專利名稱：調(diào)節(jié)禽類性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)禽類性別的核酸和方法。具體而言，本發(fā)明涉及dsRNA分子、 特別是siRNA的卵內(nèi)(in ovo)輸送，以增加雌性鳥(niǎo)類的產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
從開(kāi)始馴養(yǎng)動(dòng)物時(shí)起，人們已經(jīng)通過(guò)經(jīng)許多世代選擇種畜(seed stock)而對(duì)家畜的表型特征進(jìn)行修飾。這已經(jīng)導(dǎo)致定量生產(chǎn)參數(shù)如機(jī)體大小和肌肉量的改善。近來(lái)的用于修飾家禽生產(chǎn)性狀和/或提高對(duì)病原體抗性的革新集中于轉(zhuǎn)基因的方法，然而，許多消費(fèi)者對(duì)經(jīng)遺傳修飾的生物體會(huì)有擔(dān)心。雞生產(chǎn)者已在探尋有效且經(jīng)濟(jì)的方法以確定初生(day old)小雞的性別。許多生產(chǎn)者已經(jīng)使用肛門(mén)辨性(vent sexing)和羽毛辨性(feather sexing)，但是發(fā)現(xiàn)這些方法由于在分開(kāi)雄性與雌性小雞時(shí)需要大量的時(shí)間及人工成本因而在經(jīng)濟(jì)學(xué)有實(shí)質(zhì)性的不利之處。探針的使用(US 5，508，165)也是昂貴的方法且在經(jīng)濟(jì)上不實(shí)用。小雞肛門(mén)區(qū)域的光測(cè)知(light sensing) (US 4，417，663)是確定小雞性別的另一方式，但是其也是昂貴且耗時(shí)的，因?yàn)楸仨殞?duì)每只小雞進(jìn)行處理和操作。已經(jīng)用到可以對(duì)小雞進(jìn)行羽毛辨性的專家， 但是這些專家成本很高且羽毛辨別也很耗時(shí)。需要用于修飾禽類性別而不導(dǎo)致鳥(niǎo)類基因組轉(zhuǎn)化、但卻可以進(jìn)行高通量處理的核酸和方法。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)鑒別了核酸分子、特別是dsRNA分子，其可用于在卵內(nèi)修飾禽類的性別。因此，在一方面，本發(fā)明提供了包含雙鏈區(qū)的分離的和/或外源核酸分子，其在施用于禽卵時(shí)降低至少一種RNA分子和/或蛋白的水平，其中如果卵的胚胎是雄性，則其性別在施用所述分離的和/或外源核酸分子之后被改變?yōu)榇菩?，并且其中所述分離的和/或外源核酸分子不包含選自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQ ID NO :254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO :369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO :474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQ ID NO :530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQ ID NO :605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQ ID NO :747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQ ID NO :3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO :3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQ ID NO :3434)或其中任意一個(gè)的變體。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的和/或外源核酸分子，其包含SEQ ID NO 11-3431所提供的一或多個(gè)核苷酸序列或者其中任意的一個(gè)或多個(gè)的變體，其中所述分離的和/或外源核酸分子不包含選自如下的序列
CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQ ID NO :254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO :369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO :474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQ ID NO :530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQ ID NO :605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQ ID NO :747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQ ID NO :3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO :3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQ ID NO :3434)或其中任意一個(gè)的變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是dsRNA。更優(yōu)選地，所述dsRNA是siRNA或者 shRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子降低禽卵中DMRTl基因、ASW基因或者 r-spondin基因所編碼的蛋白的水平。在上述兩方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸不包含所述RNA分子或者編碼其的 cDNA的全長(zhǎng)開(kāi)放讀框。在相關(guān)的實(shí)施方案中，優(yōu)選所述核酸不包含SEQ ID NO :2、4或6所提供的核苷酸序列、或者SEQ ID NO :2、4或6所提供的核苷酸序列其中每個(gè)T (胸腺嘧啶) 均被U (尿嘧啶)替換。正如技術(shù)人員的讀者會(huì)意識(shí)到的，因?yàn)樗龊怂崾请p鏈的，因此其也將包含本文提供的相關(guān)核苷酸序列的相應(yīng)反向互補(bǔ)體。