專利名稱：提高植物對環(huán)境應(yīng)激的耐受性的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)具有提高的應(yīng)激耐受性的植物的組合物和方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境非生物應(yīng)激，包括干旱應(yīng)激、寒冷應(yīng)激、冰凍應(yīng)激、熱應(yīng)激和鹽度應(yīng)激，是限制植物生長和生產(chǎn)力的主要因素。由這些應(yīng)激引起的包括玉米、小麥和水稻的主要作物的作物損失和產(chǎn)量降低代表了意義重大的經(jīng)濟問題，并且還導(dǎo)致一些不發(fā)達(dá)國家的食物短缺。應(yīng)激耐受性植物的研發(fā)具有減少或解決這些問題中的至少一些問題的潛能。使用傳統(tǒng)植物育種策略來產(chǎn)生新的呈現(xiàn)出對這些類型的應(yīng)激的耐受性的植物系是緩慢的。缺乏足夠的種質(zhì)資源以及遠(yuǎn)緣相關(guān)植物物種之間的不相容性代表了常規(guī)育種中的重要問題。此夕卜，導(dǎo)致對這些應(yīng)激的耐受性的細(xì)胞過程是復(fù)雜的并且涉及細(xì)胞順應(yīng)的多重機理和各種代謝途徑。這限制了傳統(tǒng)育種和遺傳工程方法開發(fā)應(yīng)激耐受性植物的成功。鑒定涉及控制導(dǎo)致應(yīng)激耐受性的復(fù)雜過程的基因和蛋白將是有益的。涉及控制應(yīng)激耐受性的基因表達(dá)的調(diào)控子，如轉(zhuǎn)錄因子，在植物的基因工程中特別有用，因為單個基因可以控制導(dǎo)致耐受性表型的基因的整個級聯(lián)。此外，在上述不同類型的應(yīng)激耐受性應(yīng)答的許多方面中，有時候存在共同性。例如，提高冷或鹽耐受性的基因也可以提高干旱應(yīng)激耐受性。這在轉(zhuǎn)錄因子At CBF/DREBl(Kasuga等，1999 Nature Biotech 17:287-91)和空泡的焦磷酸酶AVPl(Gaxiola等，2001 PNAS 98 11444-19)的情況中已經(jīng)得到了證實。盡管已經(jīng)鑒定了一些潛在有用的基因，但給予應(yīng)激耐受性的植物基因的鑒定和克隆仍然是片段化的和不完整的。盡管推定應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白在應(yīng)激耐受性中具有一定的作用，但仍然缺乏證據(jù)，而且許多這樣的應(yīng)激應(yīng)答基因的功能是未知的。新西蘭和其他國家夏季的干熱天氣條件對裸麥草的產(chǎn)量具有重要的影響。這一定是在乳場擠奶季的期間，并因此通過減少的奶產(chǎn)量或使用補充飼料和/或灌溉系統(tǒng)對乳制品生產(chǎn)的成本具有現(xiàn)實的影響。在應(yīng)激易感植物品種中鑒定出具有提供應(yīng)激耐受性能力的基因?qū)⑹怯幸娴?。?yīng)激耐受性作物的研發(fā)將提供許多優(yōu)勢，如提高產(chǎn)量和生產(chǎn)出可以在之前不合適的環(huán)境條件中栽培的植物。因此，對用于生產(chǎn)相對于栽培的對應(yīng)物具有提高的應(yīng)激耐受性的植物的組合物和方法存在著需求。本發(fā)明的目的是提供用于研發(fā)如下植物品種的改進(jìn)的組合物和方法，該植物品種對以下的至少一種應(yīng)激(干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度)具有提高的耐受性，或至少給公眾提供了一種有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該遺傳構(gòu)建體包括a)編碼具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽變體的多核苷酸，其中變體能夠提高對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性；b)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；或c)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸。在可替換的方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物， 該遺傳構(gòu)建體包括a)編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO=I的多肽或多肽變體的多核苷酸；b)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；或c)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸。優(yōu)選，a)中的變體編碼能夠提高對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。在一個實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是干旱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是冰凍。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是熱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是鹽度。在進(jìn)一步的實施方案中，變體與具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的多肽具有至少 50%的序列同一性。在進(jìn)一步的實施方案中，變體包含氨基酸序列X1X2RGVRX3RPX4GRX5Aaeirdpx6X7KX8X9X10WLGTX11DX12X13X14X15AAX16AYDX17X18AX19X20X21RG X22X23AX24TNFX25 其中=X1 = H 或 R，X2 = F 或 Y，X3 = K 或 R，X4 = S 或 W，X5 = F 或 Y，X6 = 任何氨基酸，X7 = K或R或S，X8 = A或E或S或T，X9 = R或P，Xltl = I或R或V，X11 = F 或 Y，X12 = S 或 T，X13 = A 或 P，X14 = E 或 Q 或 V，X15 = D 或 E 或 Q 或 V，X16 = C 或 L 或 K 或R，X17 =任何氨基酸，X18 = A或K，X19 = R或V，X2tl = A或D或E或H或N或S，X21 = F 或L或M或Y，X22 =任何氨基酸，X23 = K或R或TJPX24 = K或R，X25 = A或G或P(SEQ ID NO 28)。在優(yōu)選的實施方案中，變體包含選自SEQ ID NO :2_27任一個的氨基酸序列。在更優(yōu)選的實施方案中，a)的多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO=I的多肽。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，該遺傳構(gòu)建體包括a)包含核苷酸序列SEQ ID NO 29的多核苷酸，或其變體，其中變體編碼能夠提高對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽；b)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；或c)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸。在可替換的方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、 熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的 耐受性的植物的方法，該方法包括用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，該遺傳構(gòu)建體包括a)包含核苷酸序列SEQ ID NO 29的多核苷酸，或其變體，b)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；或c)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸。優(yōu)選，a)中的變體編碼能夠提高對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。在一個實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是干旱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是冰凍。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是熱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是鹽度。在進(jìn)一步的實施方案中，變體包含SEQ ID NO 30至55任一個的序列。在進(jìn)一步的實施方案中，a)的多肽包含SEQ ID NO 29的序列。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物細(xì)胞或植物。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其與編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的多肽的核苷酸序列具有至少70%序列同一性，其中多核苷酸編碼能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。在可替換的方面中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其與編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的多肽的核苷酸序列具有至少50%序列同一性。優(yōu)選，多核苷酸編碼能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。在一個實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是干旱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是冰凍。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是熱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是鹽度。在進(jìn)一步的實施方案中，所述核苷酸序列包含來自SEQ ID NO 29的序列。在進(jìn)一步的實施方案中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 29的全長編碼序列。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的多肽的分離多核苷酸。在進(jìn)一步的實施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO 29的序列。在進(jìn)一步的實施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO 29的全長編碼序列。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO 29的序列或其變體的多核苷酸， 其中變體來自裸麥草或羊茅草，并且編碼能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、 熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。在一個實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是干旱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是冰凍。
