專利名稱：用于檢測(cè)和鑒別樣品中變異艱難梭菌菌株的方法
用于檢測(cè)和鑒別樣品中變異艱難梭菌菌株的方法艱難梭菌(Clostridium difficile)是3-6 μ m長(zhǎng)和大約0. 5 μ m寬的嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌。梭菌屬屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)。發(fā)現(xiàn)艱難梭菌作為抗生素相關(guān)結(jié)腸炎的重要病原體是在70年代末實(shí)現(xiàn)的。名稱艱難梭菌源于培養(yǎng)中的緩慢生長(zhǎng)和所述細(xì)菌困難的分離。在補(bǔ)充的血瓊脂平板上，生長(zhǎng)出大的、灰色的透明克隆，而沒有溶血作用。像所有的梭菌一樣，艱難梭菌具有孢子形成能力。以這種方式，所述細(xì)菌在極端環(huán)境條件下也能夠存活。健康成人在胃腸道中攜帶有2-7%的艱難梭菌。在抗生素治療期間，生理菌群的保護(hù)作用受到干擾并可在腸中發(fā)生艱難梭菌的過(guò)度繁殖。由此引起的艱難梭菌相關(guān)4疾病 (CDAD)的嚴(yán)重程度取決于所存在的艱難梭菌菌株的毒力而變化。臨床現(xiàn)象從輕微腹瀉直到伴有發(fā)燒和痙攣性腹痛的嚴(yán)重假膜性腸炎以及嚴(yán)重并發(fā)癥(例如結(jié)腸穿孔、膿毒癥和中毒性巨結(jié)腸)的危險(xiǎn)。作為毒力因子，首先涉及腸毒素(毒素A)和細(xì)胞毒素(毒素B)。這些毒素屬于大梭菌毒素(LCT，Largeclostridial toxins)家族并且具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性。 此外，數(shù)種菌株具有二元毒素CDT(ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶)的基因，其被作為另外的毒力因子進(jìn)行討論。將艱難梭菌分為所謂的標(biāo)準(zhǔn)菌株和其變種。作為標(biāo)準(zhǔn)艱難梭菌菌株，通常稱為毒素型0菌株。對(duì)此，分為具有不同核糖核酸型(例如001、003和01 的菌株。毒素型0菌株的特征在于存在毒素A和B兩者的基因，而缺少二元毒素的基因。近年來(lái)顯示，除了標(biāo)準(zhǔn)艱難梭菌外，還有許多不同的變異艱難梭菌菌株，其具有增加的臨床重要性并且也在家畜(特別是狗、貓)和有用動(dòng)物(Nutztieren)(特別是牛犢和豬)中檢測(cè)到。因此，自2003年以來(lái)，在加拿大、USA、英國(guó)和許多其它歐洲國(guó)家觀察到了地方性的、經(jīng)常嚴(yán)重進(jìn)展的變異艱難梭菌菌株感染。與這些嚴(yán)重進(jìn)展的感染相關(guān)而分離的變異艱難梭菌菌株既具有毒素A(tcdA)和毒素B (tcdB)的基因，也具有⑶T的基因并且在其調(diào)控基因tcdC中具有部分缺失。這些PCR-核糖核酸型027、毒素型III、REA_B1和PFGE NAPl的高毒力艱難梭菌菌株在調(diào)控基因(tcdC)中具有18bp的缺失并在117位具有移碼，這被推測(cè)為是其在體外檢測(cè)到的增加的毒素產(chǎn)生的原因和其提高的毒力的基礎(chǔ)。此外，這些菌株的特征在于，與其它的艱難梭菌菌株相比，它們具有改變的表面蛋白和提高的對(duì)人腸表皮細(xì)胞的粘附。此外，這些菌株針對(duì)氟喹諾酮效果類的抗生素以及針對(duì)紅霉素抗生素具有抗性-推測(cè)是由于gyrA/ B和23sRNA的基因中的突變。下文中，這些高毒力艱難梭菌菌株簡(jiǎn)稱為“C. d-027-hv”。迄今為止，艱難梭菌感染大多涉及超過(guò)60歲的患者，而C. d. -027-hv也在年輕患者中以及在醫(yī)院之外在迄今具有低危險(xiǎn)的患者中檢測(cè)到了。其致死性相對(duì)于迄今為止檢測(cè)到的艱難梭菌提高至五倍。另一組臨床相關(guān)的變異艱難梭菌菌株被歸類為核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F。這些菌株主要的特征在于它們?cè)趖cdA基因中具有1. 7kB的大缺失并且由于提前的終止密碼子而不表達(dá)毒素Α。所述菌株具有針對(duì)克林霉素和氟喹諾酮的抗生素抗性，而缺少二元毒素⑶T的基因，并且調(diào)控基因tcdC也不具有缺失。美國(guó)、日本、以色列、愛爾蘭和荷蘭等報(bào)道了這樣的菌株大量出現(xiàn)。在具有這種感染的患者中死亡率超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌株的死亡率 14-66%。下文中，將這些高毒力艱難梭菌菌株簡(jiǎn)稱為“C. d-017-hv”。艱難梭菌的診斷檢測(cè)通常是通過(guò)檢測(cè)毒素A、在一些情況下也通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)毒素 A和B而進(jìn)行的。用該方法檢測(cè)變異艱難梭菌菌株是不可能的。變異菌株根本不被檢出(毒素A陰性菌株)或者不被單獨(dú)檢出。為了鑒別和表征變異艱難梭菌菌株，需要對(duì)其進(jìn)行分型。用于對(duì)艱難梭菌進(jìn)行分型的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，例如毒素型分型、血清分型、核糖核酸分型或者通過(guò)PFGE 或REA進(jìn)行分型。然而，所有這些方法都是費(fèi)力和費(fèi)時(shí)的，只能由專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行并且首先需要對(duì)所牽涉的艱難梭菌菌株進(jìn)行昂貴的分離。此外，為了準(zhǔn)確鑒別具體的艱難梭菌菌株，大多還需要進(jìn)一步的研究，例如，在 C. d. -027-hv的情形中，檢測(cè)抗生素抗性和tcdC基因中的缺失。因此，在實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，例如關(guān)于Cd. -027-hv的存在的研究，如下進(jìn)行1.通過(guò)免疫測(cè)定，在患者的大便中通過(guò)檢測(cè)毒素A和/或B而一般性地檢測(cè)艱難梭菌，2.當(dāng)為陽(yáng)性時(shí)由研究材料培養(yǎng)艱難梭菌細(xì)菌，3.在成功分離細(xì)菌的情況下在E-測(cè)試中測(cè)試紅霉素和莫西沙星抗性的存在，4.在陽(yáng)性抗性檢測(cè)的情況下通過(guò)DNA制備和核糖體RNA基因的PCR擴(kuò)增(核糖核酸分型)[

圖1]測(cè)試核糖核酸型027的存在，5.在核糖核酸型027為陽(yáng)性檢測(cè)的情況下進(jìn)行部分基因分型以檢測(cè)毒素基因 tcdA和tcdB 二者、二元毒素CDT的基因cdtA/B和調(diào)控基因tcdC中的缺失，6.在存在所測(cè)試的兩種抗生素抗性和特征性基因分型模式的所有特征的情況下 診斷為高毒力艱難梭菌菌株核糖核酸型027 (C. d. -027-hv)。該迄今的實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐(其對(duì)于其它變異的和高毒力的艱難梭菌菌株相似的復(fù)雜) 的缺點(diǎn)，首先在于其非常費(fèi)時(shí)為了分離和培養(yǎng)病菌，測(cè)定抗生素抗性和核糖核酸分型，時(shí)間需求為7-10天。為了目標(biāo)為阻止醫(yī)院感染和控制感染爆發(fā)(既保護(hù)患者和工作人員也出于費(fèi)用節(jié)省)的最佳感染監(jiān)測(cè)，鑒別方法首先必須是快速和盡可能準(zhǔn)確的。因此，本發(fā)明的任務(wù)在于提供快速和安全地檢測(cè)和鑒別樣品(特別是患者樣品 (人或動(dòng)物患者))中的變異艱難梭菌菌株的方法。在所述任務(wù)的過(guò)程中特別存在的待解決的問(wèn)題是(i)不同艱難梭菌菌株的毒素不是通過(guò)獨(dú)特的區(qū)域相區(qū)別，( )產(chǎn)生針對(duì)確定的艱難梭菌菌株的LCT的特異性抗體不是微不足道的(EU資助的例如從事C. d. -027-hv菌株的研究的特別研究項(xiàng)目編號(hào)37870 (縮寫“EACCAD”)、并且此外具有產(chǎn)生針對(duì)C. d.-027-hv的LCT的抗體的目標(biāo))，(iii)還由其它的艱難梭菌形成二元毒素CDTjn (iv)允許檢測(cè)大便樣品中確定基因(例如tcdC)中的突變，通常不是免疫學(xué)地。該任務(wù)的解決在于提供方法，所述方法的特征在于下述步驟
