專利名稱：制備小粒徑脂質(zhì)體的方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及脂質(zhì)體疫苗生產(chǎn)領域。發(fā)明概述本發(fā)明旨在提供粒徑小于約200nm的脂質(zhì)體。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在制備脂質(zhì)體的方法中，若其包含將有機液體(其中溶有脂質(zhì)) 與水混合的步驟，那么有機溶劑的濃度和所產(chǎn)生的混合物的迅速冷卻對形成并保持一致的脂質(zhì)體粒徑至關重要。本申請的方法與裝置有助于商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)包封了藥物的勻質(zhì)脂質(zhì)體疫苗制劑，即在新穎的條件下，將脂質(zhì)溶液，其含有溶入與水互溶的有機溶劑中的脂質(zhì)，混入流動的水中，以促進疫苗質(zhì)量級別的脂質(zhì)體不斷生成。所述方法使用一種連續(xù)混合系統(tǒng)，其中流速比，即脂質(zhì)溶液流速與水流速之比，保持恒定，由此保持系統(tǒng)中恒定的有機溶劑百分比。所述方法更進一步用一種快速且規(guī)模依賴性的冷卻步驟，其在脂質(zhì)體形成后使用并防止脂質(zhì)體平均粒徑的增長。所述方法還進一步提供一種管道排布方法，其促進形成具有理想粒徑的脂質(zhì)體。為制備粒徑小于約200nm的脂質(zhì)體，依照本申請的方法，有機溶劑/水混合物中的有機溶劑濃度保持在5%到30%之間，更優(yōu)選地，在10%到25%之間，最優(yōu)選地，在10%到 25%之間；流速比(水/有機溶劑)保持在19 1到3又1/3 1之間，更優(yōu)選地在9 1 到5 1之間，或在9 1到4 1之間；且脂質(zhì)體混合物的冷卻(從約55°C至約30°C ) 時間少于5小時，更優(yōu)選地少于2小時，最優(yōu)選地少于30分鐘，更優(yōu)選基本上即時冷卻。本發(fā)明解決了領域內(nèi)的難題，即批次間的差異性、在冷卻中出現(xiàn)的脂質(zhì)體粒徑不期望的增長以及需要諸如超聲或增壓系統(tǒng)等精密方法。依照本發(fā)明制得的脂質(zhì)體適用于制造人用或獸用疫苗。附圖概述

圖1為裝置布局示意圖，其中的嵌入物描述的是“T”型連接排布，和任選地，是否管道可包括內(nèi)部突起或擋板以增強湍流度，其有助于混合。圖2為流程圖，描述了總體臨床制備過程中的各類參數(shù)。圖3為一幅照片，顯示在使用不同管道直徑的情況下染料(模擬脂質(zhì)/溶劑)和水的聚集情況(A)兩管均為9mm直徑；⑶5mm(水)管和3mm(脂質(zhì)/溶劑)管。圖4為透射電鏡照片(放大倍數(shù)18K)，顯示依照本方法采用20%叔丁醇制備的載有MUC-I肽的脂質(zhì)體形成。優(yōu)選實施方式的詳述本方法可適用于大規(guī)模商業(yè)化的生產(chǎn)納米級別的脂質(zhì)體制劑，特別是那些包括基本上勻質(zhì)的不超過200nm直徑的脂質(zhì)體粒徑。優(yōu)選地，脂質(zhì)體中多于90% (采用動態(tài)光散射測得的權重(weighted)體積)小于200nm，最優(yōu)選的，多于99%的小于200nm。此類粒徑的顆?？芍苯右勒展I(yè)認可的臨床生產(chǎn)標準過濾除菌。所述粒徑均勻的脂質(zhì)體可依照本發(fā)明制備，包括控制有機溶劑的濃度，并在脂質(zhì)體形成以及接下去的過程中保持其基本恒定。通過控制溶劑濃度有可能控制脂質(zhì)體顆粒的粒徑，所述顆粒是在脂質(zhì)溶液與水(或其它適于脂質(zhì)體形成的水性溶劑)匯合和相混時形成的。在本方法中，脂質(zhì)溶液與水在管道連接處正下方的“中流”處發(fā)生匯合，通過所述管道安排溶液和水被初始泵入。