專利名稱：針對(duì)il-25的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)白細(xì)胞介素25(IL_25)的抗體，包括其結(jié)合片段。
背景技術(shù)：
哮喘哮喘是常見(jiàn)的慢性氣道炎性病癥。近幾十年來(lái)，患者數(shù)目急劇增加，并且世界衛(wèi)生組織估計(jì)世界范圍內(nèi)大約有300，000, 000人患有哮喘。過(guò)敏性哮喘的特征在于，由多種激發(fā)性刺激物誘導(dǎo)的不可控的氣道反應(yīng)過(guò)度(AHR)，并且與2型炎性浸潤(rùn)物進(jìn)入肺相關(guān)。2型細(xì)胞因子在介導(dǎo)針對(duì)寄生的蠕蟲(chóng)感染的保護(hù)性免疫力、調(diào)節(jié)效應(yīng)子功能例如 B細(xì)胞生長(zhǎng)和IgE分泌、誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和相關(guān)的粘液產(chǎn)生、嗜曙紅細(xì)胞增多、肥大細(xì)胞增多和纖維化中具有重要作用(1)。正是這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)這些效應(yīng)子功能中所起的關(guān)鍵作用，使它們成為哮喘中的主要治療靶標(biāo)。事實(shí)上，在過(guò)表達(dá)這些細(xì)胞因子的小鼠模型中，顯示出哮喘的顯著特征。然而令人驚奇的是，除了抑制IL-13之外，通過(guò)阻斷特定的2 型細(xì)胞因子來(lái)改善實(shí)驗(yàn)性哮喘的努力卻證明是不成功的。IL-13的抑制阻抑AHR和氣道炎癥，雖然其機(jī)理仍然未知0，3)。然而，鑒于哮喘的病理生理學(xué)的復(fù)雜性以及對(duì)其病因?qū)W知之甚少，仍然不確定的是，靶向單一的途徑最終是否會(huì)在治療上取得成功。最近證明，IL-25/IL_17E(結(jié)構(gòu)上相關(guān)的IL-17細(xì)胞因子家族的成員)(8)的過(guò)表達(dá)在體內(nèi)誘導(dǎo)2型應(yīng)答(4-6)并且增強(qiáng)對(duì)氣道激動(dòng)劑的反應(yīng)性(7)。1125+小鼠未能有效驅(qū)除蠕蟲(chóng)寄生蟲(chóng)；還已經(jīng)表明，在來(lái)自具有哮喘的患者的樣品中，無(wú)效2型應(yīng)答的關(guān)鍵指征 IL-25(9，10)上調(diào)。炎癥性腸病炎癥性腸病(IBD)是慢性炎癥，其影響大腸或結(jié)腸的粘膜層，其通常包括選自下列的一種或多種疾病病況潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。UC被認(rèn)為是Th2介導(dǎo)的疾病，其代表性小鼠模型顯示出2型細(xì)胞因子參與腸炎癥的產(chǎn)生(16)。已經(jīng)在慢性結(jié)腸炎的小鼠模型中觀察到了 IL-25的產(chǎn)生，伴隨從Thl至Th2型應(yīng)答的轉(zhuǎn)變(17)，并且已經(jīng)報(bào)道了 IL-25mRNA在小鼠整個(gè)胃腸道中的高表達(dá)(18)。此外，IL-25基因位于14號(hào)染色體上的克羅恩病易感區(qū)內(nèi)，雖然其與該疾病的潛在關(guān)聯(lián)仍待研究(19)。此外，IBD可以包括一種或多種選自下列的疾病病況膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、轉(zhuǎn)向性結(jié)腸炎、白塞病、感染性結(jié)腸炎和未定型結(jié)腸炎。用于治療IBD的常規(guī)治療法包括抗生素或留體衍生的藥物；然而目前這些在誘導(dǎo)或維持患者的臨床緩解上是不成功的00)。包括抗-TNF-α試劑的治療法也是目前可以獲得的，雖然其顯示出差的功效01，22)。這說(shuō)明顯然需要新的和更有效的用于治療炎癥性腸病的治療法?？贵w抗體的基本結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域中是熟知的。天然存在的抗體通常具有4個(gè)多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接的2個(gè)相同的重鏈和2個(gè)相同的輕鏈。重鏈和輕鏈各具有恒定區(qū)和可變區(qū) (或域)，即VH和VL?？勺儏^(qū)主要負(fù)責(zé)抗原的結(jié)合。在每個(gè)可變區(qū)內(nèi)，被稱作互補(bǔ)決定區(qū) (OTR)的三個(gè)亞區(qū)與抗原接觸。每個(gè)可變域的⑶R從N-末端至C-末端編號(hào)為⑶R1、⑶R2 和CDR3。N-和-C末端與CDR之間是4個(gè)所謂的框架區(qū)，其不與抗原接觸或接觸極少。在下文列舉的很多文獻(xiàn)中詮釋了關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)的內(nèi)容，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用方式并入本文。有多種方式可以產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的抗體。