專利名稱：從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法
從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法本申請要求以下各項申請的優(yōu)先權(quán)申請日為2008年10月22日的英國專利申請No. 0819376. 5、申請日為2009年5月27日的美國臨時專利申請系列號No. 61/181，582、 申請日均為2009年7月27日的PCT專利申請No. PCT/US2009/051851和美國專利申請 No.12/509，731。
背景技術(shù)：
漿細(xì)胞是終末分化的非增殖性細(xì)胞，它們以非常高速率分泌抗體(每秒幾千個分子，相應(yīng)于每天每個細(xì)胞大約30-50pg)。從漿細(xì)胞分離抗體例如單克隆抗體依賴于免疫球蛋白基因的克隆及表達。這可以使用分離自漿細(xì)胞的混雜的VH和VL基因的噬菌體展示文庫進行，或者通過用單細(xì)胞 PCR從單漿細(xì)胞分離成對VH和VL基因而進行。但是，為了篩選由漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，免疫球蛋白基因需要以重組形式克隆及表達以確定編碼抗體的特異性和功能性質(zhì)。這個方法是困難的、昂貴的、耗時的、不適于高通量且不能高效獲得由漿細(xì)胞所有組成成分(total repertoire)的一小部分產(chǎn)生的稀有抗體。因此，需要鑒定更高效的適于高通量從漿細(xì)胞分離和篩選抗體例如單克隆抗體的方法。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的有效及高通量方法，其使得無需依賴于免疫球蛋白基因的克隆及表達便能表征抗體。用本發(fā)明產(chǎn)生的抗體可以通過多重篩選進行表征，包括結(jié)合、功能和/或中和測定。本發(fā)明提供了鑒定由漿細(xì)胞產(chǎn)生的稀有抗體的方法。因此，在本發(fā)明一個方面，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的方法，包括以單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)漿細(xì)胞。本發(fā)明的方法可進一步包括表征抗體或者抗體片段?？贵w或者抗體片段的表征包括但非限于進行功能測定以確定抗體或者抗體片段的功能，進行結(jié)合測定以確定抗體或者抗體片段的結(jié)合特異性或者由所述抗體或者抗體片段識別的表位，和/ 或進行中和測定以確定抗體或者抗體片段中和毒素或者病原體的能力。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗體或者抗體片段的方法。所述方法包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞；鑒定產(chǎn)生具有所需特征的抗體的培養(yǎng)物；分離編碼所產(chǎn)生的抗體的核酸；以及在宿主細(xì)胞中表達所述核酸。在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的分離的抗體或者抗體片段。本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的分離的抗體或者抗體片段診斷和/或治療各種病癥或疾病的方法。附圖簡述

圖1示出由⑶138+漿細(xì)胞累積產(chǎn)生的IgG，所述漿細(xì)胞分離自外周血并且在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞單層上培養(yǎng)50天。
圖2示出由含有分離自㈧外周血和⑶骨髓的單個漿細(xì)胞的培養(yǎng)物中的CD138+ 漿細(xì)胞累積產(chǎn)生的IgG。圖3示出測試分離自外周血并在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞單層上培養(yǎng)的⑶138-high漿細(xì)胞的10天培養(yǎng)物上清液中IgG、IgA、IgM和IgE的存在的結(jié)果。圖4示出產(chǎn)生IgG、IgA或IgM抗體的抗體分泌細(xì)胞(ASC)當(dāng)在hMSC_TERT細(xì)胞上培養(yǎng)時的平板效率(plating efficiency)，并且表示為存活時間長到足以在上清液中產(chǎn)生可檢測量抗體的漿細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖5示出在破傷風(fēng)類毒素(TT)加強免疫后7天從收集的外周血分離的漿細(xì)胞中鑒定分泌破傷風(fēng)類毒素特異性IgG的漿細(xì)胞。圖6示出由培養(yǎng)的漿細(xì)胞回收的VH和VL基因的克隆和表達產(chǎn)生的重組抗體與破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合，所述培養(yǎng)的漿細(xì)胞分離自用破傷風(fēng)類毒素免疫接種后10年的供體的血液。發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明基于從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的有效及高通量方法的發(fā)現(xiàn)，其使得無需依賴于免疫球蛋白基因的克隆及表達便能表征抗體。在一個方面，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞。用本發(fā)明產(chǎn)生的抗體可以通過使用多種篩選而方便地表征，所述篩選包括結(jié)合、功能和/或中和測定，甚至可以原位進行，即在培養(yǎng)漿細(xì)胞的孔中進行。如本文所用，術(shù)語“漿細(xì)胞”包括在外周血、骨髓、組織或體液中發(fā)現(xiàn)的或者體外從 B細(xì)胞產(chǎn)生的所有原代抗體分泌細(xì)胞(ASC)。新近產(chǎn)生的漿細(xì)胞被稱為“成漿細(xì)胞”。天然產(chǎn)生的成漿細(xì)胞通常在血液特別是外周血中發(fā)現(xiàn)。成漿細(xì)胞也可以在體外通過用各種刺激物包括多克隆激活物如TLR激動劑刺激B細(xì)胞而產(chǎn)生。在此，術(shù)語“漿細(xì)胞”應(yīng)被認(rèn)為包括 “漿細(xì)胞”、“成漿細(xì)胞”及ASC。理論上，可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任何數(shù)目的漿細(xì)胞以產(chǎn)生和鑒定具有所需特征的抗體。實踐中，可以被培養(yǎng)的漿細(xì)胞數(shù)目由于現(xiàn)有的用于克隆和表達多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的多個VH和VL基因序列及其組合的技術(shù)而受到限制。在一個實施方案中，“有限數(shù)目的漿細(xì)胞”是指漿細(xì)胞的數(shù)目是大約100或更少，例如90或更少、80或更少、70或更少、60或更少、50或更少、45或更少、40或更少、35或更少、30或更少、25或更少、20或更少、17或更少、15或更少、12或更少、10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、2或更少、或者1或更少。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，包括在培養(yǎng)物中以低漿細(xì)胞濃度培養(yǎng)漿細(xì)胞。培養(yǎng)物中的低漿細(xì)胞濃度通常包括每個培養(yǎng)物大約1至大約10 個、或者大約1至大約15個、或者大約1至大約20個、或者大約1至大約25個、或者大約1 至大約30個、或者大約1至大約40個、或者大約1至大約50個、或者大約1至大約60個、 或者大約1至大約70個、或者大約1至大約80個、或者大約1至大約90個、或者大約1至大約100個細(xì)胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，包括培養(yǎng)漿細(xì)胞， 其中所述漿細(xì)胞在每個培養(yǎng)物中已被稀釋至低細(xì)胞濃度。