(a)獲得人或動(dòng)物患者的身體排泄物樣品和/或身體組織樣品，(b)使該樣品與各來(lái)自抗體組組I、組II、組III、組IV、組V和組VI中的至少三組的至少一種抗體接觸，其中組I 包含下述抗體泛1TcdB抗體，組II包含下述抗體與毒素TcdB-10463和TcdB-017反應(yīng)，而不與毒素 TcdB-8864 和 ^(1Β-027 反應(yīng)的抗體，組III 包含下述抗體與TcdB-10463反應(yīng)，而不與毒素TcdB-8864、TcdB-017和 TcdB-027反應(yīng)的抗體，組IV 包含下述抗體與毒素 ^(1Β-8864、TcdB-017和TcdB-027反應(yīng)，而不與毒素TcdB-10463反應(yīng)的抗體，組V 包含下述抗體與毒素TcdB-8864和TcdB-027反應(yīng)，而不與毒素 TcdB-10463 和 iTcdB-On 反應(yīng)的抗體，組VI 包含下述抗體泛TcdA抗體(c)檢測(cè)抗體反應(yīng)并生成反應(yīng)模式，其中關(guān)于每個(gè)在(b)中所采用的、各抗體組I 至VI的抗體，對(duì)于檢測(cè)到的陽(yáng)性抗體反應(yīng)分配陽(yáng)性符號(hào)(例如，“ + ”)，對(duì)于檢測(cè)到的陰性抗體反應(yīng)分配陰性符號(hào)(例如，“-”)，和(d)將在(C)中獲得的反應(yīng)模式與參考模式進(jìn)行比較，所述參考模式通過(guò)下述方式獲得來(lái)自現(xiàn)有技術(shù)中已知的且在就存在而進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)測(cè)試中的艱難梭菌菌株RXl、 Rx2、Rxi;在與步驟(b)中所選擇的來(lái)自抗體組I至VI中至少三組的抗體的反應(yīng)測(cè)試中采用了至少一種所述的或者Rx^ Rx2> Rxi各自的大梭菌毒素LCT-RXl、LCT-Rx2, LCT-RXi,并且將對(duì)于每種LCT與抗體組I至VI中至少三組所獲得的反應(yīng)結(jié)果如此地以模式方式進(jìn)行檢測(cè)、 或登記或描繪在檢測(cè)到陽(yáng)性抗體反應(yīng)的情況下給各抗體組分配陽(yáng)性符號(hào)(例如，“+”)，或者在檢測(cè)到陰性抗體反應(yīng)的情況下給各抗體組分配陰性符號(hào)(例如，“_”)，(e)評(píng)估在(c)中獲得的反應(yīng)模式與參考模式之間的一致性作為樣品中存在相關(guān)參考模式的艱難梭菌菌株的指示。在本文中含義如下. LCT 大梭菌毒素，即艱難梭菌的毒素A和/或毒素B. TcdB-10463 艱難梭菌菌株VPI-10463的毒素B (= “標(biāo)準(zhǔn)毒素”)
. TcdB-8864 艱難梭菌菌株8864的毒素B. TcdB-1470 艱難梭菌菌株1470的毒素B. TcdB-7002/8 艱難梭菌菌株7002/8的毒素B. TcdB-017 具有核糖核酸型017的艱難梭菌菌株的毒素B. TcdB-027 具有核糖核酸型027的艱難梭菌菌株的毒素B.泛TcdA抗體識(shí)別所有致病性艱難梭菌菌株的TcdA蛋白的抗體(例如，TTC8).泛TcdB抗體識(shí)別所有致病性艱難梭菌菌株的TcdB蛋白的抗體(例如，2CV、 TGC35)根據(jù)本發(fā)明的方法的教導(dǎo)基于令人驚訝的認(rèn)識(shí)，即(1.)可以將針對(duì)艱難梭菌的LCT (即針對(duì)毒素A或毒素B)的抗體劃分為六個(gè)組， 對(duì)其表征如下
組I =泛 TcdB 抗體 TGC35 (DSM ACC 2918)和 2CV (DSM ACC2321)以及與 TGC35 禾口 /或2CV功能相同且作用相同的抗體；組II =與標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463和變異的TcdB-017反應(yīng)，但不與變異的毒素 I~CdB-8864和I~CdB-027反應(yīng)的抗體，特別是抗體TGC23 (DSM ACC2917)和與其功能及作用相同的抗體；組III =與標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463反應(yīng)，但不與變異的毒素 ^(1Β-8864、TcdB-017 和TcdB-027反應(yīng)的抗體，特別是抗體TGC41(DSM ACC2919)和與其功能及作用相同的抗體；組IV =與變異的毒素TcdB-8864和TcdB-017及TcdB-027反應(yīng)但不與標(biāo)準(zhǔn)毒素 TcdB-10463反應(yīng)的抗體，特別是抗體TGC16(DSMACC2915)和與其功能及作用相同的抗體；組V =與變異的毒素TcdB-8864和TcdB-027反應(yīng)但不與標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463及變異的jTcdB-OH反應(yīng)的抗體，特別是抗體TGC19(DSMACC2916)和與其功能及作用相同的抗體；組VI =泛TcdA抗體，其與所有致病性艱難梭菌菌株的TcdA蛋白反應(yīng)，特別是抗體TTC8(DSM ACC 2322)和與其功能及作用相同的抗體(如US4879218中所描述的抗體 PCG4)；和(2.)迄今已知的毒力變異艱難梭菌菌株或其LCT與這六個(gè)組的抗體(特別是其毒素B與I至V五個(gè)組的抗體)各顯示特征性的反應(yīng)模式，其區(qū)別于其它(高)毒力變異艱難梭菌菌株的毒素的反應(yīng)模式和標(biāo)準(zhǔn)艱難梭菌菌株的毒素的反應(yīng)模式。例如，高毒力變異艱難梭菌菌株C. d. -027-hv通過(guò)反應(yīng)模式“+—+++”來(lái)以組I、 II、III、IV、V、VI的順序被表征，而同樣高毒力的艱難梭菌菌株C. d. -017-hv通過(guò)反應(yīng)模式 “++-+--”被表征(同樣以組I、II、III、IV、V、VI的順序)。為了鑒別和檢測(cè)不同的目前已知的和診斷上相關(guān)的毒力變異艱難梭菌菌株，通常來(lái)自至少三個(gè)不同抗體組的各至少一種抗體是必要的且足夠的。例如，為了將艱難梭菌菌株C. d.-027-hv與其余的相關(guān)變異艱難梭菌菌株以及與標(biāo)準(zhǔn)艱難梭菌菌株相區(qū)分，II、IV 和VI三組的反應(yīng)模式(即“_++”(以組II、IV、VI的順序))是足夠的，為了區(qū)分或鑒別艱難梭菌菌株C. d. -017-hv，II、IV和VI三組的反應(yīng)模式(即“++_”(同樣以組II、IV、VI的順序))是足夠的。根據(jù)本發(fā)明的方法特別伴有下述優(yōu)勢(shì)可以直接借助大便樣品、通過(guò)簡(jiǎn)單進(jìn)行的測(cè)試并且在幾小時(shí)內(nèi)確定特定的高毒力變異艱難梭菌菌株是否存在例如研究C. d. -027-hv的存在并獲得抗體-抗原反應(yīng)模式，其對(duì)于來(lái)自抗體組I、IV、V和/或VI的至少一組的抗體不顯示陽(yáng)性反應(yīng)，則可以可靠地診斷不存在C. d0-027-hv類型的菌株。反之，對(duì)于所有四個(gè)抗體組I、IV、V和VI，抗體-抗原反應(yīng)模式均顯示陽(yáng)性反應(yīng)，則存在非常高的被C. d. -027-hv菌株感染的可能性。為了證實(shí)該懷疑診斷，則可以/應(yīng)當(dāng)進(jìn)行費(fèi)時(shí)和耗資的特異性分析、抗生素抗性、核糖核酸分型和/或基因分析(特別是毒素基因tcdA、tcdB和tcd A/B以及具有特征性缺失和移碼的調(diào)控基因 tcdC的檢測(cè))。換言之根據(jù)本發(fā)明的方法代替了常規(guī)研究方法中的前三個(gè)步驟(毒素檢測(cè)、細(xì)菌培養(yǎng)、抗生素抗性測(cè)試)并且使得能夠在顯著更短的時(shí)間(即幾個(gè)小時(shí)，相對(duì)于常規(guī)方式的若干天)中、在不存在待檢變異艱難梭菌菌株(例如C. d.