專利名稱：用于生產(chǎn)抗淀粉狀蛋白β肽抗體的含有D-肽的組合物的制作方法
用于生產(chǎn)抗淀粉狀蛋白β肽抗體的含有D-肽的組合物本發(fā)明涉及包含D-肽或抗體的組合物，其在疾病的治療中用作治療劑，在所述疾病中異常的蛋白質(zhì)聚集或蛋白質(zhì)多聚化起作用。本發(fā)明還涉及制備此組合物的方法及其用途。蛋白質(zhì)聚集疾病或淀粉樣變性是臨床狀態(tài)的異類組，其具有的共同標(biāo)準(zhǔn)是(在許多情況下，但不唯獨(dú)的)特異于各情形的蛋白質(zhì)以β折疊片結(jié)構(gòu)的有序構(gòu)象在細(xì)胞外 (全身性地或局部地)沉積。該蛋白質(zhì)聚集疾病或蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊疾病的組也包括阿爾茨海默病。阿爾茨海默病(拉丁語Morbus Alzheimer)作為神經(jīng)退行性病癥，以其最常見的形式出現(xiàn)在年齡為65歲以上的人中。它的發(fā)病機(jī)制被表征為認(rèn)知能力的損傷，其通常伴隨著日?；顒?dòng)的減少，帶有行為上的顯著問題和神經(jīng)心理學(xué)癥狀。晚期的患者忘記長期已知的技能并不再識(shí)別與他們親近的人。從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來看，診斷為阿爾茨海默病后的預(yù)期壽命平均為約7到10年。Ferri等人顯示，在2005年，約2千4百萬人患有癡呆，其中約60%歸因于阿爾茨海默病(Ferri等人，Lancet. 366，no. 9503，2005，2112-7頁)。阿爾茨海默病是目前最常見的癡呆疾病，對(duì)于該病，目前為止(2008年10月)不存在有效的療法。阿爾茨海默病的病理學(xué)特征(其甚至在首個(gè)臨床癥狀之前就可以被確定)是斑塊 (稱為阿爾茨海默原纖維)。這些蛋白質(zhì)聚集物主要由錯(cuò)誤折疊的淀粉狀蛋白β肽(也已知為Αβ肽或淀粉狀蛋白β肽)組成，并且沉積在阿爾茨海默病患者的腦中(Walsh和 Selkoe ；2007, Journal ofNeurochemistry 101 :1172-1184)，并且是腦中淀粉狀蛋白 β 肽的成簇增加的結(jié)果。然而，淀粉狀蛋白質(zhì)β肽原纖維只是下述過程的最終階段，所述過程以單體淀粉狀蛋白β肽從APP(淀粉狀蛋白前體蛋白質(zhì))分裂開始，然后形成神經(jīng)毒性的淀粉狀蛋白β肽寡聚體，然后才以淀粉狀蛋白β肽原纖維結(jié)束。為了防止淀粉狀蛋白β肽成簇，有以淀粉狀蛋白β肽片段作為免疫原的主動(dòng)和被動(dòng)免疫作為實(shí)驗(yàn)性治療。實(shí)驗(yàn)性治療是在淀粉狀蛋白β肽聚集物的體外模型中、在產(chǎn)生淀粉狀蛋白β肽的細(xì)胞模型中、以及在腦中形成淀粉狀蛋白β肽聚集物的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中進(jìn)行的。更特別地，主動(dòng)和被動(dòng)免疫作為療法在淀粉狀蛋白β肽聚集物的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中進(jìn)行 (Schenk等人，Nature，1999 ；Bard等人，200 。在主動(dòng)免疫的首次描述中，使用了全長L-淀粉狀蛋白β肽作為免疫原，并在免疫的情況下引起了阿爾茨海默病小鼠模型中斑塊的清除(Schenk等人，Nature，1999)。在類似的小鼠模型中，也成功地應(yīng)用了被動(dòng)免疫。從而可見，淀粉狀蛋白β肽1-11區(qū)域中的N末端表位在引起淀粉狀蛋白β肽原纖維的腦清除中特別有效(Bard等人，2003，PNAS 100(4) =2023-2028) 0目前在阿爾茨海默病患者中進(jìn)行兩個(gè)被動(dòng)免疫(即抗體/抗體片段)的研究(Brody和Holtzman ；2008, Annual Reviews in Neuroscience 31:175-193)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中成功地測試了免疫，但人中的主動(dòng)免疫導(dǎo)致了 T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答或自身免疫疾病，其中內(nèi)源性免疫系統(tǒng)在患者腦中引起了腦膜腦炎(Brody和 Holtzman ；2008，Annual Reviews inNeuroscience 31:175-193)。因此，利用淀粉狀蛋白β肽片段的主動(dòng)免疫目前被認(rèn)為有很小的前景。Bard 等人(PNAS 100(4) :2023-2028)、Dodel 等人(2002 ;Ann Neurol 52: 253-256)描述了用于被動(dòng)免疫治療的抗淀粉狀蛋白β肽的抗體，并且Gardberg等人 (PNAS104(40) :15659-15664)在2007年描述了抗淀粉狀蛋白β肽的氨基酸1_8的抗體。