使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體是此類方法之一。通常在小鼠或其它嚙齒類動(dòng)物中產(chǎn)生抗體。這可以是產(chǎn)生高親和性抗體的有用方式。然而，對(duì)于隨后要用于人類治療中的此類抗體而言，通常需要將抗體的CDR轉(zhuǎn)移進(jìn)入人類框架區(qū)。這是為了避免在患者中出現(xiàn)人-抗-小鼠抗體應(yīng)答。Jones 等人和 Riechman 等人(11，12)描述了 CDR 移植(grafting)的一般原理。 即，將小鼠抗體的CDR移植進(jìn)入受體人抗體的框架區(qū)內(nèi)。在實(shí)踐中，雖然得到的抗體將與相同的靶抗原結(jié)合，如同原始供體小鼠抗體一樣，但是，移植的抗體的親和性通常會(huì)大大降低。此外，移植的抗體的熱穩(wěn)定性通常會(huì)被破壞。試圖恢復(fù)并優(yōu)化原始抗體的性質(zhì)的多種方式是本領(lǐng)域已知的。例如，框架區(qū)內(nèi)包含一些與某些種系⑶R相關(guān)的“典型(canonical)結(jié)構(gòu)”殘基，見(jiàn)Chothia & Lesk(13)。另外，F(xiàn)oote & Winter(H)已經(jīng)鑒定了“微調(diào)區(qū)”殘基(其中有一些也是典型結(jié)構(gòu)殘基)，其支持抗原結(jié)合環(huán)構(gòu)象及其相對(duì)排列，因此被認(rèn)為在抗體與抗原的適合性的微調(diào)中具有重要作用。此外，認(rèn)為框架區(qū)內(nèi)的其它殘基使VH/VL界面穩(wěn)定并維持該界面。因此，研究抗體人源化的技術(shù)人員通常尋找這樣的人類框架其中微調(diào)區(qū)、典型殘基和界面殘基(“VCI”)盡可能接近地對(duì)應(yīng)于原始供體抗體中的那些殘基。然而，每種抗體都代表了對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員的獨(dú)特挑戰(zhàn)，不能確定的是，任意一般性的已知的用于CDR移植的方法對(duì)于每種情況都是直接適用的。本發(fā)明人和合作者(Ballantyne等人(15))報(bào)道了與IL-25結(jié)合的小鼠單克隆抗體2C3的產(chǎn)生，其能夠在體內(nèi)阻斷過(guò)敏性哮喘中的氣道反應(yīng)過(guò)度。迄今為止，該抗體的序列是公眾不可獲得的。PCT/GB2008/001365,
公開(kāi)日為 2008 年 10 月 30 日，公開(kāi)號(hào)為 W02008/U^63，報(bào)道了 2C3抗體的序列及其在阻斷氣道反應(yīng)過(guò)度中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及基于2C3序列的人源化的(CDR-移植的)抗體。在產(chǎn)生該抗體時(shí)，需要克服多種挑戰(zhàn)。本發(fā)明人首先選擇了具有最大的VCI同源性的受體(recipient)人類抗體VH鏈，其具有22個(gè)VCI殘基中的20個(gè)。然而發(fā)現(xiàn)，得到的抗體(“RHA”)與IL-25的結(jié)合程度顯著小于2C3本身與IL-25結(jié)合的程度。雖然對(duì)該抗體進(jìn)行了很多進(jìn)一步的修飾，包括改變VCI指定的氨基酸和那些似乎代表罕見(jiàn)的體細(xì)胞突變的殘基，但是對(duì)抗體結(jié)合的改善收效甚微。在試圖克服VCI同源性方法在抗體人源化中的失敗時(shí)，選擇了不同的人類VH框架，其具有較低的VCI殘基匹配(17/22)，但是具有稍高的總體同源性。得到的抗體提供了比“RHA”抗體更高的結(jié)合，雖然其結(jié)合仍然不如母體2C3抗體高。為了使結(jié)合最大化并且使具有激發(fā)抗體應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)的非人殘基最少化，進(jìn)行了另外的框架ILCDR變化。發(fā)現(xiàn)得到的抗體與2C3相比，具有增強(qiáng)的結(jié)合，并且在體內(nèi)測(cè)試對(duì)氣道反應(yīng)過(guò)度的抑制時(shí)發(fā)現(xiàn)，該抗體的效力顯著高于2C3。該抗體還顯示出良好的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明涉及衍生自2C3的人源化VH鏈。在一些方面，本發(fā)明涉及包含該鏈的抗體。 所述抗體可以包含含有2C3 VL⑶R的人源化VL鏈。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗體VH域，其包含SEQ ID NO=I Glu Val Gln Leu ValGlu Ser Gly Ala GluValLysLysProGlyAlaSer ValLys ValSer Cys Lys Ala SerGly Tyr Ser Phe XalXa2TyrThrMetAsnTrpVal ArgGln AlaPro Gly Gln Arg LeuGlu Trp Xa3 Gly LeulieAsnProTyrAsnGlyGly ThrSer TyrAsn Gln Asn Phe LysGly Arg Val Thr LeuThrXa4AspThrSerAlaSer ThrAla TyrLeu Glu Leu Asn SerLeu Arg Ser Glu AspThrGlyValTyrTyrCysAla ArgGlu Xa5Tyr Asp Gly Tyr LeuTyr Phe Ala Met AspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu Val
