專利名稱：向白細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)運(yùn)的制作方法
向白細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)運(yùn)本發(fā)明涉及特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子(transporter cargo conjugate molecule)的用途，用于將感興趣物質(zhì)(貨物分子)運(yùn)輸?shù)桨准?xì)胞。所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子可以被用于治療、預(yù)防、減弱和/或改善涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥。本發(fā)明也涉及所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的制造、涉及將感興趣物質(zhì)(貨物)運(yùn)輸?shù)桨准?xì)胞的方法、以及涉及包含所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子或其片段的白細(xì)胞。使感興趣的物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)或細(xì)胞毒性劑，而且還有其它化合物能夠從外部介質(zhì)有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)組織或細(xì)胞，特別是轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域相當(dāng)受關(guān)注。 這些技 術(shù)可適于體外和體內(nèi)運(yùn)輸并翻譯核酸進(jìn)細(xì)胞，并因此適于蛋白質(zhì)或(多)肽生產(chǎn)、適于基因表達(dá)調(diào)節(jié)、適于細(xì)胞毒性效應(yīng)或凋亡效應(yīng)的誘導(dǎo)、適于細(xì)胞內(nèi)過程的分析以及適于由運(yùn)輸各種不同貨物進(jìn)細(xì)胞(或細(xì)胞核)引起的影響的分析等。感興趣貨物從外部介質(zhì)到組織或細(xì)胞的這種轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要應(yīng)用是靶向藥物輸送。靶向藥物輸送涉及藥學(xué)活性藥物的組織_/細(xì)胞特異性輸送。目的是在(全身)給藥后，在感興趣細(xì)胞和組織上或內(nèi)隨著時(shí)間推移達(dá)到高濃度的藥學(xué)活性藥物，而同時(shí)剩余細(xì)胞和組織中藥學(xué)活性藥物的濃度被保持在低水平。這提高治療的功效并降低副作用。這樣的靶向藥物輸送可以，例如通過高度特異性抗體調(diào)節(jié)。感興趣貨物從外部介質(zhì)到組織或細(xì)胞的這種轉(zhuǎn)移的進(jìn)一步重要應(yīng)用是基因治療， 其中所述貨物通常是核酸或基因。管該技術(shù)在過去十年已顯示一些相當(dāng)有前景的發(fā)展，但是基因轉(zhuǎn)移通常受限于基因轉(zhuǎn)移載體不能有效地將生物活性貨物轉(zhuǎn)移進(jìn)將被治療的宿主的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核而不影響宿主基因組或改變活性貨物的生物學(xué)性質(zhì)。在這方面，已發(fā)展了幾項(xiàng)技術(shù)，以努力更有效地將例如核酸，如DNA或RNA，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。通過基因轉(zhuǎn)移的方法將核酸轉(zhuǎn)染進(jìn)患者的細(xì)胞或組織是分子醫(yī)學(xué)的重要方法并在眾多疾病的治療和預(yù)防中起關(guān)鍵作用?；蜣D(zhuǎn)移方法的代表性例子包括普通(物理的或物理化學(xué)的)方法如用磷酸鈣或 DEAE-葡聚糖共沉淀核酸，這是能使核酸穿透質(zhì)膜然后進(jìn)入細(xì)胞和/或細(xì)胞核的方法。然而，該技術(shù)遭受低轉(zhuǎn)移效率和高百分比細(xì)胞死亡的困擾。另外，由于其本身的性質(zhì)，該方法局限于體外或離體方法，但不適用于體內(nèi)情況。對(duì)于涉及體外電穿孔的方法同樣如此。體外電穿孔基于高壓電流的使用，使細(xì)胞膜變得可透過，以允許新的核酸，例如DNA或RNA引入細(xì)胞。然而，這樣的方法通常不適于體內(nèi)。此外，該技術(shù)同樣遭受低轉(zhuǎn)移效率和高百分比細(xì)胞死亡的困擾。另外熟知的物理或物理化學(xué)方法包括(裸)核酸的(直接)注射或生物射彈基因轉(zhuǎn)移。生物射彈基因轉(zhuǎn)移(也稱作生物射彈粒子轟擊)是在康奈爾大學(xué)開發(fā)的方法，其允許將遺傳物質(zhì)引入組織或培養(yǎng)細(xì)胞。