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，包括培養(yǎng)降低數(shù)目的漿細(xì)胞。分離自例如生物學(xué)來源的漿細(xì)胞數(shù)目可以如下所述降低。如本文所用，“降低數(shù)目的漿細(xì)胞”與上述“有限數(shù)目的漿細(xì)胞”可互換使用。在培養(yǎng)物中獲得所需細(xì)胞數(shù)目的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。這種技術(shù)包括但非限于有限稀釋或者細(xì)胞分選和沉積。例如，包含有限或降低數(shù)目漿細(xì)胞的培養(yǎng)物可以通過使用細(xì)胞分選儀經(jīng)單細(xì)胞沉積或者用足夠培養(yǎng)基稀釋漿細(xì)胞懸液而實現(xiàn)，從而微滴定培養(yǎng)平板每個孔存在1個、2個、3個或者更多個、例如5個、10個、15個、20個、25個、30個、40個、50 個、60個、70個、80個、90個或100個細(xì)胞。在一個實施方案中，培養(yǎng)單個漿細(xì)胞。鑒于由單個漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的單克隆性質(zhì)，以單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)漿細(xì)胞會產(chǎn)生單克隆抗體群。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的方法，包括以單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)漿細(xì)胞。如本文所用，“單細(xì)胞培養(yǎng)物”與“培養(yǎng)單個漿細(xì)胞”可互換使用，并且涉及一種培養(yǎng)物，其平均包含單個漿細(xì)胞。因此，在多孔板例如96孔板或者1536孔板中，大多數(shù)孔含有單個漿細(xì)胞，一些孔不含漿細(xì)胞，其它一些孔含有一個以上漿細(xì)胞。在一些實施方案中， 漿細(xì)胞可以在其中每孔中有平均少于1個細(xì)胞、例如0. 8個細(xì)胞/孔、0. 6個細(xì)胞/孔、0. 5 個細(xì)胞/孔、0. 3個細(xì)胞/孔或者0. 1個細(xì)胞/孔的培養(yǎng)物中培養(yǎng)漿細(xì)胞。獲得培養(yǎng)物中單細(xì)胞的技術(shù)與上述類似，除了微滴定培養(yǎng)平板每孔存在平均1個或者少于1個細(xì)胞。本發(fā)明進一步提供了產(chǎn)生抗體或抗體片段的方法。所述方法包括根據(jù)本發(fā)明任何方法培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞，鑒定產(chǎn)生具有所需特征的抗體的培養(yǎng)物，分離編碼所產(chǎn)生的抗體的核酸，以及在宿主細(xì)胞中表達所述核酸。與可以通過永生化擴增成抗體產(chǎn)生細(xì)胞克隆的記憶B細(xì)胞(Traggiai etal., 2004, Nat Med 10 :871-875 ；Lanzavecchia et al,2007, Curr OpinBiotechnol. 18 523-528)不同，漿細(xì)胞不分化，并且不能被刺激或者永生化。因此，為了以任何有意義方式利用這些“抗體工廠”，漿細(xì)胞必須在培養(yǎng)中保持存活。漿細(xì)胞以連續(xù)方式產(chǎn)生和分泌抗體， 因此抗體群的大小隨著時間而增加。盡管漿細(xì)胞在體內(nèi)存活非常長時間，它們在體外存活的時間不比一天長許多(實驗數(shù)據(jù)未示出)。因此，本發(fā)明提供了通過在包含延長培養(yǎng)的細(xì)胞存活的外源成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)漿細(xì)胞(包括但非限于單個漿細(xì)胞)而產(chǎn)生抗體的方法。通常，培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活被延長足夠時間，由此以表征抗體所需的量產(chǎn)生抗體， 即，培養(yǎng)基含有足夠的抗體，由此其可以用于篩選測定，包括但非限于結(jié)合測定、中和測定或者確定功能或者另外表征抗體的其它測定。含有所需特異性的抗體的培養(yǎng)物然后可以被分離，免疫球蛋白基因可以被克隆、測序及表達以產(chǎn)生單克隆抗體。培養(yǎng)物中的漿細(xì)胞包括但非限于單個漿細(xì)胞的存活可以短期或長期延長。如本文所用，“短期”是指至少2天至大約9天時間，即2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或者大約9天。如本文所用，“長期”是指至少10天時間，例如10天、15天、20天、25天、30天、35 天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天或者大約150天。盡管短期延長漿細(xì)胞的存活不能產(chǎn)生如長期延長漿細(xì)胞存活所產(chǎn)生的那樣多的抗體，但是如本文所述短期延長漿細(xì)胞的存活更簡單、更快及更經(jīng)濟，并且特別有用于在敏感測定中篩選抗體。長期延長漿細(xì)胞存活特別適于其中抗體表征需要多個篩選測定或者低敏感性測定的情況中。在一個實施方案中，培養(yǎng)基中存在的外源成分短期延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活。在另一個實施方案中，外源成分長期延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活。外源成分可以是一或多種由漿細(xì)胞表達的受體的配體或者一或多種非漿細(xì)胞。用于延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活的由漿細(xì)胞表達的受體的配體的例子包括但非限于細(xì)胞因子、趨化因子和其它配體。在一個實施方案中，所述配體是IL-5、IL-6、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I(SDF-I)、TNF-α或者CD44的配體，例如ialuronic acid。在另一個實施方案中，外源成分包括選自由IL-5、IL-6、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-I) >TNF-α、⑶44的配體例如ialuronic acid及其組合組成的組的一或多種配體，并用于短期或者長期延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活。用于延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活的非漿細(xì)胞的例子包括但非限于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞或者破骨細(xì)胞。在一個實施方案中，所述非漿細(xì)胞是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或者破骨細(xì)胞，并且用于短期或者長期延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活。在另一個實施方案中， 所述非漿細(xì)胞是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞并且用于短期或者長期延長培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以是哺乳動物間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，包括但非限于人類間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以任選地在用于培養(yǎng)物之前永生化。