在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是熱。在進(jìn)一步的實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是鹽度。在進(jìn)一步的實施方案中，分離的多核苷酸包含SEQ ID NO 29的序列。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少72%序列同一性的分離多肽，其中多肽能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。在一個實施方案中，分離的多肽包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離多核苷酸。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包含a)包含本發(fā)明多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；b)包含本發(fā)明多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸；c)包含能夠與本發(fā)明的多核苷酸雜交的至少15個核苷酸長的序列的多核苷酸。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的遺傳構(gòu)建體。在一個實施方案中，遺傳構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。優(yōu)選，構(gòu)建體包含可操作地連接多核苷酸的啟動子。優(yōu)選，啟動子通常不是在自然狀態(tài)下與多核苷酸相關(guān)的啟動子。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體的載體。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了遺傳修飾的宿主細(xì)胞，以表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的多肽。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選，宿主細(xì)胞沒有形成活的人類的一部分。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了遺傳修飾的植物細(xì)胞，以表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的多肽。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的植物細(xì)胞的植物。優(yōu)選，包含本發(fā)明的植物細(xì)胞的植物與自然界中已經(jīng)存在的植物不同。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了選擇相對于合適的對照植物對至少一種選自干旱、寒冷冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括測試植物中本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)的改變。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了選擇相對于合適的植物對至少一種選自干旱、 寒冷冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括測試植物中本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)的改變。
在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物細(xì)胞或植物。優(yōu)選，所產(chǎn)生的植物與自然界中已經(jīng)存在的植物不同。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法選擇的植物。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一組通過本發(fā)明的方法選擇的植物。
在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了對抗本發(fā)明的多肽的抗體。本發(fā)明的多核苷酸和多核苷酸變體可以源自任何物種和/或可以通過合成或重
組產(chǎn)生。在一個實施方案中，多核苷酸或變體源自植物物種。

在進(jìn)一步的實施方案中，多核苷酸或變體源自裸子植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多核苷酸或變體源自被子植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多核苷酸或變體源自雙子葉植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多核苷酸或變體源自單子葉植物物種。本發(fā)明的多肽和多肽變體可以源自任何物種和/或可以通過合成或重組產(chǎn)生。在一個實施方案中，多肽或變體源自植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多肽或變體源自裸子植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多肽或變體源自被子植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多肽或變體源自雙子葉植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，多肽或變體源自單子葉植物物種。本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物可以源自任何物種。在一個實施方案中，植物細(xì)胞或植物源自裸子植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，植物細(xì)胞或植物源自被子植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，植物細(xì)胞或植物源自雙子葉植物物種。在進(jìn)一步的實施方案中，植物細(xì)胞或植物源自單子葉植物物種。優(yōu)選的植物物種是飼料植物物種。優(yōu)選，物種選自以下的屬裸麥草屬(Lolium)、 羊茅屬(Festuca)、鴨茅屬(Dactylis)、雀麥屬(Bromus)、三葉草屬(Trifolium)、苜蓿屬 (Medicago)、Pheleum、薦草屬(Phalaris)、絨毛草屬(Holcus)、蓮屬(Lotus)、車前草屬 (Plantago)禾口胃H屬(Cichorium)。優(yōu)選的屬是裸麥草屬或三葉草屬。特別優(yōu)選的是多年生裸麥草(Lolium Perenne) 和白三葉草(Trifolium repens)物種。最優(yōu)選的是多年生裸麥草物種。術(shù)語“植物”旨在包括完整的植物，植物的任何部分，植物的繁殖體和子代。術(shù)語“繁殖體”意思是可以用于再生或繁殖中的任何植物部分，有性或無性，包括種子和切片。本發(fā)明的植物可以種植并自交或與不同的植株雜交，并且可以鑒定出所得到的具有所需表型特征的雜種?？梢苑N植兩代或更多代，以確保主體表型特征得到穩(wěn)定維持和遺傳。從這種標(biāo)準(zhǔn)育種方法得到的植物也形成本發(fā)明的一個方面。詳述定義術(shù)語“對干旱應(yīng)激的耐受性或耐力，，旨在描述在次最佳水合條件下比相同條件下的合適對照植物能更好地進(jìn)行其生長和發(fā)育的任一方面的一種或多種植物。術(shù)語“對寒冷應(yīng)激的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳降低降低的溫度的條件下比相同條件下的合適對照植物能更好地進(jìn)行其生長和發(fā)育的任一方面的一種或多種植物。術(shù)語“對冰凍應(yīng)激的耐受性或耐力”旨在描述在低于或等于0°C的溫度條件下比相同條件下的合適對照植物能更好地進(jìn)行其生長和發(fā)育的任一方面的一種或多種植物。
術(shù)語“對熱應(yīng)激的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳升高溫度的條件下比相同條件下的合適對照植物能更好地進(jìn)行其生長和發(fā)育的任一方面的一種或多種植物。術(shù)語“對鹽度的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳升高鹽度的條件下比相同條件下的合適對照植物能更好地進(jìn)行其生長和發(fā)育的任一方面的一種或多種植物。 合適的對照植物可以包括相同物種和品種的未轉(zhuǎn)化植物，或用對照構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的相同物種或品種的植物。關(guān)于本發(fā)明的選擇方法，對環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物指的是選自在應(yīng)激條件下比相同條件下的平均數(shù)的群體能更好地進(jìn)行生長和發(fā)育的任一方面的植物群中的植物。多核苷酸和片段如在此所用的術(shù)語“多核苷酸”意思是任何長度的單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，但優(yōu)選至少15個核苷酸，并且作為非限制性的實例，包括基因的編碼和非編碼序列、正義和反義序列互補體、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、 rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多肽、分離和純化的天然產(chǎn)生的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。在此提供的多核苷酸序列的“片段”是能夠與感興趣的目標(biāo)特異性雜交的連續(xù)核苷酸的子序列，例如，至少15個核苷酸長的序列。本發(fā)明的片段包含本發(fā)明多核苷酸的連續(xù)核苷酸的15個核苷酸，優(yōu)選至少20個核苷酸，更優(yōu)選至少30個核苷酸，更優(yōu)選至少50 個核苷酸，更優(yōu)選至少50個核苷酸，最優(yōu)選至少60個核苷酸。多核苷酸序列的片段可以用于反義、基因沉默、三鏈螺旋或核酶技術(shù)中，或作為引物、探針、包括在微矩陣中，或用于本發(fā)明的基于多核苷酸的選擇方法中。術(shù)語“引物”指的是與模板雜交并用于引發(fā)與目標(biāo)互補的多核苷酸的聚合的短多核苷酸，通常具有游離的3’ OH基團(tuán)。術(shù)語“探針”指的是在基于雜交的試驗中，用于檢測與探針互補的多核苷酸序列的短多核苷酸，探針可以由在此限定的多核苷酸的“片段”組成。多肽和片段如在此所用的術(shù)語“多肽”包括任何長度的氨基酸鏈，優(yōu)選至少5個氨基酸，包括全長蛋白，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。本發(fā)明的多肽可以是純化的天然產(chǎn)物，或可以使用重組或合成技術(shù)來部分或全部產(chǎn)生。術(shù)語可以指多肽、多肽的聚集物(如，二聚體或其他多聚體)、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。多肽的“片段”是執(zhí)行生物活性所需功能的和/或提供多肽三維結(jié)構(gòu)的多肽的子序列。術(shù)語可以指能夠執(zhí)行以上酶活性的多肽、多肽的聚集物(如，二聚體或其他多聚體)、 融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。用于在此公開的多核苷酸或多肽序列的術(shù)語“分離的”用于表示從其天然細(xì)胞環(huán)境中取出的序列?？梢酝ㄟ^任一種方法或這些方法的結(jié)合來獲得分離的分子，這些方法包括生化、重組和合成技術(shù)。術(shù)語“重組”指的是從其天然內(nèi)含物中圍繞其的序列中取出和/或與不存在于其天然內(nèi)含物中的序列重組的多核苷酸序列。通過從“重組”多核苷酸序列翻譯來產(chǎn)生“重組”多肽序列。