生物射彈基因轉(zhuǎn)移通常通過表面包被金屬的顆粒，如金或銀顆粒而完成，并通過使用基因槍將包括被吸附的DNA的這些金屬顆粒射進(jìn)細(xì)胞。與上面所討論的相似，該方法局限于體外或離體方法，但通常不適用于體內(nèi)情況。其它方法利用所謂的轉(zhuǎn)運(yùn)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。將在該上下文中使用的轉(zhuǎn)運(yùn)分子通?？梢员环譃橐环矫娌《据d體，即轉(zhuǎn)運(yùn)分子，其包括病毒元件(viral element)；以及另一方面非病毒載體。當(dāng)今可利用的最成功的基因治療策略依賴于病毒載體，如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒。這些病毒載體通常應(yīng)用對(duì)DNA和核酸具有強(qiáng)親和力的病毒相關(guān)物質(zhì)的結(jié)合物。由于其感染性質(zhì)，病毒或病毒載體具有非常高的轉(zhuǎn)染速率。以在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不形成功能性感染顆粒的方式，基因修飾通常使用的病毒載體。然 而，盡管有這個(gè)安全措施， 但是存在許多與涉及免疫原性、細(xì)胞毒性和插入誘變的病毒載體有關(guān)的問題。舉例來說，不能排除引入的治療上有活性的基因或病毒基因的不受控增殖的危險(xiǎn)，例如，由于可能的重組事件。另外，病毒結(jié)合物難于利用并通常在治療之前需要長(zhǎng)期的制備(參考，例如，美國(guó)專利號(hào) 5，521，291)。如果是基因治療，非病毒載體不象病毒載體一樣有效；然而，它們當(dāng)中的許多已經(jīng)被開發(fā)，以在基因治療中提供更安全的選擇。一些最常見的非病毒載體包括聚乙稀亞胺、樹狀聚體、殼聚糖、聚賴氨酸和基于(多)肽的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，例如許多類型的(多)肽，它們通常本質(zhì)上是陽離子并能通過靜電相互作用而與核酸如質(zhì)粒DNA相互作用。另外，非病毒載體也允許不基于核酸的輸送藥物。為了成功的輸送，非病毒載體，特別是基于(多)肽的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)必須能克服許多障礙。這樣的障礙包括在運(yùn)輸期間貨物部分，例如DNA或其它化合物的保護(hù)，以及貨物部分在體內(nèi)早期降解或代謝的預(yù)防。在核酸，如DNA和RNA分子的情況下，非病毒載體必須另外能特異性地輸送這些分子，以在靶細(xì)胞中有效表達(dá)基因。尤其是關(guān)于核酸，如DNA和RNA分子，非病毒載體目前必須克服4個(gè)障礙以達(dá)到成功地輸送基因(參考，例如 Martin et al. ,The AAPS Journal 2007 ；9 (I)Article 3)。非病毒載體必須能1)緊密地結(jié)合并保護(hù)核酸，2)它必須能靶向特異的細(xì)胞表面受體，3)非病毒載體必須能分裂內(nèi)體膜，和4)它必須將核酸貨物輸送到核并允許編碼的蛋白質(zhì)或(多) 肽序列的翻譯。這樣的非病毒載體，特別是基于(多)肽的非病毒載體，相對(duì)于其它非病毒策略有禾IJ，因?yàn)樗鼈円话愣阅艿竭_(dá)所有這4個(gè)目的，然而，關(guān)于不同的障礙具有不同的效率。舉例來說，富含堿性殘基如賴氨酸和/或精氨酸的陽離子(多)肽能有效地將核酸如DNA濃縮成可以穩(wěn)定于血清中的小的緊密的顆粒。此外，(多)肽配體與多聚物/核酸復(fù)合物(polyplex)的連接允許靶向特異受體和/或特異細(xì)胞型。如上述的多聚物/核酸復(fù)合物或陽離子聚合物通常與帶負(fù)電荷的核酸形成復(fù)合物，所述復(fù)合物導(dǎo)致核酸的濃縮，并保護(hù)這些核酸免于降解。利用多聚物/核酸復(fù)合物(陽離子聚合物)向運(yùn)細(xì)胞運(yùn)輸通常通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而發(fā)生。因此，通過例如結(jié)合到表面受體并觸發(fā)胞吞作用的多聚物/ 核酸復(fù)合物聚左旋賴氨酸(PLL)，將DNA偶聯(lián)到獨(dú)特的分子，如轉(zhuǎn)鐵蛋白。多聚物/核酸復(fù)合物(陽離子聚合物)包括例如聚左旋賴氨酸(PLL)、殼聚糖、聚乙稀亞胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯(polydimethylaminoethylmethacrylate) (PD-MAEMA)、聚酰胺(PAMAM)。這樣的作用還從納米顆粒/核酸復(fù)合物(nanoplexes)(納米顆粒系統(tǒng))或脂質(zhì)/核酸復(fù)合物 (Iipoplexes)(脂質(zhì)體系統(tǒng))得知。