專利名稱：具有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的活性的肽及其用途的制作方法
具有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的活性的肽及其用途技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (Transforming growth factor-β =TGF-β)的活性的肽及其用途。背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (Transforming growth factor- β :TGF_ β )是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及增殖的聚肽集團(tuán)。作為該集團(tuán)的其他成員，則可舉苗勒(Mulleria)抑制物質(zhì) (Cate et al.，Cell, 45 :685-698 (1986))，抑制素類(inhibins) (Mason et al.，Nature, 318 :659-663(1985))及從果蠅(Drosophilla)的十五褶基因復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄物推測(cè)到的蛋白(Padgett et al.，Nature，325 :81-84 (1987))。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β )由各分子量是13000的2個(gè)類似的二硫鍵亞基組成(Assoian et al.，J. Biol. Chem.，258 7155-7160(1983) ；Frolik et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA,80 :3676-3680(1983)； Frolik et al. , J. Biol. Chem. ,260 10995-11000 (1984)) 這是從幾種組織，例如胎盤 (Frolik et al.，Nature, 325 :81-84 (1983))，血小板(Childs et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79 :5312-5316(1982)，Assioan et al.，J. Biol. Chem.，258 :7155-7160(1983))， 腎臟(Roberts et al.，Biochemistry, 22 :5692-5698 (1983))，及無(wú)機(jī)分減小的骨 (Seyedin et al.，Proc. Natl. Acad. ki. USA，82 :119-123 (1985))純化而來(lái)的。在 10 % 血清及表皮生長(zhǎng)因子的存在下，則TGF-β使正常的大鼠的腎臟成纖維細(xì)胞的錨著非依賴性(anchorage independent)生長(zhǎng)增強(qiáng)(Roberts et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 :5339-5343(1981) =Roberts et al. ， Nature，295 :417-419(1982) =Twardzik et al.， J. Cell. Biochem.，28 :289-297 (1985))，且只存在10 %血清時(shí)，可誘導(dǎo)AKR-2B成纖維細(xì)胞的集落形成(Tucker et al.，Cancer Res. ,43 :1518-1586 (1983))。TGF-β 另外呈現(xiàn)為，引發(fā)胚胎大鼠的肌肉間葉細(xì)胞的分化及軟骨特異巨大分子的生成(Seyedin et al. ,J.Biol. Chem.，261 :5693-5695(1986))。
與其對(duì)于細(xì)胞增殖的效果形成對(duì)照，不僅是從非洲綠猴細(xì)胞(BSC-I)分離的功能性關(guān)聯(lián)蛋白，還從人體血小板純化的TGF-β呈現(xiàn)為抑制培養(yǎng)中任何的細(xì)胞的生長(zhǎng)(Tucker et al. , Science, 226 =705-707 (1984)) TGF-β還另外呈現(xiàn)為，也抑制幾種人體癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Roberts et. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 :119-123 (1985))。TGF-β 這樣的抑制 /刺激效果，似乎依賴?yán)缂?xì)胞形態(tài)及細(xì)胞的生理狀態(tài)等的幾種因子(參考Spon et al., Science, 232 534 (1986))
分離了編碼人 TGF-β (Derynck et al.，Nature, 316 :701-705 (1985))，小鼠 TGF-β (Derynck et al. , J. Biol. Chem.，261 :4377-4379(1986))及猿猴 TGF-β (Sharpies et. al.，DNA，6 :239-244(1987))的基因的cDNA克隆。這樣的克隆的DNA序列分析結(jié)果，呈現(xiàn)為作為使生成TGF-β單體的大的前體聚肽而被合成。從上述的全部TGF-β源的TGF-β 前體蛋白之間發(fā)現(xiàn)了非常高的序列同一性。