在本發(fā)明的一個實施方案中，漿細(xì)胞在由漿細(xì)胞表達的受體的一或多種配體存在下以例如單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)大約3天至大約7天，或者大約5天至大約9天。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞在一或多種類型非漿細(xì)胞存在下以例如單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)大約5天至大約7天，或者大約10天，或者大約15天，或者大約20天，或者大約W天，或者大約30天， 或者大約35天，或者大約40天，或者大約45天，或者50天以上。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞存在下以例如單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)大約5-7天，或者大約10天，或者大約15天，或者大約20天，或者大約W天，或者大約30天，或者大約；35天，或者大約40 天，或者大約45天，或者50天以上。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞在一或多種類型非漿細(xì)胞以及由漿細(xì)胞表達的受體的一或多種配體存在下以例如單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)大約5-7天， 或者大約10天，或者大約15天，或者大約20天，或者大約％天，或者大約30天，或者大約 35或者大約40天，或者大約45或者大約50天，或者大約55或者大約60天，或者大約65 天，或者70天以上。在一個實施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞的平板效率可以是至少大約30%，在另一個實施方案中平板效率可以是至少大約40 %，在另一個實施方案中平板效率可以是至少大約50 %， 在另一個實施方案中平板效率可以是至少大約55%，在另一個實施方案中平板效率可以是至少大約60%或更多。如本文所用，術(shù)語“平板效率”指的是存活足夠長時間以在上清液中產(chǎn)生可檢測量的抗體的漿細(xì)胞百分比。培養(yǎng)的漿細(xì)胞可以得自任何所需物種。在一個實施方案中，漿細(xì)胞是小鼠、大鼠、 駱駝或者猴的漿細(xì)胞。在另一個實施方案中，培養(yǎng)的漿細(xì)胞是人類漿細(xì)胞，產(chǎn)生的抗體是人類抗體。在另一個實施方案中，通過以單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)人類漿細(xì)胞產(chǎn)生人類單克隆抗體。漿細(xì)胞例如人類漿細(xì)胞可以分離自人類外周血。這些人類漿細(xì)胞可以被稱為“外周血漿細(xì)胞”或者“循環(huán)漿細(xì)胞”。漿細(xì)胞例如人類漿細(xì)胞也可以分離自骨髓、組織或者分離自體液，包括但非限于人類的滑液、腦脊液和滲出物。術(shù)語“組織”意在覆蓋存在于人體內(nèi)的任何組織，并且可以包括心臟組織、神經(jīng)組織、肌肉組織、上皮、結(jié)締組織和淋巴器官如胸腺、脾和淋巴結(jié)。漿細(xì)胞通常特征在于表達⑶138，任選地特征在于另外表達⑶27、⑶38、⑶9、⑶44 和MHC II類分子。在一個實施方案中，細(xì)胞可以根據(jù)⑶138的表達而分離自外周血、組織、骨髓或者體液。除了 CD138之外表面標(biāo)記如⑶27、⑶38、CD9、CD44和MHC II類分子也可以使用以改善分離程序及鑒定漿細(xì)胞亞集(Arce et al. ,2004, J Leukoc Biol, 75 1022-1028)。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以用磁性微珠分離。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以用包被有固定化抗CD138抗體的磁性微珠分離。在另一個實施方案中，用磁性微珠富集漿細(xì)胞可以后接細(xì)胞分選。在一個實施方案中，漿細(xì)胞可以分離自免疫接種后的人類供體的外周血。免疫接種是指施用能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何抗原。疫苗可以是現(xiàn)在已知的任何疫苗，或者后來本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的疫苗，并且包括但非限于破傷風(fēng)類毒素、流感、黃熱病、破傷風(fēng)-白喉、乙型肝炎、天花和癌癥疫苗。在另一個實施方案中，免疫接種可以是加強免疫。漿細(xì)胞可以在免疫接種后4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天分離自供體。在一個實施方案中，漿細(xì)胞可以分離自應(yīng)答已知病原體的供體。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以分離自應(yīng)答未知病原體的供體。在進一步的實施方案中，漿細(xì)胞可以分離自具有變態(tài)反應(yīng)的供體。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以分離自穩(wěn)態(tài)條件下的供體。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以分離自具有自身免疫病的供體。在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以通過刺激B細(xì)胞體外產(chǎn)生。這個刺激可以用本領(lǐng)域已知任何方法進行，包括原初或者記憶B細(xì)胞的多克隆或者抗原特異性刺激 (Bernasconi et al，2002，Science，298 :2199-2202)。本發(fā)明的方法可以用于培養(yǎng)分泌任何同種型的任何抗體的漿細(xì)胞。在一個實施方案中，漿細(xì)胞可以是IgG漿細(xì)胞，在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以是IgA漿細(xì)胞，在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以是IgM漿細(xì)胞，在另一個實施方案中，漿細(xì)胞可以是IgD漿細(xì)胞，在進一步的實施方案中，漿細(xì)胞可以是IgE漿細(xì)胞。在另一個實施方案中，分離的漿細(xì)胞群可以是包含兩個或多個同種型的漿細(xì)胞的混合群。分離的人類漿細(xì)胞可以用酶聯(lián)免疫吸附法斑點(ELISP0T)測定計數(shù)(Bernasconi et al，2002，Science, 298 :2199-2202)。這個測定通過顯現(xiàn)由感興趣細(xì)胞分泌的產(chǎn)物而進行，其中測定產(chǎn)生的每個斑點代表一個單細(xì)胞。在一個實施方案中，人類漿細(xì)胞可以通過有限稀釋或者通過單細(xì)胞沉積而作為單細(xì)胞接種。在一個方面，人類漿細(xì)胞可以在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞存在下作為單細(xì)胞接種。在另一個實施方案中，人類漿細(xì)胞可以作為多克隆培養(yǎng)物接種。漿細(xì)胞可以在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞存在下作為多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物接種?；蛘叨嗫寺∪祟悵{細(xì)胞培養(yǎng)物可以用有限稀釋分離成單細(xì)胞培養(yǎng)物。在另一方面，多克隆人類漿細(xì)胞培養(yǎng)物可以用單細(xì)胞沉積分離成單細(xì)胞培養(yǎng)物。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，但是具有比成纖維細(xì)胞大的分化潛力，并且能分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞作為異質(zhì)群體被發(fā)現(xiàn)，并且形成它們所位于的組織的支持結(jié)構(gòu)。