV VffAVLQLGffR PGWFLDSPDR PWNPPTFFPALLVVTEGDNATFTCSFSNTS60ESFVLNffYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGT120YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGS180LVLLVffVLAV ICSRMRGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFSVDYGELDFQffREKTPEPPVP240CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPEDGHCSWPL288獼猴(Cynomolgus monkey) PD-I (SEQ ID NO :20)MQIPQAPWPV VffAVLQLGffR PGWFLESPDR PWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNAS60ESFVLNffYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGT120YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGS180LVLLVffVLAV ICSRMRGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFSVDYGELDFQffREKTPEPPVP240CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPEDGHCSWPL288依照本發(fā)明，因?yàn)锽7-1及其片段還能結(jié)合B7-H1及經(jīng)由B7-H1將抑制性轉(zhuǎn)導(dǎo)傳送
至T細(xì)胞，所以阻斷這種相互作用也能降低經(jīng)由B7-H1發(fā)生的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本發(fā)明中使用的化合物包括那些阻斷這種類型相互作用的分子。此類分子披露于Butte等(2007)， 見(jiàn)上文，而且包括具有雙特異性的抗B7-H1抗體，其阻斷B7-H1 :B7_1和B7-H1 :PD_1任一相互作用，以及展現(xiàn)單特異性的抗體，其阻斷PD-Ll :B7-1相互作用。通過(guò)阻斷B7-1來(lái)阻斷這種相互作用的化合物也是有用的，而且包括抗B7-1抗體。4.變異多肽如描述的，在本發(fā)明中有用的多肽包括那些經(jīng)過(guò)突變以含有一處或多處氨基酸替代、刪除、或插入的多肽。用于誘變的方法是本領(lǐng)域已知的。通過(guò)結(jié)合PD-I的配體，突變或變異多肽抑制或降低經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體?；蛘?，變體(例如B7-DC多肽)能結(jié)合PD-I受體及抑制、降低、或阻斷經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。變異多肽可以是任何物種起源的。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異多肽來(lái)自哺乳動(dòng)物物種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，變異多肽是鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人起源的。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異多肽是如下的B7-DC多肽，具有與野生型或非變異B7-DC 相同的對(duì)PD-I的結(jié)合親和力，但是具有相對(duì)于未突變的B7-DC多肽不到10%的觸發(fā)經(jīng)由 PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力或不具有該能力。在其它實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽具有比野生型B7-DC大10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、或60 %的對(duì)PD-I的結(jié)合親和力且不觸發(fā)PD-I抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。變異多肽(例如變異B7-DC多肽)包括那些具有氨基酸替代、刪除或插入的任何組合的變異多肽，只要PD-I拮抗活性相對(duì)于野生型沒(méi)有實(shí)質(zhì)性降低。然而，在有此類降低的情況中，這應(yīng)當(dāng)不超過(guò)野生型的一半，使得所述變體具有野生型蛋白質(zhì)的PD-I拮抗劑活性的至少50 %，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少80 %，最優(yōu)選至少90 %或95 %，尤其優(yōu)選至少 100%。甚至更加想要源自所述變體的此類活性升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的B7-DC變異多肽具有氨基酸改變，使得它們的氨基酸序列與野生型B7-DC多肽(尤其是來(lái)自哺乳動(dòng)物的，優(yōu)選野生型小鼠或野生型靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人B7-DC多肽)的氨基酸序列共享至少 60、70、80、85、90、95、97、98、99、99. 5 或 100% 同一性。多肽序列同一性可以使用上文提供的百分比同一性的定義來(lái)計(jì)算。多肽中的氨基酸替代可以是“保守的”或“非保守的”。B7家族分子(包括B7-DC)在細(xì)胞表面處表達(dá)，有一個(gè)近膜恒定IgC域和一個(gè)遠(yuǎn)膜 IgV域。這些配體的受體共享共同的胞外IgV樣域。受體-配體對(duì)的相互作用主要經(jīng)由配體和受體的IgV域中的殘基來(lái)介導(dǎo)。通常，IgV域被描述為具有兩個(gè)片層，每個(gè)含有一層β 鏈。這些β鏈稱作A’、B、C、C’、C”、D、E、F和G。在一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC變異多肽在一個(gè)或多個(gè)這些β鏈內(nèi)含有任何可能組合形式的氨基酸改變(即替代、刪除或插入)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC變體在Α’、C、C’、C”、D、Ε、F或G β鏈內(nèi)含有一處或多處氨基酸改變(即替代、刪除或插入)。在一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC變體在Gi3鏈內(nèi)含有一處或多處氨基酸改變。關(guān)于小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人B7-DC，變異B7-DC多肽可以在相對(duì)于未突變的 B7-DC不會(huì)實(shí)質(zhì)性降低對(duì)PD-I的結(jié)合的位置處含有但不限于替代、刪除或插入。然而，可以理解的是，所述氨基酸位置處的替代可以使用任何氨基酸或氨基酸類似物來(lái)進(jìn)行。例如，所述位置處的替代可以用任何天然存在氨基酸(例如丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、 半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸)來(lái)進(jìn)行。雖然本文中描述的替代是關(guān)于小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人B7-DC的，但是，注意到，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能容易地在來(lái)自其它物種(例如大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、沙鼠、家兔、犬、 貓、馬、豬、綿羊、?；蚍侨遂`長(zhǎng)類動(dòng)物)的相應(yīng)多肽中進(jìn)行等同改變。
23優(yōu)選的片段包括B7-DC的有效結(jié)合PD-I的整個(gè)或部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段是那些保留結(jié)合PD-I的能力且不觸發(fā) PD-I抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。一個(gè)實(shí)施方案提供變異B7-DC多肽，其是全長(zhǎng)B7-DC的片段且通常具有全長(zhǎng)變異 B7-DC 多肽的至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、 98%、99%、100%、或甚至超過(guò)100%的PD-I拮抗劑活性。變異B7-DC多肽的有用片段包括可溶性片段。可溶性B7-DC片段是可以自生成細(xì)胞脫落、分泌或以其它方式提取的B7-DC片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的整個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。B7-DC的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人B7-DC的氨基酸約20至約氨基酸221。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括 B7-DC的IgC和IgV域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段包括B7-DC的IgV域。在一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC多肽片段含有多肽中對(duì)于對(duì)PD-I的結(jié)合親和力重要的區(qū)。這些多肽片段可用于結(jié)合及阻斷PD-I受體以阻止天然配體結(jié)合PD-I受體，由此增強(qiáng)免疫應(yīng)答。抑制天然B7-H1或B7-DC與PD-I的相互作用抑制在其它情況中會(huì)發(fā)生的對(duì)免疫應(yīng)答的遏制。作為非限制性例子，小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人B7-DC的結(jié)合PD-I的多肽片段含有氨基酸101-105或111-113。與片段缺失情況下B7-H1對(duì)PD-I的結(jié)合水平相比，B7-H1對(duì)PD-I受體的結(jié)合通常被抑制至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少 75%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或更多。人PD-I突變體A99L以比未突變的人PD-I要高的親和力結(jié)合B7-DC和 B7-H1 (Lazar Molnar 等 PNAS 105p. 10483-10488 (2008)) 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，起降低抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用的化合物是可溶性蛋白質(zhì)，諸如摻入這種突變的PD-I的ECD。5.經(jīng)修飾的多肽如所述的，在本發(fā)明中有用的多肽(包括其變體、同系物和片段)可以通過(guò)在正常細(xì)胞環(huán)境中發(fā)現(xiàn)與多肽關(guān)聯(lián)的化學(xué)模塊來(lái)修飾，例如通過(guò)多肽的磷酸化、甲基化、酰胺化、 硫酸化、?；?、糖基化、sumoylation和遍在蛋白化。此類多肽也可以通過(guò)在細(xì)胞環(huán)境中正常情況下不是多肽一部分的化學(xué)模塊來(lái)修飾。通過(guò)使多肽的靶定氨基酸殘基與有機(jī)衍生化試劑(其能夠與選定側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng))反應(yīng)，可以將此類修飾引入分子。另一種有用的修飾是蛋白質(zhì)的環(huán)化。此類修飾還包括引入能夠直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物，包括但不限于放射性同位素和熒光化合物。多肽的化學(xué)衍生物的例子包括用琥珀酸或其它羧酸酐衍生化的賴氨酰和氨基末端殘基。用環(huán)狀羧酸酐衍生化具有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的效果。用于衍生化含氨基殘基的其它合適試劑包括亞氨酸酯諸如甲基吡啶亞胺甲酯；吡哆醛磷酸；吡哆醛；氯硼氫化物； 三硝基苯磺酸；0-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。側(cè)鏈羧基天冬氨?；蚬劝滨？梢酝ㄟ^(guò)與碳二亞胺(R-N = C = N-R')諸如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3- (4-氮陽(yáng)離子-4，4- 二甲基苯基)碳二亞胺反應(yīng)來(lái)選擇性修飾。此外，通過(guò)與氨反應(yīng)，天冬氨酰和谷氨酰殘基可以轉(zhuǎn)變成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。本發(fā)明的多肽也可以包括一種或多種D-氨基酸，其替代一種或多種L-氨基酸。在其它實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑諸如CTX自身可以是降低抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物的一部分，諸如增強(qiáng)劑化學(xué)連接至本發(fā)明PD-I拮抗劑的情況。
