專利名稱：雜合α-淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
提供了包含古細菌(archae) α-淀粉酶序列和透阿米爾樣α-淀粉酶 (Termamyl-like α-amylase)序列的雜合淀粉酶。與野生型透阿米爾樣α-淀粉酶相比， 該雜合淀粉酶可以具有改變的特性。
背景技術(shù)：
具有共同功能的相關(guān)酶可以具有或可以不具有顯著的序列同一性。例如，若其氨基酸序列與地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) α -淀粉酶共有60%或更高的同一性，則芽孢桿菌(Bacillus) α -淀粉酶(1，4_α _D_葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3. 2. 1. 1)分類為“透阿米爾樣”。參見WO 96/23874。可以在共享62%或更高序列同一性的淀粉酶之間產(chǎn)生雜合淀粉酶。參見 Gray 等人，J. Bacteriology 166:635-43(1986)；美國專利號 6，143，708。 例如，已經(jīng)重組表達并且結(jié)晶出含有解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)第 1-300位殘基和地衣芽孢桿菌第301-483位殘基的嵌合淀粉酶。見Brzozowski等人， Biochemistry 39:9099-107(2000)；還見 WO 96/23874 ；WO 97/41213。然而，甚至共享小于 25%序列同一性的淀粉酶如來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌的淀粉酶卻可以共享共同的催化功能和總體保守的三維立體(3D)折疊。許多淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)是目前可獲得的。見上文Brzozowski等人(2000)。 Protein Data Bank(PDB)例如含有至少在表1中所示的淀粉酶的3D結(jié)構(gòu)。表 權(quán)利要求
1.雜合淀粉酶，其包含從N端至C端具有式(I)的多肽A-x-y-B(I)， 其中A是來自古細菌α-淀粉酶的第一氨基酸序列；B是來自野生型透阿米爾樣α-淀粉酶的或來自與野生型透阿米爾樣α-淀粉酶具有至少80%序列同一性的變體的第二氨基酸序列；X是第一氨基酸序列的C端殘基；y是第二氨基酸序列的N端殘基；其中第一和第二氨基酸序列一起含有約400至約500個氨基酸殘基；其中雜合淀粉酶中約10%至約80%之間的總氨基酸由古細菌α-淀粉酶貢獻；并且其中與野生型透阿米爾樣α -淀粉酶相比，殘基χ和y在雜合淀粉酶中是結(jié)構(gòu)上保守的。
2.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中與野生型透阿米爾樣α-淀粉酶相比，雜合淀粉酶具有改變水平的重組表達、溶解度、PH活性譜、底物特異性或比活性。
3.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中與野生型透阿米爾樣α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)相比， 殘基X和y中的α -碳之間的均方根距離不多于約0.5 L·
4.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中與野生型透阿米爾樣α-淀粉酶相比，第一氨基酸序列A在雜合淀粉酶中是結(jié)構(gòu)上保守的。
5.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中野生型透阿米爾樣α-淀粉酶是芽孢桿菌 (Bacillus) α-淀粉酶。
6.權(quán)利要求5所述的雜合淀粉酶，其中芽孢桿菌α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) α -淀粉酶、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) α-淀粉酶、枯草芽孢桿菌(B. subtilis) α-淀粉酶、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.) KSM-K38 α -淀粉酶或鹽敏芽孢桿菌(B. halmapalus) α -淀粉酶。
7.權(quán)利要求6所述的雜合淀粉酶，其中芽孢桿菌α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌 α-淀粉酶。
8.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中野生型透阿米爾樣α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，其中淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域從嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的羧基端移除。
9.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中古細菌α-淀粉酶是Ultrathinα-淀粉酶。
10.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中第一和第二氨基酸序列從共享小于約60%序列同一性的淀粉酶衍生。
11.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中殘基X和y在B結(jié)構(gòu)域中。
12.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中第一氨基酸序列貢獻B結(jié)構(gòu)域的至少80%氨基酸殘基。
13.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中第一氨基酸序列包含Zn2+結(jié)合位點。
14.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中野生型透阿米爾樣α-淀粉酶的Ca2+結(jié)合位點中的至少一個氨基酸以來自第一氨基酸序列的氨基酸殘基替換。
15.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中雜合淀粉酶具有α-淀粉酶活性，并且其中該活性不受Ca2+濃度影響。
16.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其包含SEQID NO :1-8任一序列中所示的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求16所述的雜合淀粉酶，其中淀粉酶包含SEQID NOS :1、2、6、7或8任一序列中所示的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求1所述的雜合淀粉酶，其中雜合淀粉酶是被純化的。
19.核酸，其編碼權(quán)利要求1的雜合淀粉酶。
20.載體，其包含權(quán)利要求19的核酸。
21.宿主細胞，其包含權(quán)利要求19的核酸或權(quán)利要求20的載體。
22.權(quán)利要求21所述的宿主細胞，其中宿主細胞是細菌或真菌。
23.權(quán)利要求22所述的宿主細胞，其中細菌是芽孢桿菌屬物種(Bacillussp)。
24.一種設(shè)計權(quán)利要求19的核酸的方法，包括(a)在計算機執(zhí)行的操作中比對古細菌α-淀粉酶和野生型透阿米爾樣α-淀粉酶的 3D結(jié)構(gòu)；(b)選擇結(jié)構(gòu)上保守的氨基酸殘基χ和y；和(c)設(shè)計編碼雜合淀粉酶的核酸。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中與野生型透阿米爾α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)相比，殘基χ 和y中的α -碳之間的均方根距離不多于約0.5人。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中計算機執(zhí)行的操作包括在計算機監(jiān)視器上顯示三維結(jié)構(gòu)比對結(jié)果。
全文摘要
提供了與野生型透阿米爾樣α-淀粉酶例如芽孢桿菌淀粉酶整體或部分地共享保守3D結(jié)構(gòu)的雜合α-淀粉酶。在該雜合體中，透阿米爾樣α-淀粉酶的N端部分以來自古細菌α-淀粉酶的序列替換。這兩個淀粉酶序列之間的序列相似性可以小于60％。該雜合體中保留野生型3D結(jié)構(gòu)有利于獲得有酶活性的淀粉酶。在一個實施方案中，一個或兩個淀粉酶序列向B結(jié)構(gòu)域貢獻殘基，從而產(chǎn)生特別有利的特性。例如，用不結(jié)合Ca2+的古細菌α-淀粉酶的B結(jié)構(gòu)域序列替換透阿米爾樣α-淀粉酶B結(jié)構(gòu)域中的Ca2+結(jié)合位點可以產(chǎn)生在Ca2+不存在下具有充分活性的雜合體。
文檔編號C07K19/00GK102245764SQ200980150419
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者A·肖, S·D·鮑爾 申請人:丹尼斯科美國公司