在骨髓中，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞是造血細(xì)胞的生長及分化以及白血病細(xì)胞的維持所需的。原代間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以在合適培養(yǎng)基中分離并且培養(yǎng)若干代，但是僅培養(yǎng)有限時間之后經(jīng)歷衰老。使用端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的轉(zhuǎn)導(dǎo)已用于永生化間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞在體外無限擴增的同時保持它們的生理學(xué)生長速度和功能特征。用于培養(yǎng)物中的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以是骨髓衍生的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以是哺乳動物間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，例如人類間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。用于本發(fā)明方法中的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以通過在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)而分離自貼壁骨髓細(xì)胞。這種培養(yǎng)基可含有氫化可的松。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞也可以衍生自其它組織。為實踐的理由，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以在用于本發(fā)明方法中之前永生化。如本文所用，“永生化”是指間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞具有改良的增殖能力，同時保持使它們能維持漿細(xì)胞的所有特征，包括經(jīng)歷接觸依賴性生長抑制的能力。在一個實施方案中，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在到達鋪滿后可以存活至少大約1周。在另一個實施方案中，永生化的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在到達鋪滿后可以存活至少大約2周，或者在到達鋪滿后可以存活至少大約3周，或者在到達鋪滿后可以存活至少大約4周。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以用本領(lǐng)域已知的任何方式永生化。在一個實施方案中，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞通過用端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而永生化。在另一個實施方案中，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞可以根據(jù)Mihara et al. ,2003 Br J Haematol 120 :846-849所述方法用 TERT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而永生化。如上討論，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗體或者抗體片段的方法。所述方法包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞，鑒定產(chǎn)生具有所需特征的抗體的培養(yǎng)物，分離編碼所產(chǎn)生的抗體的核酸，以及在宿主細(xì)胞中表達所述核酸。如本文所用，術(shù)語“片段”和“抗體”片段可互換使用，是指本發(fā)明抗體的任何片段。 在一個實施方案中，抗體片段保留抗體的抗原結(jié)合活性。在另一個實施方案中，抗體片段可包含 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 或更多個連續(xù)氨基酸。舉例的抗體片段可包含F(xiàn)e、Fab、Fab，、F (ab' ) 2、Fv、scFv片段、重鏈、輕鏈、鉸鏈區(qū)、抗原結(jié)合位點、單鏈抗體或其任何部分中的一或多種。如本文所用，術(shù)語“核酸”包括所有形式的核酸，包括但非限于基因組DNA、cDNA 和mRNA?？贵w或者抗體片段的克隆及異源表達可以用本領(lǐng)域已知的分子生物學(xué)和重組 DNA 常規(guī)技術(shù)進行(Wrammert et al. , 2008Nature 453，667_671&Mei jer et al. ,2006 J Mol Biol 358,764-772) 這種技術(shù)在文獻中詳細(xì)解釋，例如 Sambrook，1989 Molecular Cloning ；A LaboratoryManual, Second Edition。對于 VH/VL 序列的獲取及表達可以使用 Tiller etal.，J Immunol Methods 2008329 :112-124 的方法。在一個實施方案中，抗體用合適載體或病毒在真核細(xì)胞中表達。真核細(xì)胞可以是 CH0、293TJ93F或者酵母細(xì)胞。在另一個實施方案中，抗體用合適載體或噬菌體在原核細(xì)胞中表達。原核細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。在進一步實施方案中，異源表達系統(tǒng)可以是無細(xì)胞系統(tǒng)。本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體和抗體片段可以容易地用公知方法學(xué)分離(Coligan et al Eds Current Protocol in Immunology 1:2.7)。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或者抗體片段包括單克隆抗體或者抗體片段可以通過離心或者親和層析從培養(yǎng)物上清液中分離。在另一個實施方案中，抗體或者抗體片段可以根據(jù)它們的結(jié)合特異性分離。例如，抗體可以通過施加于包含合適的固定化抗原的固體支持物而分離。在進一步的實施方案中， 抗體可以用在一些情況中可以固定化的抗-IgG、抗-IgE、抗-IgA、抗-IgD或抗-IgM抗體分
1 O血漿分泌Ig或者特異性抗體可以用免疫親和方法分離。首先，分泌的產(chǎn)物可以用合適的共價結(jié)合的捕獲試劑捕獲在分泌細(xì)胞表面。然后捕獲的產(chǎn)物可以用熒光標(biāo)記的第二抗體或抗原揭示(Manz et al.，1998 Int Immunol 10,1703-1711)?？贵w表征漿細(xì)胞不表達表面免疫球蛋白，因此不能根據(jù)同種型或者抗原特異性選擇。因此漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體需要被分離以表征。目前，現(xiàn)有技術(shù)主要使用兩種方法從漿細(xì)胞制備單克隆抗體。第一種方法是篩選從免疫供體的全部骨髓制備的抗體的展示文庫(Williamson et al.，1993Proc Natl Acad Sci U S A 90,4141-4145)。但是這種方法受到骨髓樣品的可得性限制。第二種方法涉及在加強免疫后分離循環(huán)漿細(xì)胞，隨后用單細(xì)胞PCR從個體漿細(xì)胞中回收 Ig基因(Wrammert et al. , 2008Nature 453,667-671 & Meijer et al.