246.融合蛋白還提供了融合多肽，其具有第一融合配偶或多肽部分，該第一融合配偶或多肽部分包含整個(gè)或部分PD-I拮抗劑蛋白，例如B7-DC多肽，包括其變體、同系物及其片段，(i)直接融合至第二多肽或(ii)任選融合至接頭肽序列，接頭肽序列融合至第二多肽。融合配偶的存在能改變例如PD-I拮抗劑多肽的溶解度、親和力和/或效價(jià)。所公開(kāi)的融合蛋白包括如上所述的PD-I拮抗劑多肽的氨基酸改變(即替代、刪除或插入)、片段、和/或修飾的任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，B7-DC融合蛋白包括B7-DC蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域作為第一結(jié)合配偶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類B7-DC融合蛋白包括B7-DC蛋白的IgV和IgC域作為第一結(jié)合配偶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變異B7-DC融合蛋白包括B7-DC蛋白的IgV域作為第一結(jié)合配偶。代表性第一融合配偶包括上文公開(kāi)的靈長(zhǎng)類動(dòng)物優(yōu)選人或小鼠B7-DC多肽、其片段、和其變體。優(yōu)選片段包括B7-DC的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。如所述的，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包括信號(hào)肽、B7-DC跨膜結(jié)構(gòu)域、或二者的1-10個(gè)連續(xù)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和/或產(chǎn)物和/或方法利用PD-I受體拮抗劑，尤其是多肽，包括其變體、同系物和片段，它們偶聯(lián)至其它多肽以形成融合蛋白，通過(guò)結(jié)合PD-I配體諸如B7-H1，由此抑制配體與PD-I相互作用來(lái)拮抗PD-I受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-I受體拮抗劑多肽或其變體偶聯(lián)至其它多肽以形成融合蛋白，其通過(guò)結(jié)合及阻斷PD-I受體來(lái)拮抗PD-I受體及抑制或降低經(jīng)由PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相對(duì)于PD-I拮抗劑多肽，第二多肽結(jié)合配偶或第二多肽部分可以在N端或C端。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二多肽在PD-I拮抗劑多肽的C端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為在本發(fā)明的方法和組合物和/或產(chǎn)物中使用而涵蓋的融合蛋白至少包含抗體的一部分。隨著重組技術(shù)和分子生物學(xué)方法的出現(xiàn)，現(xiàn)在有可能通過(guò)重組手段生成抗體分子，及由此生成編碼在抗體的多肽結(jié)構(gòu)中找到的特定氨基酸序列的基因序列。此類抗體可以如下生成，或是克隆編碼所述抗體之多肽鏈的基因序列或是直接合成所述多肽鏈，在體外裝配合成的鏈以形成對(duì)特定表位和抗原決定簇具有親和力的活性四聚物(H2L2)結(jié)構(gòu)。這允許容易地生成具有來(lái)自不同物種和來(lái)源的中和性抗體的特征性序列的抗體。不管抗體的來(lái)源，或它們是如何重組構(gòu)建的，或它們是如何合成的，在體外或在體內(nèi)，使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，諸如牛、山羊和綿羊，使用實(shí)驗(yàn)室或商業(yè)規(guī)模的大量細(xì)胞培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器中或通過(guò)直接化學(xué)合成(其在工藝的任何階段都不采用活的生物體)，所有抗體具有相似的總體三維結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)常常以H2L2給出，而且指抗體通常包含2條輕(L)氨基酸鏈和2條重(H)氨基酸鏈。這兩種鏈都具有能夠與結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原靶相互作用的區(qū)。與靶相互作用的區(qū)稱作“可變”或“V”區(qū)，而且以來(lái)自抗原特異性不同的抗體的氨基酸序列的差異來(lái)表征。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-I受體拮抗劑多肽，包括片段、突變體和其它變體，具有第一融合配偶，該第一融合配偶具有整個(gè)或部分B7-DC蛋白或其變體，其(i)直接融合至第二多肽或(ii)任選融合至接頭肽序列，接頭肽序列融合至第二多肽。融合配偶的存在能改變B7-DC多肽的溶解度、親和力和/或效價(jià)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，B7-DC多肽融合至Ig 重鏈恒定區(qū)的一種或多種域，更優(yōu)選與人免疫球蛋白C y 1鏈的Ch2和Ch3區(qū)或與鼠免疫球蛋白CYh鏈的鉸鏈、Ch2*Ch3區(qū)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，恒定區(qū)優(yōu)選包括突變(例如N297Q)來(lái)消除或降低Fc受體結(jié)合。人免疫球蛋白c γ 1鏈的鉸鏈、ch2和ch3區(qū)具有如下氨基酸序列EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF 60NffYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDffLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT 120ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 180PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RffQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK232(seq id no :6)。小鼠免疫球蛋白CYh鏈的鉸鏈、Ch2和Ch3區(qū)具有如下氨基酸序列EPRGPTIKPC PPCKCPAPNL LGGPSVFIFP PKIKDVLMIS LSPIVTCVVV DVSEDDPDVQ 60ISWFVNNVEV HTAQTQTHRE DYNSTLRVVS ALPIQHQDWM SGKEFKCKVN NKDLPAPIER 120TISKPKGSVR APQVYVLPPP EEEMTKKQVT LTCMVTDFMP EDIYVEffTNN GKTELNYKNT 180EPVLDSDGSY FMYSKLRVEK KNffVERNSYS CSVVHEGLHN HHTTKSFSRT PGK233(seq id no 7)例示性小鼠B7-DC融合蛋白含有小鼠B7-DC的氨基酸20_221，其融合至鼠 IgG2a(CAA49868)的氨基酸237-469。人B7-DC融合蛋白可含有人B7-DC的氨基酸20-221， 其融合至人IgGl(AAA02914)的氨基酸對(duì)5_476。用于B7-DC融合蛋白的信號(hào)肽可以是內(nèi)源信號(hào)肽或任何其它信號(hào)肽，其促進(jìn)宿主分泌融合蛋白。一種代表性小鼠b7-dc_ig融合蛋白由seq id no 8的核酸序列編碼。會(huì)領(lǐng)會(huì)，所公開(kāi)的核酸序列可進(jìn)行密碼子優(yōu)化以提高合成在本發(fā)明的方法和組合物中有用的融合蛋白的表達(dá)水平。用于密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知的。由SEQ ID NO 8編碼的小鼠B7_DC_Ig融合蛋白具有如下氨基酸序列MLLLLPILNL SLQLHPVMLFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQ60KVENDTSLQS ERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQY RCLVICGMffDYKYLTVKVK120ASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSffQNVSV PANTSHIRTPEGLYQVTSVL180RLKPQPSRNF SCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRMEPKVPRTWEPRGPTIKPCPPCKCPAPN240LLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDV QISWFVNNVEVHTAQTQTHR300EDYNSTLRVVSALPIQHQDffMSGKEFKCKVNMDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPP360PEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEffTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVE420KKNffVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK454(SEQ ID NO9)SEQ ID NO 10提供小鼠B7-DC-Ig融合蛋白的氨基酸序列，沒(méi)有信號(hào)序列。LFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRREC TELEGIRASLQKVENDTSLQ SERATLLEEQ60LPLGKALFHIPSVQVRDSGQ YRCLVICGM WDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEV120QLTCQARGYPLAEVSffQNVS VPANTSHIRT PEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHM180KELTSAIIDPLSRMEPKVPR TWEPRGPTIK PCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLM240ISLSPIVTCVVVDVSEDDPD VQISWFVNNV EVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQD300^sgkefkckVNNKDLPAPIERTISKPKGS VRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDF360MPEDIYVEffTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNffVERNSYSCSVVHEGL420HNHHTTKSFSRTPGK435(SEQ ID NO10)在一個(gè)實(shí)施方案中，人B7-DC-Ig由編碼人B7-DC-Ig之氨基1g序列的SEQIDNO ；11的核·陵序列編碼MIFLLLMLSLELQLHQIMLFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQ60KVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAff腿YLTLKVK120ASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVL180RLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLAS酬SQMEPRTHPTWEPKSCDKTHTCPPCPAPEL240LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREE300QYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS360RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK420SRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK453(SEQ ID NO12) 本發(fā)明具體涵蓋如下的實(shí)施方案，其中在本發(fā)明的方法和組合物中有用的成熟融合蛋白切除了信號(hào)序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，信號(hào)序列被完全切除。SEQ ID NO 13提供人B7-DC-Ig的氨基酸序列，沒(méi)有信號(hào)序列ULFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASL QKVENDTSPHRERATLLEEQ60LPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEV120ELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHV180RELTLASIDLQSQMEPRTHPTWEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI240SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDff300LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY360PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALH420NHYTQKSLSLSPGK434(SEQ ID NO13)。本發(fā)明具體涵蓋如下的實(shí)施方案，其中在本文中公開(kāi)的方法和組合物中使用的所公開(kāi)的B7-DC-Ig融合蛋白與SEQ ID NO :9，10，12或13具有至少約80%、85%、90%、99% 或100%序列同一性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽可具有雙特異性功能，由此第一融合配偶結(jié)合PD-I的配體，諸如B7-H1，而第二融合配偶結(jié)合PD-I受體且不觸發(fā)經(jīng)由PD-I受體的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然在本發(fā)明中有用的多肽可以是單體或二聚物，融合蛋白自身可以以單體或二聚物形式存在，優(yōu)選二聚物。在具體的實(shí)施方案中，可用作本發(fā)明方法和組合物中的PD-I 拮抗劑的融合蛋白可自發(fā)裝配成寡聚物，尤其是二聚物形式，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域公知手段化學(xué)連接以形成此類寡聚物。例如，可用于實(shí)施本發(fā)明的融合蛋白自身可以包含B7-DC 多肽的一部分，其融合至抗體的一部分，而且這些可以進(jìn)一步裝配成二聚物。在一個(gè)此類例子中，用于本發(fā)明的多肽作為單一氨基酸鏈融合至抗體的Fc區(qū)(諸如這種構(gòu)建物自單一重組多核苷酸表達(dá)的情況)，之后兩個(gè)此類融合產(chǎn)物彼此連接以形成同二聚物，諸如通過(guò)各 Fc區(qū)之間二硫化物連接。
27此類二聚物產(chǎn)物可以是同二聚物(兩個(gè)單體融合蛋白相同的情況)或者可以是異二聚物(兩個(gè)不同融合蛋白彼此連接的情況)。此類二聚物的各個(gè)單體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段來(lái)連接，諸如通過(guò)共價(jià)連接(例如二硫鍵)或通過(guò)非共價(jià)連接(諸如離子相互作用)。在本發(fā)明的實(shí)施例中使用的B7-DC-Ig以同二聚物的形式存在，其具有2個(gè)拷貝的SEQ ID NO :10，通過(guò)二硫化物連接連接在一起。另外，本發(fā)明的異二聚物包括雙特異性蛋白和融合蛋白，其中一種單體部分結(jié)合PD-1，而另一種結(jié)合PD-I的天然配體。此類異二聚物通過(guò)偶聯(lián)本文中別處全面描述的多肽和融合蛋白來(lái)形成。在本發(fā)明的另一個(gè)有用的實(shí)施方案中，PD-I拮抗劑是異二聚物，諸如兩個(gè)融合蛋白連接在一起但它們不是相同氨基酸序列的情況。在一個(gè)具體的例子中，每個(gè)單體可包含抗體Fc部分，其連接至B7-DC多肽的活性片段，其中這些活性片段來(lái)自B7-DC多肽的不同部分，或其中包含與全長(zhǎng)天然B7-DC多肽融合的抗體Fc部分的融合蛋白連接(例如交聯(lián)) 至包含抗體Fc部分和全長(zhǎng)天然B7-DC多肽之活性片段的融合蛋白。在每一種此類情況中， 形成每個(gè)單體融合蛋白中使用的部分抗體在兩個(gè)單體單元之間可以是不同的。本發(fā)明的方法和組合物具體涵蓋任何此類二聚物組合。在一種優(yōu)選的二聚物融合蛋白中，二聚物源自兩條Ig重鏈的CH區(qū)中的Cys殘基的共價(jià)鍵合，該Cys殘基與二聚化的正常Ig重鏈中二硫化物連接的Cys殘基相同。又一個(gè)實(shí)施方案提供一種四聚物構(gòu)建物，該構(gòu)建物具有BirA底物，其融合至變異B7-DC多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。用于生成四聚物構(gòu)建物的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn) Pertovas 等，J. Exp. Med.，203 :2281 (2006))。7.抗PD-I和其它抗體本發(fā)明的方法涵蓋的其它PD-I拮抗劑包括結(jié)合PD-I或PD-I配體的抗體和其它抗體。在一個(gè)發(fā)明，本發(fā)明涉及一種在有下述需要的哺乳動(dòng)物中提高T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用包含抗PD-I抗體和增強(qiáng)劑的有效治療方案，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物對(duì)所述抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明的治療方案中有用的抗PD-I抗體包括但不限于那些記載于下述出版物的PCT/IL03/00425 (Hardy 等，W0/2003/099196)PCT/JP2006/309606 (Korman 等，W0/2006/121168)PCT/US2008/008925 (Li 等，W0/2009/014708)PCT/JP03/08420 (Honjo 等，W0/2004/004771)PCT/JP04/00549 (Honjo 等，W0/2004/072286)PCT/IB2003/006304(Collins 等，W0/2004/056875)PCT/US2007/088851 (Ahmed 等，W0/2008/083174)PCT/US2006/026046 (Korman 等，W0/2007/005874)PCT/US2008/084923 (Terrett 等，W0/2009/073533)Berger 等，Clin. Cancer Res.，Vol. 14，pp. 30443051 (2008)。在本發(fā)明的方法中有用的抗PD-I抗體的一個(gè)具體的例子是MDX-1106 (參見(jiàn) Kosak, US 20070166281 (pub. 19July 2007) at par. 42)，一種人抗 PD-1 抗體，優(yōu)選以 3mg/