還提供了編碼本發(fā)明的核酸分子或者其單鏈的載體。這種載體可用于宿主細(xì)胞或者無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，以產(chǎn)生可用于本發(fā)明方法的核酸分子。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的外源核酸分子或者其單鏈、和/或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子或者其單鏈、本發(fā)明的載體、和 /或本發(fā)明的宿主細(xì)胞的組合物。再一方面，本發(fā)明提供了修飾禽類性別的方法，所述方法包括向禽卵施用至少一種本發(fā)明的核酸分子。優(yōu)選地，所述核酸被施用于所述卵的非細(xì)胞部位。更優(yōu)選地，所述非細(xì)胞部位是氣囊、卵黃囊、羊膜腔或者絨膜尿囊液。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述卵不是電穿孔的。優(yōu)選地，所述核酸不是通過(guò)施用編碼該核酸分子的載體而輸送的。優(yōu)選地，所施用的核酸分子是dsRNA。優(yōu)選地，所述核酸分子是通過(guò)注射施用的。所述核酸可方便地在本發(fā)明的組合物中施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法將所述卵的胚胎的性別從雄性修飾為雌性。所述禽類可以是鳥(niǎo)綱(Aves)的任何種。實(shí)例包括但不限于雞、鴨、火雞、鵝、矮腳雞(bamtam)和鵪鶉。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述禽類是雞。再一方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明方法所產(chǎn)生的禽類。另一方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明方法所產(chǎn)生的雞。
再一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子或其單鏈、本發(fā)明的載體、和/或本發(fā)明宿主細(xì)胞的禽類卵。另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含本發(fā)明的核酸分子或其單鏈、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、和/或本發(fā)明的組合物。顯然，本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特性可用于本發(fā)明的許多其它方面。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，詞語(yǔ)“包含”或其變體如“含有”或“包括”應(yīng)理解為是指包含所述的元件(整體或步驟)、或者元件組(整體或步驟)，但是不排除任何其它元件(整體或步驟)、或者元件組(整體或步驟)。本發(fā)明在后文通過(guò)如下非限制性實(shí)施例及參考附圖來(lái)進(jìn)行描述。附圖簡(jiǎn)述

圖1-選擇的shRNA用于EGFP-Dmrtl基因融合表達(dá)的敲低(knockdown)。每個(gè)轉(zhuǎn)染條件的平均熒光強(qiáng)度相對(duì)于PEGFP-Dmrtl而表示。誤差棒表示對(duì)一式三份進(jìn)行的每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)所計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2-在沉默后對(duì)DMRTl基因表達(dá)的qPCR分析。序列表解讀SEQIDNO ；:1-部分雞DMRTl蛋白質(zhì)序列(Genbank AF123456)
SEQIDNO ；:2-編碼雞DMRTl (Genbank AF123456)的部分核苷酸序列。
SEQIDNO ；:3-雞 WPKCI(ASff)(Genbank AF148455)。
SEQIDNO ；:4-編碼雞 WPKCI (ASW) (Genbank AF148455)的核苷酸序列。
SEQIDNO ；:5-雞 r-spondin(Genbank XM_417760)。
SEQIDNO ；:6-編碼雞 r-spondin (Genbank XM_417760)的核酸序列。
SEQIDNO ；:7-雞TO-I啟動(dòng)子的核苷酉I序列。
SEQIDNO ；:8-雞TO-3啟動(dòng)子的核苷酉I序列。
SEQIDNO ；:9-雞TO-4啟動(dòng)子的核苷酉I序列。
SEQIDNO ；:10-雞7SK啟動(dòng)子的核苷酉I序列。
SEQIDNO11-3430-表1-3中所提供的RNA序列，用于使得雞DMRTl
r-spondin基因沉默。SEQ ID NO :3431-3434-適用于使雞DMRTl基因沉默的RNA序列。SEQ ID NO :3435-3485-雞 DMRTl 的靴區(qū)域。SEQ ID NO :；3486-3499_寡核苷酸引物和探針。發(fā)明詳述一般技術(shù)和定義除非另外特別定義，則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均應(yīng)被理解為具有本領(lǐng)域 (例如在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、禽類生物學(xué)、RNA干擾、以及生物化學(xué)領(lǐng)域中)技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外指出，則本發(fā)明中所使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)均是標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。此類技術(shù)的解釋和說(shuō)明遍及于文獻(xiàn)中，如下列來(lái)源的文獻(xiàn) J. Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) ； J.Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press (1989) ；Τ.Α.Brown (editor)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991) ；D. Μ. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning :A Practical Approach，Volumes 1-4,IRL Press(1995 禾口 1996)；以及 F. Μ. Ausubel et al. (editors)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988，包括直至目前的所有更新)，Ed Harlow and David Lane (editors)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“禽類”是指分類學(xué)的鳥(niǎo)綱中的任何種、亞種或品種(race)的生物體，此類生物體例如但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞、鸚鵡、雀、鷹、鴉以及平胸類鳥(niǎo)包括鴕鳥(niǎo)、鴯鹋和鶴鴕(cassowary)。該術(shù)語(yǔ)包括各種已知品系的feillus gallus(雞)，例如白色來(lái)航雞(White Leghorn)、棕色來(lái)航雞(Brown Leghorn)、蘆花巖雞(Barred-Rock)、 蘇塞克斯雞(Sussex)、新罕布什爾雞(New Hampshire)、羅得島雞(Iihode Island)、澳洲黑雞(Australorp)、康沃爾雞(Cornish)、米諾卡雞(Minorca)、Amrox、加利福尼亞灰雞 (California Gray)、意大利鷓鴣斑雞(Italian Partidge-coloured)，以及火雞、野雞、鵪鶉、鴨、鴕鳥(niǎo)及通常產(chǎn)業(yè)化規(guī)模飼養(yǎng)的其它家禽的品系。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“卵，，是指已由鳥(niǎo)類生所產(chǎn)出的受精卵。通常，禽類卵由硬的橢圓形外層卵殼、“卵白”或者白蛋白、卵黃、及不同的薄膜所組成。此外，“in ovo”是指在卵內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非細(xì)胞部位”是指所述卵除了胚胎之外的部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“降低”或其變體是指，當(dāng)與未施用本文所述核酸的相同種的禽類的卵相比、優(yōu)選與相同品系或品種禽類的卵相比、以及更優(yōu)選與同一只鳥(niǎo)類的卵相比時(shí)， 所述卵中的靶RNA和/或靶蛋白的量可測(cè)量的降低。該術(shù)語(yǔ)還指靶蛋白質(zhì)活性可測(cè)量的降低。優(yōu)選地，靶RNA和/或靶蛋白水平降低至少約10%。更優(yōu)選地，所述降低為至少約 20%、30%、40%、50%、60%、80%、90%，及更優(yōu)選約 100%。如本文所用，短語(yǔ)“核酸分子導(dǎo)致降低”或其變體是指在卵中所述核酸分子的存在誘導(dǎo)所述卵中同源RNA降解，這是通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法如“RNA干擾”或者“基因沉默”來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外，所述核酸分子直接導(dǎo)致所述降低，而不是在卵內(nèi)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生希望的作用。所述“至少一種RNA分子”可以是存在于禽類卵中或者由其產(chǎn)生的任何類型的 RNA。實(shí)例包括但不限于 mRNA、snRNA、microRNA 和 tRNA。本發(fā)明核酸分子的“變體”包括這樣的分子，其由于和/或具有一或多個(gè)不同核苷酸而有不同的大小、但仍可用于使靶序列沉默。例如，變體可包含額外的核苷酸(如1、2、3、 4或更多個(gè))、或更少的核苷酸。此外，少量核苷酸可以被取代而不影響該核酸使靶基因沉默的能力。在實(shí)施方案中，所述變體包括額外的5’和/或3’核苷酸，其與相應(yīng)的靶RNA分子同源、和/或其增強(qiáng)該核酸分子的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，所述核酸分子與本文提供的序列相比具有不超過(guò)4個(gè)、優(yōu)選不超過(guò)3個(gè)、更優(yōu)選不超過(guò)2個(gè)以及更優(yōu)選不超過(guò)1個(gè)核苷酸的差異。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸分子與本文提供的序列相比具有不超過(guò)2個(gè)、 更優(yōu)選不超過(guò)1個(gè)在內(nèi)部添加的和/或缺失的核苷酸。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸在5’ 和/或3’端具有1個(gè)、優(yōu)選2個(gè)添加的非靶核苷酸，例如在3’端的額外的UU。這種添加可增加所述分子在卵內(nèi)的半衰期?！胺蛛x的核酸分子”是指與其天然狀態(tài)中關(guān)聯(lián)的或連接的核酸分子至少部分分離的核酸分子。優(yōu)選所述分離的核酸分子至少60%、優(yōu)選至少75%、最優(yōu)選至少90%沒(méi)有其天然所關(guān)聯(lián)的其它成分。此外，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”與“核酸”在本文可互換使用。以核酸分子為背景的術(shù)語(yǔ)“外源”是指，當(dāng)存在于細(xì)胞或者無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中時(shí)核酸分子以改變的量存在。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是天然不包含所述核酸分子的細(xì)胞。然而，所述細(xì)胞可以是包含外源核酸分子導(dǎo)致該核酸分子的量增加的細(xì)胞。本發(fā)明的外源核酸分子包括與其所存在的重組細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其它成分未分離的核酸分子，以及在這種細(xì)胞或者無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中所產(chǎn)生的并隨后從至少一些其它成分中純化的核酸分子。件別確定本發(fā)明涉及在卵內(nèi)調(diào)節(jié)禽類的性別?？杀话邢蛞哉{(diào)節(jié)禽類性別的基因的例子包括但不限于DMRTl基因、ASW (WPKCI)基因、R-spondin基因、R)x9基因和β-聯(lián)蛋白基因。