脂質(zhì)溶液持續(xù)地流過一個管道并流入持續(xù)流動的水流中。 兩條液流可能以任何角度交匯，故水和脂質(zhì)溶液分別流經(jīng)的管道可能以約90度或小于90 度的角度匯合。脂質(zhì)溶液與水的渾濁混合物，即“溶劑云”，在管道連接處下方形成，且這里也是開始形成脂質(zhì)體的分界線。進一步地，脂質(zhì)/溶劑與水性液體混合成湍流的程度也會有助于脂質(zhì)體形成。因此，本發(fā)明可能包括的裝置和連接的一種特征，但并非形成脂質(zhì)體必需的，是在任何管道的管腔內(nèi)部存在折流擋板、內(nèi)向突起或刻紋，它們有助于增加湍流從而促進脂質(zhì)體的產(chǎn)生。因此，依據(jù)本發(fā)明，在液體匯聚處制造高剪切的環(huán)境有益于制備脂質(zhì)體。能在從脂質(zhì)體形成到將混合物裝入儲存容器的時間內(nèi)對混合物進行冷卻的在線冷卻設備可實現(xiàn)脂質(zhì)體混合物的快速冷卻。這可以通過諸如冷卻套管、冷卻盤管或?qū)⒅|(zhì)體混合物流經(jīng)的管道或其他接頭處浸沒的冰浴來實現(xiàn)?？焖倮鋮s可保持脂質(zhì)體粒徑，而慢速冷卻時，在有機溶劑的理想濃度下脂質(zhì)體粒徑會隨時間增大。經(jīng)由控制(1)水流對有機溶劑流的流速比和( 混合物中有機溶劑的濃度和(3) 脂質(zhì)體形成后立即快速冷卻混合物，以及可選地(4)使用湍流增強結(jié)構(gòu)，不斷生產(chǎn)出粒徑一直維持在一定范圍內(nèi)的脂質(zhì)體是可能的。因此本裝置與設計避免了現(xiàn)有技術中其直接將預置好的大量體積的水與脂質(zhì)/ 溶劑混合，即從一個大桶裝入另一個大桶中(例如，美國專利申請No. 11/185，448)，的封閉低效的系統(tǒng)。取而代之，本發(fā)明的裝置是持續(xù)流動的、開放的系統(tǒng)，其能夠?qū)崿F(xiàn)不停的循環(huán)往復的生產(chǎn)均勻脂質(zhì)體制劑的過程，所述脂質(zhì)體可包含能摻入脂質(zhì)溶液中的任何有治療活性的物質(zhì)。本發(fā)明裝置與現(xiàn)有技術裝置還存在不同之處在于本裝置中沒有將加壓脂質(zhì)/溶劑溶液通過分散小孔或微米級小洞以加壓脂質(zhì)/溶劑噴霧形式進入水流(例如，美國專利 US6, 843，942，Wagner 等，2002，Journal of Liposome Research，12 (3)，第 259-270 頁，美國專利US6，855，277)。本裝置不要求“交叉流注入模塊”，例如其中開有前文所述的微米級小孔但其另一方面防止大量的水和脂質(zhì)液體在管道間混合。亦即，本發(fā)明不通過小孔將脂質(zhì)/溶劑強行注射入水中，所述小孔位于分隔兩種液體的載液管的連接壁上。相反地，本發(fā)明裝置和方法無需借助任何上述隔斷或加壓噴霧就實現(xiàn)了一種液流(水)與另一種自由流動的液流(脂質(zhì)溶液)間的交錯竄流。本發(fā)明還無需任何之前介紹過的勻質(zhì)化或超聲處理 (例如，美國專利US6，855，277)即可制備具有限定且均勻粒徑范圍的脂質(zhì)體。將所需的治療用化合物例如藥物、肽或脂肽，以及任何其他需要的成分，例如佐劑或賦形劑，加入本發(fā)明的脂質(zhì)溶液中，能促進這些物質(zhì)在脂質(zhì)溶液與流動水匯聚時包封入形成的脂質(zhì)體。除了控制溶劑濃度以及水對脂質(zhì)溶液的流速比之外，在各種液流開始流經(jīng)上述管道系統(tǒng)前還可能需要對脂質(zhì)溶液和水中的一種或兩種進行加熱。因此，本發(fā)明液體的各自溫度對于確保穩(wěn)定且可重復地制備出粒徑均一、可濾過的脂質(zhì)體可能是重要的條件。優(yōu)選的溫度取決于所用脂質(zhì)的轉(zhuǎn)變溫度。