用完整的(1-4 纖維化淀粉狀蛋白β肽免疫老的獵犬狗也被例如，Head等人所描述(2008 ；The Journal of Neuroscience 28(14) :3555-3566)。然而，狗和人之間在利用淀粉狀蛋白β肽作為免疫原方面有嚴(yán)重的差異，因?yàn)榕c人相反，狗不表現(xiàn)對(duì)抗性的自身免疫應(yīng)答。Cribbs 等人(1997 ；The Journal of Biological Chemistry 272 (11) 7431-7436)研究了淀粉狀蛋白β肽的機(jī)理，并且利用了完整的淀粉狀蛋白β肽以及截短型淀粉狀蛋白β肽(氨基酸1-42或25-3 的D-和L-異構(gòu)體。Esler等人同樣地研究了立體特異性。Orser等人(US2008，0171341A1)顯示了利用對(duì)應(yīng)于待檢測靶蛋白的序列來檢測具有改變的構(gòu)象的蛋白質(zhì)/朊病毒。Willbold等人(W0 02/081505 A2)表明了應(yīng)用噬菌體展示來鑒定結(jié)合Ass肽的氨基酸序列。Findeis等人(US 6，689，752 B2)研究了由3_5個(gè)氨基酸組成的序列對(duì)于淀粉狀蛋白β肽的聚集的影響。Cribbs等人從他們的結(jié)果中推斷，神經(jīng)毒性不是立體異構(gòu)特異的。然而，沒有進(jìn)行免疫應(yīng)答的測試，但是參考了 D-異構(gòu)體的更低的免疫原性。Geylis等人描述了獲得自健康人的細(xì)胞系(所述細(xì)胞系合成結(jié)合淀粉狀蛋白β 肽的氨基酸1-16的抗體)，并且討論了其在被動(dòng)免疫中的用途。Lee等人Q005 ；American Neurological Association 58:430-435)比較了在淀粉狀蛋白β肽免疫后，患有或不患有腦膜腦炎的人的抗體血清。此研究的結(jié)果是該抗體主要針對(duì)淀粉狀蛋白β肽的氨基酸 1-8。因此，本發(fā)明的任務(wù)是提供在蛋白質(zhì)聚集/錯(cuò)折疊疾病的預(yù)防性治療或療法中用作治療劑的組合物。所述組合物應(yīng)當(dāng)能夠用于抵抗阿爾茨海默病和其它蛋白質(zhì)聚集疾病的主動(dòng)免疫方法中。由此，應(yīng)該將實(shí)現(xiàn)在避免T細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)選擇性地喚起B(yǎng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，通過將包含D-肽或抗體的組合物用作治療劑和/或用于疾病預(yù)防解決了上述任務(wù)，其中a)所述D-肽與淀粉狀蛋白β肽相互作用，和b)所述抗體與a)中的 D-肽結(jié)合，并且還與a)中的淀粉狀蛋白β肽結(jié)合。所以所述組合物包含作為免疫原的D-肽，其與淀粉狀蛋白β肽相互作用并引起抗-淀粉狀蛋白β肽抗體的抗體形成。所述組合物還可以包含與淀粉狀蛋白β肽相互作用的抗體，其中此抗體結(jié)合前述D-肽，并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽。D-肽和淀粉狀蛋白 β肽之間的“相互作用”是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。根據(jù)本發(fā)明的“組合物”可以是例如疫苗，藥物(例如，以片劑形式)，注射溶液，食品或食物補(bǔ)充劑。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以僅由D-肽組成或僅由抗體組成，結(jié)合各應(yīng)用所需的助劑，如鹽(例如鋁鹽)，緩沖液，或溶劑。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的其它優(yōu)勢有-免疫原的低分子量
-沒有T細(xì)胞應(yīng)答(細(xì)胞自身免疫)，并且因而顯著更少的副作用-使用少量的所述組合物就足夠，因?yàn)槊庖咴谎舆t降解-免疫原的修飾或組合是簡單的。通過本發(fā)明的組合物，利用D-肽的免疫導(dǎo)致產(chǎn)生淀粉狀蛋白β肽特異性抗體。 利用來自D-肽的、不同于淀粉狀蛋白β肽的免疫原的這一免疫優(yōu)于淀粉狀蛋白β肽免疫原，因?yàn)橐鹆丝沟矸蹱畹鞍爪码牡目贵w應(yīng)答，而沒有同時(shí)的、引起副作用的抗-淀粉狀蛋白β肽T細(xì)胞免疫應(yīng)答?！懊庖摺敝府a(chǎn)生抗確定抗原的免疫應(yīng)答，目標(biāo)是清除此抗原、中和它、和/或另外地使它對(duì)生物體無害。主動(dòng)免疫引入抗原(通常是肽序列)，從而產(chǎn)生的內(nèi)源性免疫應(yīng)答， 其引起所述抗原、以及主要是相關(guān)抗原的清除?！氨粍?dòng)免疫”指腸胃外引入抗體，其引起抗原的清除。