納米顆粒/核酸復(fù)合物(納米顆粒系統(tǒng))通常包括聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚苯乙烯、氰基丙烯酸酯、聚乳酸(polylactat) (PLA)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)(PLGA)等的使用。脂質(zhì)/核酸復(fù)合物或脂質(zhì)體系統(tǒng)通常包括能模擬細(xì)胞膜的陽離子脂質(zhì)的使用。因此，脂質(zhì)帶有正電荷的部分與核酸帶有負(fù)電荷的部分相互作用，并因而能夠與細(xì)胞膜融合。脂質(zhì)/核酸復(fù)合物或脂質(zhì)體系統(tǒng)包括，例如DOTMA、DOPE、DOSPA、DOTAP, DC-Cho 1、EDMPC 等。在該上下文中，受體介導(dǎo)的胞吞作用在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中同樣被廣泛利用，以向細(xì)胞靶內(nèi)向輸送貨物如核酸或治療劑。在受體介導(dǎo)的胞吞作用期間，含有貨物的復(fù)合物被位于細(xì)胞膜中的對(duì)該貨物特異的受體或者位于細(xì)胞膜組分中的特異抗體選擇性地內(nèi)在化。針對(duì)包括IgG Fe、生長(zhǎng)抑素、胰島素、IGF-I和-II、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EGF、GLP-I、VLDL或整合素受體等在內(nèi)的許多受體，已經(jīng)描述了胞吞作用活性。通過受體介導(dǎo)的胞吞作用，已經(jīng)廣泛檢驗(yàn)了不同的(多)肽或蛋白質(zhì)序列在基因轉(zhuǎn)移方法中的用途。令人驚奇地，通過噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)深深地推動(dòng)了指導(dǎo)有效的受體介導(dǎo)的胞吞作用的(多)肽序列的分離。噬菌體展示文庫(kù)是極其強(qiáng)大的工具，其為細(xì)胞受體提供分子變體的幾乎無限的來源以及短(多)肽，所述變體包括對(duì)天然配體或貨物部分的修飾。相似的文庫(kù)也已被直接注射進(jìn)小鼠中，并且(多)肽序列已被成功地分離， 所述序列顯示對(duì)腦和腎的13倍的選擇性。前蛋白轉(zhuǎn)化酶可作為可用于將分子運(yùn)輸至細(xì)胞的(多)肽或蛋白質(zhì)序列的例子。 前蛋白轉(zhuǎn)化酶是細(xì)胞表面受體的例子，其通過受體介導(dǎo)的胞吞作用變得內(nèi)在化。已經(jīng)顯示， 這些蛋白質(zhì)是造成(多)肽激素、神經(jīng)肽和許多其它蛋白質(zhì)的前體轉(zhuǎn)變成其生物學(xué)活性形式的原因。前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的所有切割位點(diǎn)遵從共有序列R-X-X-R。哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶在其組織分布的基礎(chǔ)上可以分成三組。弗林蛋白酶、PACE4、PC5/PC6和LPCIPC7/PC8/ SPC7在廣泛范圍的組織和細(xì)胞系中表達(dá)。相反，PC2和PC1/PC3的表達(dá)限于神經(jīng)內(nèi)分泌組織，如胰島、垂體、腎上腺髓質(zhì)和許多腦區(qū)域。PC4的表達(dá)高度局限于睪丸生精細(xì)胞。神經(jīng)內(nèi)分泌特異轉(zhuǎn)化酶——PC2和PC1/PC3主要位于分泌顆粒中。也已經(jīng)報(bào)道PC5/PC6A位于分泌顆粒中。此外，間接的證據(jù)已經(jīng)表明，一部分前蛋白轉(zhuǎn)化酶分子存在于細(xì)胞表面上，并且已經(jīng)顯示，弗林蛋白酶在TGN和細(xì)胞表面之間循環(huán)。總之，這些性質(zhì)表明，前蛋白轉(zhuǎn)化酶將細(xì)胞外配體運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)間隙。所謂的易位蛋白(translocatory protein)或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)也是有利的。來源于易位蛋白或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)的(多)肽序列通常能在其酸性環(huán)境中選擇性地裂解內(nèi)體膜，導(dǎo)致多聚物/核酸復(fù)合物的胞質(zhì)釋放。易位蛋白被認(rèn)為是能影響大分子在細(xì)胞(易位蛋白)之間轉(zhuǎn)運(yùn)的一組(多)肽，如HIV-ITAT(HIV)、觸角(果蠅屬(Drosophila)觸角)、HSVVP22 (單純皰疹)、FGF或乳鐵蛋白等。相反，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (PTDs)被認(rèn)為是能指導(dǎo)與這些序列共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)和(多)肽通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的一組(多)月太(Leifert and Whitton Translocatory proteins and protein transduction domains -.a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol.8 No. 12003)。