本發(fā)明方法允許對實際流速在一定范圍內(nèi)進行操作。驚喜的發(fā)現(xiàn)只要流速比(即脂質(zhì)溶液流速對水流速的比例)保持恒定，液體被驅(qū)動進入對方時的速度在實踐范圍內(nèi)是不重要的。因此，所述過程從液體總體積很小到液體總體積很大的情況均能適應。由此，本發(fā)明中有助于持續(xù)形成載藥、可濾過脂質(zhì)體的因素包括，但不僅限于(1) 溶劑和溶劑濃度；( 脂質(zhì)；C3)脂質(zhì)溶液與水之間的流速比；(4)混合前和混合時液體的溫度；( 液體混合及脂質(zhì)體形成后的冷卻；(6)各種液體間持續(xù)且不受阻礙的流進對方； 以及(7)產(chǎn)生湍流的方式。以下段落將對上述條件做詳細說明。(1)溶劑和溶劑濃度本發(fā)明中一種特定種類的溶劑是水互溶性的有機溶劑，例如，但不僅限于，低級烷醇，諸如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異戊醇、異丙醇、2-甲氧基乙醇以及丙酮。本發(fā)明優(yōu)選的溶劑為丁醇或叔丁醇。依照本發(fā)明，有機溶劑用于溶解脂質(zhì)和藥物或生物活性物質(zhì)，隨后流入水流或水性介質(zhì)中以形成本文公開的載藥或載藥劑脂質(zhì)體。制備粒徑在特定范圍內(nèi)的脂質(zhì)體需要考慮的一個條件是水互溶性有機溶劑的濃度。依照本發(fā)明，混合點的有機溶劑的濃度，同時也是移除溶劑(例如，通過冷凍干燥的終濃度，為5% -30%，更優(yōu)選為10% -25%，最優(yōu)選為10% -25%。典型地，溶劑濃度越低，形成的脂質(zhì)囊泡脂質(zhì)體顆粒就越小。因此，我們發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明裝置和過程中10%叔丁醇濃度得到的脂質(zhì)體制劑中有約99%脂質(zhì)體粒徑都小于lOOnm，與之相比20%叔丁醇得到的制劑有99%粒徑都小于200nm。而例如叔丁醇濃度得到的脂質(zhì)體粒徑小于400nm。因此，脂質(zhì)體總體的平均粒徑可經(jīng)由調(diào)節(jié)溶劑在溶劑混合物中的濃度以及保持所述濃度的恒定來調(diào)整。希望制備得到粒徑小于200nm的脂質(zhì)體，因為它們可易于用臨床上允許的 0. 22 μ m孔徑的過濾器進行滅菌過濾。所以，在本發(fā)明的一個方面，優(yōu)選的溶劑濃度，特別是對于叔丁醇來說，為不多于約20%，這是為了制備出可用上述過濾器過濾的粒徑小于 200nm的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)/溶劑混合物快速分散在水中有助于保持穩(wěn)定的溶劑濃度，故維持溶劑濃度比如說在約20%。(2)脂質(zhì)優(yōu)選的能形成脂質(zhì)體的磷脂包括，但不僅限于二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，磷脂酰膽堿(PC ；卵磷脂)，磷脂酸(PA)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰絲氨酸(PQ。其他適宜的磷脂還包括二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿 (DMPC)，二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二硬脂酰磷脂酸(DSPA)， 二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)，二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸(DMPS)，二硬脂酰磷脂酰絲氨酸 (DSPS)，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。最優(yōu)選的脂質(zhì)為DPPC。在脂質(zhì)溶液中包括留醇可能是合乎需要的，這有助于促進或調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的形成。