關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸或多肽的術(shù)語“源自”是源自特定的屬或種，意思是多核苷酸或多肽具有與該屬或種中天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸或多肽相同的序列。因此，源自特定屬或種的多核苷酸或多肽可以被合成或重組產(chǎn)生。變體 如在此所用的，術(shù)語“變體”指的是不同于具體限定序列的多核苷酸或多肽序列， 其中刪除、置換或添加了一個或多個核苷酸或氨基酸殘基。變體可以是天然產(chǎn)生的等位基因變體，或非天然產(chǎn)生的變體。變體可以來自相同或其他物種，并且可以包括同源物、旁系同源(paralogue)和直系同源(orthologue)。在特定的實施方案中，本發(fā)明多肽和多肽的變體具有與本發(fā)明的多肽或多肽相同或相似的生物活性。關(guān)于多肽和多肽的術(shù)語“變體”包括如在此限定的所有形式的多肽和多肽。多核苷酸變體變體多核苷酸序列優(yōu)選呈現(xiàn)出與特定的多核苷酸序列至少50%，更優(yōu)選至少 51%,更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選至少53%，更優(yōu)選至少54%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少 56 %，更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少 61%,更優(yōu)選至少62%，更優(yōu)選至少63%，更優(yōu)選至少64%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少 66 %，更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少 71%,更優(yōu)選至少72%，更優(yōu)選至少73%，更優(yōu)選至少74%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少 76 %，更優(yōu)選至少77 %，更優(yōu)選至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少 81%,更優(yōu)選至少82%，更優(yōu)選至少83%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少 86 %，更優(yōu)選至少87 %，更優(yōu)選至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少 91%,更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少 96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，最優(yōu)選至少99 %的同一性。在特定多核苷酸序列的至少20個核苷酸位置，優(yōu)選至少50個核苷酸位置，更優(yōu)選至少100個核苷酸位置，最優(yōu)選全長的比較窗口中發(fā)現(xiàn)同一性。可以以以下方式來測定多核苷酸序列同一性。使用從NCBI (ftp://ftp.ncbi. nih. Rov/blast/)可公開獲得的 b!2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences，，， FEMS Microbiol Lett. 174 :247_250)中的 BLASTN(來自 BLAST 組程序(BLAST suite of programs)，版本2. 2. 5 [2002年11月])，來比較主體多核苷酸序列與候選多核苷酸序列。 除了應(yīng)當(dāng)關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾外，使用bl2seq的缺省參數(shù)?？梢允褂靡韵碌膇mix命令行參數(shù)來檢測多核苷酸序列的同一性bl2seq-i核苷酸序列l(wèi)_j核苷酸序列2_F F_p blastn參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-ρ選擇用于序列對的合適算法。bl2seq 程序?qū)⑿蛄型恍杂涗洖樾小巴恍?”中的相同核苷酸的數(shù)量和百分比。還可以使用通用序列比對程序(例如，Needleman, S. B.和Wunsch，C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)在候選和主體核苷酸序列之間的重疊的完整長度中計算多核苷酸序列同一'性。在可以獲自 http //www. hRmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/ 的 EMBOSS 包(Rice, P.Longden, I.禾口 Bleasby, A. EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics，2000 年 6 月，vol 16，No. 6ρρ· 276-277)中的 needle程序中找到了 Needleman-Wimsch通用比對算法的全部執(zhí)行。歐洲生物信息研究院服務(wù)器還提供了工具，以在http:/WWW. ebi. ac. uk/emboss/align/在線進(jìn)行兩個序列之間的 EMBOSS-needle 通用比對?？蛇x擇地，可以使用GAP程序，其計算兩個序列的最佳通用比對，不需要處罰末端缺口。GAP 描述于以下的論文中Huang，X. (1994)0n Global Sequence Alignment. Computer Application in the Biosciences 10,227-235。本發(fā)明的多核苷酸變體還包括呈現(xiàn)出與一個或多個很可能保留那些序列等價功能的具體限定序列的相似性并且不能合理地預(yù)期通過隨機機會出現(xiàn)的那些。可以使用公眾可獲得的來自 NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)的 BLAST 組程序(版本 2. 2. 5 [2002 年11月])的bl2seq程序來測定關(guān)于多肽的這種序列相似性。可以使用以下的imix命令行參數(shù)來檢測多核苷酸序列的相似性bl2seq-i核苷酸序列l(wèi)_j核苷酸序列2_F F_p tblastx參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-ρ選擇用于序列對的合適算法。該程序發(fā)現(xiàn)了序列之間的相似性區(qū)域，并且對于每個這樣的區(qū)域，記錄了 “E值”，這是預(yù)期的次數(shù)，可以預(yù)期在含有隨機序列的固定參照大小的數(shù)據(jù)庫中看到這樣偶然的匹配。該數(shù)據(jù)庫的大小通過bl2seq程序中的缺省來設(shè)定。對于小的E值，比一小得多，E值大致是該隨機匹配的可能性。與任一個具體限定序列相比時，變體多核苷酸序列優(yōu)選呈現(xiàn)出低于1χ10_1(ι的E 值，更優(yōu)選低于lxl0_2°，更優(yōu)選低于1χ10_3°，更優(yōu)選低于1χ10_4°，更優(yōu)選低于1χ10_5°，更優(yōu)選低于1χ10_6°，更優(yōu)選低于1χ10_7°，更優(yōu)選低于1x10,，更優(yōu)選低于1χ10_9°，更優(yōu)選低于 lxlO—·，更優(yōu)選低于1x10—"°，最優(yōu)選低于1x10,。可選擇地，本發(fā)明的變體多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與特定的多核苷酸序列或其互補體雜交。術(shù)語“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”及其語法等價體指的是多核苷酸分子在限定的溫度和鹽濃度條件下與目標(biāo)多核苷酸分子(如，固定于DNA或RNA印跡上的目標(biāo)多核苷酸分子，如 Southern印跡或Northern印跡)雜交?？梢酝ㄟ^最初在較低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，然后將嚴(yán)謹(jǐn)度提高至所需的嚴(yán)謹(jǐn)度來測定嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交能力。對于大于約100個堿基長的多核苷酸分子，典型的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為低于天然雙鏈體的解鏈溫度(Tm)不超過25至30°C (例如，10°C )(通常參見，Sambrook等，編輯，1987， Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Press ；Ausubel 等，1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing)?？梢酝ㄟ^公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)來計算超過約100個堿基的多核苷酸分子的Tm。 (Sambrook 等，編$|，1987，Molecular Cloning,ALaboratory Manual，第 2 片反，Cold Spring Harbor Press ；Bolton和McCarthy，1962，PNAS 84 :1390)。對于超過 100 個堿基長的多核苷酸的典型嚴(yán)謹(jǐn)條件將是如下的雜交條件，在6XSSC，0. 2% SDS的溶液中預(yù)先洗滌；在65°C， 6X SSC，0.2% SDS雜交過夜；接著兩次在IX SSC，0. 1 % SDS中，65°C，30分鐘的洗滌，兩次在 0. 2X SSC, 0. 1% SDS 中，65°C，30 分鐘的洗滌。對于長度低于100個堿基的多核苷酸分子，示例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是低于Tm5至 10°C。平均起來，長度低于IOObp的多核苷酸分子的Tm大約降低(500/寡核苷酸長度)°C。
對于通常所說的肽核酸(PNAs)的DNA模擬物(Nielsen等，Science，1991年12月 6日；254(5037) =1497-500), Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA雜交體的那些，并且可以使用 Giesen 等所述的公式來計算，Giesen 等，Nucleic Acids Res. 1998 年 11 月 1 日；26 (21) 5004-6。長度低于100個堿基的DNA-RNA雜交體的示例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為低于Tm 5至 10°C。 本發(fā)明的變體多核苷酸還包括不同于本發(fā)明序列的多核苷酸，但其是作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，編碼具有與由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽相似活性的多肽。沒有改變多肽氨基酸序列的序列變化是“沉默變化”。除了 ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，對于相同氨基酸的其他密碼子可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)來改變，例如，以優(yōu)化在特定宿主生物體中的密碼子表達(dá)。本發(fā)明中還包括導(dǎo)致所編碼多肽序列中的一個或幾個氨基酸的保守性置換但沒有明顯改變其生物活性的多核苷酸序列改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解進(jìn)行表型沉默氨基酸置換的方法(參見，例如，Bowie 等，1990，Science 247，1306)。使用公眾可獲得的來自NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)的 BLAST 組程序 (版本2. 2. 5 [2002年11月])的bl2seq程序，通過之前所述的tblastx算法，可以測定所編碼多肽序列中由于沉默改變和保守性置換產(chǎn)生的變體多核苷酸。多肽變體關(guān)于多肽的術(shù)語“變體”包括天然產(chǎn)生的、重組和合成產(chǎn)生的多肽。