28kg的劑量施用。在另一個(gè)發(fā)明，本發(fā)明涉及一種在有下述需要的哺乳動(dòng)物中提高T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用包含抗PD-I配體抗體(例如抗B7-H1抗體)和增強(qiáng)劑的有效治療方案，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物對(duì)所述抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明的治療方案中有用的抗B7-H1抗體包括但不限于那些記載于下述出版物的PCT/US06/022423(W0/2006/133396, pub. 14December 2006)PCT/US07/088851(W0/2008/083174, pub.IOJuly 2008)US 2006/0110383(pub. 25May 2006)在本發(fā)明的方法中有用的抗B7-H1抗體的一個(gè)具體的例子是 MDX-1105 (W0/2007/005874, published 11 January 2007)，一種人抗 B7-H1 抗體。對(duì)于抗B7-DC 抗體，參見(jiàn) 7，411，051,7, 052，694,7, 390，888,20060099203ο本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括一種雙特異性抗體，其包含結(jié)合PD-I受體的抗體和與該抗體橋接的結(jié)合PD-I配體諸如Β7-Η1的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-I結(jié)合部分降低或抑制經(jīng)由PD-I受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本發(fā)明中使用的抗體不必是抗PD-I或抗PD-I配體抗體，但是可以是可用于介導(dǎo)T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的作用的其它抗體。在這個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在有下述需要的哺乳動(dòng)物中提高針對(duì)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用包含抗 CTLA4抗體和增強(qiáng)劑的有效治療方案，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物對(duì)所述抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。為在本發(fā)明的方法中使用而涵蓋的抗CTLA4抗體的一個(gè)例子包括PCT/ US2006/043690 (Fischkoff 等，W0/2007/056539)中記載的抗體。在本發(fā)明的方法中有用的抗CTLA4抗體的具體例子是Ipilimumab，也稱作 MDX-010或MDX-101，一種人抗CTLA4抗體，優(yōu)選以10mg/kg的劑量施用，及iTremelimumab, 一種人抗CTLA4抗體，優(yōu)選以15mg/kg的劑量施用。8.小分子PD-I拮抗劑PD-I受體拮抗劑也可以是小分子拮抗劑。術(shù)語(yǔ)“小分子”指具有大于100且小于約2，500道爾頓的分子量的有機(jī)小化合物，優(yōu)選介于100和2000之間，更優(yōu)選介于約100 和約1250之間，更優(yōu)選介于約100和約1000之間，更優(yōu)選介于約100和約750之間，更優(yōu)選介于約200和約500道爾頓之間。小分子常常包括環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或多芳香族結(jié)構(gòu)，被一種或多種官能團(tuán)取代。通過(guò)結(jié)合PD-I的配體諸如B7-H1和B7-DC及阻止配體與PD-I相互作用或者通過(guò)直接結(jié)合及阻斷PD-I受體且不觸發(fā)經(jīng)由PD-I受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，小分子拮抗劑降低或干擾PD-I受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類小分子可以與另一種PD-I拮抗劑或CTLA4拮抗劑，諸如對(duì)PD-I或其配體之一特異性的抗體或?qū)TLA4或其配體之一特異性的抗體組合施用。如此，此類小分子可以作為化合物在本發(fā)明的一種或多種方法中施用，或者可以與在本發(fā)明的方法中有用的其它化合物組合施用。例如，一系列有機(jī)小化合物顯示出結(jié)合B7-1配體以阻止結(jié)合 CTLA4 (參見(jiàn) Erbe 等，J. Biol. Chem.，Vol. 277，pp. 7363-7368 (2002))。此類小有機(jī)物可以單獨(dú)地或與抗CTLA4抗體一起地，與CTX施用聯(lián)合施用以降低T細(xì)胞的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為在本發(fā)明的方法中使用而涵蓋PD-I拮抗劑或CTLA4拮抗劑包括反義核酸，DNA和RNA皆可，以及siRNA分子。此類反義分子阻止PD-I在T細(xì)胞上表達(dá)以及T細(xì)胞配體諸如B7-H1、PD-Ll和PD-L2生成。例如，與載體諸如聚乙烯亞胺(參見(jiàn) Cubillos-Ruiz 等，J. Clin. Invest. 119(8) :2231-2244(2009))復(fù)合的 siRNA(例如長(zhǎng)度為約21個(gè)核苷酸的，對(duì)編碼PD-I或編碼PD-I配體的基因特異性的，且該寡核苷酸可以容易地購(gòu)得)易于被表達(dá)PD-I以及PD-I配體的細(xì)胞攝取，并降低這些受體和配體的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞中的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低，由此活化T細(xì)胞。B.增強(qiáng)劑依照本發(fā)明，在增強(qiáng)劑存在下，PD-I拮抗劑的活性升高，優(yōu)選協(xié)同地升高。增強(qiáng)劑起提高PD-I受體拮抗劑的功效的作用，可能通過(guò)超過(guò)一種機(jī)制，盡管確切的作用機(jī)制對(duì)于本發(fā)明的廣泛實(shí)施不是至關(guān)重要的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺。環(huán)磷酰胺(CTX，Cytoxan ,或 Neosar )是一種oxazahosphorine藥物，而類似物包括異環(huán)磷酰胺(IF0，Ifex)、過(guò)磷酰胺(perfosfamide)、曲磷酉先胺(trophosphamide) (trofosfamide, Ixoten),及其藥學(xué)可接受鹽、溶劑合物、前藥和代謝物(美國(guó)專利申請(qǐng)20070202077，完整收入本文)。異環(huán)磷酰胺 (MITOXANA )是環(huán)磷酰胺的一種結(jié)構(gòu)類似物，而且認(rèn)為它的作用機(jī)制與環(huán)磷酰胺的相同或?qū)嵸|(zhì)性相似。過(guò)磷酰胺(4-氫過(guò)氧環(huán)磷酰胺)和曲磷酰胺也是烷化劑，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與環(huán)磷酰胺相關(guān)。例如，過(guò)磷酰胺烷化DNA，由此抑制DNA復(fù)制及RNA和蛋白質(zhì)合成。已經(jīng)設(shè)計(jì)并評(píng)估了新的oxazaphosphorine衍生物，試圖改善選擇性和應(yīng)答及降低宿主毒性(Liang J, Huang Μ, Duanff, Yu XQ, Zhou S.Design of new oxazaphosphorineanticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007 ；13 (9) :963-78. Review)。這些包括馬磷酰胺(NSC 345842)、葡磷酰胺(D19575，0-0-葡萄糖基異磷酰胺芥)、3-(-)-溴異丙異煙胼(CBM_11)、NSC 612567(醛磷酰胺全氫噻嗪)和NSC 613060 (醛磷酰胺噻唑烷)。馬磷酰胺是一種oxazaphosphorine 類似物，它是4-羥基-CPA的化學(xué)穩(wěn)定的4-硫乙烷磺酸鹽。葡磷酰胺是IFO衍生物，其中異磷酰胺芥(IF0的烷化代謝物)以糖苷鍵連接至β-D-葡萄糖分子。別的環(huán)磷酰胺類似 ^ Ι ^,^Μ^] "Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumor agents，，的
5，190, 929，通過(guò)述及完整收入本文。在其它實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑是降低調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T-reg)活性和/或減少調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T-reg)數(shù)目的藥劑，優(yōu)選Simitinib (SUTENT )、抗TGFi3或 lmatinib (GLEEVAC )。所述治療方案也可以包括施用佐劑。有用的增強(qiáng)劑還包括有絲分裂抑制劑諸如帕立他塞、芳香酶抑制劑(例如來(lái)曲唑)和血管發(fā)生抑制劑(VEGF抑制劑，例如Avastin、VEGF-Trap)(參見(jiàn)例如Li等，Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoralregulatory T cells and enhances the efficacy of a GM—CSF—secreting cancerimmunotherapy. Clin Cancer Res. 2006 Nov 15 ；12(22) :6808-16)、蒽環(huán)類抗生素、奧沙利鉬、多柔比星、TLR4拮抗劑、和 IL-18拮抗劑。C.藥物組合物在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種治療組合物，其在藥學(xué)可接受載體中包含阻止經(jīng)由 PD-I的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子或CTLA4拮抗劑和增強(qiáng)劑。所述組合物的成分以有效提高哺乳動(dòng)物中的T細(xì)胞應(yīng)答的量存在。在具體的實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺類似物，上文描述了此類類似物的例子。在其它具體的例子中，增強(qiáng)劑是降低調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T-reg)活性的藥劑，優(yōu)選活性是由于所述T-reg數(shù)目減少而降低的情況。在優(yōu)選的非限制性實(shí)施方案中，所述藥劑是 Sunitinib (SUTENT )、抗 TGF β 或 lmatinib (GLEEVAC )?？捎糜谂渲票景l(fā)明組合物的增強(qiáng)劑還包括有絲分裂抑制劑諸如帕立他塞、芳香酶抑制劑(例如來(lái)曲唑)、血管發(fā)生抑制劑(VEGF抑制劑，例如Avastin、VEGF-Trap)、蒽環(huán)類抗生素、奧沙利鉬、多柔比星、TLR4拮抗劑、和IL-18拮抗劑。本發(fā)明的治療組合物還任選包含至少一種別的藥劑，其可以是一種或多種抗PD-I 抗體、抗CTLA4抗體、有絲分裂抑制劑、芳香酶抑制劑、Ah腺苷受體(A2AR)拮抗劑、或血管發(fā)生抑制劑。任何本發(fā)明治療組合物還可含有一種或多種佐劑，如上所述。可用作本發(fā)明治療組合物的成分的PD-I拮抗劑包括本文中為在任何本發(fā)明方法中使用而描述的任何PD-I拮抗劑。例如，此類PD-I拮抗劑包括任何本文所述融合蛋白。此類拮抗劑也可以是本文中為用作任何融合蛋白(為在任何本發(fā)明方法中使用而描述的)之第一多肽部分而描述的任何多肽或PD-I結(jié)合片段.此類拮抗劑還可以是抗體，諸如本文中提到的任何已知的抗PD-1、B7-DC或B7-H1抗體。在上述PD-I拮抗劑之外或替代上述PD-I拮抗劑，本發(fā)明的治療組合物還包括抗 CTLA4抗體。此類組合物會(huì)因此含有此類抗CTLA4抗體和本文早就描述的所述種類的增強(qiáng)劑。本發(fā)明的治療組合物可用于本文中公開(kāi)的任何本發(fā)明方法。雖然意圖用作疾病狀況的積極治療，但是此類組合物還可用作預(yù)防組合物來(lái)預(yù)防本文中描述的任何疾病。在一個(gè)方面，本發(fā)明涵蓋在藥學(xué)可接受載體中包含PD-I拮抗劑和增強(qiáng)劑的治療組合物，其中PD-I拮抗劑和增強(qiáng)劑一起以有效提高哺乳動(dòng)物中的T細(xì)胞應(yīng)答的量存在。本發(fā)明范圍內(nèi)的治療組合物包括如下的組合物，其包含本文中公開(kāi)的PD-I拮抗劑和/或抗體與任何所述增強(qiáng)劑的任何和所有組合。作為非限制性例子，本發(fā)明的治療組合物包括如下的組合物，其包含有效量的一種或多種PD-I拮抗劑，諸如任何或所有本文中作為具體SEQ ID NO列出的全長(zhǎng)多肽或其同系物以及任何所述多肽的一種或多種片段的組合，包括任何或所有這些融合至其它蛋白質(zhì)，諸如融合至一種或多種本文所述免疫球蛋白， 或者不這樣融合的情況，而且包含一種或多種增強(qiáng)劑，諸如單獨(dú)的環(huán)磷酰胺，或環(huán)磷酰胺加一種或多種其類似物，或僅僅是一種或多種環(huán)磷酰胺類似物，或者增強(qiáng)劑可以由環(huán)磷酰胺和在接受組合物的哺乳動(dòng)物中減少T reg數(shù)目的藥劑組成，或者可以由環(huán)磷酰胺類似物加減少Treg數(shù)目的藥劑組成，或者增強(qiáng)劑可以僅僅由一種或多種減少Treg數(shù)目或降低其它 Treg活性的藥劑組成。本發(fā)明涵蓋所有此類組合，只要組合物包含至少一種介導(dǎo)T細(xì)胞活性的PD-I拮抗劑和/或抗體和至少一種增強(qiáng)劑。本發(fā)明的組合物還可包括別的活性劑。