最近，從無(wú)機(jī)分減小的牛骨分離出的任何蛋白被鑒定為與TGF-β關(guān)聯(lián)(Seyedinet al.，J. Biol. Chem.，262 1946-1949 (1987))。此蛋白另外也從豬的血小板(Cheifetz et al.，Cell, 48 :409-415 (1987))，人前列腺腺癌細(xì)胞系 PC-3 (Ikeda et al.，Biochemistry, 26 :2406-2410(1987))及人成膠質(zhì)細(xì)胞系(Wrann et al.，EMBO J.，6 :1633-1636(1987)) 分離。此蛋白的部分氨基酸序列與TGF-β有同一性，所以被命名為TGF-i32。上述的人 TGF-β (Derynck et al.，Nature, 316 :701-705 (1985))，小鼠 TGF-β (Derynck et al.，J. Biol. Chem.，261 :4377-4379(1986))及猿猴 TGF-β (Sharpies et al.，DNA, 6 239-244(1987))被命名為 TGF-β 1。
跨本說明書全體而參照了多個(gè)論文及專利文獻(xiàn)，并表示了其引用。被引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用整體并入本說明書，從而更明確地說明本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容
TGF- β是活性非常高的蛋白，但是表達(dá)非常難，且價(jià)格昂貴，且半衰期短，從而制約了其靈活的使用。本發(fā)明人為了制備可發(fā)揮與天然的人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)類似的功能或作用，且相比天然TGF-β穩(wěn)定性優(yōu)秀，并可改善天然TGF-β的由大的分子量所致的問題的肽，制備及篩選了多種人TGF- β -來(lái)源的肽。其結(jié)果，從多種肽候選物質(zhì)中選定生理活性優(yōu)秀，且穩(wěn)定性及皮膚透過率優(yōu)秀的肽，從而完成本發(fā)明。
從而，本發(fā)明的目的在于提供轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β，transforming growth factor-beta) _ 太。
本發(fā)明的另一目的在于提供TGF- β -有效性(TGF- β -effective)的疾病或狀態(tài) (conditions)的預(yù)防或治療用組合物。
本發(fā)明的再一目的在于提供TGF-β -有效性(TGF-β -effective)的疾病或狀態(tài) (conditions)的預(yù)防或治療方法。
本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)下述的發(fā)明詳述、權(quán)利要求書及附圖而更加明晰。
根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，則本發(fā)明提供包括SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β，transforming growth factor-beta)-模擬肽。
TGF-β是活性非常高的蛋白，但是表達(dá)非常難，且價(jià)格昂貴，且半衰期短，從而制約了其靈活的使用。本發(fā)明人為了制備可發(fā)揮與天然的人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)類似的功能或作用，且相比天然TGF-β穩(wěn)定性優(yōu)秀，并可改善天然TGF-β的由大的分子量所致的問題的肽，制備及篩選了多種人TGF- β -來(lái)源的肽。其結(jié)果，從多種肽候選物質(zhì)中選定生理活性優(yōu)秀，且穩(wěn)定性及皮膚透過率優(yōu)秀的肽。
本發(fā)明的肽基本上包括源于天然人TGF-β氨基酸序列的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的TGF-β -模擬肽的N-末端或C-末端額外地結(jié)合有細(xì)胞附著氨基酸序列，且更優(yōu)選，結(jié)合到N-末端。所述細(xì)胞附著氨基酸序列發(fā)揮提高本發(fā)明的肽的TGF-β活性的作用。
本發(fā)明中可利用的細(xì)胞附著氨基酸序列也包括本領(lǐng)域公知的任何細(xì)胞附著氨基酸序列。優(yōu)選地，細(xì)胞附著氨基酸序列是RGD(Arg-Gly-Asp)， RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser)，RGDC (Arg-Gly-Asp-Cys)，RGDV (Arg-Gly-Asp-Val)，RGES (Arg-Gly-Glu-Ser)，RGDSPASSKP (Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Ly s-Pro)， GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser)， GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro)， KGDS (Lys-Gly-Asp-Ser)，GRGDSP (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro)， GRGDTP (Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro)，GRGES (Gly-Arg-Gly-Glu-Ser)，GRGDS PC (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys)，GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro)， SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg)，YRGDS (Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser)，GQQHHLGGAKQAGDV(Gly-Gl n-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)， GPR(Gly-Pro-Arg)， GHK(Gly-His-Lys)， YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)， PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)， CDPGYIGSR (Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-IIe-Gly-Ser-Arg)，LCFR (Leu-Cys-Phe-Arg)， EIL(Glu-Ile-Leu)， EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val)， EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val)或 LDVPS (Leu-Asp-Val-Pro-Ser)，且最優(yōu)選是 RGD (Arg-Gly-Asp)。RGD 序列選自作為細(xì)胞間質(zhì)蛋白的纖連蛋白(fibronectin)。
本發(fā)明的肽本身示相比天然TGF-β非常優(yōu)秀的穩(wěn)定性，但可由額外的氨基酸的修飾而提高穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的肽的N-末端和/或C-末端額外地結(jié)合選自下列的保護(hù)基乙酰基，芴基甲氧基羰基，甲?；?，棕櫚?；?，肉豆蔻基，硬脂基，聚乙二醇(PEG)及氨基酸。這樣的保護(hù)基發(fā)揮增加本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的作用。
更優(yōu)選，所述保護(hù)基是氨基酸，并更優(yōu)選是Gly或Ala，且最優(yōu)選是Gly。作為保護(hù)基利用氨基酸的情況中，氨基酸殘基的數(shù)優(yōu)選是1 3，并更優(yōu)選是1 2，并最優(yōu)選是1。
本說明書中術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”不僅指體內(nèi)穩(wěn)定性，也指儲(chǔ)藏穩(wěn)定性(例如，常溫儲(chǔ)藏穩(wěn)定性)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一實(shí)施方式，本發(fā)明的肽在SEQ ID N0:1,SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的N-末端或C-末端，優(yōu)選在N-末端結(jié)合細(xì)胞附著氨基酸序列，接著所述保護(hù)基結(jié)合到N-末端或C-末端，優(yōu)選N-末端。
本發(fā)明的肽的具體例，如SEQ ID NO 2所示。
本說明書中術(shù)語(yǔ)“肽”是指氨基酸殘基通過肽鍵相互結(jié)合而形成的線形的分子。
本發(fā)明的肽可根據(jù)本領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法，尤其是固相合成技術(shù) (solid-phase synthesis techniques)而制備(Merrifield, J. Amer.Chem. Soc. 85 2149-54(1963) ；Stewart, et al. , Solid Phase Peptide Synth esis,2nd. ed. , Pierce Chem. Co. =Rockford,111(1984))
本發(fā)明的肽不僅發(fā)揮優(yōu)秀的生理學(xué)活性，熱穩(wěn)定性及對(duì)酸和堿等的物理化學(xué)的因子的穩(wěn)定性優(yōu)秀。因此，具有所述優(yōu)秀的長(zhǎng)期保存性的本發(fā)明的肽可有利地適用于如藥品、 準(zhǔn)藥品、化妝品及口腔用品的要求長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的產(chǎn)品。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，則本發(fā)明提供包括示TGF-β活性的上述的本發(fā)明的肽作為有效成分的TGF-β-有效性(TGF-β-effective)的疾病或狀態(tài)(conditions)的預(yù)防或治療用組合物。