變體多肽序列優(yōu)選呈現(xiàn)出與本發(fā)明的序列至少50%，更優(yōu)選至少51%，更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選至少 53 %，更優(yōu)選至少54 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少56 %，更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少61 %，更優(yōu)選至少62 %，更優(yōu)選至少63 %，更優(yōu)選至少64 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少66 %，更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少71 %，更優(yōu)選至少72 %，更優(yōu)選至少73 %，更優(yōu)選至少74 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更優(yōu)選至少％，更優(yōu)選至少 77 %，更優(yōu)選至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少81 %，更優(yōu)選至少 82 %，更優(yōu)選至少83 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少86 %，更優(yōu)選至少 87 %，更優(yōu)選至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91 %，更優(yōu)選至少 92 %，更優(yōu)選至少93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少 97 %，更優(yōu)選至少98 %，最優(yōu)選至少99 %的同一性。在本發(fā)明多肽的至少20個氨基酸位置， 優(yōu)選至少50個氨基酸位置，更優(yōu)選至少100個氨基酸位置，最優(yōu)選全長的比較窗口中發(fā)現(xiàn)同一性?？梢砸砸韵路绞絹頊y定多肽序列同一性。使用從NCBI (ftp://ftp.ncbi. nih. rov/ blast/)可公開獲得的bl2seq中的BLASTP (來自the BLAST組程序，版本2. 2. 5 [2002年 11月])，來比較主體多肽序列與候選多肽序列。除了應(yīng)當(dāng)關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾外，使用bl2seq的缺省參數(shù)。還可以使用通用序列比對程序在候選和主體多核苷酸序列之間的重疊的完整長度中計算多肽序列同一性。如以上討論的EMBOSS-needle (在http:/www. ebi. ac. uk/ emboss/align/)禾口 GAP(Huang, Χ. (1994), On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10，227-235)也是合適的用于計算多肽序列同一性的通用序列比對程序。優(yōu)選使用如上所述的BLASTP，用于測定根據(jù)本發(fā)明的多肽變體。本發(fā)明的多肽變體還包括呈現(xiàn)出與一個或多個很可能保留那些序列等價功能的具體限定序列的相似性并且不能合理地預(yù)期通過隨機機會出現(xiàn)的那些?？梢允褂霉娍色@得的來自 NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)的 BLAST 組程序(版本 2. 2. 5 [2002 年 11月])的bl2seq程序來測定關(guān)于多肽的這種序列相似性?？梢允褂靡韵碌膇mix命令行參數(shù)來檢測多肽序列的相似性bl2seq-i 肽序列 l_j 肽序列 2_F F_p blastp與任一個具體限定序列相比時，變體多肽序列優(yōu)選呈現(xiàn)出低于1x10,的E值，更優(yōu)選低于lxl0_2°，更優(yōu)選低于1χ10_3°，更優(yōu)選低于1χ10_4°，更優(yōu)選低于1χ10_5°，更優(yōu)選低于 IxlO-60,更優(yōu)選低于1x10— ，更優(yōu)選低于1χ1(Γ8°，更優(yōu)選低于1χ1(Γ9°，更優(yōu)選低于lxlO—·，更優(yōu)選低于1x10-"°，更優(yōu)選低于1χ1(Γ12°，最優(yōu)選低于lxlO—123。參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-P選擇用于序列對的合適算法。該程序發(fā)現(xiàn)了序列之間的相似性區(qū)域，并且對于每個這樣的區(qū)域，記錄了 “E值”，這是預(yù)期的次數(shù)，可以預(yù)期在含有隨機序列的固定參照大小的數(shù)據(jù)庫中看到這樣偶然的匹配。對于小的 E值，比一小得多，這大致是該隨機匹配的可能性。本發(fā)明中還包括所述多肽序列的沒有明顯改變其生物活性的一個或幾個氨基酸的保守性置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解進(jìn)行表型沉默氨基酸置換的方法(參見，例如， Bowie 等，1990，Science 247，1306)。構(gòu)建體、載體及其成分術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”指的是多核苷酸分子，通常是雙鏈DNA，其可以具有插入其中的另一個多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)，如，但不局限于，cDNA分子。遺傳構(gòu)建體可以含有允許轉(zhuǎn)錄插入的多核苷酸分子和任選將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯成多肽的必需元件。插入的多核苷酸分子可以源自宿主細(xì)胞，或可以源自不同的細(xì)胞或生物體和/或可以是重組多核苷酸。一旦在宿主細(xì)胞內(nèi)，遺傳構(gòu)建體可以變得整合在宿主染色體DNA中?？梢詫⑦z傳構(gòu)建體連接至載體。術(shù)語“載體”指的是多核苷酸分子，通常是雙鏈DNA，將其用于將遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞中。載體能夠在至少一種其他宿主系統(tǒng)(如，大腸桿菌)中復(fù)制。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”指的是包括允許轉(zhuǎn)錄插入的多核苷酸分子和任選將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯成多肽的必需元件的遺傳構(gòu)建體。表達(dá)構(gòu)建體在5’至3’方向通常包含a)在將要轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的宿主細(xì)胞中的功能性啟動子，b)待表達(dá)的多核苷酸，和c)在將要轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的宿主細(xì)胞中的功能性終止子。術(shù)語“編碼區(qū)”或“開放閱讀框”(ORF)指的是在合適的調(diào)控序列的控制下，能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈。通過5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子的存在來識別編碼序列。插入遺傳構(gòu)建體時，與啟動子和終止子序列可操作地連接時，“編碼序列”能夠得到表達(dá)?！翱刹僮鞯剡B接”意思是將待表達(dá)的序列置于調(diào)控元件的控制下，調(diào)控元件包括啟動子、組織特異性調(diào)控元件、暫時的調(diào)控元件、增強子、抑制子和終止子。
術(shù)語“非編碼區(qū)”指的是在翻譯起始位點上游和翻譯終止位點下游的非翻譯序列。 這些序列也各自指5’UTR和3’UTR。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄啟動和終止以及翻譯效率調(diào)控需要的元件。終止子是終止轉(zhuǎn)錄并且在翻譯序列的基因下游的3’非翻譯端發(fā)現(xiàn)的序列。終止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定因子，并且在一些情況中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有空間調(diào)控功能。術(shù)語“啟動子”指的是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的編碼區(qū)上游的非轉(zhuǎn)錄順調(diào)控元件。啟動子包含指定轉(zhuǎn)錄起始位點的順_啟動子元件和保守盒(如TATA盒)，以及由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序?！稗D(zhuǎn)基因”是取自一個生物體并通過轉(zhuǎn)化引入不同生物體中的多核苷酸。轉(zhuǎn)基因可以源自與其中引入轉(zhuǎn)基因的生物體物種相同的物種或來自不同的物種?！胺聪蛑貜?fù)”是一種重復(fù)的序列，其中重復(fù)的后半部分在互補鏈中，例如(5，) GATCTA.......TAGATC (3，)(3，) CTAGAT.......ATCTAG (5，)通讀轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生經(jīng)受互補堿基配對的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，只要重復(fù)的區(qū)域之間存在3-5bp間隔物?！稗D(zhuǎn)基因”植物指的是含有作為遺傳操縱或轉(zhuǎn)化結(jié)果的新遺傳材料的植物。新遺傳材料可以源自與所得到的轉(zhuǎn)基因植物相同物種的植物或源自不同的物種。術(shù)語“以改變本發(fā)明的多核苷酸或多肽的表達(dá)”和“本發(fā)明的多核苷酸或多肽改變的表達(dá)”旨在包括其中對應(yīng)于本發(fā)明多核苷酸的基因組DNA被修飾，因此導(dǎo)致本發(fā)明的多核苷酸或多肽表達(dá)改變的情況?？梢酝ㄟ^基因轉(zhuǎn)化或本領(lǐng)域中的其他方法誘導(dǎo)突變進(jìn)行基因組DNA的修飾?！案淖兊谋磉_(dá)”可以與所產(chǎn)生的信使RNA和/或多肽的含量增加或降低相關(guān)，并且還可以由于多核苷酸和所產(chǎn)生多肽的序列的變化而導(dǎo)致改變的多肽活性。申請人:已經(jīng)從裸麥草鑒定出多核苷酸(SEQ ID NO :29)，其編碼調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽(SEQ ID NO :1)。申請人還鑒定出編碼SEQ ID NO 1的多肽變體(SEQ ID NO :2_27)的SEQ ID NO 29的多核苷酸變體(SEQ ID NO :30-55)，這些多肽變體調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。本發(fā)明提供了相對于合適的對照植物，對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性改變了的植物。本發(fā)明提供了對以上特征性應(yīng)激耐受性提高的植物和對以上特征性應(yīng)激耐受性降低的植物。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)或選擇這些植物的方法。分離或產(chǎn)生多核苷酸的方法可以通過使用各種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)來分離本發(fā)明的多核苷酸分子。例如，可以通過使用Mullis等編輯，1994，The Polymerase Chain Reaction(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，Birkhauser中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來分離這些多核苷酸，在此引入作為參考。可以如在此限定的源自本發(fā)明多核苷酸序列的引物來擴增本發(fā)明的多肽。用于分離本發(fā)明的多核苷酸或在本發(fā)明的方法中有用的更多方法包括使用在此作為雜交探針列出的所有或部分多核苷酸。將標(biāo)記的多核苷酸探針與固定于固體支持物 (如硝基纖維素濾紙或尼龍膜)上的多核苷酸雜交的技術(shù)可以用于篩選基因組或cDNA文庫。示例性雜交和洗滌條件為在65°C，在5. OX SSC, 0. 