易位蛋白共有的以及 PTDs 共有的是堿性區(qū)，由于所述堿性區(qū)能結(jié)合聚陰離子如核酸，其被認(rèn)為是造成融和(多)肽轉(zhuǎn)運(yùn)的主要原因。利用受體依賴的非飽和吸附胞吞作用，在沒有結(jié)合到其上的情況下，PTDs可以發(fā)揮與陽離子轉(zhuǎn)染試劑相似的作用。當(dāng)給予基于疫苗的(多)肽時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)CTL應(yīng)答， PTDs通常與蛋白質(zhì)或(多)肽偶聯(lián)(參考綜述Melikov and Chernomordik,Arginine-rich cell penetrating (poly-)peptides s :from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell.Mol. Life Sci. 2005)。
盡管已知本領(lǐng)域存在幾項(xiàng)技術(shù)，其能夠?qū)⒏信d趣物質(zhì)從外部介質(zhì)轉(zhuǎn)移到組織或細(xì)胞，總體而言，但仍非常需要允許向特異組織和細(xì)胞型有效轉(zhuǎn)移的技術(shù)。因此，本發(fā)明的目的是提供新的手段，以有效地并以提高的特異性將貨物例如藥物和效應(yīng)分子靶向到特定組織和細(xì)胞型中。借助于所附權(quán)利要求所闡明的主題，針對(duì)白細(xì)胞(WBC)，該目的被解決。尤其地，本申請(qǐng)的發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)，某些類型的(多)肽可以使感興趣貨物有效轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞中。 如本文所使用的術(shù)語“WBC靶向(多)肽”指這樣的(多)肽，所述(多)肽能夠以增加的特異性(與例如H印G2(人肝癌細(xì)胞)或HCT-116細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)相比) 進(jìn)入白細(xì)胞(white blood cell)(白細(xì)胞(leukocyte))，而且其衍生自HIV TAT蛋白，即包括這樣的氨基酸序列或由這樣的氨基酸序列組成，所述氨基酸序列是片段或變體(或者這樣的HIV TAT蛋白(SEQ ID NO 1 ；描述于美國(guó)專利號(hào)5，804，604和5，674，980中，這些參考文獻(xiàn)每篇均通過引用被并入本文)片段的變體)。尤其地，所述片段、變體和這樣的片段的變體由TAT殘基49至57 (SEQ ID NO 2)或者48至57 (SEQ ID NO 3)生成。所述氨基酸序列可以包括D-氨基酸和/或L-氨基酸。如本文所使用的術(shù)語“(多)肽” 一般與本領(lǐng)域所理解的一樣，即指氨基酸鏈。然而，該術(shù)語不應(yīng)該被解釋為限制氨基酸鏈的長(zhǎng)度。該鏈也不必是線性的，而是可以是分枝的。優(yōu)選地，WBC靶向(多)肽包括少于 150、100、90、80、70、60、50、40、30、20 或少于 10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選為5至150個(gè)氨基酸殘基的范圍，更優(yōu)選為5至100個(gè)氨基酸殘基的范圍，甚至更優(yōu)選為5至75個(gè)氨基酸殘基的范圍，而最優(yōu)選為9至50個(gè)氨基酸殘基的范圍，例如 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40 或 50 個(gè)氨基酸殘基。所述WBC靶向(多)肽序列的例子可以包括表1中給出的序列或由表1中給出的序列組成。表權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子用于治療、預(yù)防、減弱和/或改善涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥的的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子包括a)作為組分㈧包括HIVTAT殘基49至57 (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列，或其變體的(多)肽，b)作為組分(B):(藥學(xué)活性)貨物分子，和c)任選的一種或更多種另外的組分，其中，所述SEQ ID NO 2的變體選自i)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NO 235的至少一個(gè)氨基酸序列，或其反向序列，和ii)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NOs 2至116任意一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸序列，或其反向序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥選自選自癌或腫瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾??；炎性疾病、感染疾病——包括細(xì)菌和病毒 (感染)疾病、與JNK信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)的疾病、自身免疫性病癥或疾病、心血管疾病、神經(jīng)元或神經(jīng)變性疾病、肝病、脊柱疾病、子宮疾病、嚴(yán)重抑郁癥、非慢性或慢性炎性消化病、糖尿病、脫發(fā)、聽力喪失或內(nèi)耳疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥選自病毒感染，尤其選自白細(xì)胞的病毒感染。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥是由選自以下之一的介質(zhì)引起的感染疾病HIV、愛潑斯坦巴爾病毒、麻疹病毒(麻疹)、副粘病毒、 風(fēng)疹病毒、皰疹病毒6型、皰疹病毒、登革病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、細(xì)小病毒、呼吸道合胞病毒、天花病毒、水痘、黃病毒、人類嗜T淋巴病毒1型、人類嗜T淋巴病毒2型、人類嗜T淋巴病毒3型、人類嗜T淋巴病毒4型、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、拉沙病毒、甲型流行性感冒(包括亞型Hmi和 H3N2)、乙型流行性感冒、丙型流行性感冒。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥選自 中性白細(xì)胞增多癥、中性白細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少、嗜堿細(xì)胞減少癥、嗜堿粒細(xì)胞增多、嗜曙紅細(xì)胞減少、嗜曙紅細(xì)胞增多、特發(fā)性嗜酸細(xì)胞增多綜合征、淋巴細(xì)胞白細(xì)胞增多、淋巴細(xì)胞增多、淋巴細(xì)胞減少、單核細(xì)胞增多、單核細(xì)胞減少、梅一黑二氏異常、佩一休二氏異常、奧而德一賴?yán)袭惓?、切一東二氏綜合征、喬布綜合征(高IgE)、懶惰白細(xì)胞綜合征、 先天性C3缺乏、慢性肉芽腫性疾病、白細(xì)胞、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、髓過氧化物酶缺陷-良性、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病、迪喬治氏綜合征、奈澤洛夫氏綜合征、嬰兒伴性無Y球蛋白血癥、普通可變性低丙種球蛋白血癥、粘多糖增多癥、脂積癥、高歇病、尼一皮二氏病、 法布里病、法伯氏病、神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥；泰一薩二氏(病)、山德霍夫病、克臘比病、變色反應(yīng)的、腦白質(zhì)病變、沃耳曼氏病、白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病(L1、L2、L3)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、未分化AML (MO)、原始粒細(xì)胞性白血病(Ml)、原始粒細(xì)胞性白血病、(M2)、前髓細(xì)胞性白血病、(M3)、粒一單核細(xì)胞型白血病(M4)、單核細(xì)胞性白血病(M5)、紅白血病(M6)、成巨核細(xì)胞白血病、(M7)、慢性骨髓性白血病。
6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的劑量(每kg 體重)在多達(dá)lOmmol/kg，優(yōu)選為多達(dá)lmmol/kg，更優(yōu)選為多達(dá)100 μ mol/kg,甚至更優(yōu)選為多達(dá)1()1111101/1^，甚至更優(yōu) 選為多達(dá)11111101/1^，甚至更優(yōu)選為多達(dá)lOOnmol/kg，最優(yōu)選為多達(dá)50nmol/kg的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的劑量(每kg 體重)在約 lpmol/kg 至約 lmmol/kg、約 IOpmol/kg 至約 O, lmmol/kg、約 IOpmol/kg 至約 0，01mmol/kg、約 50pmol/kg 至約 1 μ mol/kg、約 100pmol/kg 至約 500nmol/kg、約 200pmol/ kg 至約 300nmol/kg、約 300pmol/kg 至約 100nmol/kg、約 500pmol/kg 至約 50nmol/kg、約 750pmol/kg 至約 30nmol/kg、約 250pmol/kg 至約 5nmol/kg、約 lnmol/kg 至約 1 Onmol/kg> 或者任意兩個(gè)所述值的組合的范圍內(nèi)。