-027-hv)感染的情形中，有至少一個(gè)可靠的排除診斷。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法指明存在待檢變異艱難梭菌菌株(例如 C. d. -027-hv或C. d. -017-hv)時(shí)，才需要進(jìn)行常規(guī)研究方法中費(fèi)時(shí)和耗資的其它步驟G、5 和6)。當(dāng)基于本發(fā)明的檢測(cè)測(cè)試的結(jié)果，確實(shí)給出了高度的C. d. -027-hv感染或 C. d. -017-hv感染的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，那么也可以有針對(duì)性地采取預(yù)防措施例如分離、隔離、嚴(yán)格的衛(wèi)生措施。組I至VI的抗體優(yōu)選地是單克隆抗體。原則上，作為用于本發(fā)明的方法的抗體， 也考慮所有的、技術(shù)人員已知的天然的、生物技術(shù)制造的或基因技術(shù)制造的抗體備選物，例如駱駝抗體(納米抗體)、Affib0dies、Anticaline、半胱氨酸結(jié)微小蛋白。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案(其在實(shí)踐中被證明是非常好的)中，至少一種來(lái)自組I 的抗體是單克隆抗體2CV (DSM ACC 2321)或單克隆抗體TGC 35 (DSM AC(^918)，和/或至少一種來(lái)自組II的抗體是單克隆抗體TGC23(DSM ACa917)，和/或至少一種來(lái)自組III的抗體是單克隆抗體TGC41 (DSM ACC2919)，和/或至少一種來(lái)自組IV的抗體是單克隆抗體TGC 16 (DSM AC(^915)，和/或至少一種來(lái)自組V的抗體是單克隆抗體TGC 19 (DSM ACC2916)和 /或至少一種來(lái)自組VI的抗體是單克隆抗體TTC8 (DSM ACC 2322)。在實(shí)踐中，身體排泄物樣品優(yōu)選地是大便樣品，并且身體組織樣品優(yōu)選地是血液樣品。本方法的另一個(gè)實(shí)施方案(其對(duì)于實(shí)踐是高度相關(guān)的，因?yàn)樗沟媚軌蚩焖倏煽康貦z測(cè)變異艱難梭菌菌株)的特征在于，在步驟(b)中，使樣品與來(lái)自組I、IV和VI的每組的各抗體接觸，和在步驟(C)中，來(lái)自組I、IV和VI的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)顯示存在高毒力變異艱難梭菌菌株。對(duì)于實(shí)踐高度相關(guān)的本方法的一個(gè)實(shí)施方案(其使得能夠快速可靠地檢測(cè)核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III高毒力艱難梭菌菌株并由此核實(shí)C. d. -027-hv 的疑似情形)的特征在于，在步驟(b)中，使樣品與來(lái)自抗體組組II、組IV和組VI的每組的各至少一種抗體接觸，和在步驟(c)中，來(lái)自組IV和組VI的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)以及來(lái)自組 II的抗體的陰性反應(yīng)顯示存在核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1、毒素型III類型的高毒力變異艱難梭菌菌株。該實(shí)施方案還可以擴(kuò)展，其中在步驟(b)中，還使樣品與抗體組I和/或抗體組 III和/或抗體組V的各至少一種抗體接觸，并且其中此外在步驟(C)中，來(lái)自組I和組V的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)以及來(lái)自組III的抗體的陰性反應(yīng)顯示存在核糖核酸型027、PFGE-NAPU REA-B1、毒素型III類型的高毒力變異艱難梭菌菌株。對(duì)于實(shí)踐同樣高度相關(guān)的本方法的另一個(gè)實(shí)施方案(其使得能夠快速可靠地檢測(cè)核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F高毒力艱難梭菌菌株并由此核實(shí)C. d. -017-hv 的疑似情形)的特征在于，在步驟(b)中，使樣品與來(lái)自抗體組組II、組IV和組VI的每組的各至少一種抗體接觸，和在步驟(c)中，來(lái)自組II和組IV的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)以及來(lái)自組 VI的抗體的陰性反應(yīng)顯示存在核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F類型的高毒力變異艱難梭菌菌株。該實(shí)施方案還可以擴(kuò)展，其中在步驟(b)中還使樣品與抗體組I和/或抗體組III和/或抗體組V的各至少一種抗體接觸，并且其中此外在步驟(c)中，來(lái)自組I的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)和來(lái)自組III及組V的抗體的陰性反應(yīng)顯示存在核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F類型的高毒力變異艱難梭菌菌株。本發(fā)明所基于的任務(wù)也通過(guò)提供這樣的單克隆抗體而被解決，所述單克隆抗體由自2008年6月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM ACC2916 (TGC19)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，并且用于根據(jù)本發(fā)明的方法中以檢測(cè)和鑒別變異艱難梭菌菌株，特別適于并被計(jì)劃用于用來(lái)檢測(cè)和鑒別核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III艱難梭菌菌株的方法變體中。所述任務(wù)還通過(guò)提供這樣的單克隆抗體而被解決，所述單克隆抗體由自2008年6 月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM ACC2917(TGC 23)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，并且用于根據(jù)本發(fā)明的方法中以檢測(cè)和鑒別變異艱難梭菌菌株，特別適于并被計(jì)劃用于用來(lái)檢測(cè)和鑒別核糖核酸型017，毒素型VIII和血清型F艱難梭菌菌株的方法變體中。此外，所述任務(wù)通過(guò)提供這樣的單克隆抗體而被解決，所述單克隆抗體由以編號(hào) DSM ACC2915(TGC 16)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，并且用于所述方法中以檢測(cè)和鑒別樣品中的變異艱難梭菌菌株，特別地，特別適于并被計(jì)劃用于用來(lái)檢測(cè)和鑒別具有核糖核酸型017，毒素型VIII和血清型F的艱難梭菌菌株和/或具有核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III的艱難梭菌菌株的方法變體中。最后，所述任務(wù)通過(guò)提供這樣的單克隆抗體而被解決，所述單克隆抗體由以編號(hào) DSM ACC2918(TGC 35)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，并且用于所述方法中以檢測(cè)和鑒別樣品中的變異艱難梭菌菌株，特別地，特別適于并被計(jì)劃用于用來(lái)檢測(cè)和鑒別具有核糖核酸型017，毒素型VIII和血清型F的艱難梭菌菌株和/或具有核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III的艱難梭菌菌株的方法變體中。下面根據(jù)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明在實(shí)施例中提及的圖表示圖1 所使用的菌株的核糖核酸分型。