在任何本發(fā)明組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中， 藥物或治療組合物進(jìn)一步包含至少一種別的藥劑，其選自下組抗PD-I抗體，抗CTLA4抗體，有絲分裂抑制劑諸如帕立他塞，芳香酶抑制劑諸如來(lái)曲唑，A2AR拮抗劑，血管發(fā)生抑制劑，蒽環(huán)類抗生素，奧沙利鉬，多柔比星，TLR4拮抗劑，和IL-18拮抗劑。PD-I拮抗劑和/或增強(qiáng)劑可以通過(guò)任何合適的手段來(lái)施用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-I拮抗劑和/或增強(qiáng)劑在水溶液中通過(guò)胃腸外注射來(lái)施用。配制劑也可以處于懸浮液或乳狀液的形式。一般地，提供如下的藥物組合物，其包括有效量的肽或多肽，而且任選包括藥學(xué)可接受稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。此類組合物包括稀釋劑無(wú)菌水，各種緩沖劑內(nèi)容(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的緩沖鹽水；和任選的添加劑，諸如去污劑和增溶劑(例如TWEEN 20,TffEEN 80,Polysorbate 80)抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、和防腐劑(例如Thimersol、苯甲醇)和填充物質(zhì) (例如乳糖、甘露醇)。非水溶劑或媒介的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射有機(jī)酯諸如油酸乙酯。配制劑可以凍干及臨使用前重溶解/重懸浮。 配制劑可以滅菌，例如通過(guò)經(jīng)由細(xì)菌保留濾器過(guò)濾、通過(guò)將滅菌劑摻入組合物、通過(guò)照射組合物、或通過(guò)加熱組合物來(lái)滅菌。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)通過(guò)胃腸外(肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)(IV)或皮下注射)、經(jīng)皮(被動(dòng)地或使用離子透入或電穿孔)、或經(jīng)粘膜(鼻、陰道、直腸、或舌下)施用路徑來(lái)施用。本發(fā)明的方法不排除通過(guò)分開(kāi)的和不同的路徑(例如表面)來(lái)施用PD-I拮抗劑和增強(qiáng)劑。PD-I拮抗劑和增強(qiáng)劑可以在相同時(shí)間或在不同時(shí)間(增強(qiáng)劑在PD-I拮抗劑之前或之后)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在PD-I拮抗劑之前和之后都施用增強(qiáng)劑。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，在PD-I拮抗劑之前和之后施用相同的增強(qiáng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在PD-I 拮抗劑之前使用增強(qiáng)劑。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”意指足以治療、抑制、或減輕所治療病癥的一種或多種癥狀或以其它方式提供想要的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果的劑量。精確的劑量會(huì)隨多種因素而變化，諸如受試者依賴性變量(例如年齡、免疫系統(tǒng)健康、等)、疾病、和所施用的治療。治療有效量的PD-I受體拮抗劑和/或抗體與增強(qiáng)劑一起引起免疫應(yīng)答活化或持續(xù)。所選擇的劑量取決于期望的治療效果、施用的路徑、和期望的治療持續(xù)時(shí)間。一般地，給哺乳動(dòng)物施用每天0. 001至50mg/kg體重的劑量水平。優(yōu)選地，所述劑量是1至50mg/ kg,更優(yōu)選1至40mg/kg，或甚至1至30mg/kg，其中2至20mg/kg的劑量也是一種優(yōu)選的劑量。其它劑量的例子包括2至15mg/kg，或2至10mg/kg，或甚至3至5mg/kg，其中約^ig/ kg的劑量是一個(gè)具體的例子。對(duì)于使用增強(qiáng)劑和抗體諸如抗PD-I抗體或抗CTLA4抗體的治療方案，劑量通常在0. 1至100mg/kg的范圍中，優(yōu)選更窄的范圍1至50mg/kg，而且更優(yōu)選范圍10至20mg/ kg。用于人受試者的一種適宜劑量介于5和15mg/kg之間，最優(yōu)選10mg/kg抗體(例如人抗PD-I抗體，像MDX-1106)(加合適劑量的環(huán)磷酰胺或其它增強(qiáng)劑，在抗體之前多至約M 小時(shí)給予)。一般地，僅作為例子，在本發(fā)明的方法中有用的任何信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑基于體重的劑量形式包括范圍 5-300mg/kg、或 5-290mg/kg,或 5-280mg/kg,或 5_270mg/kg、或 5-260mg/kg、或 5_250mg/kg、或 5_240mg/kg、或 5_230mg/kg、或 5_220mg/kg、或 5-2IOmg/ kg、或 20-180mg/kg、或 30_170mg/kg、或 40_160mg/kg、或 50_150mg/kg、或 60_140mg/kg、或 70-130mg/kg、或 80-120mg/kg、或 90-110mg/kg、或 95_105mg/kg 中的劑量，劑量 3mg/kg、 5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、50mg/kg 禾口 lOOmg/kg 是優(yōu)
32選劑量的具體例子。此類劑量當(dāng)然可以重復(fù)。劑量當(dāng)然會(huì)與接受所述劑量的哺乳動(dòng)物的身份有關(guān)。上述mg/kg范圍中的劑量對(duì)于哺乳動(dòng)物(包括嚙齒類動(dòng)物，諸如小鼠和大鼠，和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人)是方便的，劑量約5mg/kg、約10mg/kg和約15mg/kg尤其優(yōu)選用于治療人。依照本發(fā)明的治療方案，增強(qiáng)劑例如環(huán)磷酰胺以隨動(dòng)物而變化的無(wú)毒劑量來(lái)施用。在具體的實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑通過(guò)任何合適的施用路徑來(lái)施用，包括胃腸外或口服，前者包括系統(tǒng)施用，諸如靜脈內(nèi)。例如，增強(qiáng)劑像環(huán)磷酰胺在正常情況中口服施用。此類施用可以是任何方便的劑量，取決于增強(qiáng)劑。每種情況中的劑量可以基于體重，或者可以以單位劑量來(lái)施用。雖然CTX自身是無(wú)毒的，但是它的一些代謝物是細(xì)胞毒性烷化劑，其誘導(dǎo)DNA交聯(lián)及在較高的劑量誘導(dǎo)鏈斷裂。許多細(xì)胞對(duì)CTX有抗性，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)高水平的解毒酶醛脫氫酶(ALDH)。CTX靶向增殖中的淋巴細(xì)胞，因?yàn)榱馨图?xì)胞(但不是造血干細(xì)胞)只表達(dá)低水平的ALDH，而且循環(huán)中的細(xì)胞對(duì)DNA烷化劑最敏感。低劑量的CTX(< 200mg/kg)可具有免疫刺激效果，包括在人和小鼠癌癥模型中刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答(Brode 和 Cooke，Crit. Rev. Immunol. 28 109-126 (2008)) 這些低劑量是亞治療性的，而且不具有直接的抗腫瘤活性。相反，高劑量的CTX抑制抗腫瘤應(yīng)答。數(shù)種機(jī)制可解釋CTX在加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用(a)消減⑶4+⑶25+FoXP3+Treg (及特異性增殖Treg，其尤其可以是遏制性的)；(b)消減B淋巴細(xì)胞；(c)誘導(dǎo)一氧化氮(NO)，導(dǎo)致對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的遏制；(d)動(dòng)員和擴(kuò)增⑶llb+Gr-1+MDSC。這些初級(jí)效果具有眾多次級(jí)效果；例如iTreg消減后，巨噬細(xì)胞生成更多IFN- γ和更少I(mǎi)L-10。CTX還顯示出誘導(dǎo)I型IFN 表達(dá)及促進(jìn)淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖。Treg消減被最多地引用為CTX加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的機(jī)制。這個(gè)結(jié)論部分基于過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在ABl-HA腫瘤模型中，第9天的CTX處理給出75%的治愈率。在第12天轉(zhuǎn)移純化的iTreg幾乎完全抑制CTX應(yīng)答(van der Most等，Cancer Immunol. Immunother. 58 1219-1228 (2009))。在HHD2腫瘤模型中觀察到類似的結(jié)果:CTX預(yù)處理后過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg消除針對(duì)疫苗的治療性應(yīng)答(Taieb J.，J. Immunol. 176 2722-2729(2006))ο 眾多人臨床試驗(yàn)證明了低劑量CTX對(duì)于促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答是安全的、耐受較好的、且有效的藥劑(Bas 禾口 Mastrangelo，Cancer Immunol. Immunother. 47 :1-12 (1998))。CTX用于加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的最佳劑量是如下的劑量，其通過(guò)降低Treg水平至正常范圍以下來(lái)降低總體T細(xì)胞計(jì)數(shù)但是是亞治療性的(參見(jiàn)Machiels等，Cancer Res.61 :3689-3697(2001))。在CTX用作免疫增強(qiáng)劑的人臨床試驗(yàn)中，通常使用300mg/m2的劑量。對(duì)于正常男性(6英尺，170磅(78kg)，體表面積1. 98m2), 300mg/m2為8mg/kg或624mg總蛋白質(zhì)。在癌癥的小鼠模型中，在15-150mg/kg的劑量范圍看到了功效，相當(dāng)于30g小鼠0. 45-4. 5mg 總蛋白質(zhì)(Machiels 等，Cancer Res. 61 :3689-3697(2001) ；Hengst 等，Cancer Res. 41 2163-2167(1981) ；Hengst，Cancer Res. 40 :2135-2141(1980))。對(duì)于大型哺乳動(dòng)物(諸如靈長(zhǎng)類動(dòng)物，優(yōu)選人)患者，可以使用此類mg/m2劑量， 但是可能優(yōu)選在限定時(shí)間間隔上施用單位劑量。此類單位劑量可以以每天一次施用限定時(shí)
33間段，諸如長(zhǎng)達(dá)3天、或長(zhǎng)達(dá)5天、或長(zhǎng)達(dá)7天、或長(zhǎng)達(dá)10天、或長(zhǎng)達(dá)15天、或長(zhǎng)達(dá)20天、或長(zhǎng)達(dá)25天都被本發(fā)明具體涵蓋。相同的方案可應(yīng)用于本文中描述的其它增強(qiáng)劑。所有此類施用可發(fā)生于施用本發(fā)明的PD-I結(jié)合分子之前或之后?；蛘?，一劑或多劑本發(fā)明PD-I結(jié)合分子的施用與增強(qiáng)劑的施用可以在時(shí)間上交錯(cuò)以形成均勻的或不均勻的治療過(guò)程，由此施用一劑或多劑增強(qiáng)劑，接著是一劑或多劑PD-I結(jié)合化合物，接著是一劑或多劑增強(qiáng)劑，都依照施用所述藥劑的科研人員或臨床醫(yī)師選擇或想要的無(wú)論什么進(jìn)度表。在其它具體的實(shí)施方案中，治療方案包括多次施用一種或多種PD-I拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，此類多次施用PD-I拮抗劑聯(lián)合多次施用相同或不同的增強(qiáng)劑。如在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，這里增強(qiáng)劑在施用PD-I拮抗劑之前或之后至少 1，2，3，5，10，15，20，24 或 30 小時(shí)施用。在本文中有用的藥物組合物還含有藥學(xué)可接受載體，包括任何合適的稀釋劑或賦形劑，其包括自身不誘導(dǎo)對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體生成，且施用時(shí)沒(méi)有不當(dāng)毒性的的任何藥劑。藥學(xué)可接受載體包括但不限于液體，諸如水、鹽水、甘油和乙醇等等，包括可用于形成供鼻和其它呼吸道投遞或投遞至眼系統(tǒng)的噴霧劑的載體。關(guān)于藥學(xué)可接受載體、稀釋劑、和其它賦形劑的深入討論見(jiàn) REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co. , N. J. current edition)。疫苗組合物(如下文討論的)可進(jìn)一步摻入別的物質(zhì)以穩(wěn)定pH，或發(fā)揮佐劑、濕潤(rùn)劑、或乳化劑的功能，其可有助于改善疫苗的有效性。疫苗一般配制成供胃腸外施用，而且皮下或肌肉內(nèi)注射。使用本領(lǐng)域已知的方法， 此類疫苗還可配制成栓劑或供口服施用，或供經(jīng)由鼻或呼吸路徑施用。D.制備方法分離的PD-I拮抗劑多肽，包括其變體、同系物和片段，野生型的或突變型的，及包含任何這些的融合蛋白(都為在本發(fā)明中使用而涵蓋)可以通過(guò)例如活性合成或通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)來(lái)獲得。為了重組生產(chǎn)共刺激多肽，可以用含有編碼多肽的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、或轉(zhuǎn)染細(xì)菌或真核宿主細(xì)胞(例如昆蟲(chóng)、酵母、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。會(huì)領(lǐng)會(huì)，核苷酸序列可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化以提高蛋白質(zhì)表達(dá)在特定種類的宿主細(xì)胞中的水平。 用于密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域公知的。一般而言，核酸構(gòu)建物包括與編碼共刺激多肽的核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列(在本文中也稱作表達(dá)控制序列)通常不編碼基因產(chǎn)物，而是影響與它們可操作連接的核酸序列的表達(dá)。用于自細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)肽可以是內(nèi)源信號(hào)肽或任何其它信號(hào)肽，其促進(jìn)宿主分泌融合蛋白。對(duì)于在實(shí)施本發(fā)明中有用的一般分子生物學(xué)規(guī)程，可得到多種標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)，它們含有分子生物學(xué)和遺傳工程領(lǐng)域公知的規(guī)程，而且這些規(guī)程無(wú)需在本文中進(jìn)一步描述。有用的參考書(shū)包括Sambrook等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual，Second Edition， Cold Spring Harbor，N. Y.