6本方案中一個特別有用的留醇是膽固醇。膽固醇對于促進脂質(zhì)體形成是非必要的，但其確實能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的性質(zhì)(例如，穩(wěn)定性)。(3)脂質(zhì)溶液與水之間的流諫比假如水流和脂質(zhì)溶液流的啟動與停止是同時的，那么水對脂質(zhì)溶液的流速比就決定了溶劑濃度以及由此獲得的脂質(zhì)體粒徑。溶劑濃度越高，形成的脂質(zhì)體就會越大。水流速度對脂質(zhì)溶液流速度之比優(yōu)選至少為2 1(由此得到的有機溶劑濃度不會高于約33 1/3%)，更優(yōu)選為至少3 1(由此得到的有機溶劑濃度不會高于約25%)。優(yōu)選不超過 19 1?？梢栽诩s19 1(得到有機溶劑的濃度約為5%)到3 1/3 1(得到有機溶劑的濃度約為30%)之間，更優(yōu)選在9 1(得到有機溶劑的濃度約為10%)到5 1(得到有機溶劑的濃度約為20%)之間，或在9 1到4 1(得到有機溶劑的濃度約為25%)之間。由此，本發(fā)明中水的流速可以是約1.7升每分鐘。本發(fā)明中脂質(zhì)/溶劑的流速可以是約0. 43升每分鐘。只要流速比保持很定，具體流速可依照想獲得的脂質(zhì)體粒徑在實際生產(chǎn)中調(diào)整。故，例如，若想制備高于約99%的脂質(zhì)體的粒徑都小于約200nm的脂質(zhì)體制劑，且有機溶液濃度為約20%，則在保持水流速對脂質(zhì)溶液流速比約4 1的情況下，具體流速可依照實際考慮，諸如實際混合時間以及所要用溶液的體積等進行調(diào)整。(4)液體的溫度優(yōu)選的最低溫度與轉(zhuǎn)變溫度有關。希望能夠同時加熱本申請所述的水和脂質(zhì)溶液液體；優(yōu)選加熱至比組分轉(zhuǎn)變溫度高10°c或更多。故，可以是轉(zhuǎn)變溫度以上10，11，12，13， 14，15，16，17，18，19，20或更多度?？梢栽诟髯缘膬Υ嫒萜髦屑訜嵋后w，所述容器可用套罩隔離以降低熱損耗。任一液體的溫度可為約40°C -45°C，約45°C -50°C，約50°C -55°C，或約55°C -60°C。對于DPPC所述溫度優(yōu)選至少為42°C，更優(yōu)選為至少45°C，最優(yōu)選為至少 50°C。最高溫度不重要，當更高的溫度必然需要更多的能量輸入。對于DPPC，優(yōu)選的溫度區(qū)間選擇為約42°C -65°C，更優(yōu)選45°C -60°C，最優(yōu)選50°C -55°C。(5)冷卻許多過程要求在儲存、過濾或其他步驟前冷卻物料。我們驚喜地觀察到，在本流程的脂質(zhì)體形成步驟中所要求的溫度和溶劑濃度下，脂質(zhì)體形成后其粒徑隨時間增長。因此，若在收集容器中進行冷卻，則批次的規(guī)模影響脂質(zhì)體的最終粒徑，這是由于越大的批次冷卻時間就越長。即時冷卻，可在脂質(zhì)體形成后立即使用熱交換器來達到，其可實現(xiàn)脂質(zhì)體粒徑的控制并消除批次規(guī)模獨立性的障礙。為維持脂質(zhì)體粒徑冷卻時間不應超過20°C用5 小時，例如，在不足5小時內(nèi)從約55°C冷卻至約35°C，更優(yōu)選在不足2小時內(nèi)從約55°C冷卻至約30°C，最優(yōu)選在不足30分鐘內(nèi)從約55°C冷卻至約30°C。如有需要，所述混合物還可冷卻至更低的溫度。