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以通過抗體與淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來防止淀粉狀蛋白β肽多聚體的形成，其中所述抗體是在用D-肽免疫后形成的。在本發(fā)明的意思中，“淀粉狀蛋白β肽多聚體”指獲得了新功能(“功能的獲得”) 的多個(gè)淀粉狀蛋白β肽分子的穩(wěn)定集合。術(shù)語“多聚化結(jié)構(gòu)域”定義了涉及淀粉狀蛋白β肽彼此相互作用的那些淀粉狀蛋白β肽的結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)變體中，淀粉狀蛋白β肽的氨基酸10-42實(shí)現(xiàn)此功能。其它的適應(yīng)征領(lǐng)域是在阿爾茨海默病，糖尿病，和其它淀粉狀蛋白疾病，以及其中蛋白質(zhì)同源多聚化是關(guān)鍵的疾病(例如帕金森病，額顳葉型失智癥，肌萎縮側(cè)索硬化癥，囊性纖維化，某些形式的癲癇)的治療中的用途。本發(fā)明的其它主題是組合物，其中D-肽a)包含淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列并且完全由D-氨基酸組成，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)包含序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2并完全由D-氨基酸組成，和/或d)包含具有序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的D-肽，其中所述具有序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的D-肽部分地包含L-氨基酸，和/或e)包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2同源的序列。在一個(gè)變體中，“D-肽”由淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列組成并完全由D-氨基酸組成?！皝喥巍庇膳c淀粉狀蛋白β肽的氨基酸序列同源的3，4，5，6，7，8，9，10，11，12， 13，14，15，16，或更多的氨基酸組成。在另外的變體中，根據(jù)本發(fā)明的D-肽結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域。在其他變體中，D-肽具有序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2并且完全由D-氨基酸組成。在另外的變體中，D-肽具有序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2且部分地包含L-氨基酸。在另外的變體中，D-肽具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的同源序列。“D-肽”指由D-型的氨基酸構(gòu)成的肽。“部分地”包含L-氨基酸指與由D-氨基酸組成的D-肽的氨基酸序列同源的1，2， 3，4，5，6，7，8，9，10，或更多的氨基酸各自被L-構(gòu)象的相同氨基酸替代。
在本發(fā)明的意思中，“同源序列”指與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有至少 70%，75%，80%，特別優(yōu)選地 85%，90%，特別是 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%， 98%，或99%的同一性的氨基酸序列。與由D-氨基酸組成的根據(jù)本發(fā)明的序列同源的序列也可以部分地包含L氨基酸。在本說明書中同義地使用術(shù)語“同源的”或“同源性”來替代術(shù)語“同一'性”。在基于 Smith，Τ. F.和 Waterman，Μ. S.的算法(Adv. App 1. Math. 2 482-489(1981))的程序BESTFIT的輔助下通過比較來計(jì)算兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的同一性，對(duì)于氨基酸設(shè)置下列參數(shù)缺口制造懲罰為8和缺口延伸懲罰為2 ；以及對(duì)于核酸設(shè)置下列參數(shù)缺口制造懲罰為50和缺口延伸懲罰為3。優(yōu)選地，兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的同一性是通過跨越各整個(gè)序列長度的核酸序列/多肽序列的同一性而確定的， 正如是在基于 Needleman，S. B.和 Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol. 48 :443-453)的算法的程序 GAP的輔助下通過比較而計(jì)算的，對(duì)于氨基酸設(shè)置下列參數(shù)缺口制造懲罰為8和缺口延伸懲罰為2 ；以及對(duì)于核酸設(shè)置下列參數(shù)缺口制造懲罰為50和缺口延伸懲罰為3。