，2006 J Mol Biol 358,764-772)。這個方法基于如下事實加強免疫后6_8天，相當(dāng)大部分循環(huán)漿細(xì)胞特異于免疫抗原。但是這個方法需要在抗體特異性可以評估之前進行大量基因克隆和表達工作，因此當(dāng)漿細(xì)胞應(yīng)答針對多個抗原如復(fù)雜病原體時這個方法不太適用。因此開發(fā)人類漿細(xì)胞的長期培養(yǎng)系統(tǒng)對于獲取足夠抗體進行體外結(jié)合測定、功能測定和進一步抗體表征是特別有用的，以便能選擇產(chǎn)生感興趣抗體的漿細(xì)胞。從漿細(xì)胞或者其它抗體分泌細(xì)胞分離抗體的其它方法基于顯微操作并且包括第一步，其中細(xì)胞鋪板于半固體培養(yǎng)基中(Harriman WD et al J Immunol Methods 341 ； 135-1452009)或者微陣列芯片中(Jin A et al Nat Medicine 15 ;10882009)，分泌的抗體用熒光探針原位檢測。一旦鑒定，可通過顯微操作回收漿細(xì)胞，擴增并測序VH和VL基因。 這些方法基于短期培養(yǎng)及分泌抗體的局部檢測，需要顯微操作抗體分泌細(xì)胞的專門設(shè)備并且不適于測試抗體的功能性質(zhì)如病毒或毒素中和。本發(fā)明的方法不是基于也不需要任何顯微操作，本發(fā)明的方法使得產(chǎn)生的抗體得以在多種測定中被篩選，包括但非限于結(jié)合測定、 功能測定和/或中和測定。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法， 包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞并表征抗體，其中所述方法不包括顯微操作獲取抗體分泌漿細(xì)胞。本發(fā)明包括表征由本發(fā)明的方法分離的抗體或者抗體片段。在一個實施方案中， 抗體表征可包括確定抗體或者抗體片段的結(jié)合特異性。在另一個實施方案中，抗體表征可包括確定由抗體或者抗體片段識別的表位。分離的抗體或者抗體片段的結(jié)合特異性和/或由抗體或者抗體片段識別的表位可以用本領(lǐng)域已知的任何方法確定。在一個實施方案中， 所述結(jié)合特異性和/或識別的表位可以如下確定標(biāo)記分離的抗體或者抗體片段，將標(biāo)記的抗體或者抗體片段呈遞給抗原文庫，檢測與其關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體或者抗體片段。 在另一個實施方案中，標(biāo)記抗體或者抗體片段可以施加于含有固定化抗原分子的純化柱， 柱上標(biāo)記抗體或者抗體片段的存在與否可以用作抗體特異性和/或識別的表位的指示。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了分離自已用特定抗原免疫的或者已暴露于特定病原體的供體的外周血的漿細(xì)胞將產(chǎn)生結(jié)合該抗原或病原體的抗體或抗體片段。然而，病原體特別是復(fù)雜病原體很可能包含許多抗原，特定抗體或者抗體片段的結(jié)合特異性和/或識別的表位可能仍是不確定的。本發(fā)明的單細(xì)胞培養(yǎng)方法提供了產(chǎn)生特異性抗體的單個漿細(xì)胞，從其可以容易地用公知方法學(xué)分離編碼抗體的核酸(Wrammert et al.，2008Nature453，667-671 & Meijer et al. ,2006 J Mol Biol 358，764-77 。在一個實施方案中，抗體表征可涉及測序編碼抗體或者抗體片段的核酸。核酸測序可以用本領(lǐng)域已知的任何方法進行。在一個實施方案中， 核酸測序可以用鏈終止進行，其中可以使用放射性染料、熒光染料或者其它染料。在另一個方面核酸測序可以用自動化測序方法進行。在另一個實施方案中，表征可涉及測序抗體蛋白?？贵w蛋白可用本領(lǐng)域已知任何方法測序。在一個實施方案中，抗體蛋白可以通過N-末端分析、C-末端分析或者Edman降解進行測序。N-末端分析可包括i)將蛋白質(zhì)與選擇性標(biāo)記氨基末端氨基酸的試劑反應(yīng); )水解所述蛋白質(zhì)；及iii)通過層析確定氨基末端氨基酸并與標(biāo)準(zhǔn)進行比較。在這個方面中，可以使用任何標(biāo)記試劑，包括但非限于Sanger試劑、丹磺酰衍生物如丹磺酰氯及苯基異硫氰酸酯。C-末端分析可包括將蛋白質(zhì)與羧基肽酶保溫并且以固定間隔取樣以產(chǎn)生氨基酸濃度對時間的做圖?？贵w蛋白測序后，本發(fā)明還包括基于鑒定的抗體序列化學(xué)合成結(jié)合蛋白?；瘜W(xué)合成可根據(jù)本領(lǐng)域已知任何方法進行。在一個實施方案中，化學(xué)合成可以通過將氨基酸的羧基附著于不溶的固體支持物并且將固定化抗體的氨基與序列中下一個抗體的羧基反應(yīng)而進行。這個方法可以重復(fù)直至產(chǎn)生所需氨基酸序列，在此階段完整蛋白質(zhì)可以從固體支持物上裂解，并且使其或者誘導(dǎo)其采取正確蛋白質(zhì)折疊。本發(fā)明還包括用本發(fā)明任何方法產(chǎn)生的抗體或抗體片段。抗體的藥物用途本發(fā)明提供了由本發(fā)明任何方法產(chǎn)生的抗體或者抗體片段用于治療、例如用于治療變態(tài)反應(yīng)、感染性病癥或疾病、癌癥和自身免疫病癥或疾病術(shù)語“變態(tài)反應(yīng)”包括所有形式的由非寄生蟲抗原導(dǎo)致的超敏感性反應(yīng)，包括但非限于變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎、血管性水腫、過敏反應(yīng)、阿司匹林敏感性、哮喘、變應(yīng)性皮炎、 禽類過敏、金絲雀過敏、貓哮喘、特應(yīng)性皮炎、鳥過敏、金絲雀過敏、貓過敏、化學(xué)品敏感、雞過敏、結(jié)膜炎、慢性疲勞、接觸性皮炎、化妝品過敏、牛奶過敏、皮炎、狗過敏、藥物反應(yīng)、鴨過敏、灰塵過敏、塵螨過敏、濕疹、鵝過敏、草過敏、花粉熱、頭痛、心律不齊、蕁麻疹、兒童多動癥(hyperactivity in children)、低血糖、呼吸和接觸過敏原、乳糖不耐受、偏頭痛、乳品過敏、螨蟲過敏、風(fēng)疹，鸚鵡過敏、長尾小鸚鵡過敏(parakeet allergy)、常年性鼻炎、鴿子過敏、花粉過敏、鼻炎、漆樹過敏、水楊酸鹽敏感、鼻竇炎、皮疹、麻雀過敏、火雞過敏、ucaria 以及酵母過敏。術(shù)語“感染性疾病”包括因存在病原性微生物而引起的任何具有顯著臨床表現(xiàn)的疾病，所述病原性微生物包括但不限于病毒、細(xì)菌、原生動物、寄生蟲和真菌。術(shù)語“感染性疾病”包括但不限于AIDS、AIDS相關(guān)綜合征、水痘、感冒、巨細(xì)胞病毒感染、科羅拉多壁虱熱、登革熱、埃博拉出血熱、手-足-口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、HPV、流感、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、傳染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、諾如病毒(Norovirus)、脊髓灰質(zhì)炎、進行性多灶性白質(zhì)腦病、狂犬病、風(fēng)疹、SARS、天花、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅河熱、黃熱病、炭疽、細(xì)菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯氏菌病、 彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑疹傷寒、淋病、膿皰病-軍團菌、麻風(fēng)病、鉤端螺旋體病、利斯特菌病、萊姆病、類鼻疽、風(fēng)濕熱；MRSA感染、諾卡菌病、百日咳、瘟疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡熱、Q熱、落基山斑疹熱(RMSF)、沙門氏菌病、猩紅熱、志賀菌病、梅毒、破傷風(fēng)、 沙眼、肺結(jié)核、兔熱病、傷寒、斑疹傷寒-尿路感染、非洲錐蟲病、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝蟲病、南美洲錐蟲病、支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊尾蚴病、裂頭絳蟲病、龍線蟲病、棘球蚴病、 蟯蟲病、片吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自生生活阿米巴蟲感染、賈第蟲病、腭口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、旋毛蟲病(trichinellosis)、旋毛蟲病(trichinosis)、鞭蟲病、滴蟲病、錐蟲病、曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、足癬、可傳播性海綿狀腦病、牛海綿狀腦病、克羅伊茨費爾特-雅各布病、庫魯病、致死性家族性失眠癥，以及Alpers綜合征。