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子降低由DMRTl基因所編碼的蛋白的水平。 DMRTl是涉及性別確定的第一種在生物門(mén)(phyla)之間顯示出序列保守性的分子。DMRTl 的禽類同系物在雞的Z (性)染色體上發(fā)現(xiàn)，并且在雄性和雌性胚胎的生殖嵴上差異表達(dá) (Raymond et al. ,1999 ；Smith et al.，1999)。DMRTl是迄今為止參與哺乳動(dòng)物性別確定且具有嚴(yán)格的性腺表達(dá)模式的幾個(gè)基因之一(Raymond et al.，1999)。可用于降低雞DMRTl蛋白及編碼其的mRNA水平的核酸分子的例子包括但不限于， 包含表1所提供的一或多個(gè)核苷酸序列(SEQ ID NO :11-1644)或者其中任意的一個(gè)或多個(gè)的變體的核酸，除了所述核酸分子不包含選自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQ ID NO :254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO :369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO :474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQ ID NO :530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQ ID NO :605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQ ID NO :747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQ ID NO :3432) (SEQ ID NO :493 的反向互補(bǔ)體)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO :3433) (SEQ ID NO :612 的反向互補(bǔ)體)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQ ID NO :3434) (SEQ ID NO :1520 的反向互補(bǔ)體)，或其中任意一個(gè)的變體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用于降低雞DMRTl蛋白水平的核酸分子包含選自如下的序列GAGCCAGUU ⑶ CAAGAAGA(SEQ ID NO :251)、GACUGCCAGUGCAAGAA ⑶(SEQ ID NO: 116)、CUGUAUCCUUACUAUAACA(SEQ ID NO :476)及 CUCCCAGCAACAUACAUGU(SEQ ID NO :602)、 或其中任意一個(gè)的變體。更優(yōu)選地，可用于降低雞DMRTl蛋白水平的核酸分子包含序列 GAGCCAGUU⑶CAAGAAGA(SEQ ID NO :251)或者其變體如 GAGCCAGUU⑶CAAGAAGAUU(SEQ ID NO 3431)?？杀话邢蛞孕揎椥詣e的基因另外的例子是WPKCI基因。禽類基因WPKCI已被顯示出在廣泛的禽類W染色體上保守，并且在性腺分化開(kāi)始前于雌性雞胚胎中活躍表達(dá)。據(jù)推測(cè)WPKCI可通過(guò)干擾H(CI功能或者通過(guò)在核中展現(xiàn)其獨(dú)特功能從而在雌性性腺分化中起作用(Hori et al.，2000)。此基因也被鑒別為ASW(禽類性別特異性W-關(guān)聯(lián))(0' Neill et al. ，2000)。
可用于降低雞ASW (WPKCI)蛋白及編碼其的mRNA的水平的核酸分子的例子包括但不限于，包含表2所提供的一或多個(gè)核苷酸序列(SEQ ID NO =1645-2209)或者其中任意一個(gè)或多個(gè)的變體的核酸?？杀话邢蛞孕揎椥詣e的基因的另一實(shí)例是r-spondin基因?？捎糜诮档碗u r-spondin蛋白及編碼其的mRNA水平的核酸分子的例子包括但不限于，包含表3所提供的一或多個(gè)序列(SEQ ID NO =2210-3430)或者其中任意一個(gè)或多個(gè)的變體的核酸?；虺聊g(shù)語(yǔ)“RNA干擾”、“RNAi”或者“基因沉默”通常是指其中雙鏈RNA分子降低核酸序列表達(dá)的過(guò)程，所述核酸序列與所述雙鏈RNA分子具有實(shí)質(zhì)的或者完全的同源性。然而，最近已經(jīng)顯示基因沉默可以通過(guò)使用非RNA雙鏈分子來(lái)實(shí)現(xiàn)(見(jiàn)例如US 20070004667)。RNA干擾(RNAi)對(duì)于特異性抑制特定RNA和/或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生特別有用。盡管并非希望理論來(lái)作限制，但是Waterhouse et al. (1998)提供了 dsRNA(雙鏈RNA)可用于降低蛋白質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)制模型。這種技術(shù)依賴于dsRNA分子的存在，其含有與感興趣的基因的mRNA或其部分基本相同的序列，在這種情況中為編碼感興趣的多肽的mRNA。所述dsRNA 可方便地在重組載體或者宿主細(xì)胞中由單一的啟動(dòng)子所產(chǎn)生，其中有義和反義序列側(cè)面有不相關(guān)的序列使得所述有義和反義序列雜交以形成dsRNA分子(具有形成環(huán)結(jié)構(gòu)的不相關(guān)的序列)。適用于本發(fā)明的dsRNA分子的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，具體參見(jiàn) Waterhouse et al. (1998)、Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050、WO 99/49029 和 WO 01/34815。本發(fā)明包括核酸分子，其包含和/或編碼雙鏈區(qū)用于基因沉默。所述核酸分子通常是RNA，但是也可包含DNA、化學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。表1 靶向編碼雞DMRTl的mRNA的dsRNA分子
權(quán)利要求