這些同源的D-肽與淀粉狀蛋白β肽結(jié)合和/或與淀粉狀蛋白β肽多聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合。它們可以是從淀粉狀蛋白β肽衍生的(同源的)，并且在功能上是確定的，即能夠引起至少與淀粉狀蛋白β肽相同的免疫應(yīng)答。然而，它們不是淀粉狀蛋白β肽本身，并且在小鼠中產(chǎn)生抗淀粉狀蛋白β肽和/或淀粉狀蛋白β肽多聚體的抗體應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“逆-反肽”(“Retro-inversesP印tid，，或"Retro-inverso P印tid”)表示由D-型的氨基酸構(gòu)成的肽(逆α碳原子的手性與L型相逆)，其中原肽的序列J幌序也被倒轉(zhuǎn)了 (retro =反向，也見 Regenmortel 禾口 Muller，1998 ；Current Opinion in Biotechnology9 :377-382)。本發(fā)明另外的主題是包含抗體的組合物，其中所述抗體結(jié)合淀粉狀蛋白肽或淀粉狀蛋白β肽并且a)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽，和/或c)結(jié)合SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2或其同源序列。有利地，如果對(duì)于產(chǎn)生抗體使用的是結(jié)合淀粉狀蛋白β肽多聚化結(jié)構(gòu)域的肽，那么所述抗體具有淀粉狀蛋白β肽本身的特性并且與淀粉狀蛋白β肽的多聚化競爭。本發(fā)明另外的主題是制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的方法，其中通過免疫動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞并將動(dòng)物細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以及隨后的選擇和培養(yǎng)來獲得產(chǎn)生抗體的雜交細(xì)胞， 并且分離和純化抗體。免疫，融合，選擇，培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的雜交細(xì)胞和抗體分離或抗體純化可以例如使用 "Monoclonal antibodies，，(Heddy Zola. SpringerVerlag, New York 2000)中所示的方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行。其他的方法，特別是用于篩選產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的方法已經(jīng)由 Korth 等人，1999，在 “Methods in Enzymology” 309 106f 中顯示了。對(duì)于免疫，可以使用動(dòng)物(或動(dòng)物細(xì)胞)，例如，小鼠，兔子，大鼠，豚鼠，以及常規(guī)用于抗體生產(chǎn)的其它動(dòng)物。如果選擇小鼠用于以根據(jù)本發(fā)明的組合物進(jìn)行免疫，免疫策略可以如下可皮下注射所述組合物(例如，三次；第0天完全弗氏佐劑；第21和22天不完全弗氏佐劑；第31天抽取約100 μ 1的血液)。在用根據(jù)本發(fā)明的組合物進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)注射后，例如，在第50天將小鼠麻醉、斷頭、并取出脾臟。將如此獲得的脾臟細(xì)胞(脾細(xì)胞)與小鼠骨髓瘤細(xì)胞以1 5的比例混合，并通過加入50%的聚乙二醇(PEG)融合(8 分鐘，室溫)。然后，洗滌細(xì)胞并過夜培養(yǎng)。生產(chǎn)抗體的雜交瘤細(xì)胞的選擇例如可以在HAT 培養(yǎng)基中、在96孔微量滴定板中以及在ELISA酶測試中進(jìn)行。本發(fā)明另外的主題是根據(jù)本發(fā)明的組合物在防止淀粉狀蛋白β肽多聚體中的用途。為此可使用結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域的抗體或者D-肽。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)變體中，所述組合物包含10-1000 μ g的免疫原。在另一個(gè)變體中，所述組合物包含 20-900，25-750，30-600，40-500，50-400，50-300 或 50-250 μ g 的免疫原。可以設(shè)想組合物包含少于10 μ g的免疫原或者多于1000 μ g的免疫原。優(yōu)選地，“免疫原”指產(chǎn)生免疫性的抗原。免疫原是觸發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。