根據(jù)^ubbs等人的報(bào)告對(duì)菌株進(jìn)行核糖核酸分型并通過(guò)用參考菌株進(jìn)行的調(diào)整而對(duì)不同的核糖核酸型進(jìn)行歸類。由此將菌株 VPI-10463和菌株8864歸入迄今未知的核糖核酸型，而將菌株1470歸入核糖核酸型017和將菌株7002/8歸入核糖核酸型027。標(biāo)記物條帶行進(jìn)在600bp、500bp、400bp和300bp (從上面起)。圖2 純化的毒素B變異體。在經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE中顯示不同的毒素B變異體。每道加載250-400ng單一毒素。圖3 單克隆抗毒素B抗體特異性的檢測(cè)。在SDS-PAGE中使不同的毒素B變異體分離，將其印跡到尼龍膜上并隨后用相應(yīng)的抗體顯色。所顯示的是單克隆抗體TGC35(圖 3A)、TGC16 (圖 3B)、TGC41 (圖 3C)、TGC23 (圖 3D)和 TGC19 (圖 3E)的特異性。圖4:單克隆抗體的結(jié)合區(qū)。圖4A是毒素B的結(jié)構(gòu)的圖示。圖4B顯示了毒素B內(nèi)的抗體結(jié)合區(qū)。圖4C顯示單克隆抗體的反應(yīng)活性。圖5 艱難梭菌菌株的參考模式。通過(guò)使用來(lái)自抗體組I、II、IV和VI的捕獲抗體用夾心ELISA測(cè)試了四種不同的艱難梭菌菌株在培養(yǎng)上清液中的毒素A和毒素B表達(dá)。作為捕獲抗體所使用的是來(lái)自組I :TGC35，來(lái)自組II :TGC23，來(lái)自組IV :TGC16，組VI :TTC8。所顯示的是艱難梭菌菌株VPI-10463(圖5A)、8864(圖5B)、1470核糖核酸型017 (圖5C) 和7002/8核糖核酸型027(圖5D)的識(shí)別模式。圖6 捕獲-ELISA中不同艱難梭菌菌株的反應(yīng)模式。被用作鑒別抗體的是來(lái)自組 I的TGC35，來(lái)自組II的TGC23，來(lái)自組IV的TGC16和來(lái)自VI的TTC8。圖6A中描繪了來(lái)自17種不同的艱難梭菌菌株的結(jié)果，且在圖6B中描繪了其它艱難梭菌菌株的結(jié)果。實(shí)施例1 與艱難梭菌的毒素B特異性反應(yīng)的單克隆抗體的制備(A)體纏纖隱編艮麵所使用的艱難梭菌菌株VPI-10463 (ATCC43255)，8864 (CCUG20309)，1470(ATCC43598)，禾口7002/8 (來(lái)自患者樣品的人分離株)。根據(jù)Mubbs等人(1999)的核糖核酸分型方法對(duì)所述菌株進(jìn)行核糖核酸分型。由此獲得的結(jié)果表示在圖Abb. 1中。它顯示，菌株1470符合核糖核酸型017且菌株7002/8 符合核糖核酸型027，而菌株VPI-10463和8864被歸入迄今尚未正式命名的核糖核酸型。由菌株VPI-10463表達(dá)的毒素B CTcdB-1046;3)在現(xiàn)有技術(shù)中一般被稱作標(biāo)準(zhǔn)毒
ο菌株8864產(chǎn)生此毒素B的變異體(TcdB_8864)，其主要在C末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中與標(biāo)準(zhǔn)毒素相區(qū)別(Soehn等人，1998)。菌株1470表達(dá)毒素B (TcdB-1470)，其特別在N末端酶結(jié)構(gòu)域中與標(biāo)準(zhǔn)毒素B相區(qū)別(來(lái)自 Eichel-Streiber 等人，1995)。不知道菌株7002/8核糖核酸型027的毒素B的序列。相反，確定了兩種其它的 C. d. -027-hv 菌株(菌株 QCD-32g58, Genbank 登錄號(hào) NZ_AML00000000，菌株 R20291, www. sanger. ac. uk)中的 ^(1Β-027序列。這些TcdB-027序列與標(biāo)準(zhǔn)毒素B和其它變異iTcdB毒素的比較表明，TcdB-027在N末端、酶結(jié)構(gòu)域中與標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463相似，然而在C末端結(jié)構(gòu)域中與毒素TcdB-8864相似。為了純化毒素，使細(xì)菌厭氧地吸附在腦心輸注營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(Becton Dickinson, Heidelberg，德國(guó))中。隨后將毒素A和B從該培養(yǎng)的上清液中純化，如Moos等人Q000) 所描述的。在考馬斯凝膠中檢驗(yàn)毒素的純度(比較，圖2)。用現(xiàn)有技術(shù)中已知的和常用的方法將艱難梭菌菌株VPI_10463、8864和1470的經(jīng)分離和純化的TcdB滅活并在細(xì)胞毒性測(cè)試中檢驗(yàn)滅活的效果。(B)獲得針對(duì)來(lái)自㈧的毒素B變異體的單克隆抗體順次各使多只小鼠經(jīng)受滅活的毒素B變異體TcdB-8864和TcdB-1470以及標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB 10163，首先經(jīng)受基礎(chǔ)免疫且隨后經(jīng)受兩次加強(qiáng)免疫。測(cè)定所述動(dòng)物對(duì)免疫原的滴度，如果產(chǎn)生了顯著的滴度則取出脾臟。用現(xiàn)有技術(shù)中已知和常用的方法使分離的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)(63Ag8. 653(ATCC CRL1580) 融合并隨后挑選和克隆融合細(xì)胞。根據(jù)針對(duì)用于進(jìn)行免疫的毒素B的特異性單克隆抗體的產(chǎn)生，免疫學(xué)地篩選由此獲得的雜交瘤克隆?？偣策M(jìn)行了 15次融合，且最后分離了 21個(gè)不同的、表達(dá)毒素B特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系。對(duì)于其它研究，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化抗體。為此，使雜交瘤細(xì)胞系吸附于無(wú)血清培養(yǎng)基 ISF-I (Biochrom，德國(guó)柏林)中，并隨后在 Spinner_System(Bellco，Vineland，USA) 中、以50rpm、在250ml的體積中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)物的活力降低至小于30%。用蛋白A 柱(HiTrap MabSelect SuRe, GE Healthcare, Freiburg，德國(guó))純化培養(yǎng)物上清液。所純化的抗體的濃度為l_2mg/ml，在考馬斯凝膠中檢驗(yàn)所述純度。實(shí)施例2 抗毒素B抗體的表征為了表征在實(shí)施例1中產(chǎn)生的抗體，在蛋白質(zhì)印跡中測(cè)試所述抗體。為此首先在SDS-PAGE中分離各250_400ng的標(biāo)準(zhǔn)毒素B-10463和毒素B變異體 TcdB-8864,TcdB-017以及TcdB-027并隨后在半干燥印跡方法中印跡到尼龍膜上。按照現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行顯色。為了檢測(cè)毒素，使用在實(shí)施例1產(chǎn)生的單克隆抗體。帶有實(shí)驗(yàn)室符號(hào)TGC 16, TGC 19, TGC 23, TGC 35和TGC 41的抗體的結(jié)果總結(jié)在圖3中這些結(jié)果顯示，大多數(shù)所產(chǎn)生的抗體識(shí)別不同毒素B變異體的亞組并且不是僅對(duì)確定的毒素變異體為單特異性的?？偣茶b別了 11種與標(biāo)準(zhǔn)毒素B和所有的毒素B變異體結(jié)合的不同的抗體。這種所謂泛TcdB抗體的一個(gè)特征性的代表是抗體TGC35。