根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，則本發(fā)明提供包括給受試者(subject)施用包括示TGF-β活性的上述的本發(fā)明的肽作為有效成分的組合物的步驟的TGF-β-有效性 (TGF-β-effective)的疾病或狀態(tài)(conditions)的預(yù)防或治療方法。
本發(fā)明的組合物由于包括上述的本發(fā)明的肽作為有效成分，對(duì)于二者之間重復(fù)的內(nèi)容而言，為避免重復(fù)記載所致的本說明書的過度的復(fù)雜性而省略其記載。
本發(fā)明中作為有效成分利用的肽保持TGF-β活性，適用于活體時(shí)發(fā)揮天然 TGF-β所發(fā)揮的作用或功能。本說明書中術(shù)語(yǔ)“TGF-β活性”是指對(duì)于天然TGF-β以往明晰的全部活性，例如細(xì)胞增殖及分裂促進(jìn)等的活性。本發(fā)明的肽是旨在模擬(mimicking) 天然TGF-β的作用而制備的，因此可將天然TGF-β的多樣的體內(nèi)活性全部發(fā)揮。
本發(fā)明中利用的肽不僅與天然TGF- β發(fā)揮相同的功能或作用，且由于生理活性度也類似，可在TGF-β-有效性的疾病或狀態(tài)的預(yù)防或治療中有利地利用。本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)“TGF-β-有效性的疾病或狀態(tài)”是指可由天然的TGF-β治療或預(yù)防的疾病或狀態(tài)。TGF-β-有效性的疾病或狀態(tài)由美國(guó)專利第5780436號(hào)及美國(guó)專利申請(qǐng)公開第 20020010134號(hào)公開，且所述專利文獻(xiàn)的教導(dǎo)事項(xiàng)通過引用并入本說明書。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，由本發(fā)明的組合物發(fā)揮的活性可表現(xiàn)為，細(xì)胞增殖促進(jìn)、分裂促進(jìn)、上皮細(xì)胞的生理活性促進(jìn)、血管形成促進(jìn)、神經(jīng)再生的促進(jìn)、組織修復(fù) (tissue r印air)、傷口治愈、血栓癥治療、骨缺陷的治療、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療、葡萄膜炎的治療、癌的治療、動(dòng)脈硬化癥治療、膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白或透明質(zhì)酸合成促進(jìn)、牙周疾病的治療或皮膚狀態(tài)的改善。
本發(fā)明的組合物適用于牙周疾病的情況中，本發(fā)明的組合物可制備成牙膏 (toothpaste)、口腔清潔用組合物或口腔保護(hù)用組合物。本說明書中術(shù)語(yǔ)“牙周疾病治療用組合物”可代替為“口腔保護(hù)用組合物(composition for tooth and mouth care)"或 “口腔清潔用組合物(composition for tooth and mouth cleaning)"。本發(fā)明的肽通過促進(jìn)牙齦組織的上皮細(xì)胞的生理活性，并通過迅速地牙齦傷口的治愈而使損傷的牙齦組織再生，從而可治療或預(yù)防牙周疾病。
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物具有皮膚狀態(tài)的改善的功效或活性。尤其是，因?yàn)楸景l(fā)明的組合物中作為有效成分利用的肽相比天然TGF-β分子量顯著小，因此皮膚滲透率非常優(yōu)秀。因此，將本發(fā)明的組合物局部涂覆到皮膚的情況中，可大大實(shí)現(xiàn)皮膚狀態(tài)的改善。更優(yōu)選地，由本發(fā)明的組合物的皮膚狀態(tài)的改善是皮膚美白、改善皺紋、改善皮膚彈力、防止皮膚老化、改善皮膚保溫，除去黑斑，治療痤瘡，除去傷口及皮膚再生效果， 且最優(yōu)選是皮膚美白與改善皺紋。
例如，本發(fā)明中作為有效成分利用的肽有效阻斷皮膚上黑色素形成(例如，酪氨酸酶的活性抑制)而示美白功效，且同時(shí)示除去皺紋(原膠原的增加或纖連蛋白的增加) 的功效。本發(fā)明的美白組合物示使皮膚色澤變亮，使皮膚色調(diào)恒定或除去皮膚色素的及除去黑斑等的效果。
再者，本發(fā)明的肽對(duì)多樣的人來(lái)源的細(xì)胞完全不顯示毒性，被判斷為作為非常安全地處置是可能的治療用藥物的適用度非常高。
本發(fā)明的組合物可制備成藥學(xué)組合物和化妝品組合物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物是包括(a)藥學(xué)有效量的上述的本發(fā)明的肽；及(b)藥學(xué)容許的載體的藥學(xué)組合物。