(6)各液體間持續(xù)的流入對方本發(fā)明的液體，即水和脂質(zhì)溶液，可由不同的馬達泵送，所述馬達依照上文所述的需要的流速進行設置或調(diào)校，且所述液體可以儲存在容量多至可容納很多升的各種液體的大桶內(nèi)。故，容量多至50L或以上(優(yōu)選200L)注射用水液罐可用作容器，水可從其中泵出并流經(jīng)上文所述的管道和T型接口，而水的流速可通過在水流路上安裝流量計來監(jiān)測。類似地，獨立的裝有多升脂質(zhì)/溶劑溶液的液罐，例如多至50L或以上，溶液亦從其中泵出并流經(jīng)本發(fā)明的裝置，且由同樣的方法監(jiān)測流量。根據(jù)水通過裝置被泵出的速度，經(jīng)過一段確定的時間，或多些或少些的水量將從儲液罐中排空。顯然同樣的情況也發(fā)生在脂質(zhì)溶液容器。由于有時水的流速需要是脂質(zhì)溶液流速的至少大約四倍，就需要使用能容納至少四倍于脂質(zhì)溶液體積的水體積的儲液罐。 然而，當然還有一時段，兩個儲液罐中均有足量液體以在這一時段產(chǎn)生水和脂質(zhì)溶液的持續(xù)液流，從而將單位時間內(nèi)生產(chǎn)的粒徑適宜的脂質(zhì)體的產(chǎn)量最大化。所述“液罐”可以是任何能夠容納和/或加熱本文所述體積的液體的容器，包括但不僅限于玻璃、不銹鋼和塑料制成的容器。(7)液體無阻礙的流動，以及誘導湍流的裝置如上文所述，可用的將脂質(zhì)溶液引入水流中的布局是通過兩條按照一定方式排列的管道實現(xiàn)的，所述方式是兩條管道內(nèi)部在它們的鄰接處，即連接處，彼此開口相通，在此連接處兩個開口之間沒有任何會阻止脂質(zhì)溶液物料自由流過此開口的內(nèi)部阻擋。兩液流可以任何角度交匯，故水和脂質(zhì)溶液分別流經(jīng)的管道可能以約90度或小于90度的角度連接。 見圖1。因為本方法具有高適應性且容易可為商業(yè)生產(chǎn)目的進行規(guī)?；艿乐睆娇呻S本發(fā)明所述其他參數(shù)，例如流速和溶劑濃度，的適當修改來使用。由此本發(fā)明的管道可采用任何直徑，例如約 lmm, 2mm, 3mm, 4mm, 5mm, 6mm, 7mm, 8mm, 9mm, 10mm, 12mm, 13mm, 14mm, 15mm, 16mm, 17mm, 18mm, 19mm或20mm，或大于20mm的直徑?？梢栽诳紤]過流速與混合效率后進行
選擇直徑。這種直徑的管道可以在其全長一直均一或在其的一部分長度均一。亦即為了容納典型的“管道”接頭，所述接頭在實驗室中廣泛用以方便玻璃管道相互之間或玻璃管道與龍頭或泵之間撓性的連接，本發(fā)明所述管道可在某一末端縮窄以方便插入所述管中。組成連接處的兩根管道在它們的開口相接處可以是同樣的直徑也可以不是。因此，載水管道可比脂質(zhì)溶液管道窄或粗，反之亦然。本發(fā)明所述管道可為玻璃、塑料或金屬的?？墒褂脙?nèi)表面含有棱線、隔板、縮進或突起的管道以調(diào)節(jié)流經(jīng)其管腔的液體流速。 如果希望增加水和脂質(zhì)溶液匯合處環(huán)境的湍流度，那么可以將這些管道中的一個用來激發(fā)水流以在接頭處創(chuàng)造湍流并由此弓I發(fā)比正常更強的剪切力以促進脂質(zhì)體生成。所述突起或隔板最好同時位于水流管接頭處的“上游”，以及或取而代之，在接頭處的下面，以促進液體
混合O(8)其他考慮、成分和參數(shù)⑴脂質(zhì)體希望制備粒徑小于200nm的脂質(zhì)體，因為它們易于用臨床批準的0. 22 μ m孔徑過濾器進行過濾除菌。依照本發(fā)明方法使用本發(fā)明設備制得的制劑包含具備特定最大粒徑的脂質(zhì)體的集合。一般情況下，當水流速對脂質(zhì)溶液流速之比減小時會帶來脂質(zhì)體粒徑的增大，因而有機溶劑濃度升高時是如此。脂質(zhì)體粒徑還會受到其他因素諸如溫度或所用有機溶劑的影響。脂質(zhì)/溶劑匯聚并與水混合后制備出的脂質(zhì)體隨后可任選的通過冷卻套并收集至一個獨立的液罐中。