產(chǎn)生所述TGC 35的雜交瘤細(xì)胞系自 2008年6月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM AC(^918保藏于DSMZ (德意志微生物保藏中心，德國(guó)布倫瑞克)°一些抗體既與標(biāo)準(zhǔn)毒素反應(yīng)也與毒素TcdB-017反應(yīng)。這一抗體組的一個(gè)特征性代表是抗體TGC 23。產(chǎn)生所述TGC 23的雜交瘤細(xì)胞系自2008年6月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM ACC2917 保藏于 DSMZ。一些抗體與標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463特異性反應(yīng)。這一抗體組的一個(gè)特征性代表是抗體TGC 41。產(chǎn)生所述TGC 41的雜交瘤細(xì)胞系自2008年6月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM ACC2919 保藏于DSMZ。令人驚訝地，還可以產(chǎn)生與一種或多種毒素B變異體反應(yīng)而不與標(biāo)準(zhǔn)毒素B反應(yīng)的兩種抗體?？贵wTGC 16不與標(biāo)準(zhǔn)毒素B結(jié)合，但與變異毒素TcdB-8864、TcdB-017和 I~CdB-027結(jié)合。產(chǎn)生所述TGC 16的雜交瘤細(xì)胞系自2008年6月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM AC(^915 保藏于 DSMZ?？贵wTGC 19不與標(biāo)準(zhǔn)毒素B或變異毒素TcdB-017結(jié)合，但與變異毒素TcdB-8864 及TcdB-027結(jié)合。產(chǎn)生所述TGC 19的雜交瘤細(xì)胞系自2008年6月5日以來(lái)、以編號(hào)DSM ACC2916 保藏于 DSMZ。在捕獲ELISA中關(guān)于其抗原檢測(cè)范圍對(duì)抗體進(jìn)行研究。為此將ELISA平板的每孔用50 μ 1包被緩沖液(50mM Na2C03、50mMNaHC03，pH9. 6)和250ng每種抗體在室溫下孵育3h 并從而使抗體附加至ELISA平板。通過(guò)之后用200 μ 1 5x WAPU (12. 5ml TritonXlOO, 62. 5ml IM Tris-HCl pH7. 5,62. 5ml 20%的明膠溶液，用H2O加至500ml)孵育30分鐘的時(shí)間來(lái)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后施用不同濃度的抗原，即在TGC 16和TGC 19的情況下施用抗原TcdB-027，而在TGC 23和TGC 35的情況下施用抗原TcdB_017。用多克隆血清Q66ng/ ml)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)果(本文未描述)顯示，對(duì)于抗體TGC 16和TGC 23，各毒素B的檢測(cè)范圍為< 300pg/ml，對(duì)于抗體TGC 35，其為低于lng/ml以及對(duì)于抗體TGC 19，其在Ing/ ml附近。關(guān)于其與毒素B的結(jié)合位置對(duì)抗體TGC 16, TGC 19, TGC 23, TGC ；35和TGC 41進(jìn)行了研究。通過(guò)毒素B的蛋白水解消化或通過(guò)在大腸桿菌(E.coli)中克隆和表達(dá)重組毒素B部分片段而制備毒素B的蛋白片段。在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中使這些毒素B片段分離并且隨后用抗體TGC 16、TGC 19，TGC 23、TGC 35和TGC 41孵育所述印跡。該研究的結(jié)果被圖示總結(jié)在圖4中并且顯示，單一的抗體識(shí)別或結(jié)合毒素B分子的不同區(qū)域。所有氨基酸位置說(shuō)明都是參照標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463中的相應(yīng)位置而標(biāo)明的。TGC 16在糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域中與 \;(1Β-8864、iTcdB-On和1^(1-027各自結(jié)合，并且在那里在氨基酸位置122至沈1的范圍內(nèi)。TGC 19在糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域之后的氨基酸位置543和2366之間的范圍內(nèi)與 TcdB-8864 和 1^(1-027 各自結(jié)合。TGC 23在具有氨基酸位置1692和2113之間的C末端區(qū)段的配體結(jié)構(gòu)域中與標(biāo)準(zhǔn)毒素和TcdB-017各自結(jié)合。TGC 35在易位結(jié)構(gòu)域內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)毒素、TcdB-8864、TcdB-017及Tcd-027各自結(jié)合， 所述易位結(jié)構(gòu)域在毒素N末端處的糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和氨基酸位置543和1692之間的C 末端處的配體結(jié)構(gòu)域之間。TGC 41與TGC 16類似地結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)毒素，也就是說(shuō)，在糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)并且在那里在氨基酸122至的范圍內(nèi)。TGC 16和TGC 41在相同的毒素B區(qū)中結(jié)合，即在糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域中，然而來(lái)自不同的毒素B變異體，即一方面來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)毒素(TGC 41)而另一方面來(lái)自TcdB-8864、 TcdB-017和Tcd-027 (TGC16)。由此第一次在毒素B中鑒別了這樣的區(qū)域，其使得能夠特異性地區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)毒素B TcdB-10463與變異毒素TcdB-8864、TcdB_017和Tcd-027。令人驚訝地，該區(qū)域恰好涉及糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，其介導(dǎo)毒素B的酶活性。原則上，酶活性在所有毒素B中是相同的。用本發(fā)明中新產(chǎn)生的抗體允許建立不同組(類)的抗體(抗體組/抗體類)，其關(guān)于與標(biāo)準(zhǔn)毒素B和與不同的毒素B變異體的反應(yīng)活性而彼此相區(qū)別泛-TcdB抗體的組在下文中被稱為組I。該組的典型代表是單克隆抗體TGC 35和 2CV (從 EP 0994904 中獲知)。這樣的抗體的組在下文中被稱為組II 所述抗體既與標(biāo)準(zhǔn)毒素反應(yīng)也與毒素 TcdB-017反應(yīng)，但不與變異毒素TcdB-027和I~CdB-8864反應(yīng)。該組的典型代表是單克隆抗體 TGC 23。這樣的抗體的組在下文中被稱為組III 所述抗體與標(biāo)準(zhǔn)毒素TcdB-10463反應(yīng)， 但不與變異毒素TcdB-027、TcdB-8864和I~CdB-1470反應(yīng)。該組的典型代表是單克隆抗體 TGC 41。這樣的抗體的組在下文中被稱為組IV 所述抗體不與標(biāo)準(zhǔn)毒素B相互作用，但與毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027相互作用。該組的典型代表是單克隆抗體TGC 16。