，(1989) ；Wu et al，Methods in Gene Biotechnology (CRC PressiNew York，NY，1997)；及Recombinant Gene Expression Protocols,in Methods in Molecular Biology, Vol. 62，(Tuan，ed.，Humana Press，Totowa, NJ, 1997)，通過(guò)述及將其公幵內(nèi)容收入本文。E.疾病治療要通過(guò)施用由本發(fā)明提供的治療劑組合來(lái)治療或預(yù)防的疾病包括惡性腫瘤或由細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)、或其它進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的微生物病原體引起的慢性感染性疾病。此類疾病常常經(jīng)由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的攻擊來(lái)抗擊。因?yàn)楸景l(fā)明提供了可用于經(jīng)由升高的 T細(xì)胞活性、升高的T細(xì)胞增殖和降低的T細(xì)胞抑制性信號(hào)來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的聯(lián)合療法， 所以本發(fā)明的聯(lián)合療法在治療(或甚至預(yù)防)此類疾病中具有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，因?yàn)椴《靖腥局饕ㄟ^(guò)T細(xì)胞來(lái)清除，T細(xì)胞活性的升高在治療上可用于增強(qiáng)自動(dòng)物或靈長(zhǎng)類動(dòng)物(優(yōu)選人)受試者清除病毒感染物(infectious agent)。如此，所公開(kāi)的具有PD_1受體拮抗劑活性的本發(fā)明化合物與增強(qiáng)劑一起組合地運(yùn)作來(lái)治療局部或系統(tǒng)病毒感染。要通過(guò)本發(fā)明的化合物來(lái)治療的感染包括但不限于免疫缺陷(例如HIV)、乳頭瘤(例如HPV)、皰疹(例如HSV)、腦炎、流感(例如人流感病毒A)、肝炎(例如HCV、HBV)、和感冒(例如人鼻病毒)病毒感染。也可以施用PD-I受體拮抗劑組合物的藥物配制劑來(lái)治療系統(tǒng)性病毒病，包括但不限于AIDS、流感、感冒、或腦炎。通過(guò)本發(fā)明的化合物可治療的非病毒感染包括但不限于由微生物引起的感染， 包括但不限于放線菌屬(Actinomyces)、魚(yú)腥藻屬(Anabaena)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、 擬桿菌屬(Bacteroides)、蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、博德特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、柄桿菌屬(Caulobacter)、衣原體屬 (Chlamydia)、綠菌屬(Chlorobium)、產(chǎn)色菌屬(Chromatium)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀
(Corynebacterium) JM^f t^MM (Cytophaga)(Deinococcus)
菌屬(Escherichia)、弗朗西其jf 氏菌屬(Francisella)、鹽桿菌屬(Halobacterium) ^ilfflii 屬(Heliobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、B 型流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenza type B) (HIB)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、軍團(tuán)桿菌屬(Legionella)、鉤端螺旋體屬 (L印tspirosis)、李斯特氏菌屬(Listeria)、腦膜炎球菌(Meningococcus) A、B 和 C、甲燒桿菌屬(Methanobacterium)、細(xì)球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Myobacterium)、 支原體屬(Mycoplasma)、粘球菌屬(Myxococcus)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、顫藻屬(Oscillatoria)、原綠藍(lán)細(xì)菌屬(Prochloron)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(I^seudomonas)、紅螺菌屬(Phodospirillum)、立克次氏體屬 (Rickettsia)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、螺菌屬(Spirillum)、 螺方iH本屬(Spirochaeta)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、 鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)、硫葉菌屬(Sulfolobus)、熱原體屬(Thermoplasma)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、密螺旋體屬(Tr印onema)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia)、新型細(xì)球菌(Cryptococcus neoformans)、組織胞菜菌(Histoplasmasp.) 諸如莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、白色假絲酵母(Candidaalbicans)、 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、星形諾卡菌(Nocardiaasteroides)、立氏立克次氏體(Rickettsia ricketsii)、斑疹傷寒立克次氏體(Rickettsia typhi)、利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumomae)、嬰鳥(niǎo)踏熱衣原體(Chlamydial psittaci)、砂目艮衣原體(Chlamydialtrachomatis)、癥原蟲(chóng)(Plasmodium sp.)諸如惡性皰原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)、溶組織內(nèi)阿米巴 (Entamoebahistolytica) ^ M1eJ MW (Toxoplasma gondii)、陰 毛蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis)和曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在宿主中誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答以治療癌癥的方法和組合物?？梢杂盟峁┑慕M合物和方法來(lái)治療的癌癥的類型包括但不限于下述膀胱、腦、乳腺、宮頸、結(jié)腸直腸、食管、腎、肝、 肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮膚、胃、子宮、卵巢、睪丸、和血液學(xué)癌癥?？梢灾委煹膼盒阅[瘤在本文中依據(jù)衍生腫瘤的組織的胚胎起源來(lái)歸類。癌瘤 (Carcinoma)為源自內(nèi)胚層或外胚層組織的腫瘤，諸如皮膚或內(nèi)臟和腺的上皮層。不太頻繁產(chǎn)生的肉瘤(Sarcoma)衍生自中胚層結(jié)締組織，諸如骨、脂肪、和軟骨。白血病(leukemia) 和淋巴瘤(lymphoma)為骨髓的造血細(xì)胞的惡性腫瘤。白血病作為單細(xì)胞來(lái)增殖，而淋巴瘤趨于作為腫瘤塊來(lái)生長(zhǎng)。惡性腫瘤可以在身體的多種器官或組織處顯露出來(lái)以形成癌癥。作為本發(fā)明治療方案的價(jià)值的證明，在結(jié)腸癌、肥大細(xì)胞瘤、和其它腫瘤類型的同基因小鼠腫瘤模型中測(cè)試了 B7-DC-Ig的鼠類似物(其中與人蛋白共享72%序列同一性的小鼠B7-DC E⑶融合至小鼠IgGh Fc域)，其中如本文所述摻入環(huán)磷酰胺(CTX)預(yù)處理。結(jié)果顯示用單個(gè)亞治療劑量的CTX(其起免疫增強(qiáng)劑的作用)，接著用小鼠 B7-DC-IG處理在多至80%的動(dòng)物中根除了已建立的CD6結(jié)腸癌瘤腫瘤。另外，在CD6結(jié)腸癌瘤腫瘤再攻擊研究中，在先前在CTX+小鼠B7-DC-Ig處理后根除了腫瘤的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到腫瘤再生長(zhǎng)。這些小鼠還顯示出具有相對(duì)于無(wú)處理小鼠升高的腫瘤特異性CTL群。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋本文中別處描述的降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物在制造用于通過(guò)聯(lián)合療法來(lái)提高T細(xì)胞應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述化合物與增強(qiáng)劑聯(lián)合施用。另外，降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物和所述增強(qiáng)劑作為分開(kāi)的藥物提供，供不同時(shí)間施用，優(yōu)選增強(qiáng)劑在降低抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物之前，例如在抑制性化合物之前多至M小時(shí)(或本文所述其它時(shí)間間隔)施用的情況。優(yōu)選地，所述化合物和增強(qiáng)劑用于治療感染性疾病或癌癥，包括本文中別處描述的由任何感染物引起的疾病或癌癥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在這些方法中有用的化合物是由人B7-DC的E⑶融合人IgGl的Fc域而構(gòu)成的重組蛋白，在本文中稱作B7-DC-Ig。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于與增強(qiáng)劑聯(lián)合施用本文中公開(kāi)的降低T 細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物的醫(yī)學(xué)試劑盒，所述試劑盒包含(a)供應(yīng)劑量的降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物；(b)增強(qiáng)劑；(c)藥學(xué)可接受載體；和(d)關(guān)于在上文所述用途中施用化合物的印刷的用法說(shuō)明。F.聯(lián)合療法疫苗要求強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答來(lái)消除癌細(xì)胞和受到感染的細(xì)胞或感染物 (infectious agent) 0本文中描述的PD-1受體拮抗劑可以作為疫苗的成分與增強(qiáng)劑一起施用以給T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。本文中公開(kāi)的疫苗包括抗原，PD-I受體拮抗劑和任選的佐劑和靶向分子。通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物來(lái)增強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答所針對(duì)的抗原包括肽、蛋白質(zhì)、 多糖、糖、脂、核酸、或其組合。在疾病的情況中，所述抗原是由于疾病過(guò)程而存在的。所公開(kāi)的PD-I受體拮抗劑組合物可以與預(yù)防性疫苗(其賦予受試者患者對(duì)后續(xù)暴露于感染物的抗性)或治療性疫苗(其可用于啟動(dòng)或增強(qiáng)受試者對(duì)預(yù)先存在的抗原(諸
36如具有癌癥的受試者中的腫瘤抗原或受到病毒感染的受試者中的病毒抗原)的免疫應(yīng)答) 聯(lián)合施用?；诒绢I(lǐng)域公知的原則，預(yù)防、治療或消除對(duì)免疫應(yīng)答敏感性的期望結(jié)果可以隨疾病而變化。例如，針對(duì)感染物的免疫應(yīng)答可以完全阻止感染物建群(colonization)和復(fù)制，實(shí)現(xiàn)“無(wú)菌免疫(sterile immune) ”和任何疾病癥狀的消失。然而，若針對(duì)感染物的疫苗較少癥狀的數(shù)目、降低癥狀的嚴(yán)重性或縮短癥狀的持續(xù)時(shí)間；若它減少群體中有癥狀的個(gè)體的數(shù)目；或減少感染物的傳播，則可以認(rèn)為它是有效的。類似地，針對(duì)癌癥、變應(yīng)原或感染物的免疫應(yīng)答可以完全治療疾病，可以減輕癥狀，或者可以是針對(duì)疾病的總體治療干預(yù)中的一個(gè)方面。例如，刺激針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答可以與手術(shù)、化療、放射學(xué)、激素和/或其它免疫學(xué)辦法聯(lián)用以進(jìn)行治療。本發(fā)明的方法和產(chǎn)物不排除在增強(qiáng)劑之外佐劑的使用。此類佐劑可以例如與PD-I 拮抗劑一起施用。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的佐劑包括但不限于下述一種或多種 油乳劑(例如弗氏佐劑)；皂苷配制劑；病毒體(virosome)和病毒樣顆粒；細(xì)菌和微生物衍生物；免疫刺激性寡核苷酸；ADP-核糖基化毒素和去毒衍生物；明礬；BCG ；含礦物組合物 (例如礦物鹽，諸如鋁鹽和鈣鹽、氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽、等)；生物粘附劑和/或粘膜粘附劑；微粒；脂質(zhì)體；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配制劑；胞壁?；?；聚磷腈；咪唑并喹諾酮化合物；和表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔蟲(chóng)威血藍(lán)蛋白、和二硝基酚)。有用的佐劑還包括免疫調(diào)控劑，諸如細(xì)胞因子、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-12、等)、干擾素(例如干擾素-Y )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、和腫瘤壞死因子。本文中沒(méi)有排除所公開(kāi)的PD-I受體拮抗劑(包括本文中公開(kāi)的任何多肽、片段、變體、同系物和融合蛋白)與一種或多種別的治療劑(在增強(qiáng)劑之外)聯(lián)合施用于有此需要的受試者。別的治療劑基于所處理的狀況、病癥或疾病來(lái)選擇。例如，PD-I受體拮抗劑可以與一種或多種別的藥劑共施用，所述別的藥劑發(fā)揮增強(qiáng)或促進(jìn)免疫應(yīng)答的功能，而且在本文中被認(rèn)為是活性劑。此類藥劑包括但不限于安吖啶(amsacrine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉬(carboplatin)、 卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉬(cisplatin)、克拉屈濱 (cladribine) > 0, ^* ^ (clofarabine) > crisantaspase> HHlfe1^f (cytarabine) > ^· 巴[!