5%十二烷基硫酸鈉，IXDenhardt's溶液中雜交20小時；在1. OX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌(三次洗滌，在55°C， 每次二十分鐘，)，任選在0.5X SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉中60°C—次洗滌(二十分鐘)?？梢栽?. IX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉，60°C的條件下，進(jìn)行任選的進(jìn)一步洗滌 (二十分鐘)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的技術(shù)，如限制性核酸內(nèi)切酶消化和寡核苷酸合成，來產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸片段?？梢栽诒绢I(lǐng)域公知的方法中使用部分多核苷酸序列，以鑒定相應(yīng)的全長多核苷酸序列。這樣的方法包括基于 PCR 的方法，5，RACE (Frohman ΜΑ, 1993,Methods Enzymol. 218 340-56)和基于雜交的方法，基于計算機/數(shù)據(jù)庫的方法。此外，例如，使用基于已知的區(qū)域的引物開始，逆向PCR允許獲取在此公開的多核苷酸序列兩側(cè)的未知序列，(Triglia等， 1998, Nucleic Acids Res 16，8186，在此引入作為參考)。該方法使用了幾種限制性酶來產(chǎn)生基因已知區(qū)域中的合適片段。然后通過分子內(nèi)連接將片段環(huán)化并用作PCR模板。從已知區(qū)域設(shè)計分叉的引物。為了在物理上裝配全長克隆，可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法 (Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 2 版，Cold Spring Harbor Press, 1987)。從特定的物種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物時，用源自該物種的一個或多個序列轉(zhuǎn)化該植物將是有益的。益處是可以減少公眾對產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體中的交叉物種轉(zhuǎn)化的關(guān)注。此外，基因下調(diào)是所需結(jié)果時，可能需要利用與植物中與希望表達(dá)降低的序列相同的序列(或至少高度相似)。出于其中這些原因，希望能夠鑒定并分離出幾種不同植物物種中特定基因的直系同源。通過所述的方法可以鑒定出變體(包括直系同源)。鑒定變體的方法物理方法可以使用基于PCR的方法來鑒定變體多核苷酸(Mullis等，編輯，1994，The Polymerase Chain Reaction(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，Birkhauser)。通常，用于擴增變體多核苷酸分子PCR引物的多核苷酸序列可以基于編碼相應(yīng)氨基酸序列的保守區(qū)的序列?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的文庫篩選方法(Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 2 版，Cold Spring Harbor Press, 1987) 0鑒定探針序列的變體時，相對于尋找精確序列的匹配時，通常降低雜交和/ 或洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性。也可以通過物理方法來鑒定多肽變體，例如，通過使用對抗本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的抗體來蹄選表達(dá)文庫(Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版， Cold Spring Harbor Press, 1987)或通過借助于這樣的抗體來鑒定來自天然來源的多肽。基于計算機的方法還可以使用公眾結(jié)構(gòu)域序列比對算法和序列相似性研究工具搜尋序列數(shù)據(jù)庫 (公眾結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫包括Genbank，EMBL, Swiss-Prot, PIR等)，通過本領(lǐng)域公知的基于計算機的方法來鑒定多核苷酸和多肽。參見，例如，Nucleic Acids Res. 29 :1_10和11-16， 2001，例如，在線資源。相似性研究重新獲得并比對目標(biāo)序列，用于與待分析的序列(即，詢問序列)比較。序列比較算法使用評分矩陣，將全部評分分配給各自的比對。用于鑒定序列數(shù)據(jù)庫中的變體的程序的示例性家族是BLAST組程序(版本 2. 2. 5 [2002 年 11 月])，包括 BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 和 tBLASTX,其從 (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast)或從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，國家醫(yī)學(xué)實驗室 (National Library of Medicine), Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894 USA 是公眾可獲得的。NCBI服務(wù)器還提供工具來使用程序以篩選各種公眾可獲得的序列數(shù)據(jù)庫。BLASTN相對核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較了核苷酸詢問序列。BLASTP相對蛋白序列數(shù)據(jù)庫比較了氨基酸詢問序列。BLASTX相對蛋白序列數(shù)據(jù)庫比較了在所有閱讀框中翻譯的核苷酸詢問序列。tBLASTN相對所有閱讀框中動態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較了蛋白詢問序列。tBLASTX相對六-框翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較了六-框翻譯的核苷酸詢問序列。 BLAST程序可以與缺省參數(shù)一起使用，或參數(shù)可以按照需要而改變，以提煉篩選。BLAST家族算法的使用，包括BLASTN、BLASTP和BLASTX，描述于Altschul等的出版物中，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402，1997。通過BLASTN、BLASTP, BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法產(chǎn)生的詢問序列“擊中(hit)”一個或多個數(shù)據(jù)庫序列，比對并鑒定序列的相似部分。擊中以相似性程度和序列重疊長度的次序來排列。數(shù)據(jù)庫序列的擊中通常表示僅有一部分詢問序列的序列長度是重疊的。BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 和 tBLASTX 算法還產(chǎn)生比對的“預(yù)期”值。預(yù)期值(E)表示搜尋含有隨機連續(xù)序列的相同大小的數(shù)據(jù)庫時，“預(yù)期”偶然能看到的擊中數(shù)。 預(yù)期值用作顯著性閾值，用于測定數(shù)據(jù)庫的擊中是否表示真實的相似性。例如，分配給多核苷酸擊中的0. 1的E值解釋為表示在所篩選的數(shù)據(jù)庫大小的數(shù)據(jù)庫中，可以預(yù)期在具有相似評分的序列的比對部分中看到0. 1匹配僅僅是偶然。對于比對和匹配部分中具有0. 01 或更低E值的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法，該數(shù)據(jù)庫中偶然發(fā)現(xiàn)匹配的可能性是或更低?？梢允褂肅LUSTALW(Thompson，J. D.，Higgins, D. G.禾Π Gibson, Τ. J. (1994) CLUSTALff improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice (CLUSTALW:通過序列權(quán)重、位置特異性缺口懲罰和權(quán)重基質(zhì)選擇來提高漸進(jìn)性多序列比對的靈敏度)，Nucleic Acids Research, 22 4673-4680, http //www-igbmc. u_strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或 T-C0FFEE(Cedric Notredame, Desmond G. Higgins,Jaap Heringa,T-Coffee :A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000)302 :205_217))或 PILEUP 進(jìn)行相關(guān)序列組的多序列比對，其使用漸進(jìn)性的成對比對(Feng和Doolittle, 1987，J. Mol. Evol. 25，351)。模式識別軟件應(yīng)用可以用于發(fā)現(xiàn)基序或標(biāo)志序列。例如，MEME(Multiple Em for MotifElicitation)在一組序列中發(fā)現(xiàn)基序和標(biāo)志序列，MAST (Motif Alignment and Search Tool)使用這些基序來鑒定詢問序列中相似或相同的基序。作為一系列與合適的統(tǒng)計數(shù)據(jù)的比對和所發(fā)現(xiàn)基序的直觀概覽來提供MAST結(jié)果。MEME和MAST發(fā)展于University of California, San Diego。PR0SITE(Bairoch 禾口 Bucher，1994，Nucleic Acids Res. 22,3583 ；Hofmann 等， 1999,Nucleic Acids Res. 27,215)是鑒定從基因組或cDNA序列翻譯的未表征蛋白的功能的方法。PR0SITE數(shù)據(jù)庫(www, expasy. orR/prosite)包含生物上重要的模式和剖析圖，并
16且對其進(jìn)行設(shè)計，使其可以與合適的計算機工具一起使用，以將新的序列分配給已知的蛋白家族或測定哪個已知的結(jié)構(gòu)域存在于序列中(Falquet等，2002，Nucleic Acids Res. 30， 235)。Prosearch是可以搜尋具有已知序列模式或標(biāo)志的SWISS-PR0T和EMBL數(shù)據(jù)庫的工具。分離多肽的方法可以使用本領(lǐng)域公知的肽合成方法，如使用固相技術(shù)的直接肽合成(例如，Stewart 等，1969, 見 Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California)或自動化合成，例如使用 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California)，來制備本發(fā)明的多肽，包括變體多肽。在這樣的合成過程中，也可以產(chǎn)生突變形式的多肽。還可以使用各種本領(lǐng)域公知的技術(shù)(例如，Deutscher，1990，編輯，Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification (蛋白純化指南))，從天然來源純化本發(fā)明的多肽和變體多肽?；蛘?，可以在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)本發(fā)明的多肽和變體多肽，并按照以下所討論的從細(xì)胞中分離出來。生產(chǎn)構(gòu)建體和載體的方法本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含一個或多個本發(fā)明的多核苷酸序列和/或編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且可以用于轉(zhuǎn)化例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體旨在包括在此所限定的表達(dá)構(gòu)建體。