該脂質(zhì)體制劑可接著被冷凍干燥或依照熟知的方法進行重組。(ii)牛物活件物質(zhì)MUC-I是一種大分子粘蛋白，其包含由30-100個20個氨基酸序列的重復序列組成的多肽核。MUC-I肽，糖肽，脂肽以及糖脂肽對摻入本發(fā)明所述脂質(zhì)體中是特別可取的，但本發(fā)明并不僅限于這些物質(zhì)，因為其他任何肽，生物活性物質(zhì)，藥物或有治療活性的化合物均可被摻入本發(fā)明的脂質(zhì)體中。優(yōu)選地，所述物質(zhì)為肽(任選被糖基化和/或脂基化(lapidated))，其包含至少五個，至少六個，至少七個，至少八個，至少九個前述20個氨基酸的重復序列的連續(xù)殘基。應該明白的是，由于是串聯(lián)重復，首個氨基酸的選擇基本上是任意的。優(yōu)選地，所述肽包含重復序列的至少DTR三肽。其可包含，例如，PDTRP (SEQ ID NO 1的第13-17位的氨基酸)， SAPTDRP (第 12-17 位的氨基酸)，TSAPDTRP (第 11-17 位的氨基酸)，PDTRPAP (第 13-19 位的氨基酸)或TSAPDTRPAP(第11-19位的氨基酸)序列。所述物質(zhì)可包含多于一個的重復序列，且還可包含非整數(shù)次的重復，例如1又1/4。脂基化有助于將肽摻入脂質(zhì)體。優(yōu)選地，若脂基化，則所述肽包含第一序列和第二序列，或由它們組成，所述第一序列是串聯(lián)重復區(qū)域的一個片段(所述片段可以少于，等于或多于一次重復)，所述第二序列被脂基化。第一序列優(yōu)選下文中將提及的MUC-I衍生的序列 BLP25 或BLP40。第二序列優(yōu)選連接至第一序列的C端，且優(yōu)選不多于五個氨基酸，最優(yōu)選兩個或三個氨基酸。優(yōu)選一至三個氨基酸被脂基化且優(yōu)選它們是連續(xù)的。優(yōu)選地，脂基化氨基酸獨立地為，絲氨酸*，蘇氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，賴氨酸*，精氨酸，天冬氨酸或谷氨酰胺Γ為最佳)。優(yōu)選地，第二序列最后一個氨基酸不被脂基化，且優(yōu)選其為甘氨酸*，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸*，或異亮氨酸。優(yōu)選脂質(zhì)基團為C12 (月桂酸基)，C14 (豆蔻酸基)，C16(棕櫚酸基廣C18(硬脂酸基)或C20(花生酸基)脂。關于MUC-I，特別要注意的物質(zhì)是27氨基酸的脂肽，"BLP25”。其由MUC-1 蛋白串聯(lián)重復區(qū)域的一個25氨基酸的殘片(即1 1/4次重復)，以及兩個氨基酸的C端延伸(KG)組成，其中K (賴氨酸)按如下方式被脂基化(lapidated) STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-K(棕櫚酰)-G-OH(SEQ ID NO :1)。另一個需特別注意的是‘‘BGLP40”，含有MUC-I蛋白串聯(lián)重復區(qū)域的一個40個氨基酸的片段，以及C端延伸(SSL)，其按以下方式被脂基化(此處顯示的糖基化是一個例子，其他糖基化模式以及未糖基化的情況亦包括在內(nèi))=TSAPDTRPAPGS(Tn)T(Tn) APPAHGVTSAPDT (Tn) RPAPGSTAPPAHGVS (脂)S (脂)L (SEQ ID NO 2)(iii)其他成分脂質(zhì)組分的其他適合的成分為糖脂和其他脂質(zhì)佐劑，例如單磷酰脂質(zhì)A (MPLA)或脂質(zhì)A，或類似或不類似于天然佐劑的合成佐劑。(iv) JC臨床級用水(9)可放大性容量僅取決于容器尺寸。商業(yè)生產(chǎn)可用電腦操控。
權利要求