術(shù)語“自身免疫疾病”包括免疫系統(tǒng)與自身抗原反應(yīng)的所有形式的疾病，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、硬皮病、乳糜瀉、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎、肺出血腎炎綜合征、阿狄森氏病、韋格納肉芽腫病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性甲狀腺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、交感性眼炎、自身免疫性神經(jīng)病、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征、抗磷脂綜合征、狼瘡、多內(nèi)分泌腺缺陷綜合征、1型多內(nèi)分泌腺缺陷綜合征、 2型多內(nèi)分泌腺缺陷綜合征、免疫性血小板減少性紫癜、惡性貧血、重癥肌無力、混合性結(jié)締組織病、原發(fā)性腎小球腎炎、白癜風(fēng)、自身免疫性色素層炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、乳糜瀉、皰疹樣皮炎、天皰瘡、尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、自身免疫性心肌炎、自身免疫性脈管炎、自身免疫性眼病、斑禿、自身免疫性動脈粥樣硬化、白塞氏病、自身免疫性脊髓病、自身免疫性血友病、自身免疫性間質(zhì)性膀胱炎、自身免疫性尿崩癥、自身免疫性子宮內(nèi)膜異位癥、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、強直性脊柱炎、自身免疫性風(fēng)疹、副腫瘤性自身免疫綜合征、皮肌炎、Miller Fisher綜合征，以及IgA腎病。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的抗體或者抗體片段，用于生產(chǎn)治療變態(tài)反應(yīng)、感染性病癥或疾病以及自身免疫性病癥或疾病的藥物。本發(fā)明進一步提供了治療變態(tài)反應(yīng)、感染性病癥或疾病以及自身免疫性病癥或疾病的方法，包括施用通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的抗體或者抗體片段。本發(fā)明還包括將通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的抗體或抗體片段或者編碼這種抗體或抗體片段的核酸配制成藥物可接受的組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物可包含通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的一或多種分離的抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，所述藥物組合物可包含通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的2、3、4、5或更多種分離的抗體或抗體片段。藥物組合物也可含有藥物可接受的載體以便施用。所述載體其自身應(yīng)不誘導(dǎo)不利于接受所述組合物的個體的抗體的產(chǎn)生及應(yīng)是無毒性的。合適的載體可包括大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物及失活的病毒顆粒。在一些實施方案中，可以使用藥物可接受的鹽，例如無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽，有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和安息香酸鹽。在一些實施方案中，所述藥物組合物也可含有液體如水、鹽水、甘油和乙醇。此外， 輔助物質(zhì)如濕潤劑或者PH緩沖物質(zhì)可以存在于所述組合物中，且可使得所述藥物組合物被配制成由患者攝取的片劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液和懸浮液。所述藥物組合物可以通過任何途徑施用，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、透皮(transdermal)、經(jīng)皮(transcutaneous)、局部、皮下、 鼻內(nèi)、經(jīng)腸道、舌下、陰道內(nèi)或者直腸途徑施用。所述藥物組合物的pH可以是在5. 5-8. 5之間，在一些實施方案中pH在6_8之間， 在進一步的實施方案中為大約7。所述pH可以通過使用緩沖液維持。所述組合物可以是無菌和/或無熱原的。所述組合物可以是對于人體等滲的。在另一個實施方案中，通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的抗體或抗體片段可以與診斷性賦形劑組合形成診斷試劑。在一個實施方案中，所述診斷試劑可包含通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的一或多種分離的抗體。例如，所述診斷試劑可包含通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的2、3、4、5或更多種抗體或抗體片段。所述診斷性賦形劑可包含藥物可接受的載體，以使得可以將診斷試劑給予患者。 所述載體其自身應(yīng)不誘導(dǎo)不利于接受所述組合物的個體的抗體的產(chǎn)生及應(yīng)是無毒性的。合適的載體可包括大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物及失活的病毒顆粒。在某些實施方案中，可以使用藥物可接受的鹽，例如無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽，有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和安息香酸鹽。在一些實施方案中，所述藥物試劑也可含有液體如水、鹽水、甘油和乙醇。此外，可以存在輔助物質(zhì)如濕潤劑或者乳化劑或者PH緩沖物質(zhì)。所述診斷試劑可用于在體內(nèi)、在體外或者離體診斷中。對于在體內(nèi)應(yīng)用，所述診斷試劑可以通過任何途徑施用，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、透皮、經(jīng)皮、局部、皮下、鼻內(nèi)、經(jīng)腸道、舌下、陰道內(nèi)或者直腸途徑施用。診斷試劑的pH可以在5. 5-8. 5之間，在一些實施方案中pH在6-8之間，在進一步的實施方案中PH為大約7。所述pH可以通過使用緩沖液維持。所述組合物可以是無菌和 /或無熱原的。所述診斷試劑對于人體可以是等滲的。在一個實施方案中，所述診斷試劑可包括標(biāo)記抗體。所述標(biāo)記可選自熒光標(biāo)記、放射標(biāo)記、半抗原和生物標(biāo)記，包括酶標(biāo)記。所述診斷試劑可用于確定特定抗原的存在與否。從這個信息中可以推斷確定特定抗原的存在與否，以及因此確定特定病癥或疾病的存在與否。