生產(chǎn)和使用遺傳構(gòu)建體和載體的方法是本領(lǐng)域公知的，并且通常描述于Sambrook 等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 2 版，Cold Spring Harbor Press, 1987 ;Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)通用實驗方案)，Greene Publishing, 1987)。生產(chǎn)包含構(gòu)建體和載體的宿主細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以源自， 例如，細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。優(yōu)選，宿主細(xì)胞不是來自活人的一部分。包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體(如表達(dá)構(gòu)建體)的宿主細(xì)胞可用于本領(lǐng)域公知的方法中(例如，Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 2 版，Cold Spring Harbor Press, 1987 ;Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)通用實驗方案)，Greene Publishing，1987)，用于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)。這樣的方法可以涉及在適于或有助于本發(fā)明多肽表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。然后可以通過本領(lǐng)域公知的方法(例如，Deutscher編輯，1990， Methods in Enzymology ( ΒΙ^^^ ), Vol 182,Guide to Protein Purification(蛋白純化指南))從介質(zhì)、宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出所表達(dá)的重組多肽(其可以任選分泌至培養(yǎng)物中)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以用于通過本發(fā)明的表達(dá)多肽產(chǎn)生的酶產(chǎn)物的生產(chǎn)中。這樣的方法可以涉及在適于本發(fā)明的重組多肽表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，任選在本發(fā)明的表達(dá)多肽的其他酶底物的存在下。然后可以通過各種本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出所產(chǎn)生的酶產(chǎn)物。
生產(chǎn)包含構(gòu)建體和載體的植物細(xì)胞和植物的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的植物細(xì)胞，并且植物細(xì)胞得到修飾，以改變本發(fā)明的多核苷酸或多肽的表達(dá)。包含這些細(xì)胞的植物也形成了本發(fā)明的一個方面。通過本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)種子產(chǎn)量改變的植物的生產(chǎn)。這樣的方法可以涉及用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，該構(gòu)建體被設(shè)計成改變能夠調(diào)節(jié)這些植物細(xì)胞和植物的種子產(chǎn)量的多核苷酸或多肽的表達(dá)。這樣的方法還包括用構(gòu)建體的組合物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，這些構(gòu)建體被設(shè)計成改變能夠調(diào)節(jié)這些植物細(xì)胞和植物的種子產(chǎn)量的一個或多個多核苷酸或多肽的表達(dá)。用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物及其部分的方法描述于Draper等，1988， Plant Genetic Transformation and Gene Expression(植物遺傳轉(zhuǎn)化禾口基因表達(dá))， ALaboratory Manual. Blackwell Sci.Pub. Oxford, p. 365 ；Potrykus 禾口 Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants.Springer-Verlag, Berlin.； 禾口 Gelvin 等，1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht。Galun 禾口 Breiman,1997, Transgenic Plants. Imperial College Press，London 中提供了轉(zhuǎn)基因植物的綜述，包括轉(zhuǎn)化技術(shù)。植物遺傳操縱方法各種用于遺傳操縱植物的策略是可獲得的(例如，Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol，48，297)。例如，可以設(shè)計策略，以提高正常表達(dá)的植物細(xì)胞、器官和 /或特定發(fā)育階段的多核苷酸/多肽的表達(dá)，或異位表達(dá)非正常表達(dá)的細(xì)胞、組織、器官和/ 或特定發(fā)育階段的多核苷酸/多肽。所表達(dá)的多核苷酸/多肽可以源自待轉(zhuǎn)化的植物物種或可以源自不同的植物物種?？梢栽O(shè)計轉(zhuǎn)化策略來降低正常表達(dá)的植物細(xì)胞、組織、器官或特定發(fā)育階段的多核苷酸/多肽的表達(dá)。這樣的策略稱為基因沉默策略。用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因的遺傳構(gòu)建體通常包括用于驅(qū)動一個或多個克隆的多核苷酸的表達(dá)的啟動子，終止子和用于測試轉(zhuǎn)化植物中遺傳構(gòu)建體存在的選擇標(biāo)記序列。適用于本發(fā)明構(gòu)建體的啟動子在單子葉或雙子葉植物的細(xì)胞、組織或器官中是功能性的，并且包括在大部分植物組織中為活性的細(xì)胞_、組織-和器官_特異性啟動子、細(xì)胞周期特異性啟動子、臨時性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組成型啟動子，以及重組啟動子。啟動子的選擇將取決于所克隆的多核苷酸的時間和空間表達(dá)，因此按照需要選擇。啟動子可以是通常與目標(biāo)轉(zhuǎn)基因相關(guān)的那些，或源自其他植物、病毒以及植物致病細(xì)菌和真菌的基因的啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要獨特的實驗，使用包含本發(fā)明的多核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，就能夠選擇適用于修飾和調(diào)節(jié)植物性狀的啟動子。組成型植物啟動子的實例包括CaMV 35S啟動子、胭脂堿合成酶啟動子和真蛸堿合成酶啟動子，以及來自玉米的Ubi 1啟動子。 在特定組織中活性的應(yīng)答內(nèi)部發(fā)育信號或外部非生物或生物應(yīng)激的植物啟動子在科學(xué)文獻(xiàn)中有描述。示例性啟動子描述于，例如，W002/00894，在此將其引入作為參考。植物轉(zhuǎn)化遺傳構(gòu)建體中常用的示例性終止子包括，例如，花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S終止子、根癌土壤桿菌胭脂堿合成酶或真蛸堿合成酶終止子、玉米zin基因終止子、水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子和馬鈴薯PI-II終止子。植物轉(zhuǎn)化中通常所用的選擇標(biāo)記包括給予了卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II基因(NPT II)、給予了壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因、用于Ignite(AgrEvo)和 Basta(Hoechst)抗性的草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar基因)和用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)。還考慮了使用包含報告基因(表達(dá)宿主外源的活性的編碼序列，通常是酶活性和 /或可見的信號(例如，熒光素酶、GUS、GFP))的遺傳構(gòu)建體，報告基因可以用于植物和植物組織中的啟動子表達(dá)分析。報告基因文獻(xiàn)綜述于Herrera-Estrella等，1993, Nature 303， 209，禾口 Schrott，1995，見Gene Transferto Plants (植物的基因轉(zhuǎn)移)，(Potrykus, Τ., Spangenbert.編輯)Springer Verlag. Berline，pp. 325—336?；虺聊呗钥梢跃劢褂诨蜃陨砘蛴绊懰幋a多肽表達(dá)的調(diào)控元件?！罢{(diào)控元件”在此以最寬的可能意思來使用，并且包括與目標(biāo)基因相互作用的其他基因。設(shè)計來降低或沉默本發(fā)明的多核苷酸/多肽表達(dá)的遺傳構(gòu)建體可以包括本發(fā)明多核苷酸的反義拷貝。在這樣的構(gòu)建體中，將多肽置于相對于啟動子和終止子的反義方向。通過顛倒多核苷酸或多核苷酸的片段獲得“反義”多核苷酸，使得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將與基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補，例如5’ GATCTA 3，(編碼鏈) 3’ CTAGAT 5，(反義鏈)3，CUAGAU 5，mRNA5，GAUCUCG 3，反義 RNA為基因沉默設(shè)計的遺傳構(gòu)建體還可以包括反向重復(fù)。“反向重復(fù)”是其中重復(fù)的后半部分在互補鏈中的重復(fù)序列，例如5，GATCTA.........TAGATC-3，3，CTAGAT.........ATCTAG-5，所形成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以經(jīng)歷互補堿基配對，以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。通常，需要重復(fù)區(qū)域之間的至少3-5bp的間隔物，使得可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。另一種沉默方法涉及使用靶向miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等價物的小反義RNA(Llave等， 2002, Science 297,2053).特別考慮了對應(yīng)于本發(fā)明多核苷酸的小反義RNA的使用。如在此所用的術(shù)語遺傳構(gòu)建體還包括小反義RNA和其他這樣的用于實現(xiàn)基因沉默的多核苷酸。如在此限定的，用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化也可以導(dǎo)致基因沉默，通過稱為正義抑制的方法(例如，Napoli 等，1990，Plant Cell 2,279 ；de Carvalho Niebel 等，1995，Plant Cell, 7,347)。在一些情況中，正義抑制可能涉及完整或部分編碼序列的過表達(dá)，但也可能涉及基因非編碼區(qū)的表達(dá)，如內(nèi)含子，或5’或3’未翻譯區(qū)(UTR)。嵌合部分正義構(gòu)建體可以用于配合地沉默多個基因(Abbott 等，2002，Plant Physiol. 128(3) :844_53 Jones 等，1998， Planta 204:499-505)。還考慮了使用這樣的正義抑制策略來沉默本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)。設(shè)計用于基因沉默的遺傳構(gòu)建體中的多核苷酸插入片段可以對應(yīng)于編碼序列和/ 或非編碼序列，如啟動子和/或內(nèi)含子和/或5’或3’ UTR序列，或相應(yīng)的基因。其他基因沉默策略包括顯性否定方法和使用核酶構(gòu)建體(MCIntyre，1996， Transgenic Res,5,257)。