這樣的抗體的組在下文中被稱為組V 所述抗體不與標(biāo)準(zhǔn)毒素B或毒素TcdB-017 反應(yīng)，但與毒素TcdB-8864和I~CdB-027反應(yīng)。該組的典型代表是單克隆抗體TGC 19。此外，從文獻(xiàn)中已知泛TcdA特異抗體的組，其在下文中被稱為組VI。該組的典型代表是單克隆抗體TTC8 (從EP 0994904中獲知)。實(shí)施例3 在捕獲-ELISA中檢測(cè)LCT-通過(guò)使用抗體組I、II、IV和VI建立對(duì)已知的變異艱難梭菌菌株的抗原-抗體參考模式原則上，抗原-抗體參考模式的建立如下進(jìn)行從現(xiàn)有技術(shù)中已知的且就存在待檢測(cè)的檢測(cè)測(cè)試中的艱難梭菌菌株RXl、Rx2> Rxi中各至少獲得毒素B，優(yōu)選兩種大梭菌毒素(LCT)均獲得(以培養(yǎng)物上清液或純化的毒素的形式)。用這些已知的毒素LCT-RXl、 LCT-RX2、LCT-RXi，與來(lái)自優(yōu)選地抗體組I至VI的每組的各至少一種抗體進(jìn)行反應(yīng)測(cè)試。將對(duì)于每種LCT (LCT-Rx1、LCT-Rx2、LCT-Rxi)和所采用的抗體組所獲得的反應(yīng)結(jié)果如此地以模式方式進(jìn)行登記在檢測(cè)到陽(yáng)性抗體反應(yīng)的情況下給各抗體組分配陽(yáng)性符號(hào)(例如“ + ”)， 或者在檢測(cè)到陰性抗體反應(yīng)的情況下給各抗體組分配陰性符號(hào)(例如，“_” )。在所設(shè)想的實(shí)施例中，具體如下進(jìn)行用實(shí)施例2中所描述的純化的抗體TGC35 (組I)、TGC23 (組II)、TGC 16 (組IV)和 TTC8(組VI)如下裝載ELISA-平板每孔用50 μ 1包被緩沖液(50mM Na2CO3>50mM NaHCO3, pH9. 6)與250ng含量的每種抗體在室溫下孵育3小時(shí)并從而使所述抗體附加至ELISA平板。隨后通過(guò)用 200μ1 5xffAPU(12. 5ml Triton X100，62.5ml IM Tris-HClpH7. 5,62. 5ml 20%的明膠溶液，用H2O加至500ml)孵育30分鐘的時(shí)間來(lái)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。如在實(shí)施例1中所描述地吸附艱難梭菌菌株10463、8864、1470和7002/8，并且在用抗體涂布的微量滴定板上給予50 μ 1等份的培養(yǎng)物上清液。通過(guò)用TBST(150mM NaCl, IOmM Tris、0.05% Tween20，pH8.0)清洗三次而去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。隨后，任選地，用50 μ 1多克隆抗毒素B-血清066ng/ml)在捕獲-ELISA中檢測(cè)各個(gè)結(jié)合了抗體的毒素。用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)堿性磷酸酶進(jìn)行顯色。這些ELISA的結(jié)果以圖表顯示在圖5中。從圖5中顯而易見的是，四種不同的艱難梭菌菌株中的每一種與四種所采用的抗體顯示出獨(dú)特的、對(duì)于其為特征性的反應(yīng)模式， 這使其與其它菌株的反應(yīng)模式相區(qū)別菌株VPI-10463的上清液與抗體TGC 35/組I、TGC 23/組II和TTC8/組VI陽(yáng)性地反應(yīng)，且與TGC 16/組IV陰性地反應(yīng)(見圖5A)。菌株8864的上清液與抗體TGC 35/組I和TGC 16/組IV陽(yáng)性地反應(yīng)，且與TGC 23/組II和TTC8/組VI陰性地反應(yīng)(見圖5B)。菌株1470 (核糖核酸型017)的上清液與抗體TGC 35/組I、TGC23/組II和TGC 16/組IV陽(yáng)性地反應(yīng)，且與TTC8/組VI陰性地反應(yīng)(見圖5C)。菌株7002/8(核糖核酸型027)的上清液與抗體TGC 35/組I、TGC16/組IV和 TTC8/組VI陽(yáng)性地反應(yīng)，且與TGC 23/組II陰性地反應(yīng)(見圖5D)。在用核糖核酸型027的艱難梭菌菌株的毒素B與抗體組I至VI的抗體的不同組合進(jìn)行的平行試驗(yàn)中，證實(shí)了該結(jié)果，TcdB-027與組I、IV、V和VI的抗體總是陽(yáng)性地反應(yīng)， 且與組II和III的抗體總是陰性地反應(yīng)。換言之，未知的艱難梭菌菌株的毒素B與六個(gè)抗體組的抗體的反應(yīng)模式“+-+++” (以組I、組II、組III、組IV、組V、組VI的順序)允許了這樣的推論所述未知的艱難梭菌菌株涉及核糖核酸型-027或所述核糖核酸型-027，而高毒力菌株c. d. -027-hv 也屬于此類型。在用核糖核酸型017的艱難梭菌菌株的毒素B與抗體組I至VI的抗體的不同組合進(jìn)行的平行試驗(yàn)中，證實(shí)了該結(jié)果，TcdB-017與組I、II和IV的抗體總是陽(yáng)性地反應(yīng)，且與組III、V和VI的抗體總是陰性地反應(yīng)。換言之，未知的艱難梭菌菌株的毒素B與六個(gè)抗體組的抗體的反應(yīng)模式 “++-+--” (以組I、組II、組III、組IV、組V、組VI的順序)允許了這樣的推論所述未知的艱難梭菌菌株涉及核糖核酸型-017或所述核糖核酸型-017，而高毒力菌株C. d. -017-hv 也屬于此類型。實(shí)施例4 根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)參考模式鑒別艱難梭菌核糖核酸型為了建立抗原-抗體-反應(yīng)參考模式，如在實(shí)施例3中所描述地進(jìn)行。對(duì)于建立樣品特異性反應(yīng)模式，如下進(jìn)行用已知的方法吸附待研究的艱難梭菌菌株并測(cè)試上清液或經(jīng)純化的毒素。為此，通過(guò)技術(shù)人員已知的和常用的方法將來(lái)自組I、 II、III、IV、V和VI的至少兩組、優(yōu)選三組或四組的各至少一種抗體(例如TGC16、TGC19、 TGC23、TGC 41、TGC 35和TTC8)涂布在合適的表面(例如膜)上。隨后，使樣品與這些抗體(下文中稱作鑒別抗體)接觸。對(duì)此適合的方法是技術(shù)人員已知的，例如ELISA或所謂的“側(cè)流”方法(如在EP 1143248中所描述的)。在方法特異性反應(yīng)時(shí)間的最后，從各配制物釋放未結(jié)合的樣品材料(清洗)。為了檢測(cè)哪種鑒別抗體與樣品顯示抗原-抗體反應(yīng)而哪種不反應(yīng)，利用檢測(cè)抗體。作為檢測(cè)抗體，可以使用針對(duì)毒素A和毒素B的多克隆血清(單特異性的或交叉反應(yīng)的)，或者還使用來(lái)自組I、II、III、IV、V和VI中一組或多組的抗體。在選擇檢測(cè)抗體時(shí)需注意，其目標(biāo)表位與鑒別抗體的目標(biāo)表位相區(qū)別或者原則上在各毒素中多重存在，從而檢測(cè)抗體能夠結(jié)合與鑒別抗體相結(jié)合的毒素。用適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，例如膠體金、碳顆?；蛉槟z顆?；蛎笜?biāo)記(例如HRP (辣根過(guò)氧化物酶)或堿性磷酸酶)標(biāo)記檢測(cè)抗體。在應(yīng)用樣品之前、或者與樣品同時(shí)或者在方法特異性反應(yīng)時(shí)間的過(guò)程中，在鑒別抗體和樣品之間向配制物中加入檢測(cè)抗體。在方法特異性反應(yīng)時(shí)間的最后去除(清洗掉)未與鑒別抗體相結(jié)合的樣品-毒素以及可能存在于樣品中的污染蛋白，是為了當(dāng)由鑒別抗體、樣品-毒素和檢測(cè)抗體形成結(jié)合物(復(fù)合物)時(shí)只出現(xiàn)一個(gè)標(biāo)記物信號(hào)(正信號(hào)“ + ”)。在反應(yīng)模式中，將對(duì)于每種鑒別抗體所獲得的標(biāo)記信號(hào)“ + ”或“_”排列在一起。 這樣的反應(yīng)模式可以例如看起來(lái)如圖5A。在此情形中，與參考模式的比較得出這樣的推論 (或懷疑診斷)存在艱難梭菌菌株VPI-10463。當(dāng)反應(yīng)模式例如看起來(lái)如圖5B時(shí)，與參考模式的比較得出這樣的推論(懷疑診斷)存在艱難梭菌菌株8864。當(dāng)反應(yīng)模式例如看起來(lái)如圖5C時(shí)，與參考模式的比較得出這樣的推論(懷疑診斷)存在艱難梭菌菌株1470或核糖核酸型017的艱難梭菌菌株。當(dāng)反應(yīng)模式例如看起來(lái)如圖5D時(shí)，與參考模式的比較得出這樣的推論(懷疑診斷)存在艱難梭菌菌株7002/8或核糖核酸型027的艱難梭菌菌株。實(shí)施例5 用組I、II、IV、VI的抗體分析不同的艱難梭菌菌株