因此，免疫原不同于被抗體識(shí)別、但并不是全部都能獨(dú)立觸發(fā)免疫應(yīng)答的抗原。優(yōu)選地，“免疫性”指免疫系統(tǒng)針對(duì)抗原(例如，病毒，細(xì)菌，或外來蛋白質(zhì))的改變的反應(yīng)預(yù)備狀態(tài)，其是由免疫引起的并且特征在于特異性抗體和/或細(xì)胞的出現(xiàn)。本發(fā)明另外的主題是根據(jù)本發(fā)明的組合物在預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病中的用途。因此，結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域的D-肽可以用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物。本發(fā)明另外的主題是根據(jù)本發(fā)明的包含D-肽的組合物作為治療劑和/或用于阿爾茨海默病的疾病預(yù)防的用途，其中所述D-肽a)包含淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列，并且完全由 D-氨基酸組成，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)包含序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2并且完全由D-氨基酸組成，和/或d)包含序列 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2，其中具有序列 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2的D-肽部分地包含L-氨基酸，和/或e)包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2同源的序列。本發(fā)明另外的主題是根據(jù)本發(fā)明的包含抗體的組合物作為治療劑和/或用于阿爾茨海默病的疾病預(yù)防或診斷的用途，其中所述抗體a)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域并且也結(jié)合淀粉狀蛋白β肽，和/或c)結(jié)合SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2或其同源序列。本發(fā)明另外的主題是包含抗體的組合物用于阿爾茨海默病的診斷，用于生物分子的檢測或定量，或用于組織、細(xì)胞中生物分子的定位，或者參與特定細(xì)胞類型的識(shí)別中的用途，其中所述抗體a)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)結(jié)合SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或其同源序列，并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽。在本發(fā)明的意思中，生物分子的檢測或定量在本申請中指通過抗原-抗體反應(yīng) (例如，免疫測定)測定物質(zhì)。
在本發(fā)明的意思中，組織或細(xì)胞中生物分子的定位或特定細(xì)胞類型的識(shí)別在此指抗體在例如免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)中的用途。本發(fā)明的優(yōu)勢是引起了治療性的抗體應(yīng)答而與此同時(shí)所使用的D-肽沒有被T細(xì)胞加工。因此，發(fā)明了方法，其使得能夠容易地開發(fā)抗蛋白質(zhì)聚集疾病或蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的免疫策略。因此，在與阿爾茨海默病的治療相關(guān)的方法(其中使用與淀粉狀蛋白β肽相互作用的D-肽進(jìn)行免疫)中，能夠在個(gè)體中實(shí)現(xiàn)中和淀粉狀蛋白β肽毒性和/或清除淀粉狀蛋白β肽的體液免疫應(yīng)答。此外，可以開發(fā)涉及阿爾茨海默病以外的疾病(CNS的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病，糖尿病等)的方法，在所述疾病中蛋白質(zhì)的聚集或多聚化同樣是疾病相關(guān)的， 并且在所述方法中使用了結(jié)合多聚化接觸面的D-肽。優(yōu)選地，“清除(clearing)”、“清除(clearance) ”或“清除(clearend) ”指從作為器官的特定功能的組織中(例如，腎清除)、從細(xì)胞成分中(例如，巨噬細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞)， 或從亞細(xì)胞區(qū)室中(蛋白酶體)除去特定的外源或內(nèi)源性物質(zhì)。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)還在于拋棄了淀粉狀蛋白β肽的表位空間(Epitope space”)，這在原則上能夠以高的自身耐受性限制體液免疫應(yīng)答。