轉(zhuǎn)錄前沉默可以通過基因自身或其調(diào)控元件的突變帶來。這樣的突變可以包括點突變、移碼、插入、刪除和置換。以下是公開了可以用于遺傳轉(zhuǎn)化以下植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化實驗方案的代表性出版物水稻(Alam 等，1999，Plant Cell Rep. 18，572)；玉米(US 專利系列 Nos. 5，177，010 和 5，981，840)；小麥(Ortiz 等，1996，Plant Cell Rep. 15,1996,877)；西紅柿(US 專利系歹Ij No. 5，159，135)；馬鈴薯(Kumar 等，1996 Plant J. 9，821)；木薯(Li 等，1996 Nat. Biotechnology 14，736)；生菜(Michelmore 等，1987，Plant Cell Rep. 6,439)；煙草 (Horsch 等，1985，Science 227，1229)；棉花(US 專利系列 Nos. 5，846，797 和 5，004，863)； 干草(US 專利 Nos. 5，187，073 和 6，020，539)；胡椒薄荷(Niu 等，1998，Plant Cell Rep. 17, 165)；柑桔類植物(Pena 等，1995，Plant Sci. 104，183)；香菜(Krens 等，1997，Plant Cell Rep, 17，39)；香蕉(US 專利系列 No. 5，792，935)；大豆(US 專利 Nos. 5，416，011 ；5，569，834 ； 5，824，877 ；5，563，04455 和 5，968，830)；菠蘿(US 專利系列 No. 5，952，543)；白楊(US 專利 No. 4，795，855)，一般的單子葉植物(US 專利 Nos. 5，591，616 和 6，037，522)；蕓苔(US Patent Nos. 5，188，958 ；5，463，174 和 5，750，871)；和谷物(US 專利 No. 6，074，877)?？紤]了其他物種，并且在科學(xué)文獻(xiàn)中可以獲得合適的方法和實驗方案，由本領(lǐng)域技術(shù)人員來使用。本領(lǐng)域中已知的幾種其他方法可以用來改變本發(fā)明的核苷酸和/或多肽的表達(dá)。 這樣的方法包括但不限于Tilling(Till等，2003，Methods Mol Biol，2 %，205)，所謂的 “Deletagene” 技術(shù)(Li 等，2001，Plant Journal 27 (3)，235)和使用人工轉(zhuǎn)錄因子，如合成的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。(例如，Jouvenot等，2003，Gene Therapy 10, 513) 此外，靶向特定多肽的抗體或其片段也可以在植物中表達(dá)，以調(diào)節(jié)該多肽的活性(Jobling等，2003，Nat. Biotechnol.，21 (1)，35)。還可以使用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記方法。此外，可以通過如噬菌體展示(Dyax Corporation)這樣的技術(shù)來鑒定與本發(fā)明的多肽相互作用的肽。這種相互作用的肽可以在植物中表達(dá)或施加于植物，以影響本發(fā)明多肽的活性。特意考慮了在本發(fā)明的核苷酸和 /或多肽表達(dá)的改變中使用上述的每一種方法。用于選擇植物的方法還提供了用于選擇種子產(chǎn)量改變的植物的方法。這樣的方法包括測試植物中本發(fā)明的多核苷酸或多肽表達(dá)的改變。在改變的種子產(chǎn)量不一定可見時，可以在幼苗或早期發(fā)育階段使用這些方法，以加速針對提高種子產(chǎn)量的育種計劃。多核苷酸(如信使RNA)的表達(dá)常常用做相應(yīng)多肽表達(dá)的指示。測量多核苷酸表達(dá)的示例性方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和點印跡分析(Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 2 版，Cold Spring Harbor Press, 1987) 0因此，將本發(fā)明的多核苷酸或多核苷酸的一部分用作探針或引物，如在此限定的，用于鑒定花青素水平改變的植物的方法中。本發(fā)明的多肽可以用作雜交實驗中的探針，或作為基于PCR實驗中的引物，進(jìn)行設(shè)計以鑒定這樣的植物?；蛘撸梢詫贡景l(fā)明的多肽來產(chǎn)生抗體。用于產(chǎn)生和使用抗體的方法是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的(參見，例如Antibodies, A Laboratory Manual (抗體，實驗室手冊)，Harlow A Lane編輯，Cold Spring Harbour Laboratory，1998。這樣的抗體可以用于檢測調(diào)節(jié)植物中花大小的多肽的表達(dá)改變的方法中。這些方法包括ELISA(Kemeny，1991,A PracticalGuide to ELISA, NY Pergamon Press)禾口 Western 印跡(Towbin & Gordon, 1994, J Immunol Methods,72,313)。這些用于分析多核苷酸或多肽表達(dá)和選擇具有表達(dá)改變的植物的方法可用于設(shè)計產(chǎn)生具有改變的種子產(chǎn)量的栽培品種的常規(guī)育種計劃中。植物可以種植本發(fā)明的植物并自交或與不同的植株雜交，并可以鑒定出具有所需表型特征的所得到的雜交體。種植兩代或更多代，以確保目標(biāo)表型特征得到穩(wěn)定維持和遺傳。從這些標(biāo)準(zhǔn)育種方法獲得的植物也形成本發(fā)明的一部分。還可以寬泛地說本發(fā)明單獨地或集合地存在于本申請說明書中涉及或所示的部分、要素和特征，以及存在于任兩個或多個所說部分、要素或特征的任何或全部組合，并且在此提及了特定的整體，其具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知的等價體，認(rèn)為在此結(jié)合這些已知的等價體，如同將其單獨列出一樣。


參照附圖將更好地理解本發(fā)明，其中圖1顯示了兩個載體(Dorf 88和Corf 88)的圖譜，用于植物轉(zhuǎn)化，其包含 0RF88(SEQ ID NO 29)。圖2顯示了本發(fā)明的0RF88多肽(SEQ ID NO :1)和來自幾個物種的0RF88 SEQ ID NO 1 的變體的序列的比對(BAA76734. 1 = SEQ ID NO 25 ；ERF3. ARATH = SEQ ID NO 27 ；
AAV85852. 1 =SEQ IDNO20 ；ΧΡ_464403· 1 ==SEQID NO 19 ；BAD45632. 1 =SEQIDNO26 ；XP473848.1=SEQIDNO11 ； ΧΡ_475484.1 = SEQ ID NO 2 ；ΝΡ915797 =SEQIDNO3 ；AAD09248. 1=SEQIDNO4 ；AAD00708. 1 ==SEQID NO 6 ；AAQ96341. 1 =SEQIDNO8 ；AAV66332. 1= SEQ ID IMO 10 ；ΑΑΡ32202. 1=SEQID NO 16 ；ΑΑ034705. 1 =SEQIDNO17 ；AAQ96342.1=SEQIDNO5 ；AAV51938. 1=SEQID NO 22 ；AAQ55276. 1 =SEQIDNO9 ；AAC49771. 1=SEQIDNO 14 ；AF499716. 1=SEQID NO7 ；BAC42202. 1 =SEQIDNO15 ；BAA97123.1= SEQIDNO12 ；ΒΑΑ07322. 1= SEQID NO 13 ；MR84424. 1 =SEQIDNO21 ； AAV43790.1= SEQIDNO18 ；ΧΡ466509. 1= SEQID NO 23 ；ΧΡ475482. 1 =SEQIDNO
24)并說明了由申請人鑒定的一致性基序(SEQ ID NO 28)存在于所有這些序列中。圖3顯示了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ章沱湶?I93WT)和不同的獨立轉(zhuǎn)基因裸麥草事件的實施；通過灌溉(直至8月5號)、干旱應(yīng)激(8月5號至9月16日)和采收(9月16日至9 月23日)方案下的生物量產(chǎn)生(作為干重g測量)證明的7AR6(0RF88-6)、7AR7 (0RF88-7)、 7AR9 (0RF88-9)和7AR16 (0RF88-16)。* = 5%水平的顯著性(LSD)；用于處理效果的F測試也是顯著的。圖4顯示了通過一周灌溉間斷的兩次六周干旱應(yīng)激的灌溉方案后植物的狀況。與最佳實施的轉(zhuǎn)基因事件0RF88-9(7AR9)(灰色箭頭)相比較，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?黑色箭頭)受損。
具體實施例方式現(xiàn)在將參照以下非限制性實施例來說明本發(fā)明。
實施例1 調(diào)節(jié)對環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多核苷酸的鑒定簡價多年生裸麥草(Lolium perenne L.)是來自禾本科和Festucaceae族的冷溫牧場植物。為了產(chǎn)生裸麥草中相對基因表達(dá)模式的剖析圖，從獲自秋天、夏天、春天和冬天期間放牧前和放牧后植物的環(huán)境溫度生長、寒冷生長、水合、脫水和再水合或脫水的樣品中提取RNA，并用于構(gòu)建SAGE(基因表達(dá)的系列分析)(Velculescu等，1995，Science 270 484-487)文庫。材料和方法在該研究中，全部使用了多年生裸麥草(Lolium perenne L. ) cv. Bronsyn。在每個季節(jié)的高峰期間，在Dexcel，Hamilton，新西蘭，從活動的小牧場收集田野生長的樣品。從放牧前(放牧后15天)和放牧后(放牧后1天)的裸麥草草地收集草的樣品。從3-6個隨機選擇的地點采收一叢草的樣品，并在用液氮急凍后存儲在干冰中。在春季，還采收了未成熟的草穗和初花(floral initials)。對于應(yīng)激處理，對實驗室生長的裸麥草使用了以下條件成熟實驗室生長多年生裸麥草，在85% RH, 200C /18°C和16h/8h白天/黑夜時段下，在生長室中生長了 15個月；水合對照，在85% RH，20°C/18°C和16h/8h白天/黑夜時段下，生長55天；在70% RH, 220C /16°C和16h/8h白天/黑夜時段下，生長6天，在整個生命周期中保持秧苗的噴淋；脫水樣品，僅在85% RH, 200C /18°C和16h/8h白天/黑夜時段下，噴淋55天；在70% RH, 280C /20°C和16h/8h白天/黑夜時段下，生長3天；在50% RH, 280C /20°C和16h/8h白天/黑夜時段下，生長3天；再水合樣品來自噴淋了 24小時并且在 70% RH, 220C /16°C和16h/8h白天/黑夜時段下生長的脫水植物；將寒冷應(yīng)激植物在85% RH, 200C /18°C和 16h/8h 白天 / 黑夜時段下，生長 55 天；在 70% RH, 22°C /16°C和 16h/8h 白天/黑夜時段下，生長7天；在70% RH, 60C /TC和16h/8h白天/黑夜時段下，生長7天， 在整個生命周期中，秧苗保持噴淋。SAGE文庫的構(gòu)建使用TRIZOL 試劑(Invitrogen，CA, USA)和制造商所述的實驗方案，從液氮中研磨的組織提取RNA。對于每個SAGE文庫，使用了 100μ g的總RNA，并使用I-SAGE 或I-SAGE Long試劑盒(Irwitr0gen，CA，USA)，根據(jù)制造商的實驗方案，形成了文庫。從每個文庫，將 960-1，920個克隆進(jìn)行了測序(Australian Genome Research Facility，Brisbane，澳大利亞)并使用SAGE2000軟件提取標(biāo)記物。SAGE生物信息設(shè)計相關(guān)數(shù)據(jù)庫來掌握SAGE實驗的標(biāo)記物、文庫和表達(dá)數(shù)。相對整個裸麥草非重疊Gene thresher和EST組來搜尋每個標(biāo)記物序列(包括酶序列)。在兩個方向進(jìn)行了搜尋，并且只使用精確的匹配。使用General Feature Format (GFF)方法(http //www3. ebi. ac. uk/Services/ffebFeat)將結(jié)果裝載于相關(guān)數(shù)據(jù)庫中。使用相對于以下公開的和適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫中的一些或全部的同源性搜尋來注釋所有裸麥草Gene thresher和EST序列AGI TIGR Gene Indices，擬南芥，2004 年 1 月，發(fā)布 11OGI TIGR Gene Indices，水稻，2004 年 1 月，發(fā)布 14-1GENESEQN Derwent 專利 DNA 序列，2002 年 12 月 7 日