在下面的實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)一系列具有已知核糖核酸型的菌株，S卩19種核糖核酸型 027 的菌株(Lumc-1、Lumc_2、Lumc_3、Lumc-4> Lumc_5、Lumc-6> Lumc-8> Lumc-9> Lumc-10> Lumc-ll> Lumc—12、Lumc-13> Lumc-14> Lumc—16、Lumc-17> Lumc-19> Lumc—20、Lumc—21、 7002-42)、4 種核糖核酸型 017 的菌株(Lumc_22、Lumc_23、Lumc_40、Lumc-41)、2 種核糖核酸型001的菌株(7002-29、7002-4；3)和一種核糖核酸型014的菌株(Lumc-31)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法以鑒別和檢測(cè)變異艱難梭菌菌株。作為參考菌株，使用菌株VPI-10463、8864和 7002/8。在捕獲-ELISA中采用組I、II、IV和VI的抗體并且將所得到的反應(yīng)模式與所建立的參考模式進(jìn)行比較(見實(shí)施例3)。如實(shí)施例1中所描述的，吸附不同的艱難梭菌菌株并將上清液用于隨后的實(shí)驗(yàn)中。作為鑒別抗體，如實(shí)施例3中所描述的，向ELISA平板上加載抗體TGC 35 (組I)、TGC 23(組 II)、TGC 16(組 IV)和 TTC8(組 VI)。其中各使用 250ng/孔 TGC 23、128ng/孔 TGC 16和TGC 35，以及1 μ g/孔TTC8，并隨后在PBS中清洗平板。為了進(jìn)行ELISA，首先通過(guò)在37°C下、在PBS+3% BSA中孵育1小時(shí)來(lái)封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。隨后加載50 μ 1/孔的艱難梭菌培養(yǎng)物上清液并將平板在37°C下再孵育1 小時(shí)。通過(guò)用PBS+3% BSA清洗三次來(lái)去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。作為檢測(cè)抗體，在TGC 35,TGC 16和TGC 23的情形中，使用經(jīng)生物素標(biāo)記的多克隆抗毒素B血清(0.32yg/ml)。在毒素 A檢測(cè)的情形中，也可將生物素化形式的抗體TTC8用作檢測(cè)抗體。在用PBS+3% BSA再次清洗后，加入50 μ 1抗生蛋白鏈菌素-HRP (0. 1 μ g/ml，Pierce, Rockford，USA) /孔并將該平板在37°C下孵育1小時(shí)。隨后，用PBS清洗所述平板并用50 μ 1/孔TMB (I-St印Ultra TMB, Pierce, Rockford, USA)進(jìn)行顯色。將平板在室溫下在黑暗中孵育30分鐘并隨后用 100 μ 1/孔的2Μ H2SO4終止反應(yīng)。相對(duì)于空白值在0D450處進(jìn)行評(píng)估。將0. 5確定為閾值。該試驗(yàn)的結(jié)果以圖的形式表示在圖6Α和圖6Β中·在19個(gè)不同的菌株中，以組I、II、IV和VI的順序檢測(cè)反應(yīng)模式“+_++”。 在4個(gè)不同的C. d.-017-hv-菌株中，以組I、II、IV和VI的順序檢測(cè)反應(yīng)模式 “+++-”。017菌株的分析顯示，該菌株在體外總體產(chǎn)生相對(duì)少的毒素(TGC 35信號(hào)也按比例地弱)。但是，明確的是，只在這些菌株中發(fā)生抗體TGC 23 (DSM ACC 2917)與毒素Β-017 之間的特異反應(yīng)。而在所有其它上清液的情形中(即所有C. d.-027-hv菌株，以及全部所測(cè)試的核糖核酸型001菌株)，在使用檢測(cè)抗體TGC 23時(shí)的值不超過(guò)0. 4，在C. d. -017-hv 菌株的情況下，吸光度總是清楚地超過(guò)0. 5的閾值。結(jié)果證實(shí)了，以組I、II、IV和VI的順序的抗原-抗體反應(yīng)模式“+_++”允許這樣的論斷所研究的菌株是C. d. -027-hv菌株，并且在以組I、II、IV和VI的順序的反應(yīng)模式為“+++-”時(shí)必然推斷出存在C. d. -017-hv菌株。所提及文獻(xiàn)的列表Moos 等人(2000) “ Purification and evaluation of large clostridial cytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies " , Meth Enzymo1. 325 :114_125。Soehn 等人(1998) " Genetic rearrangement in the pathogenicity locus of Clostridium difficile strain 8864-implications for transcription, expression and enyzmatic activity of toxin A and B" Mol Gen Genet 258 :222_2320
Stubbs ·入(1999) 〃 PCR targeted to the 16-23rRNA gene intergenic space region of Clostridium difficile and construction of a library of116 different PCR ribotypes" ,J Clin Microbiol 37 :461_463。von Eichel-Streiber 等人(1995) " Closing in on the toxic domain through analysis of a variant Clostridium difficile cytotoxin B" Mol Microbiol 17 313-321。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)和鑒別樣品中變異艱難梭菌(C.difficile)菌株的方法，其特征在于下述步驟(a)獲得身體排泄物樣品和/或身體組織樣品，(b)使該樣品與各來(lái)自抗體組組I、組II、組III、組IV、組V和組VI中的至少三組的至少一種抗體接觸，其中組I包含下述抗體泛TcdB抗體，組II包含下述抗體與毒素 ^(1Β-10463和TcdB_017反應(yīng)，而不與毒素I~cdB-8864和 TcdB-027反應(yīng)的抗體，組III包含下述抗體與 ^(1Β-10463反應(yīng)，而不與毒素TcdB_8864、TcdB-017和 TcdB-027反應(yīng)的抗體，組IV包含下述抗體與毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027反應(yīng)，而不與毒素 TcdB-10463反應(yīng)的抗體，組V包含下述抗體與毒素 ^(1Β-8864和TcdB-027反應(yīng)，而不與毒素I~cdB-10463和 TcdB-017反應(yīng)的抗體，組VI包含下述抗體泛TcdA抗體。