秦(dacarbazine)、放線菌素 D(dactinomycin)、柔紅;5素(daunorubicin)、多西他賽 (docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊昔(etoposide)、 氟達(dá)拉濱(fludarabine)、氟尿啼唆(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、輕基脲(hydroxy carbamide)、伊達(dá)比星(idarubicin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康 (irinotecan)、亞口十酸(Ieucovorin)、多柔比星(Iiposomaldoxorubicin)、柔紅β素月旨質(zhì)體(liposomal daunorubicin)、洛莫司汀(Iomustine)、美法倉(cāng)(melphalan)、巰口票呤 (mercaptopurine)、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、絲裂霉素(mitomycin) > 米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、帕立他塞(paclitaxel)、培 _ 曲■ (pemetrexed)、 Bjt 司了 (pentostatin)、”1 + El 月井(procarbazine)、 W 替曲塞(raltitrexed)、沙怕(satraplatin)、鏈唾星(streptozocin)、替力口氣一尿啼 Pg (tegafur-uracil)、替莫唾胺(temozolomide)、替尼泊昔(teniposide)、塞替派(thiot印a)、硫鳥(niǎo)嘌呤(tioguanine)、托泊替康(topotecan)、曲奧舒凡(treosulfan)、 長(zhǎng)春堿(vinblastine)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春地辛(vindesine)、長(zhǎng)春瑞濱 (vinorelbine)、或其組合。代表性的促凋亡劑包括但不限于氟達(dá)拉濱(f ludarabine)、牛黃斯坦(taurosporine)、環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)、放線菌素 D (actinomycin D)、乳糖苷神經(jīng)酰胺(Iactosylceramide)、15d-PGjQ)及其組合。通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物提供的療法還可以與其它類型的療法，諸如輻照治療、手術(shù)、等等聯(lián)合使用。G.拮抗劑活性的測(cè)定法本發(fā)明描述了在實(shí)施本發(fā)明的方法中有用的多種具體結(jié)構(gòu)。其它擁有拮抗劑活性且在本發(fā)明的方法中有用的化合物也可通過(guò)參照用于鑒定結(jié)合PD-1、CTLA4、和任何這些的配體且還擁有降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力的化學(xué)結(jié)構(gòu)的公知檢測(cè)規(guī)程來(lái)鑒定。一些此類測(cè)定法是可用于確定選定的化學(xué)結(jié)構(gòu)是否結(jié)合受體的結(jié)合測(cè)定法；這些是本領(lǐng)域公知的，而且不需要在本文中詳細(xì)討論(參見(jiàn)例如2008年11月6日公布的U. S. 2008/0274490 和2006年9月12日公告的U. S. 7，105，328，均顯示了使用T細(xì)胞的用于PD-I信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控物的測(cè)定法，通過(guò)述及將其公開(kāi)內(nèi)容完整收入本文)。使用其它測(cè)定法來(lái)測(cè)定本發(fā)明的藥劑，諸如活性片段通過(guò)提高增殖和/或細(xì)胞因子生成來(lái)活化T細(xì)胞的效果。此類測(cè)定法也是本領(lǐng)域公知的。例如，升高的細(xì)胞增殖可以通過(guò)升高的3H-胸苷摻入(由于細(xì)胞繁殖所需要的升高的DNA合成)或用于檢測(cè)培養(yǎng)物中T細(xì)胞生成細(xì)胞因子升高的ELISA和/或 RIA來(lái)證明。在一個(gè)此類實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ELISA評(píng)估人B7_DC_Ig的PD-1結(jié)合活性。96孔ELISA 板用在BupH碳酸鹽/碳酸氫鹽pH 9. 4緩沖液(Pierce)中稀釋的100 μ L0. 75ug/mL重組 A PD-I/Fe (R&D Systems)包被 2 小時(shí)，然后用 BSA 溶液(Jackson ImmunoResearch)封閉 90-120分鐘。容許連續(xù)稀釋的人B7-DC-Ig(野生型，以及為降低的對(duì)PD-I的結(jié)合而選擇的 DlllS突變蛋白和K113S突變體)以及人IgGl同種型對(duì)照結(jié)合90分鐘。使用IOOuL 0. 5ug/ mL生物素偶聯(lián)的抗人B7-DC克隆18(eBi0SCienCe)，接著用1 1000稀釋的HRP-鏈霉親合素(BDBioscience)和TMB底物(BioFX)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的B7_DC_Ig。使用讀板儀(Molecular Devices)來(lái)讀取450nm處的吸光度，并在SoftMax中使用4參數(shù)對(duì)數(shù)擬合來(lái)分析數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)顯示人B7-DC-Ig(野生型)結(jié)合PD-I，但是K113S和DlllS突變體不結(jié)合PD-I。在實(shí)施本發(fā)明的規(guī)程時(shí)，當(dāng)然會(huì)理解，提到具體的緩沖液、培養(yǎng)基、試劑、細(xì)胞、培養(yǎng)條件等等并非意圖限制，而是應(yīng)當(dāng)讀作包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到在呈現(xiàn)該討論的具體背景中感興趣或有價(jià)值的所有相關(guān)材料。例如，常常有可能用一種緩沖系統(tǒng)或培養(yǎng)基替換另一種，而且仍實(shí)現(xiàn)相似的(假如不是相同的話)結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)具有此類系統(tǒng)和方法的足夠知識(shí)，從而能夠無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就能做出此類替換，正如在使用本文中公開(kāi)的方法和規(guī)程時(shí)會(huì)最佳地實(shí)現(xiàn)其目的。在下面的非限制性實(shí)施例中更詳細(xì)地描述本發(fā)明。要理解，這些方法和實(shí)施例絕非將本發(fā)明限于本文中描述的實(shí)施方案，而且其它實(shí)施方案和使用無(wú)疑會(huì)自己呈現(xiàn)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。
實(shí)施例實(shí)施例1 :B7-DC_Ig結(jié)合表達(dá)PD-1的CHO細(xì)胞首先將B7-DC_Ig與別藻藍(lán)素(APC)偶聯(lián)，然后以多種濃度與組成性表達(dá)PD-I的 CHO細(xì)胞系或不表達(dá)PD-I的親本CHO細(xì)胞一起溫育。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析結(jié)合。作為探針濃度(χ軸)的函數(shù)，圖1顯示B7-DC-Ig-APC的中值熒光強(qiáng)度(MFI) (y軸)。B7-DC_Ig-APC 結(jié)合CHO. PD-I細(xì)胞(實(shí)心圓圈)，但是不結(jié)合未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(灰色三角形)。實(shí)施例2 :B7-DC-Ig與B7-H1競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-1的結(jié)合首先將B7-Hl_Ig與別藻藍(lán)素(APC)偶聯(lián)。首先將未標(biāo)記的B7_DC_Ig以多種濃度與組成性表達(dá)PD-I的CHO細(xì)胞系一起溫育，之后將B7-Hl-Ig-APC添加至探針和細(xì)胞混合物。作為所添加的未標(biāo)記B7-DC-Ig競(jìng)爭(zhēng)物的濃度(χ軸)的函數(shù)，圖2顯示B7-Hl-Fc-APC 的中值熒光強(qiáng)度(MFI) (y軸)。隨著未標(biāo)記B7-DC-Ig的濃度升高，結(jié)合CHO細(xì)胞的 B7-Hl-Ig-APC的量降低，從而證明了 B7-DC-Ig與B7-H1競(jìng)爭(zhēng)對(duì)PD-I的結(jié)合。實(shí)施例3 :CT26腫瘤模型小鼠結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞系，CT26，得自ATCC。遵循ATCC指導(dǎo)方針生成了處于第4 代的原始細(xì)胞庫(kù)(master cell bank)。測(cè)試細(xì)胞，并確認(rèn)沒(méi)有支原體和其它病原體污染。 自冷凍保存的原種融化一管腫瘤細(xì)胞，并培養(yǎng)兩代，之后接種。用30mL 完全培養(yǎng)基(RPMI+10% FBS, 2mM L_Glu，和 Ix P/S)以 1 5 稀釋度(用于2天培養(yǎng))或者用30ml完全培養(yǎng)基以1 10稀釋度(用于3天培養(yǎng))分開(kāi)CD6細(xì)胞。如下收獲CD6細(xì)胞，吸走培養(yǎng)基，用5mL PBS漂洗燒瓶，添加5mL胰蛋白酶，于 37°C溫育2分鐘，然后用IOmL完全培養(yǎng)基中和。以600x g( IOOOrpm)離心5分鐘后，吸走培養(yǎng)基，并通過(guò)用IOml單純的RPMI反復(fù)吸取來(lái)重懸浮細(xì)胞團(tuán)粒。此清洗步驟重復(fù)三次。最后一個(gè)清洗步驟期間，用適當(dāng)?shù)南♂尪?例如1 5稀釋，IOyL細(xì)胞+40yL錐蟲(chóng)藍(lán))通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染料染色來(lái)分析接種的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和存活力，并通過(guò)NOVA細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確認(rèn)。用于接種的細(xì)胞存活力一般大于95%。用單純的RPMI將CD6細(xì)胞稀釋至6. 7xl05個(gè)細(xì)胞/mL，供初始接種，并保存于冰上。典型地，給每只小鼠接種150uL(IxlO5個(gè)細(xì)胞)。第9天，首先將所有攜帶腫瘤的小鼠分組入大鼠籠，并將小鼠隨機(jī)分至實(shí)驗(yàn)組。用 Ix PBS重建CTX溶液至％ig/mL。給20克的小鼠腹膜內(nèi)(IP)注射0. 5mL CTX溶液，則為 2mg,艮口 100mg/kgo第10 天，給 20 克的小鼠 IP 注射 0. 5mL B7_DC_Ig (0. 2mg/mL)，則為 0. Img,即 5mg/ kg。相同劑量每周給予2次，持續(xù)4周，總共8劑。通過(guò)每周兩次經(jīng)數(shù)字式測(cè)徑器測(cè)量腫瘤來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，始于給予B7-DC-Ig那天。如下計(jì)算腫瘤體積腫瘤體積=Ji(Ds)2X (D長(zhǎng))/6 = 0. 52X (Ds)2X (D長(zhǎng))若腫瘤體積達(dá)到2000mm3或者若腫瘤接種部位有皮膚潰瘍和感染，則小鼠處以安樂(lè)死并退出研究。實(shí)施例4 環(huán)磷酰胺和B7-DC_Ig的組合能根除已建立的腫瘤如上所述給9至11周齡的Balb/C小鼠皮下植入1. OxlO5個(gè)CD6結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞。植入腫瘤后第10天，小鼠接受100mg/kg環(huán)磷酰胺。1天后，即第11天開(kāi)始B7-DC-Ig處理。小鼠用IOOug B7-DC-Ig處理，每周2劑，持續(xù)4周，總共8劑。75%的接受CTX+B7_DC_Ig 治療方案的小鼠到第44天根除了已建立的腫瘤，而對(duì)照僅CTX組中的所有小鼠因腫瘤生長(zhǎng)而死亡或因腫瘤超過(guò)IACUC批準(zhǔn)的大小而被處以安樂(lè)死(圖3中顯示的結(jié)果)。這些結(jié)果證明了所述治療方案對(duì)已建立的腫瘤的有效性，而非僅僅預(yù)防。實(shí)施例5 環(huán)磷酰胺和B7-DC_Ig的組合能根除已建立的腫瘤及針對(duì)腫瘤再攻擊提供保護(hù)在第44天和第70天用IxlO5個(gè)CD6細(xì)胞再攻擊來(lái)自上文所述實(shí)驗(yàn)的根除了已建立CD6結(jié)腸直腸腫瘤的小鼠。沒(méi)有自再攻擊長(zhǎng)出腫瘤，從而提示它們自環(huán)磷酰胺和 B7-DC-Ig組合處理形成了長(zhǎng)期抗腫瘤免疫力。媒介對(duì)照組中的所有小鼠形成了腫瘤(圖 4中顯示的結(jié)果)。這些結(jié)果顯示所述治療方案對(duì)已建立的腫瘤的有效性及環(huán)磷酰胺和 B7-DCIg組合治療導(dǎo)致針對(duì)腫瘤抗原的記憶應(yīng)答。實(shí)施例6 環(huán)磷酰胺和B7-DC_Ig的組合能生成腫瘤特異性的記憶細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在第44天用2. 5x10s個(gè)CD6細(xì)胞再攻擊來(lái)自上文所述實(shí)驗(yàn)的根除了已建立CD6 結(jié)腸直腸腫瘤的小鼠。7天后，分離小鼠脾。在高爾基體阻斷劑(BDBiokience)存在下將小鼠脾細(xì)胞用5或50ug/mL卵清蛋白(OVA)或AHl肽脈沖6小時(shí)。通過(guò)評(píng)估⑶8+/IFN y +T 細(xì)胞來(lái)分析記憶T效應(yīng)細(xì)胞。圖5中的結(jié)果顯示根除了 CD6腫瘤的小鼠中有顯著量的CD6 特異性T效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)施例7 :B7-DC-Ig劑量依賴對(duì)腫瘤根除的影響給9至11周齡的Balb/C小鼠皮下植入LOxlO5個(gè)CD6結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞。腫瘤植入后第9天，小鼠接受單劑環(huán)磷酰胺(100mg/kg)，并在第10天開(kāi)始用30，100或300ug B7-DC-Ig處理，每周2劑，持續(xù)4周，總共8劑。圖6顯示在300ug有70%的小鼠根除了腫瘤，在IOOug有40%的小鼠根除了腫瘤，而30ug劑量發(fā)生了 10%腫瘤根除。實(shí)施例8 環(huán)磷酰胺和抗PD-I的組合能根除已建立的腫瘤用LOxlO5個(gè)CD6結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞皮下攻擊9至11周齡的Balb/C小鼠。腫瘤攻擊后第11天，小鼠接受單劑環(huán)磷酰胺(100mg/kg)并開(kāi)始用抗PD-I抗體(250ug，克隆 G4, Hirano F.等，2005Cancer Research)處理，每周施用 3 次，持續(xù) 4 周。70%接受 CTX+ 抗PD-I方案的小鼠在腫瘤攻擊后第50天根除了已建立的CD6腫瘤，而僅對(duì)照和僅抗PD-I 的組中的所有小鼠因腫瘤生長(zhǎng)而死亡或因腫瘤超過(guò)IACUC批準(zhǔn)的大小而被處以安樂(lè)死。這些結(jié)果顯示了所述治療方案對(duì)已建立的腫瘤的有效性，而非僅僅預(yù)防。結(jié)果顯示于圖7。實(shí)施例9 環(huán)磷酰胺和抗CTLA4的組合能根除已建立的腫瘤用LOxlO5個(gè)CD6結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞皮下攻擊9至11周齡的Balb/C小鼠。腫瘤攻擊后第11天，小鼠接受100mg/kg環(huán)磷酰胺。1天后，即第12天開(kāi)始抗CTLA4( —種來(lái)自倉(cāng)鼠雜交瘤-ATCC保藏物UC10-4F10-11的抗小鼠CTLA4)處理。用IOOug抗CTLA4處理小鼠，每周2劑，持續(xù)4周。56 %的接受CTX+抗CTLA4方案的小鼠在腫瘤攻擊后第50天沒(méi)有腫瘤，而對(duì)照組中的所有小鼠因腫瘤生長(zhǎng)而死亡或因腫瘤超過(guò)IACUC批準(zhǔn)的大小而被處以安樂(lè)死。結(jié)果顯示于圖8。這些結(jié)果顯示了所述治療方案對(duì)已建立的腫瘤的有效性，而非僅僅預(yù)防。實(shí)施例10 環(huán)磷酰胺和B7-DC_Ig組合方案導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的Treg減少圖9顯示如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中給9至11周齡的Balb/C小鼠皮下植入IXlO5 個(gè)CD6細(xì)胞。在第9天，給小鼠IP注射100mg/kg CTX。24小時(shí)后，在第10天，用IOOug