在根據(jù)本發(fā)明的、結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的D-肽的用途中，T細(xì)胞免疫應(yīng)答被抑制，因?yàn)檫@些肽不能被降解和展示。本發(fā)明的主題還是針對(duì)淀粉狀蛋白β肽多聚化結(jié)構(gòu)域并且防止淀粉狀蛋白β肽的多聚化的抗體。而后，通過以抗體進(jìn)行的標(biāo)記，淀粉狀蛋白β肽或集合的淀粉狀蛋白β 肽沉積物可以通過內(nèi)源免疫系統(tǒng)被降解。其他根據(jù)本發(fā)明的抗體一般性地針對(duì)淀粉狀蛋白 β肽而非特異性地針對(duì)所述多聚化結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例下面借助實(shí)施例和附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

圖1顯示了合成的淀粉狀蛋白β肽(1)、和用APP轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(3)；不相關(guān)的對(duì)照⑵的蛋白質(zhì)印跡。這一蛋白質(zhì)印跡表明9Α6在蛋白質(zhì)印跡上不識(shí)別APP或淀粉狀蛋白β肽(左側(cè))，而通用的抗淀粉狀蛋白β肽抗體IC16卻能夠識(shí)別(右側(cè))。圖2顯示了從用APP永久轉(zhuǎn)染的、分泌淀粉狀蛋白β肽的CHO細(xì)胞的上清液中由 IC16(右側(cè))和9A6(右側(cè))免疫沉淀的蛋白質(zhì)印跡。可見9A6識(shí)別淀粉狀蛋白β肽寡聚物。圖3顯示了用9Α6對(duì)阿爾茨海默病患者的皮質(zhì)樣品進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色?？梢?Α6抗體微弱地識(shí)別淀粉狀蛋白β肽斑塊。實(shí)施例1(用D3-肽免疫小鼠)用D-肽免疫小鼠。利用D3-肽和淀粉狀蛋白β肽的逆-反肽(riAbetal-16 ； 逆-反-Abeta (1-16))。在多次加強(qiáng)注射(加強(qiáng)注射(Auffrischungsimpfungen)，加強(qiáng)效果)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行融合以生產(chǎn)單克隆抗體。可以分離結(jié)合D3，riAbetal-16，和結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的單克隆抗體。因此，用所述的D-肽免疫導(dǎo)致抗淀粉狀蛋白β肽的保護(hù)性免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，“加強(qiáng)效果”(通過加強(qiáng)注射或加強(qiáng)注射(Auffrischimgsimpfimg)實(shí)現(xiàn)) 指在與抗原重復(fù)接觸后的免疫學(xué)繼發(fā)反應(yīng)或增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
用于免疫的肽具有下列序列“D3” 月太rprtr Ihthr nr (SEQ ID NO 1)retro-inverso-Abeta(1-16) kqhhv eygsd hrfea d(SEQ IDNO :2)將D3與KLH (匙孔血藍(lán)蛋白)共價(jià)鍵合(交聯(lián))并利用標(biāo)準(zhǔn)程序免疫小鼠。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案將其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。然后，在標(biāo)準(zhǔn)的ELISA中測試所產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)于D3-肽和淀粉狀蛋白β肽的識(shí)別。下面的克隆只識(shí)別D3 (不識(shí)別淀粉狀蛋白β肽)4G11，13Η11，32Α11，40Β7下面的克隆既識(shí)別D3也識(shí)別淀粉狀蛋白β肽9Α6，14Β5，39Β12這些實(shí)驗(yàn)顯示1.用D3進(jìn)行的免疫引起了抗淀粉狀蛋白β肽的抗體應(yīng)答和2.在某些抗體上存在結(jié)合位點(diǎn)，其既能夠識(shí)別淀粉狀蛋白β肽也能夠識(shí)別D3。在圖1、圖2和圖3所示的測試中進(jìn)一步對(duì)示例性研究的抗-D3/抗淀粉狀蛋白β 肽抗體9Α6進(jìn)行了測試。
權(quán)利要求