(c)檢測(cè)抗體反應(yīng)并生成反應(yīng)模式，其中關(guān)于每個(gè)在(b)中所采用的、各抗體組I至VI 的抗體，對(duì)于檢測(cè)到的陽(yáng)性抗體反應(yīng)分配陽(yáng)性符號(hào)(例如，“ + ”)，對(duì)于檢測(cè)到的陰性抗體反應(yīng)分配陰性符號(hào)(例如，“_”)，和(d)將在(c)中獲得的反應(yīng)模式與參考模式進(jìn)行比較，所述參考模式通過(guò)下述方式獲得來(lái)自現(xiàn)有技術(shù)中已知的且在檢測(cè)測(cè)試中就存在而進(jìn)行檢測(cè)的艱難梭菌菌株RXl、Rx2> Rxi,在與步驟(b)中所選擇的來(lái)自抗體組I至VI中至少三組的抗體的反應(yīng)測(cè)試中采用了至少一種、Rx1, Rx2, Rxi各自的大梭菌毒素(LCT) LCT-RXl、LCT-Rx2, LCT-Rxi,并且將對(duì)于每種 LCT與抗體組I至VI中至少三組所獲得的反應(yīng)結(jié)果如此地以模式方式進(jìn)行登記在檢測(cè)到陽(yáng)性抗體反應(yīng)的情況下給各抗體組分配陽(yáng)性符號(hào)(例如，“ + ” )，或者在檢測(cè)到陰性抗體反應(yīng)的情況下給各抗體組分配陰性符號(hào)(例如，“_” )，(e)評(píng)估在(c)中獲得的反應(yīng)模式與參考模式之間的一致性作為樣品中存在相關(guān)參考模式的艱難梭菌菌株的指示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一種來(lái)自組IV的抗體是單克隆抗體 TGC16 (DSM ACC2915)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的方法，其特征在于，所述至少一種來(lái)自組V的抗體是單克隆抗體 TGC 19 (DSM ACC2916)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的方法，其特征在于，所述至少一種來(lái)自組VI的抗體是單克隆抗體 TTC8(DSM ACC 2322)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的方法，其特征在于，所述至少一種來(lái)自組I的抗體是單克隆抗體 2CV(DSM ACC 2321)或單克隆抗體 TGC 35 (DSM ACC2918)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的方法，其特征在于，所述至少一種來(lái)自組II的抗體是單克隆抗體 TGC23 (DSM ACC2917)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的方法，其特征在于，所述至少一種來(lái)自組III的抗體是單克隆抗體 TGC41 (DSM ACC2919)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的方法，其特征在于，在步驟(b)中，使樣品與來(lái)自組I、IV和VI的每組的各抗體接觸，以及在步驟(C)中，來(lái)自組I、IV和VI的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)顯示高毒力變異艱難梭菌菌株的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的方法，其特征在于，在步驟(b)中，使樣品與來(lái)自抗體組組II、組IV和組VI的每組的各至少一種抗體接觸，以及在步驟(c)中，來(lái)自組IV及組VI的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)和來(lái)自組II的抗體的陰性反應(yīng)顯示高毒力艱難梭菌菌株核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III的存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，此外，在步驟(b)中，使樣品與抗體組I和/或抗體組III和/或抗體組V的各至少一種抗體接觸，以及此外，在步驟(c)中，來(lái)自組I及組V的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)和來(lái)自組III的抗體的陰性反應(yīng)顯示高毒力艱難梭菌菌株核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III的存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的方法，其特征在于，在步驟(b)中，使樣品與來(lái)自抗體組組II、組IV和組VI的每組的各至少一種抗體接觸，以及在步驟(c)中，來(lái)自組II及組IV的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)和來(lái)自組VI的抗體的陰性反應(yīng)顯示高毒力艱難梭菌菌株核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，此外，在步驟(b)中，使樣品與抗體組I和/或抗體組III和/或抗體組V的各至少一種抗體接觸，以及此外，在步驟(C)中，來(lái)自組I的抗體的陽(yáng)性反應(yīng)和來(lái)自組III及組V的抗體的陰性反應(yīng)顯示高毒力艱難梭菌菌株核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F的存在。
14.單克隆抗體，其由以編號(hào)DSMACC2916(TGC 19)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，所述抗體用于根據(jù)權(quán)利要求1至13之一、特別是根據(jù)權(quán)利要求10或11 的方法，以檢測(cè)和鑒別艱難梭菌菌株核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III。
15.單克隆抗體，其由以編號(hào)DSMACC2917(TGC 23)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，所述抗體用于根據(jù)權(quán)利要求1至13之一、特別是根據(jù)權(quán)利要求12或13 的方法，以檢測(cè)和鑒別艱難梭菌菌株核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F。
16.單克隆抗體，其由以編號(hào)DSMACC2915(TGC 16)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，所述抗體用于根據(jù)權(quán)利要求1至13之一、特別是根據(jù)權(quán)利要求10至13 之一的方法，以檢測(cè)和鑒別具有核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F和/或具有核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III的艱難梭菌菌株。
17.單克隆抗體，其由以編號(hào)DSMACC2918(TGC 35)保藏于德國(guó)布倫瑞克的DSMZ的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，所述抗體用于根據(jù)權(quán)利要求1至13之一、特別是根據(jù)權(quán)利要求10至13 之一的方法，以檢測(cè)和鑒別具有核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F和/或具有核糖核酸型027，PFGE-NAP1、REA-Bl和毒素型III的艱難梭菌菌株。
全文摘要
用于檢測(cè)和鑒別樣品中變異艱難梭菌菌株的方法，其特征在于下述步驟(a)獲得患者的身體排泄物樣品和/或身體組織樣品，(b)使該樣品與至少一種抗體接觸，所述抗體各來(lái)自抗體組組I、組II、組III、組IV、組V和組VI中的至少三組，(c)檢測(cè)抗體反應(yīng)并生成反應(yīng)模式，(d)將在(c)中獲得的反應(yīng)模式與現(xiàn)有技術(shù)中已知的且在檢測(cè)測(cè)試中就存在待檢測(cè)的艱難梭菌菌株的參考模式進(jìn)行比較，(e)評(píng)估在(c)中獲得的反應(yīng)模式與參考模式之間的一致性作為樣品中存在具有相關(guān)參考模式的艱難梭菌菌株的指示。
文檔編號(hào)C07K16/12GK102482331SQ200980160527
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者C·馮埃歇爾斯特雷伯, K·吉施, M·默斯, V·布勞恩 申請(qǐng)人:碧奧迪克斯有限公司