Thr ValSer Ser其中Xal 是 Ser 或 Thr ；Xa2 Mi Gly> Asp> Ala> Ser> Val> Asn> Lys> Tyr Met ；Xa3 是 Met 或 lie;Xa4 是 Val 或 Arg ；并且Xa5 是 Asp、Asn 或 Gly0在一個(gè)方面，殘基Xal至Xa5可以選自下列組合Xal 是 Ser 或 Thr ；Xa2 是 Gly 或 Asp ；Xa3 是 Met 或 lie;Xa4 是 Val 或 Arg ；并且Xa5 是 Asp、Asn 或 Gly0在一些實(shí)施方式中，Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，優(yōu)選是Asp。在一些實(shí)施方式中(包括那些其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，優(yōu)選是Asp 的實(shí)施方式)，Xal是義！·。在一些實(shí)施方式中(包括那些其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，優(yōu)選是Asp 的實(shí)施方式)，Xal是Thr。在一些實(shí)施方式中(包括所有以上描述的)(a2、Xa5和Xal的組合)，Xa3是Met。在一些實(shí)施方式中(包括所有以上描述的fe2、Xa5和Xal的組合)，Xa3是lie。
所有上述實(shí)施方式可以與)(a4的任一選項(xiàng)即Val或Arg組合。上述殘基的特定組合顯示于下表中。為了技術(shù)人員方便起見(jiàn)并且為了與隨附的實(shí)施例保持一致，表中列出了殘基的Kabat編號(hào)。在一些情況下，這與序列表中的編號(hào)不同。
權(quán)利要求
1.抗體VH域，其包含SEQID NO 1GluValGlnLeuValGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheXalXa2TyrThrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpXa3GlyLeulieAsnProTyrAsnGlyGlyThrSerTyrAsnGlnAsnPheLysGlyArgValThrLeuThrXa4AspThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGluLeuAsnSerLeuArgSerGluAspThrGlyValTyrTyrCysAlaArgGluXa5TyrAspGlyTyrLeuTyrPheAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer，其中Xal 是 kr 或 Ilir ；Xa2 是 Gly、Asp、Ala、Ser、Val、Asn、Lys> Tyr 或 Met ； Xa3 是 Met 或 lie ； Xa4是Val或Arg ；并且 Xa5 是 Asp、Asn 或 Gly0
2.權(quán)利要求1的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn。
3.權(quán)利要求2的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp。
4.權(quán)利要求1的VH域，其中Xal是kr。
5.權(quán)利要求1的VH域，其中Xal是Thr。
6.權(quán)利要求1的VH域，其中Xa3是Met。
7.權(quán)利要求1的VH域，其中Xa3是lie。
8.權(quán)利要求1的VH域，其中Xa4是Val。
9.權(quán)利要求1的VH域，其中Xa4是Arg。
10.權(quán)利要求1的VH域，其中殘基fel-Xa5是以下組合CN 102245638 A權(quán)利要求書(shū)2/3頁(yè)Kabat殘基3031487196SEQ ID NO: 1 中30314872100的位置序列表殘基XalXa2Xa3Xa4Xa5SEQ ID NO:2SerGlyMetValAspSEQ ID NO:3ThrGlyMetArgAspSEQ ID NO:4SerGlyMetArgAspSEQ ID NO:5ThrGlyMetValAspSEQ ID NO:6SerAspMetValAspSEQ ID NO:7ThrAspMetArgAspSEQ ID NO:8ThrAspMetValAspSEQ ID NO:9SerGlylieValAspSEQ ID NO: 10ThrGlylieArgAspSEQ ID NO: 11ThrGlylieValAspSEQ ID NO: 12SerAsplieValAspSEQ ID NO: 13ThrAsplieArgAspSEQ ID NO: 14ThrAsplieValAsp