40B7-DC-Ig處理小鼠。有5個(gè)組不接受任何腫瘤細(xì)胞的無(wú)處理的(nai've)小鼠，注射媒介， 僅 CTX, CTX+B7-DC"Ig 或僅 B7_DC_Ig。在第 11 天(CTX 后 2 天)和第 16 天(CTX 后 7 天) 自研究取出2只無(wú)處理小鼠和4只來(lái)自其它組的小鼠供T細(xì)胞分析用。左邊小圖顯示在第 11天(CTX注射后2天)，用CTX處理的小鼠的脾中的Treg顯著低于植入腫瘤且注射媒介的小鼠。右邊小圖顯示在第16天(CTX后7天和B7-DC-Ig處理后6天)，B7_DC_Ig顯著降低表達(dá)高PD-I的CD4+T細(xì)胞。這在B7-DC-Ig處理的和CTX+B7_DC_Ig處理的小鼠中都已觀察到。與無(wú)處理小鼠相比，植入腫瘤細(xì)胞的小鼠趨于在引流LN中具有更多的PD-1+/CD4+T 細(xì)胞。實(shí)施例11 環(huán)磷酰胺和B7-DC_Ig的組合在轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤模型中能促進(jìn)小鼠存活給9至11周齡BIO. D2小鼠靜脈內(nèi)注射3. OxlO5個(gè)SP-1細(xì)胞，其分離自親本TRAMP 細(xì)胞注射后的肺轉(zhuǎn)移。在第5，12和19天，CTX小鼠接受3劑CTX，50mg/kg。在第6，13和 20天，B7-DC-Ig處理小鼠接受3劑B7-DC-Ig，5mg/kg。在第100天，對(duì)照組，無(wú)處理、僅CTX、 僅B7-DC-Ig中17%的小鼠存活，而接受CTX和B7-DC-Ig組合的43%的小鼠存活。結(jié)果顯示于圖10。實(shí)施例12 李斯特氏菌癌癥疫苗和B7-DC_Ig的組合能增強(qiáng)CD6肝植入后的小鼠存活使用半脾注射技術(shù)(YoshimuraK 等，2007，Cancer Research)，給 11-13 周齡的 Balb/C小鼠植入CD6細(xì)胞。在第10天，小鼠接受1次IP注射CTX 50mg/kg。24小時(shí)后， 即在第11天，然后在第14和17天，以0. IXLD50(IXIO7CFU)用攜帶AHl肽(CT26的一種免疫顯性表位)的重組李斯特氏菌處理小鼠。還在第11天，然后在第18天用B7-DC-Ig處理小鼠。圖11顯示沒(méi)有任何處理或用CTX和李斯特氏菌癌癥疫苗處理的小鼠都在第45天之前死亡。有60%的接受三重組合CTX+李斯特氏菌癌癥疫苗和B7-DC-Ig的小鼠存活。參考文獻(xiàn)表1. Brode S, Cooke A. Immune-potentiating effects of the chemotherapeuticdrug cyclophosphamide. Crit Rev. Immunol. 2008 ；28 (2) :109-262. van der Most RG, Currie AJ, Mahendran S, Prosser A, Darabi A, RobinsonBff,Nowak AK,Lake RA. Tumor eradication after eyelophosphamidedepends on concurrent depletion of regulatory T cells -.a role for cyclingTNFR2-expressing effector-suppressor T cells in limiting effectivechemotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2009Aug ； 58 (8) :1219-283. Taieb J, Chaput N, Schartz N, Roux S, Novault S, Menard C, Ghiringhelli F, Terme M, Carpentier AF, Darrasse-Jeze G, et al. Chemoimmunotherapy oftumors cyclophosphamide synergizes with exosome based vaccines. J. Immunol. 2006 Mar 1 ； 176(5) :2722-94. Machiels JP,Reilly RT,Emens LA,Ercolini AM,Lei RY,Weintraub D，Okoye FI, Jaffee EM. Cyclophosphamide, doxorubicin,and paclitaxelenhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-coIonystimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER—2/neu tolerizedmice. Cancer Res. 2001 May 1;61(9)3689-975. Bass KK，Mastrangelo M J. Immunopotentiation with low-dosecyclophosphamide in the active specific immunotherapy of cancer. Cancerlmmunol. Immunother. 1998 Sep ；47 (1) :1-126. Hengst JC，Mokyr MB，Dray S. Cooperation between eyelophosphamidetumoricidal activity and host antitumor immunity in the cure of mice bearinglarge MOPC-315tumors. Cancer Res. 1981 Jun ；41 (6) :2163-77. Hengst JC, Mokyr MB，Dray S. Importance of timing in eyelophosphamidetherapy of MOPC-315 tumor-bearing mice. Cancer Res. 1980Jul ； 40(7) :2135-418. Tsung K， Meko JB, Tsung YL, Peplinski GR, Norton JA. Immune responseagainst large tumors eradicated by treatment with cyclophosphamide andIL-12. J. Immunol. 1998 Feb 1 ； 160 (3) :1369-779. Honeychurch J，Glennie MJ, Illidge TM. Cyclophosphamide inhibition ofanti-CD40 monoclonal antibody-based therapy of B cell lymphoma isdependent on CDllb+cells. Cancer Res. 2005 Aug 15 ；65 (16) :7493-50110. Wada S, Yoshimura K, Hipkiss EL, Harris TJ, Yen HR, Goldberg MV,Grosso JF，Getnet D，Demarzo AM，Netto GJ，Anders R，Pardoll DM, DrakeCG. Cyclophosphamide augments antitumor immunity :studies in anautochthonous prostate cancer model. Cancer Res. 2009 Mayl5 ；69 (10) :4309-18.11. Freeman，G. J. Structures of PD-I with its ligands :sideways and dancingcheek to cheek. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105,10275-10276(2008).12. Br ode , S. &Cooke，A. Immune-potentiating effects of the chemotherapeuticdrug cyclophosphamide. Crit Rev. Immunol. 28,109-126 (2008).13. van der Most，R. G. et al. Tumor eradication after cyclophosphamide dependson concurrent depletion of regulatory T cells a role for cyclingTNFR2-expressing effector-suppressor T cells in limiting effectivechemotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 58，1219-1228 (2009).1 4 . Taieb，J . et a 1 . Chemoimmunotherapy of tumors eyelophosphamidesynergiζes with exosome based vaccines.J. Immunol. 176， 2722-2729(2006).1 5. Bass，K. K. & Mastrange 1 ο , Μ. J. Immunopotentiation with low-dosecyclophosphamide in the active specific immunotherapy of cancer. Cancerlmmunol. Immunother. 47，1-12 (1998).16· Machiels，J. P. et al. Cyclophosphamide, doxorubicin, and pac1i taxe 1 enhancethe antitumor immune response of granulocyte/ macrophage-colonystimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerizedmice. Cancer Res. 61，3689-3697(2001).17. Hengst, J. C. ,Mokyr,M. B.，& Dray, S. Cooperation betweencyclophosphamide
42tumoricidal activity and host antitumor immunity in thecure of mice bearing large M0PC-315 tumors. Cancer Res. 41，2163-2167(1981).18. Hengst, J. C. , Mokyr, M. B. , & Dray, S. Importance of timing incyclophosphamide therapy of MOPC—315 tumor-bearing mice. Cancer Res. 40, 2135-2141(1980).19. Tsung, K. ， Meko, J. B. ， Tsung, Y. L. ， Peplinski, G. R. ， & Norton， J. A. Immuneresponse against large tumors eradicated by treatment withcyclophosphamide and IL-12. J. Immunol. 160,1369-1377(1998) ·20. Honeychurch, J. , Glennie, M. J. , & Illidge, Τ. M. Cyclophosphamide inhibitionof anti-CD40 monoclonal antibody-based therapy of B cell lymphoma isdependent on CDllb+cells. Cancer Res. 65,7493-7501(2005).21. Wada S, Yoshimura K, Hipkiss EL, Harris TJ, Yen HR, Goldberg MV, Grosso JF, Getnet D, Demarzo AM, Netto GJ, Anders R, Pardoll DM, DrakeCG. Cyclophosphamide augments antitumor immunity :studies in anautochthonous prostate cancer model. Cancer Res. 2009 Mayl5 ；69 (10) :4309-18.。·
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動(dòng)物中提高T細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包括一種有效的治療方案，所述方案包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物和增強(qiáng)劑，其中所述治療方案有效提高所述哺乳動(dòng)物中的T細(xì)胞應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是包含第一和第二肽部分的融合蛋白，其中所述第一肽部分包含PD-I拮抗劑多肽的活性片段且所述第二肽部分包含免疫球蛋白(Ig)的一部分。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述PD-I拮抗劑多肽是野生型B7-DC多肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述B7-DC是人B7-DC。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述活性片段不包含所述B7-DC多肽跨膜部分的任何實(shí)質(zhì)性部分。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述活性片段包含所述B7-DC多肽的可溶性部分且所述第二肽部分包含抗體的Fc區(qū)但不包含所述抗體的任何可變區(qū)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述活性片段包含SEQID NO :3的氨基酸序列且所述第二多肽部分包含抗體的Fc區(qū)但不包含所述抗體的任何可變區(qū)。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述第一肽部分由與SEQID NO :1氨基酸20-221或20-121 具有至少80%同一性的氨基酸序列組成。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述第一肽部分由SEQID NO 1氨基酸20-221或20-121 的氨基酸序列組成。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述PD-I結(jié)合片段包含SEQID NO=I的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少25個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少50個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少75個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少90個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述融合蛋白包含與SEQID NO :9，10，12或13的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述融合蛋白包含SEQID NO :9，10，12或13的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求2的方法，其中所述融合蛋白是單體。