1 一種包含雙鏈區(qū)的分離的和/或外源的核酸分子，當(dāng)施用于禽類卵時(shí)其降低至少-種RNA分子和/或蛋白的水平，其中如果所述卵的胚胎是雄性的，則在施用所述分離的和/或外源的核酸分子之后其性別被轉(zhuǎn)變?yōu)榇菩裕⑶移渲兴龇蛛x的和/或外源的核酸分子不包含選自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQIDNO:254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQIDNO:369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQIDNO:474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQIDNO:530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQIDNO:605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQIDNO:747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG(SEQIDNO:3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQIDNO:3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQIDNO:3434)或其中任一的變體。
2. 一種分離的和/或外源的核酸分子，其包含SEQ ID NO :11-3431所提供的一或多個(gè)核苷酸序列或者其中任意一個(gè)或多個(gè)序列的變體，其中所述分離的和/或外源的核酸分子不包含選自如下的序列CCAGUU⑶CAAGAAGAGCA(SEQIDNO:254)GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQIDNO:369)CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQIDNO:474)GCCACUGA⑶CUUCCUCAA(SEQIDNO:530)CCAGCAACAUACAU⑶CAA(SEQIDNO:605)CCUGC⑶CACACAGAUACU(SEQIDNO:747)GGAGUA⑶UGUACAGGUUG (SEQIDNO:3432)GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQIDNO:3433)AUGGCG⑶UCUCCAUCCCU(SEQIDNO:3434)或其中任一的變體。
3.權(quán)利要求1或2的核酸分子，其是dsRNA分子。
4.權(quán)利要求3的核酸分子，其中所述dsRNA是siRNA或shRNA。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的核酸分子，其降低禽類卵中由DMRTl基因、ASW基因或者 R-spondin基因所編碼的蛋白質(zhì)的水平。
6.編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的核酸分子或者其單鏈的載體。
7.包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的外源核酸分子或者其單鏈、和/或權(quán)利要求6的載體的宿主細(xì)胞。
8.包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的核酸分子或者其單鏈、權(quán)利要求6的載體、和/或權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞的組合物。
9.一種修飾禽類性別的方法，所述方法包括向禽類卵施用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的至少一種核酸分子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述核酸被施用至所述卵的非細(xì)胞部位。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述非細(xì)胞部位是氣囊、卵黃囊、羊膜腔或者絨膜尿囊液。
12.權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的方法，其中所述卵未被電穿孔。
13.權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸不是通過(guò)施用編碼所述核酸分子的載體而輸送的。
14.權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)的方法，其中施用的核酸分子是dsRNA。
15.權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸分子通過(guò)注射施用。
16.權(quán)利要求9-16任一項(xiàng)的方法，其中所述禽類選自雞、鴨、火雞、鵝、矮腳雞和鵪鶉。
17.用權(quán)利要求9-16任一項(xiàng)的方法所產(chǎn)生的禽類。
18.用權(quán)利要求9-16任一項(xiàng)的方法所產(chǎn)生的雞。
19.包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的核酸分子或者其單鏈、權(quán)利要求6的載體、和/或權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞的禽類卵。
20.包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的核酸分子或者其單鏈、權(quán)利要求6的載體、權(quán)利要求7 的宿主細(xì)胞、和/或權(quán)利要求8的組合物的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)禽類性別的核酸及方法。具體而言，本發(fā)明涉及dsRNA分子、特別是siRNA的卵內(nèi)(in ovo)輸送，以增加雌性鳥(niǎo)類的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C07H21/02GK102356158SQ200980154743
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者A·H·辛克萊爾, C·史密斯, J·W·洛溫塔爾, R·J·莫爾, T·J·多蘭 申請(qǐng)人:澳大利亞家禽合作研究中心私人有限公司, 聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織