本說明書中術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)有效量”是指對(duì)于達(dá)成上述的肽的功效或活性充分的量。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物中包括的藥學(xué)容許的載體是配制制劑時(shí)常規(guī)利用的載體，包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，阿拉伯膠，磷酸鈣，藻酸鹽，明膠，硅酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素，水，糖漿，甲基纖維素，甲基羥基苯甲酸酯，丙基羥基苯甲酸酯，滑石粉，硬脂酸鎂及礦物油等，但不限于此。本發(fā)明的藥學(xué)組合物除了所述成分以外，可追加包括潤(rùn)滑劑，潤(rùn)濕劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。適合的藥學(xué)容許的載體及制劑在 Remington ‘s Pharmaceutical Sciences (19th ed.，1995)中有詳細(xì)的記載。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物可由經(jīng)口或非經(jīng)口，優(yōu)選非經(jīng)口施用，在非經(jīng)口施用的情況中，可通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部施用、經(jīng)皮施用等方式施用。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物的適合的施用量可根據(jù)如制劑化方法、施用方式、患者的年齡、體重、性別、病理狀態(tài)、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速度及反應(yīng)感應(yīng)性的因素多樣地開處方。另外，本發(fā)明的藥學(xué)組合物的優(yōu)選的施用量是每天0.0001 100 μ g。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物通過根據(jù)該發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易實(shí)施的方法，利用藥學(xué)容許的載體和/或賦形劑而制劑化，從而可制備成單位用量形態(tài)或放入多用量容器內(nèi)而制備。此時(shí)劑型是油或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳液形態(tài)，或也可以是提取劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，且也可額外地包括分散劑或穩(wěn)定劑。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，則本發(fā)明的組合物是包括(a)化妝品學(xué)有效量 (cosmetically effective amount)的上述的本發(fā)明的肽；及(b)化妝品學(xué)容許的載體的化妝品組合物。
本說明書中的術(shù)語(yǔ)“化妝品學(xué)有效量”是指對(duì)于達(dá)成上述的本發(fā)明的組合物的皮膚改善功效充分的量。
本發(fā)明的化妝品組合物可制備成本領(lǐng)域常規(guī)制備的任何劑型，可劑型化為例如， 溶液、懸浮液、乳液、膏劑、凝膠、霜、洗液、粉末、皂、含有表面活性劑的清潔劑、油、粉底、乳液底料，蠟底料及噴霧劑等，但不限于此。更詳細(xì)地，可制備成爽膚水、營(yíng)養(yǎng)液、營(yíng)養(yǎng)霜、按摩霜、精華液、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、清潔水、面膜、噴霧劑或粉末的劑型。
在本發(fā)明的劑型是膏、霜或凝膠的情況中，作為載體成分，可利用動(dòng)物性油、植物性油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅、膨潤(rùn)土、硅石、滑石或氧化鋅等。
在本發(fā)明的劑型是粉末或噴霧劑的情況中，作為載體成分，可利用乳糖、滑石、硅石、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末，尤其是在噴霧劑的情況中，可額外地包括如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲基醚的推進(jìn)劑。
在本發(fā)明的劑型是溶液或乳液的情況，作為載體成分，利用溶劑、增溶劑或乳化劑，例如有水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐基醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐的脂肪酸酯。
在本發(fā)明的劑型是懸浮液的情況中，作為載體成分，可利用如水、乙醇或丙二醇的液態(tài)的稀釋劑，如乙氧基化異硬脂基醇，聚氧基乙烯山梨糖醇酯及聚氧基乙烯山梨糖醇酐酯的懸浮劑，微晶纖維素，間氫氧化鋁，膨潤(rùn)土，瓊脂或黃蓍膠等。
在本發(fā)明的劑型是含有表面活性劑的清潔的情況中，作為載體成分，可利用脂肪族醇硫酸酯、脂肪族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸酯、咪唑鐺衍生物、甲基?；撬狨ァ⒓“彼狨?、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜堿、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯，脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