11.靶結(jié)合成員，其與IL-25結(jié)合并且包含抗體VH域，其中所述VH域是根據(jù)權(quán)利要求 1的VH域。
12.權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員，其包含VL域，所述VL域的Kabat⑶Rl-⑶R3分別是SEQ ID NO 15 的殘基 24-34 (SEQ ID NO 29) ,50-56 (SEQ ID NO 30)和 89-97 (SEQ ID NO :31)。
13.權(quán)利要求12的靶結(jié)合成員，其中所述VL域還包括SEQID NO 15的殘基35-38，其鄰近 CDRl (SEQ ID NO 29)。
14.權(quán)利要求12的靶結(jié)合成員，其包含SEQID NO :15。
15.權(quán)利要求12的靶結(jié)合成員，其中所述VL域是人源化的。
16.權(quán)利要求15的靶結(jié)合成員，其序列包含SEQID NO 25的氨基酸21-127。
17.權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員，其是Fab、F(ab')2、scFv、Fv或dAb抗體片段。
18.權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員，其包含抗體恒定區(qū)。
19.權(quán)利要求18的靶結(jié)合成員，其中所述恒定區(qū)是人IgGl或IgG4恒定區(qū)。
20.權(quán)利要求18的靶結(jié)合成員，其包括完整抗體。
21.分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1的VH域的核苷酸序列。
22.表達(dá)載體，其包含與啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求21的核酸。
23.宿主細(xì)胞，其攜帶權(quán)利要求22的表達(dá)載體。
24.產(chǎn)生靶結(jié)合成員的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述靶結(jié)合成員的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法，其還包括分離所述靶結(jié)合成員。
26.權(quán)利要求25的方法，其還包括將所述靶結(jié)合成員配制進(jìn)入包括至少一種另外的成分的組合物中。
27.組合物，其包含權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員和藥學(xué)上可接受的載體。
28.權(quán)利要求27的組合物，其為凍干的粉末形式。
29.用于治療或預(yù)防哮喘的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
30.用于治療或預(yù)防哮喘的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
31.用于治療或預(yù)防炎癥性腸病的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
32.用于治療或預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
33.用于治療或預(yù)防克羅恩病的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
34.用于治療或預(yù)防炎癥性腸病的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
35.用于治療或預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
36.用于治療或預(yù)防克羅恩病的權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員。
37.產(chǎn)生針對(duì)IL-25的抗體的方法，其包括(a)提供權(quán)利要求1的抗體VH域；(b)將所述VH域與多種抗體VL域組合以提供抗體分子；(c)就與IL-25的結(jié)合篩選所述抗體分子；和(d)選擇與IL-25結(jié)合的抗體分子。
38.分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求11的靶結(jié)合成員的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL-25抗體VH域和包含此類抗體VH域并且與IL-25結(jié)合的靶結(jié)合成員(例如抗體)。本發(fā)明還涉及包含與IL-25結(jié)合的靶結(jié)合成員(例如抗體)的組合物，產(chǎn)生此類靶結(jié)合成員的方法，以及此類靶結(jié)合成員用于治療或預(yù)防疾病和病況(例如哮喘、炎癥性腸病)的用途。
文檔編號(hào)C07K16/24GK102245638SQ200980147932
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者A·N·J·麥肯茲, D·J·馬修斯, J·巴羅 申請(qǐng)人:醫(yī)療研究局