1.包含D-肽或抗體的組合物，其用作治療劑和/或用于疾病預(yù)防，其特征在于a)所述D-肽與淀粉狀蛋白肽相互作用禾口b)所述抗體結(jié)合a)中的D-肽并且還結(jié)合a)中的淀粉狀蛋白肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于所述D-肽a)包含淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列并且完全由D-氨基酸組成，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)包含序列SEQID NO :1或SEQ ID NO 2并且完全由D-氨基酸組成，和/或d)包含具有SEQID NO :1或SEQ ID NO :2的D-肽，其中所述具有序列SEQ ID NO 1 或SEQ ID NO 2的D-肽部分地包含L-氨基酸，和/或e)包含與SEQID NO :1或SEQ ID NO 2同源的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于所述抗體a)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列并且結(jié)合淀粉狀蛋白 β肽，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)結(jié)合SEQID NO :1或SEQ ID NO :2或其同源序列并且結(jié)合淀粉狀蛋白β肽。
4.制備根據(jù)權(quán)利要求1的組合物的方法，其特征在于通過免疫動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞并將動(dòng)物細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以及隨后的選擇和培養(yǎng)來獲得產(chǎn)生抗體的雜交細(xì)胞，并且分離和純化抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物用于防止淀粉狀蛋白β肽多聚物的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物在阿爾茨海默病的預(yù)防和/或治療中的用途。
7.包含D-肽的根據(jù)權(quán)利要求1的組合物作為治療劑和/或用于阿爾茨海默病的疾病預(yù)防的用途，其特征在于，所述D-肽a)包含淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列，并且完全由D-氨基酸組成，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)包含序列SEQID NO :1或SEQ ID NO 2并且完全由D-氨基酸組成，和/或d)包含序列SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2，其中具有序列 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO: 2的D-肽部分地包含L-氨基酸和/或e)包含與SEQID NO :1或SEQ ID NO 2同源的序列。
8.包含抗體的根據(jù)權(quán)利要求1的組合物作為治療劑和/或用于阿爾茨海默病的疾病預(yù)防或診斷的用途，其特征在于，所述抗體a)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)結(jié)合SEQID NO :1或SEQ ID NO :2或其同源序列并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽。
9.包含抗體的根據(jù)權(quán)利要求1的組合物用于阿爾茨海默病的診斷，用于生物分子的檢測或定量，或用于組織、細(xì)胞中生物分子的定位，或者參與特定細(xì)胞類型的識(shí)別中的用途， 其特征在于所述抗體a)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽或淀粉狀蛋白β肽亞片段的逆-反序列，并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽，和/或b)結(jié)合淀粉狀蛋白β肽的多聚化結(jié)構(gòu)域，和/或c)結(jié)合SEQID NO :1或SEQ ID NO :2或其同源序列并且還結(jié)合淀粉狀蛋白β肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含D-肽或抗體的組合物，其用作治療劑和/或用于疾病預(yù)防，其中a)所述D-肽與淀粉狀蛋白肽相互作用和b)所述抗體結(jié)合a)中的D-肽并且還結(jié)合a)中的淀粉狀蛋白肽。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102224168SQ200980146026
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者A·米勒-施夫曼, C·科爾特, D·威爾伯爾德, S·A·豐克 申請人:于利希研究中心有限公司