在本發(fā)明的一方面中，所述疾病可以是變態(tài)反應(yīng)、感染性病癥或疾病或者自身免疫性病癥或疾病。使用診斷試劑獲得的信息可用于確定特定患者的適當(dāng)療程。特別地，所述診斷試劑可用于確定變應(yīng)原的存在與否。術(shù)語“變應(yīng)原”包含在個體內(nèi)能刺激超敏反應(yīng)的任何非寄生蟲抗原，包括但不限于貓、毛皮、毛屑、蟑螂萼、羊毛、塵螨、塵螨排泄物、青霉素、磺胺、水楊酸鹽、麻醉劑包括局麻藥、芹菜、塊根芹、谷物、玉米、小麥、蛋、蛋白、水果、南瓜、豆類、菜豆、豌豆、堅果、花生、大豆、牛奶、海產(chǎn)品、芝麻、大豆、樹生堅果(tree nuts)、美洲山核桃、杏仁、昆蟲刺傷、蜂蜇毒、 黃蜂蜇毒、蚊蟲叮咬、霉菌孢子、乳膠、金屬、植物花粉、牧草包括黑麥草和貓尾草、野草包括豚草、車前草、蕁麻、北艾蒿、藜和酸模屬、及樹木包括樺樹、榿木、榛木、角樹、七葉樹屬、柳樹、楊樹、懸鈴木屬、椴樹、橄欖樹、Ashe juniper。分離的抗體在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用本發(fā)明還包含將通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的分離的抗體或抗體片段固定在固體支持物上的方法。術(shù)語“固體支持物”包括固體和半固體支持物，以及涵蓋可用于在其上固定所述分離的抗體或抗體片段的任何支持物。所述固體支持物可包含凝膠、網(wǎng)狀物、珠包括玻璃球或磁珠、柱、管、微滴定平板孔或者塑料片。通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的固定的抗體或抗體片段可用于蛋白質(zhì)純化中。在一個實施方案中，固定的抗體可以用于免疫親和性層析。包含感興趣的蛋白質(zhì)的溶液可用于包含通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的對于感興趣的蛋白質(zhì)具有特異性的固定的抗體或抗體片段的固體支持物中。所述抗體或抗體片段可例如固定在珠上，在一些實施方案中所述珠可置于柱中。一般概念術(shù)語“包含”涵蓋“包括”以及“由……組成”，例如組合物“包含” X是指可以只由 X組成或者可包括其它一些事物，例如X+Y。單詞“基本上”不除外“完全”，例如“基本上沒有” Y的組合物可以是完全沒有Y的組合物。在需要之處，單詞“基本上”可以從本發(fā)明的定義中刪去。關(guān)于數(shù)值χ的術(shù)語“大約”是指例如χ士 10%。如本文所用，術(shù)語“疾病”是與術(shù)語“失調(diào)”和“病癥”(如在醫(yī)學(xué)病癥中)是一般同義詞，均反映出人或動物機體或者其一部分正常功能受損的異常狀況，典型通過不同的跡象和癥狀顯現(xiàn)，并導(dǎo)致人或動物的生存期或生存質(zhì)量下降。如本文所用，關(guān)于患者的“治療”是指包括防止和預(yù)防以及治療。術(shù)語“患者”是指包括人的所有哺乳動物。通常地，所述患者是人。
實施例本發(fā)明舉例的實施方案在如下實施例中提供。如下實施例只是例證本發(fā)明及幫助技術(shù)人員使用本發(fā)明。所述實施例不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的漿細(xì)胞本發(fā)明人觀測到根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從正常骨髓中建立的人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物(Pittenger et al, 1999, Science 284 :143-147 ；Bieback et al，2004Stem cells 22 :625-634 ；Dominici et al,2006,Cytotherapy 8 :315-317 ；Sotiropoulou et al 2006, Stem Cells 24:462-471)含有分泌抗體的細(xì)胞。這些細(xì)胞通過ELISP0T檢測，并鑒定為漿細(xì)胞。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的漿細(xì)胞在3周后在體外仍可檢測(數(shù)據(jù)未示出)。實施例2 人漿細(xì)胞直至50天的培養(yǎng)物為了開發(fā)其中個體漿細(xì)胞可以保持存活以便產(chǎn)生的抗體可以隨著培養(yǎng)時間積累的培養(yǎng)系統(tǒng)，本發(fā)明人檢測了根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備的不同來源的原代間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。簡而言之，將組織培養(yǎng)瓶用FCS預(yù)包被1小時。使骨髓細(xì)胞在補加30% FCS和10_%地塞米松的完全IMDM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)過夜。洗去未貼壁的細(xì)胞，并將貼壁細(xì)胞在完全DMEM-10% FCS中培養(yǎng)。檢測的7個品系中有3個品系支持人漿細(xì)胞存活，但是在幾個傳代之后終止增殖。在隨后的實驗中，使用通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(MSC-TERT)轉(zhuǎn)導(dǎo)固定的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞是由Mihara et al. (Br J Haematol2003，120，846-849)分離的那些細(xì)胞。將周圍血單核細(xì)胞用PE-標(biāo)記的抗-⑶138單克隆抗體染色，使用抗_PE微珠 (Miltenyi)富集，并通過細(xì)胞分選進一步純化以分離⑶138-陽性細(xì)胞。回收的分泌IgG的漿細(xì)胞的數(shù)目使用同種型特異性ELISP0T確定。將不同數(shù)目的CD138-陽性細(xì)胞種植在96 孔培養(yǎng)平板的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞單層上，所述96孔培養(yǎng)平板中具有RPMI 1640，且補加10% 胎牛血清(Hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸鹽和glUtamax(GIBC0)?；谠阡伆鍟r進行的 ELISP0T,圖1所示培養(yǎng)物含有7個分泌IgG的細(xì)胞。在不同時間點收集一半的培養(yǎng)物上清液并以新鮮培養(yǎng)基更換。此外，在第18天和第34天，完全除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基取代。確定每天每個培養(yǎng)物的IgG產(chǎn)生率以及估計的每天每個漿細(xì)胞的IgG產(chǎn)生率。如圖1 所示，大約7個細(xì)胞的本發(fā)明的培養(yǎng)物產(chǎn)生的IgG的量在50天期間隨著培養(yǎng)時間以線性函數(shù)方式增加，與676pg/天的產(chǎn)生率和估計的96pg/細(xì)胞/天的產(chǎn)生率一致。實施例3 個體漿細(xì)胞的3周培養(yǎng)物使用PE-綴合的抗-⑶138抗體及隨后通過抗-PE微珠和細(xì)胞分選從周圍血或者骨髓中分離漿細(xì)胞，并以0. 5細(xì)胞/孔密度種植在96孔平板中的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞單層上。 通過定期取樣在22-23天期間監(jiān)測含有IgG的培養(yǎng)物。在第16天更換培養(yǎng)基。在整個培養(yǎng)期間，單克隆培養(yǎng)物中IgG生產(chǎn)率是恒定的，為72-134pg/細(xì)胞/天(圖2a，周圍血衍生的G個培養(yǎng)物)；圖2b，骨髓衍生的(5個培養(yǎng)物))。在5個限制稀釋的實驗中，血液和骨髓漿細(xì)胞的平板效率為30% -65% (數(shù)據(jù)未示出)。