8.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子用于將感興趣物質(zhì)(貨物分子)轉(zhuǎn)運(yùn)至白細(xì)胞的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子包括a)作為組分㈧包括HIVTAT殘基49至57 (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列，或其變體的(多)肽，b)作為組分(B)貨物分子，和c)任選的一種或更多種另外的組分，其中，所述SEQ ID NO 2的變體選自i)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NO 235的至少一個(gè)氨基酸序列，或其反向序列，和ii)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NOs 2至116任意一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸序列，或其反向序列。
9.包括HIVTAT殘基49至57 (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列或其變體的(多)肽用于制備轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的用途，其中，所述SEQ ID NO :2的變體選自i)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NO 235的至少一個(gè)氨基酸序列，或其反向序列，和ii)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NOs 2至116任意一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸序列，或其反向序列，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子用于將感興趣物質(zhì)(貨物分子)轉(zhuǎn)運(yùn)至白細(xì)胞。
10.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的兩種或更多種組分彼此共價(jià)連接，尤其地，其中組分(A)和(B)彼此共價(jià)連接。
11.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述貨物分子(組分(B))選自a)蛋白質(zhì)或(多)肽，其包括治療上有活性的蛋白質(zhì)和/或(多)肽，b)蛋白激酶抑制劑，其包括蛋白激酶c-Jim氨基末端激酶或因子的抑制劑，c)抗原，d)抗體，e)凋亡因子，f)病理狀態(tài)中牽涉的蛋白酶，其包括肽蛋白酶抑制劑，g)BH3-結(jié)構(gòu)域，h)唯BH3蛋白，i)DNAs,j)RNAs，其包括 siRNAs、反義 RNAs、微小 RNAs，k)細(xì)胞毒性劑，1)小有機(jī)化合物，m)小分子藥物，η)金顆粒， ο)熒光染料， P)抗生素，和/或 q)病毒抑制劑。
12.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述SEQID NO :2變體是選自SEQ ID NOs :2至116、235或各自反向序列的化學(xué)衍生物的(化學(xué))衍生物。
13.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述任選的一種或更多種另外的組分選自信號(hào)序列或定位序列，其將所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子指引至特定的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)定位或至特定的細(xì)胞型。
14.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的一種、兩種或更多種和/或所有組分是蛋白質(zhì)或(多)肽序列，并由L-氨基酸、D-氨基酸或兩者的混合物組成。
15.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述變體包括(多)肽序列或由所述 (多)肽序列組成，所述(多)肽序列與所提到的所述(多)肽序列具有至少10%、20%、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,95%^； 99%的序列同一性。
16.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述貨物是所述c-Jun氨基末端激酶的抑制劑，選自SEQ ID NOs :117至200或其片段或變體。