14.權(quán)利要求2的方法，其中所述融合蛋白是二聚物的一部分。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述二聚物是同二聚物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述二聚物是異二聚物。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺類似物。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述增強(qiáng)劑是降低調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T-reg)活性的藥劑。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述增強(qiáng)劑在施用所述化合物之前施用。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述增強(qiáng)劑在施用所述化合物之前至少X小時(shí)施用，其中 X 選自 1，2，3，5，10，15，20，24 和 30。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療方案進(jìn)一步包括施用至少一種別的選自下組的藥劑抗PD-I抗體，抗CTLA4抗體，有絲分裂抑制劑，芳香酶抑制劑，A2AR拮抗劑，和血管發(fā)生抑制劑。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是包含野生型B7-DC多肽之活性片段的多肽。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述活性片段不包含此類多肽跨膜部分的任何部分。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述B7-DC多肽是人B7-DC多肽。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述活性片段包含與SEQID NO :1氨基酸20-221或 20-121具有至少80%同一性的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求M的方法，其中所述活性片段由SEQID NO 1氨基酸20-221或20-121 的氨基酸序列組成。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述PD-I結(jié)合片段包含SEQID NO :1或19的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少25個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少50個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少75個(gè)連續(xù)氨基酸、 或至少90個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是包含野生型B7-H1多肽之活性片段的多肽。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述活性片段不包含此類多肽跨膜部分的任何部分。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述B7-H1多肽是人B7-H1多肽。
31.權(quán)利要求觀的方法，其中所述活性片段包含SEQID NO: 16的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少25個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少50個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少75個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少90 個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是包含野生型PD-I多肽之活性片段的多肽。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述活性片段不包含此類多肽跨膜部分的任何部分。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述PD-I多肽是人PD-I多肽。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述活性片段包含SEQID NO :17或18的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少25個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少50個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少75個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少90個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。
36.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是抗PD-I抗體或其活性片段。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺類似物。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述增強(qiáng)劑在施用所述化合物之前施用。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述增強(qiáng)劑在施用所述化合物之前至少X小時(shí)施用，其中 X 選自 1，2，3，5，10，15，20，24 和 30。
40.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是抗CTLA4抗體或其活性片段。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺類似物。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述增強(qiáng)劑在施用所述化合物之前施用。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述增強(qiáng)劑在施用所述化合物之前至少X小時(shí)施用，其中 X 選自 1，2，3，5，10，15，20，24 和 30。
44.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物由B7-DC、B7-H1、PD-I或B7.1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成，或由B7-DC、B7-H1、PD-1或B7. 1中任一的活性片段組成。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述活性片段包含至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少25個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少50個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少75個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少90個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。
46.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物以足以治療下述疾病的量存在，該疾病適合通過(guò)提高的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來(lái)治療。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述化合物選自下組(a)包含第一和第二肽部分的融合蛋白，其中所述第一肽部分包含PD-I拮抗劑多肽的活性片段且所述第二肽部分包含免疫球蛋白(Ig)的一部分；(b)抗PD-I抗體，包括其活性片段；(c)抗CTLA4抗體，包括其活性片段；(d)PD-l結(jié)合多肽或PD-I配體結(jié)合多肽；和(e)(a), (b)，(c)和(d)中任何兩項(xiàng)或更多項(xiàng)的組合。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺類似物。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述增強(qiáng)劑是降低調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(T-reg)活性的藥劑。
50.權(quán)利要求47的方法，其中所述增強(qiáng)劑是Simitinib(SUTENT )、抗TGNF3或 lmatinib (GLEEVAC )、蒽環(huán)類抗生素、奧沙利鉬、多柔比星、TLR4拮抗劑、和IL-18拮抗劑。
51.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括施用至少一種別的選自下組的藥劑抗PD-I抗體，抗CTLA4抗體，有絲分裂抑制劑，芳香酶抑制劑，A2AR拮抗劑，和血管發(fā)生抑制劑。
52.權(quán)利要求46的方法，其中所述疾病是感染性疾病。
53.權(quán)利要求46的方法，其中所述疾病是癌癥。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述癌癥是膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、 食管癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、或血液學(xué)癌癥。
55.一種治療性組合物，其在藥學(xué)可接受載體中包含阻止經(jīng)由T細(xì)胞上程序性細(xì)胞死亡-I(PD-I)的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)化合物和增強(qiáng)劑，其中所述化合物和所述增強(qiáng)劑一起以足以提高哺乳動(dòng)物中T細(xì)胞應(yīng)答的量存在。
56.權(quán)利要求55的組合物，其中所述化合物選自下組(a)包含第一和第二肽部分的融合蛋白，其中所述第一肽部分包含PD-I拮抗劑多肽的活性片段且所述第二肽部分包含免疫球蛋白(Ig)的一部分；(b)抗PD-I抗體，包括其活性片段；(c)抗CTLA4抗體，包括其活性片段；(d)PD-l結(jié)合多肽、PD-I配體結(jié)合多肽、PD-I多肽、或其活性片段；和(e)(a), (b)，(c)和(d)中任何兩項(xiàng)或更多項(xiàng)的組合。
57.權(quán)利要求55的組合物，其中所述增強(qiáng)劑是環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺類似物。
58.權(quán)利要求55的組合物，其中所述增強(qiáng)劑是Simitinib(SUTENT ) ^TGNFii或 lmatinib (GLEEVAC )、蒽環(huán)類抗生素、奧沙利鉬、多柔比星、TLR4拮抗劑、和IL-18拮抗劑。
59.權(quán)利要求47的組合物，進(jìn)一步包含至少一種別的選自下組的藥劑抗PD-I抗體， 抗CTLA4抗體，有絲分裂抑制劑，芳香酶抑制劑，A2AR拮抗劑，和血管發(fā)生抑制劑。
60.降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物在制備通過(guò)聯(lián)合療法來(lái)提高T細(xì)胞應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述化合物與增強(qiáng)劑聯(lián)合施用。
61.權(quán)利要求60的用途，其中所述降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物和所述增強(qiáng)劑作為分開(kāi)的藥物提供，供不同時(shí)間施用。
62.權(quán)利要求61的用途，其中所述增強(qiáng)劑在所述抑制性化合物之前早至M小時(shí)施用。
63.權(quán)利要求60的化合物和增強(qiáng)劑在治療感染性疾病中的用途。
64.權(quán)利要求60的化合物和增強(qiáng)劑在治療癌癥中的用途。
65.權(quán)利要求64的用途，其中所述癌癥是膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、 食管癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、或血液學(xué)癌癥。
66.權(quán)利要求60的化合物和增強(qiáng)劑在治療感染性疾病中的用途。
67.一種用于與增強(qiáng)劑聯(lián)合施用降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物的醫(yī)學(xué)試劑盒，所述試劑盒包含(a)降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物的劑量供應(yīng)；(b)增強(qiáng)劑的供應(yīng)；(c)藥學(xué)可接受載體的供應(yīng)；和(d)關(guān)于依照權(quán)利要求59-64任一的用途施用所述化合物的印刷的用法說(shuō)明。
68.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物由B7-DC，B7-H1,PD-1，或B7-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成，或由與B7-DC，B7-H1, PD-1，或B7-1只相差保守性氨基酸替代的多肽組成，和由前述項(xiàng)的片段組成。
全文摘要
描述了利用下述治療方案來(lái)治療癌癥和感染性疾病的方法，該治療方案包括與增強(qiáng)劑諸如環(huán)磷酰胺聯(lián)合施用降低T細(xì)胞中抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物以生成有力的T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。還公開(kāi)了在本發(fā)明的方法中有用的包含PD-1拮抗劑和增強(qiáng)劑的組合物。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102203132SQ200980142256
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日
發(fā)明者所羅門(mén)·蘭格曼, 琳達(dá)·劉 申請(qǐng)人:安普利穆尼股份有限公司