1.制備具有一定粒徑的脂質(zhì)體制劑的方法，所述方法包含步驟a)提供基本上持續(xù)的水流，b)提供基本上持續(xù)的有機溶劑流，所述有機溶劑包含溶于其中的至少一種脂質(zhì)，所述脂質(zhì)能形成脂質(zhì)體，c)將所述水流和有機溶劑流基本持續(xù)地混合，以得到混合物，且d)冷卻所述混合物，且e)使所述混合物內(nèi)部形成脂質(zhì)體，控制水流的流速對有機溶劑流的流速之比以及所述混合物的冷卻速度以獲得至少約 90%的脂質(zhì)體的粒徑小于約200nm的脂質(zhì)體制劑。
2.權利要求1所述的方法，其中水流的流速對有機溶劑流的流速之比至少為約2 1。
3.權利要求1所述的方法，其中水流的流速對有機溶劑流的流速之比不高于約 19 1。
4.權利要求1所述的方法，其中水流的流速對有機溶劑流的流速之比至少為約3 1 且不高于約19 1。
5.權利要求1所述的方法，其中水流的流速對有機溶劑流的流速之比至少為約3 1 且不高于約9 1。
6.權利要求1所述方法，其中水流的流速對有機溶劑流的流速之比為約4 1。
7.權利要求1-6任一項所述的方法，其中冷卻速度平均為每小時至少約4°C。
8.權利要求1-7任一項所述的方法，其中所述的混合物在不多于約2小時內(nèi)被冷卻至少約20 0C ο
9.權利要求1-8任一項所述的方法，其中所述有機溶劑流在所述混合之前，處于比所述脂質(zhì)的轉(zhuǎn)變溫度至少高10°c的溫度下。
10.權利要求1-9任一項所述的方法，其中至少一種脂質(zhì)為磷脂。
11.權利要求10所述的方法，其中至少一種磷脂為DPPC。
12.權利要求1-11任一項所述的方法，其中至少一種脂質(zhì)為甾醇。
13.權利要求12所述方法，其中所述留醇是膽固醇。
14.權利要求1-13任一項所述方法，其中有機溶劑為叔丁醇。
15.權利要求1-14任一項所述方法，其中混合物在不多于約2小時內(nèi)從至少約55°C冷卻至不高于約35°C。
16.權利要求1-15任一項所述的方法，其中有機溶劑進一步包含溶解在其中的生物活性物質(zhì)。
17.權利要求16所述方法，其中生物活性物質(zhì)為MUC-I肽，或該肽的糖基化和/或脂基化(lapidated)衍生物。
18.權利要求17所述方法，其中生物活性物質(zhì)有SEQID NO :1的氨基酸序列。
19.權利要求18所述方法，其中所述物質(zhì)在賴氨酸位點被脂基化(lapidated)。
20.權利要求17-19任意一項所述方法，其中所述物質(zhì)被棕櫚?；?br> 21.權利要求17所述方法，其中生物活性物質(zhì)有SEQID NO :2的氨基酸序列。
22.權利要求21所述方法，其中生物活性物質(zhì)在最后兩個絲氨酸上被脂基化 (lapidated)0
23.權利要求72所述方法，其中生物活性物質(zhì)被糖基化。
24.權利要求幻所述方法，其中糖基化模式與BGLP40定義的一樣。
25.權利要求任一項所述的方法，進一步包括提供在所述水流，所述有機溶劑流， 或由所述混合引起的混合液流中引發(fā)湍流的方法。
全文摘要
制備具有特定粒徑的脂質(zhì)體，通過基本持續(xù)地混合基本上持續(xù)的水流和基本上持續(xù)的有機溶劑流，所述有機溶劑包含能形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)，并冷卻所述混合物以形成脂質(zhì)體，控制水流流速對有機溶劑流的流速之比以及所述混合物的冷卻速度以使獲得至少約90％的脂質(zhì)體的粒徑小于約200nm。
文檔編號C07K14/775GK102256595SQ200980150953
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權日2008年12月17日
發(fā)明者R·A·迪皮, W·J·賴利 申請人:腫瘤防護公司