此外，從多克隆培養(yǎng)物中回收的漿細(xì)胞可以再鋪板于單細(xì)胞培養(yǎng)物中，其中其維持恒定的Ig分泌率(數(shù)據(jù)未示出)。IgG的線性積累與以恒定的高比率分泌IgG的個體細(xì)胞的保持一致。以完全消除由TLR激動劑刺激的記憶B細(xì)胞的增殖和分化的水平照射細(xì)胞， 這不影響培養(yǎng)的漿細(xì)胞的IgG產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未示出)。實施例4 產(chǎn)生IgG、IgA、IgM和IgE的漿細(xì)胞的培養(yǎng)從健康供體中分離產(chǎn)生IgG、IgA、IgM和IgE的周圍血CD138-陽性細(xì)胞，并以5個細(xì)胞/孔的密度鋪板于含有間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞單層的384-孔鋪板中，617份一式兩份培養(yǎng)。 使用同種型特異性ELISA檢測第10天的培養(yǎng)物上清液中IgG、IgA、IgM和IgE的存在。在培養(yǎng)物上清液中測量4個同種型的總量(見圖3)。漿細(xì)胞的IgG、IgA、IgM和IgE生產(chǎn)率的平均值在10天內(nèi)分別為860、770、1100和1800pg，即分別為86、77、110和180pg/細(xì)胞/ 天。實施例5 體外漿細(xì)胞存活的效率根據(jù)⑶138表達從7個供體中分離周圍血衍生的人漿細(xì)胞，并以1或25個細(xì)胞/ 孔的密度種植。在培養(yǎng)開始時分泌IgG-抗體、IgA-抗體和IgM-抗體的細(xì)胞的數(shù)目通過同種型特異性ELISP0T計算。根據(jù)Poisson分布分析計算IgG-抗體、IgA-抗體和IgM-抗體分泌細(xì)胞的平板效率，IgG為50%-74%，IgA為31%-78%，IgM為0- % (見圖4)。此外，從多克隆培養(yǎng)物中回收的漿細(xì)胞可以再鋪板于單細(xì)胞培養(yǎng)物中，其中其保持恒定的Ig 分泌率(數(shù)據(jù)未示出)。
實施例6 罕見IgE單克隆抗體的分離從變態(tài)反應(yīng)個體的周圍血腫分離漿細(xì)胞，以1個細(xì)胞/孔的密度鋪板在10個384 孔微平板中的hMSC-TERT單層上。5個培養(yǎng)物上清液評分為IgE產(chǎn)生陽性的。對IgE-陽性培養(yǎng)物進行RT-PCR，回收兩個成對的VH/VL基因并測序(表1)。將V基因克隆進表達載體中，以表達輕鏈(κ或者λ )或者人IgGl或IgE重鏈，根據(jù)Wardemann et al.，(Science 301，1374-1377，200 所述方法進行。IgG或者IgE抗體通過瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生。這個實施例例證了回收罕見漿細(xì)胞及分離代表性IgE單克隆抗體的可能性。表1.從循環(huán)漿細(xì)胞回收的兩個IgE單克隆抗體
權(quán)利要求
1.從漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)的漿細(xì)胞的數(shù)目是10或以下。
3.從漿細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的方法，包括以單細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)漿細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述抗體是人抗體并且所述漿細(xì)胞是人類漿細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述漿細(xì)胞在包含外源成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述外源成分延長漿細(xì)胞的存活。
6.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中培養(yǎng)的漿細(xì)胞的存活被延長足夠時間，從而以表征抗體所需的量產(chǎn)生抗體。
7.前述任一項權(quán)利要求的方法，進一步包括從培養(yǎng)基分離抗體。
8.權(quán)利要求5-7任一項的方法，其中漿細(xì)胞的存活被短期或者長期延長。
9.權(quán)利要求5-8任一項的方法，其中漿細(xì)胞的存活被短期延長，且其中所述短期是大約5天至大約7天。
10.權(quán)利要求5-8任一項的方法，其中漿細(xì)胞的存活被長期延長，且其中所述長期是至少10天。
11.權(quán)利要求5-8或者10任一項的方法，其中漿細(xì)胞的存活被延長到至少20天或者至少30天。
12.權(quán)利要求5-9任一項的方法，其中增強漿細(xì)胞存活的外源成分包含非漿細(xì)胞類型或由漿細(xì)胞表達的受體的配體。
13.權(quán)利要求5-9或12任一項的方法，其中所述外源成分包含選自由IL-5、IL-6、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-I)、TNF- α、⑶44的配體及其組合組成的組的一或多種配體。
14.權(quán)利要求5-12任一項的方法，其中增強漿細(xì)胞的存活的外源成分包括非漿細(xì)胞， 且其中所述非漿細(xì)胞是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或者破骨細(xì)胞。
15.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述漿細(xì)胞分離自外周血、骨髓、組織或者體液， 或者體外從B細(xì)胞產(chǎn)生。
16.產(chǎn)生抗體或者抗體片段的方法，包括如下步驟a.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項的方法培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞；b.鑒定產(chǎn)生具有所需特征的抗體的培養(yǎng)物；c.分離編碼所產(chǎn)生的抗體的核酸；以及d.在宿主細(xì)胞中表達所述核酸。
17.由權(quán)利要求16的方法產(chǎn)生的分離的抗體或者抗體片段。
18.權(quán)利要求17的抗體或者抗體片段，其用于治療、作為診斷劑、用于檢測過敏原、用于診斷感染性疾病或自身免疫病或者用于藥物組合物中。
19.包含權(quán)利要求17的抗體或者抗體片段的藥物組合物，用于治療變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病或者感染性疾病。
20.權(quán)利要求1-16任一項的方法，進一步包括表征抗體或者抗體片段，其中抗體或者抗體片段的表征包括進行功能測定以確定抗體或者抗體片段的功能，進行結(jié)合測定以確定抗體或者抗體片段的結(jié)合特異性或者由所述抗體或者抗體片段識別的表位，和/或進行中和測定以確定抗體或者抗體片段中和毒素或者病原體的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體包括單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)有限數(shù)目的漿細(xì)胞。本發(fā)明還涉及鑒定抗體的方法，其是在由培養(yǎng)的漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體上進行測定以確定它們的功能、結(jié)合特異性、表位特異性和/或它們中和毒素或者病原體的能力。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體或者和抗體片段以及使用所述抗體或者抗體片段的方法。
文檔編號C07K16/12GK102282170SQ200980142313
公開日2011年12月14日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月22日
發(fā)明者A·蘭扎韋基亞, D·雅羅塞 申請人:生物醫(yī)學(xué)研究所