本發(fā)明的化妝品組合物中包括的成分除了作為有效成分的肽和載體成分以外，包括化妝品組合物中常規(guī)地利用的成分，例如，可包括如抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、 顏料及香料的常規(guī)的佐劑。

圖 1 是人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 類(Transforming growth factor-β iTGF-β )的氨基酸序列與本發(fā)明的肽的序列信息。
圖2是表示對(duì)由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽的高效液相層析分析結(jié)果的坐標(biāo)圖。
圖3是表示測(cè)定由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽的穩(wěn)定性的結(jié)果的坐標(biāo)圖。
圖4是比較在用α -MSH處理的Β16黑色素瘤細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的黑色素細(xì)胞的黑色素生成減小效果的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖5是用吸光度分析在用α -MSH處理的Β16黑色素瘤細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的黑色素生成減小的結(jié)果。
圖6是測(cè)定在用α -MSH處理的Β16黑色素瘤細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的酪氨酸酶的活性的圖。
圖7是觀察在用α -MSH處理的Β16黑色素瘤細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的黑色素瘤細(xì)胞的黑色素體變化的照片。
圖8是證明在用α -MSH處理的Β16黑色素瘤細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的黑色素生成標(biāo)記因子的減小效果的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的圖。
圖9是表示在培養(yǎng)的OTH3T3成纖維細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的原膠原的生成增加的圖。
圖10是表示在培養(yǎng)的OTH3T3成纖維細(xì)胞中處理由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽后的纖連蛋白的生成增加的圖。
圖Ila-Ilc是利用由本發(fā)明的實(shí)施例制備的肽的對(duì)角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞及Β16 黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
以下旨在通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于更具體地說明本發(fā)明，而本領(lǐng)域所屬普通技術(shù)人員明晰，根據(jù)本發(fā)明的精神，本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。
(實(shí)施例)
實(shí)施例1 :SEQ ID NO 2的肽的合成
將氯三苯甲基氯樹脂(Chloro trityl chloride resin :CTL resin, Novabiochem Cat No. 01-64-0021) 500mg放入反應(yīng)容器中，加二氯甲烷(MC)IOml而攪拌3分鐘。除去溶液，并放入二甲基仿酰胺(DMF) IOml而攪拌3分鐘后再次除去溶劑。向反應(yīng)器中放入 IOml 的二氯甲烷溶液，接著放入 Fmoc-Gln (trt) -OH (Novabiochem) 200 μ mol 及 DIEA ( 二異丙基乙胺)400 μ mol后攪拌而充分溶解，并攪拌著反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后洗滌，并將甲醇和 DIEA(2 1)溶解于MC而與樹脂反應(yīng)10分鐘后，用過量的MC/DMF(1 1)洗滌。除去溶液， 并放入IOml DMF而攪拌3分鐘后再次除去溶劑。將脫保護(hù)溶液(20%的哌啶/DMF) IOml放入反應(yīng)容器中，并于常溫下攪拌10分鐘后除去溶液。放入等量的脫保護(hù)溶液，并再次維持 10分鐘反應(yīng)后除去溶液，并用DMF洗滌2次，用MC洗滌1次，再用DMF以各3分鐘洗滌1次而制備了 Gln (trt) -CTL樹脂。向新的反應(yīng)器中放入IOml的DMF溶液，并放入Fmoc-Thr (otbu )-OH(Novabiochem) 200 μ mol,HoBt (N-Hydroxybenzotriazole,N-^S^^HR^) 200 μ mol 及Βορ200 μ mol后攪拌而使充分溶解。向反應(yīng)器中將400 μ mol DIEA以分級(jí)分離經(jīng)2次放入后，最少攪拌5分鐘至全部固體溶解。將溶解的氨基酸混合溶液放入有脫保護(hù)的樹脂的反應(yīng)容器中，并于常溫下攪拌著反應(yīng)1小時(shí)。除去反應(yīng)液，并用DMF溶液以各5分鐘攪拌3次后除去未反應(yīng)溶劑。