GENESEQP Derwent專利氨基酸序列，2002年12月7日Os_unigene 水稻 Unigene 獨特序列，2004 年 3 月 18 日est_others其他EST序列(哺乳動物，真菌，原核生物)，2003年3月11日estjlant GenBank+EMBL+DDBJ EST分類的非冗余數(shù)據(jù)庫的Viridiplantae子集， 2004年3月15日nr 所有非冗余 GenBank CDS 翻譯 +PDB+SwissProt+PIR 2003 年 3 月 11 日nr_plant 所有非冗余 GenBank CDS 翻譯 +PDB+SwissProt+PIR 的 BT 子集的 HS 子集的植物子集，2003年8月8日nt 所有非冗余 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 序列(但沒有 EST、STS、GSS 或 HTGS 序列)，2003年3月11日nt_monocots所有非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列的單子葉植物子集(但沒有 EST、STS、GSS 或 HTGS 序列)，2003 年 3 月 11 日swissprot SWISS-PR0T蛋白序列數(shù)據(jù)庫的最后的主要公布(沒有更新)2003年3 月28日使用低于E-05的E值的截留，并且在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中存儲最大10個目標(biāo)/數(shù)據(jù)庫。標(biāo)記物注釋通過形成所涉及序列的所有注釋的概述來注釋具有裸麥草組擊中的標(biāo)記物。使用計算注釋中每個單詞的出現(xiàn)頻率并基于出現(xiàn)報數(shù)以降序排列的算法來產(chǎn)生概述。將概述限于10個單詞，并且使用無效單詞列表來過濾掉無關(guān)緊要的信息。將所得到的概述行用作標(biāo)記物很可能是什么的表示。展示了實際數(shù)量；給予其他可以用于評價概述中每個單詞重要性的信息。這種使用關(guān)鍵詞計數(shù)的自動化注釋方法與ProDom數(shù)據(jù)庫用來注釋自動生成的蛋白結(jié)構(gòu)域家族的自動化評論(http://protein, toulouse. inra. fr/prodom/current/ html/home/php)相似。觀察標(biāo)記物數(shù)據(jù)時，顯示了基于所涉及序列的最高擊中的詳細(xì)注釋。在以上分析中鑒定了特別感興趣的多核苷酸序列。這是0RF88(對應(yīng)于SEQ ID N0 29)。0RF88顯示出編碼乙烯應(yīng)答性元件結(jié)合因子樣蛋白(SEQ ID NO :1)。對于該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，已經(jīng)記錄了正義和反義SAGE標(biāo)記物。對于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反義SAGE標(biāo)記物在脫水組織中累積，而正義SAGE標(biāo)記物在秋天放牧前的組織、冬天的根和春天的組織中累積。表1中顯示了兩個SAGE標(biāo)記物的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特征。表權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述遺傳構(gòu)建體包括a)編碼具有SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽或多肽變體的多核苷酸，其中變體能夠提高對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性；b)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；或c)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中環(huán)境應(yīng)激是干旱。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中變體與具有SEQID NO :1氨基酸序列的多肽具有至少50%的序列同一性。
4.如權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中變體包含氨基酸序列SEQID N0:28。
5.如權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中變體包含選自SEQID NO ,2-21任一個的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中a)的多核苷酸編碼具有SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽。
7.—種生產(chǎn)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，所述遺傳構(gòu)建體包括a)包含核苷酸序列SEQID NO :29的多核苷酸，或其變體，其中變體編碼能夠提高對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽；b)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；或c)包含a)的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中環(huán)境應(yīng)激是干旱。
9.如權(quán)利要求7或8的方法，其中變體包含與SEQID NO 29具有至少70%同一性的序列。
10.如權(quán)利要求7至9任一項的方法，其中變體包含SEQID NO :30至55任一個的序列。
11.如權(quán)利要求7的方法，其中a)的多核苷酸包含SEQID NO 29的序列。
12.通過權(quán)利要求1至11任一項的方法產(chǎn)生的植物。
13.一種分離的多核苷酸，其與編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :1的多肽的核苷酸序列具有至少70%的序列同一性，其中多核苷酸編碼能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。
14.如權(quán)利要求13的分離多核苷酸，其中環(huán)境應(yīng)激是干旱。
15.如權(quán)利要求13或14的分離多核苷酸，包含來自SEQID NO 29的序列。
16.如權(quán)利要求13或14的分離多核苷酸，包含SEQID NO 29的全長編碼序列。
17.一種分離的多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :1的多肽。
18.如權(quán)利要求17的分離多核苷酸，包含SEQID N0:29的序列。
19.如權(quán)利要求17或18的分離多核苷酸，包含SEQID NO 29的全長編碼序列。
20.一種分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :29的序列或其變體，其中變體來自裸麥草或羊茅草，并且編碼能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。
21.如權(quán)利要求20的分離多核苷酸，其中環(huán)境應(yīng)激是干旱。
22.如權(quán)利要求20的分離多核苷酸，包含SEQID NO 29的序列。
23.一種分離的多肽，與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少72%的序列同一性，其中多肽能夠調(diào)節(jié)植物對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。
24.如權(quán)利要求23的分離多肽，其包含SEQID NO=I的氨基酸序列。
25.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求23或24的 多肽。
26.一種分離的多核苷酸，其包含a)包含權(quán)利要求13至22和25任一項的多核苷酸的至少15個核苷酸長的片段的多核苷酸；b)包含權(quán)利要求13至22和25任一項的多核苷酸的至少15個核苷酸長的互補體的多核苷酸；c)包含能夠與權(quán)利要求13至22和25任一項的多核苷酸雜交的至少15個核苷酸長的序列的多核苷酸。
27.一種遺傳構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求13至22，25和26任一項的多核苷酸。
28.一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求13至22、25和26任一項的多核苷酸。
29.一種宿主細(xì)胞，其在遺傳上修飾來表達(dá)權(quán)利要求13至22、25和26任一項的多核苷酸或權(quán)利要求23或24的多肽。
30.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求27的遺傳構(gòu)建體或權(quán)利要求28的表達(dá)構(gòu)建體。
31.一種植物細(xì)胞，其在遺傳上修飾來表達(dá)權(quán)利要求13至22、25和26任一項的多核苷酸或權(quán)利要求23或24的多肽。
32.—種植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求27的遺傳構(gòu)建體或權(quán)利要求28的表達(dá)構(gòu)建體。
33.一種包含本發(fā)明植物細(xì)胞的植物。
34.一種用于選擇對至少一種選自干旱、寒冷冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激相對于合適的對照植物具有提高的耐受性的植物的方法，該方法包括測試植物對權(quán)利要求13至22，25和 26任一項的多核苷酸或權(quán)利要求23或24的多肽表達(dá)的改變。
35.一組通過權(quán)利要求34的方法選擇的植物。
36.一種對抗權(quán)利要求23或24的多肽產(chǎn)生的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生或選擇對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽度的環(huán)境應(yīng)激具有提高的耐受性的植物的方法、多核苷酸和多肽。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多核苷酸的構(gòu)建體、細(xì)胞、植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法選擇的植物組。
文檔編號C07K14/415GK102271496SQ200980154200
公開日2011年12月7日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日
發(fā)明者C·J·史密斯-埃斯皮諾哥, C·J·布萊恩特, J·R·菲利普斯, K·M·埃爾堡哥, S·布提戈 申請人:維亞拉克什亞生物科學(xué)(新西蘭)有限公司