17.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)至白細(xì)胞離體發(fā)生。
18.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述白細(xì)胞是初級(jí)細(xì)胞。
19.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述白細(xì)胞是無限增殖化細(xì)胞。
20.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述白細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
21.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述白細(xì)胞選自粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或肥大細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述粒細(xì)胞選自嗜中性粒細(xì)胞、嗜伊紅粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述淋巴細(xì)胞選自NK細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性τ細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞和B細(xì)胞。
24.將感興趣物質(zhì)(貨物分子)轉(zhuǎn)運(yùn)至白細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟 i)將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子和白細(xì)胞接觸，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子包括a)作為組分㈧(多)肽，其包括HIVTAT殘基49至57 (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列，或其(化學(xué))衍生物，或其變體，b)作為組分⑶貨物分子，和c)任選的一種或更多種另外的組分， 其中，所述SEQ ID NO 2的變體選自i’)(多)肽，其包括根據(jù)SEQ ID NO 235的至少一個(gè)氨基酸序列，其(化學(xué))衍生物， 或其反向序列，和ii’)(多)肽，其包括根據(jù)SEQ ID NOs 2至116任意一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸序列，其 (化學(xué))衍生物，或其反向序列。
25.分離的白細(xì)胞，其包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子包括a)作為組分㈧(多)肽，其包括HIVTAT殘基49至57 (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列，或其(化學(xué))衍生物，或其變體，b)作為組分⑶貨物分子，和c)任選的一種或更多種另外的組分， 其中，所述SEQ ID NO 2的變體選自i)(多)肽，其包括根據(jù)SEQID NO 235的至少一個(gè)氨基酸序列、其(化學(xué))衍生物、 或其反向序列，和ii)(多)肽， 其包括根據(jù)SEQID NOs 2至116任意一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸序列、其 (化學(xué))衍生物、或其反向序列或其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子用于將感興趣物質(zhì)(貨物分子)轉(zhuǎn)運(yùn)至白細(xì)胞的用途。所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子可以被用于治療、預(yù)防、減弱和/或改善涉及白細(xì)胞的疾病和/或病癥。本發(fā)明也涉及所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的制備，涉及將感興趣物質(zhì)(貨物)轉(zhuǎn)運(yùn)至白細(xì)胞的方法，以及涉及包括所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子或其片段的白細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K14/16GK102256999SQ200980151897
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者C·邦尼 申請(qǐng)人:希根有限責(zé)任公司