取少量反應(yīng)樹脂而利用茚三酮測(cè)試(Ninhydrine test)檢查了反應(yīng)程度。 用脫保護(hù)溶液與所述類似地脫保護(hù)反應(yīng)2次而制備了 Thr (otbu)-Gln(trt)-CTL樹脂。用 DMF與MC充分地洗滌，并再一次施行茚三酮測(cè)試后，與所述類似地施行以下的氨基酸附著實(shí)驗(yàn)。即，依據(jù)如圖1選定的氨基酸序列而以Fmoc-Asp (otbu) ,Fmoc-Leu，F(xiàn)moder (tBu)， Fmoc-Trp(boc), Fmoc-Ile, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Asp(otbu), Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gly順序進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。制備出的肽基樹脂用所述的方法進(jìn)行脫保護(hù)而除去Fmoc后， 用DMF、MC及甲醇各自洗滌3次，緩慢地通過氮?dú)飧稍锖?，在P2O5下真空減壓而完全地干燥， 從而準(zhǔn)備了肽基樹脂。向制備的樹脂放入30ml離去溶液[包括三氟醋酸(Trifluroacetic acid :TFA)81. 5%、蒸溜水 5%，茴香硫醚(Thioanisole) 5%、苯酚 5%、EDT 2. 5%及 TIS 1%]后于常溫下偶爾振蕩，維持反應(yīng)2小時(shí)。用過濾器過濾樹脂，并將樹脂用少量的TFA溶液洗滌后與母液合并。利用減壓蒸餾至留下全體體積是一半程度，并加50ml的涼醚而誘導(dǎo)沉淀后，離心收集沉淀，并用更涼的醚洗滌2次。除去母液，并在氮?dú)夥障鲁浞值馗稍锒兓斋@了全NH2-Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr-IIe-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-OH SEQ ID NO 2 的肽0. 144g，且利用分子量測(cè)定器(Perseptive Pioneer DE-STR ABI，美國(guó))可得到分子量 1411.0(理論值 1410. 5)。
圖2是對(duì)合成而未純化的所述肽的高效液相層析。
實(shí)施例2 肽的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
為確認(rèn)純化的SEQ ID NO 2肽的穩(wěn)定性，將肽溶解于50mMTris_HCl (pH 8. 0)緩沖溶液中至使成10yg/ml。作為對(duì)照組，將以lyg/ml的濃度從大腸桿菌生產(chǎn)出的重組 TGF-^l(Sigma)在緩沖溶液中準(zhǔn)備。將準(zhǔn)備的溶液放入玻璃瓶后于40°C靜置。將于40°C 靜置的溶液在第0、1、10、25、50、75及100天采樣而實(shí)施對(duì)NIH-3T3細(xì)胞(韓國(guó)細(xì)胞系銀行)的 MTT 分析(Scudiero,D. Α.，et al. Cancer Res. ,48 :4827-4833(1988))而測(cè)定了留下的肽的殘留量(圖3)。
如圖3所示，在重組TGF-β 1的情況中，可知經(jīng)時(shí)活性度是急劇地減小，但可確認(rèn)本發(fā)明的肽長(zhǎng)期持續(xù)活性度。
實(shí)施例3 制備納米肽
精確地稱量上述實(shí)施例中得到的肽50mg后充分地?cái)嚢柚芙獾秸麴s水500ml中。 將肽溶液與卵磷脂5g、油酸鈉(sodium oleate)0. :3ml、乙醇50ml以及少量的油相互一起混合后，用蒸餾水配量至總量達(dá)IL之后，用微流化器，利用高壓乳化而制備了大小IOOnm左右的納米體。制備的納米體是最終濃度約50ppm，從而用于化妝品制備用。
劑型例1 爽膚水
根據(jù)一般的化妝水制備方法制備了包括在上述實(shí)施例1中制備的肽納米體，且由以下組成形成的爽膚水。
(表 1)
權(quán)利要求
1.包括SEQID NO :1所示的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)-模擬肽。
2.權(quán)利要求1的TGF-β -模擬肽，其特征在于所述TGF- β -模擬肽的N-末端或C-末端額外地結(jié)合有細(xì)胞附著氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的TGF-β-模擬肽，其特征在于所述細(xì)胞附著氨基酸序列結(jié)合到所述 TGF-β-模擬肽的N-末端。
4.權(quán)利要求2的TGF-β-模擬肽，其特征在于所述細(xì)胞附著氨基酸序列是 RGD(Arg-Gly-Asp) , RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser) , RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser)， RGDSPASSKP(Arg-Gl y-Asp-Ser-Pro-AIa-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP (Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro)，KGDS (Lys-Gly-Asp-Ser)， GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro)，GRGDTP (Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro)， GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser)，GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys) , GRGESP (Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro)，SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS (Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser)，GQQHHLGGAKQAGDV(Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gl y-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)，GPR(Gly-Pro-Arg)，GHK (Gly-His-Lys)， YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)，PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)，CDPGYIGSR(Cys-As p-Pro-GIy-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV (Glu-Ile-Leu-Asp-Val)，EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-T hr)，EILEVPST (Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr)，LDV(Leu-Asp-Val)或 LDVPS (Leu-Asp-Val-Pro-Ser)。
5.權(quán)利要求4的TGF-β-模擬肽，其特征在于所述細(xì)胞附著氨基酸序列是 RGD (Arg-Gly-Asp)。
6.權(quán)利要求1的TGF-β -模擬肽，其特征在于所述肽的N-末端或C-末端額外地結(jié)合選自下列的保護(hù)基乙?；?，芴基甲氧基羰基，甲酰基，棕櫚?；?，肉豆蔻基，硬脂基，聚乙二醇及氨基酸。
7.權(quán)利要求2的TGF-β -模擬肽，其特征在于，所述肽的N-末端或C-末端額外地結(jié)合選自下列的保護(hù)基乙酰基，芴基甲氧基羰基，甲?；?，棕櫚?；?，肉豆蔻基，硬脂基，聚乙二醇及氨基酸。
8.權(quán)利要求7的TGF-β -模擬肽，其特征在于，所述保護(hù)基結(jié)合到所述肽的N-末端。
9.TGF-β-有效性的疾病或狀態(tài)的預(yù)防或治療用組合物，其包括示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β (TGF-β)活性的所述權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的肽作為有效成分。
10.權(quán)利要求9的組合物，其特征在于，所述TGF-β-有效性疾病或狀態(tài)是組織損傷，動(dòng)脈硬化，傷口，骨缺陷，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，葡萄膜炎，癌，皺紋改善或皮膚美白。
11.TGF-β -有效性的疾病或狀態(tài)的預(yù)防或治療方法，其包括給受試者施用包括示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)活性的所述權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的肽作為有效成分的組合物的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述TGF-β-有效性疾病或狀態(tài)是組織損傷，動(dòng)脈硬化，傷口，骨缺陷，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，葡萄膜炎，癌，皺紋改善或皮膚美白。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括特定氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)-模擬肽及包括其的TGF-β-有效性(TGF-β-effective)的疾病或狀態(tài)(conditions)的預(yù)防或治療用組合物。本發(fā)明的肽源于人TGF-β，與天然的人TGF-β發(fā)揮類似的功能或作用。本發(fā)明的肽穩(wěn)定性相比天然TGF-β優(yōu)秀，并可改善天然TGF-β的由大的分子量所致的問題。本發(fā)明的肽可用于適用TGF-β的多種疾病或狀態(tài)的治療或改善，且尤其對(duì)皮膚美白及皺紋改善發(fā)揮卓越的功效。
文檔編號(hào)C07K14/71GK102498128SQ200980159838
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者崔俊英, 崔鉦軫, 鄭镕池, 金榮德, 金銀美 申請(qǐng)人:凱爾格恩有限公司