專利名稱：作用于胰高血糖素受體的抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與作用于胰高血糖素受體的抗體及這些抗體的衍生物相關(guān)的組合物和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于這種方法中的藥物組合物及衍生物。更具體地，本發(fā)明涉及可特異結(jié)合胰高血糖素受體的單克隆抗體和多克隆抗體及其片段的生產(chǎn)、診斷應(yīng)用和治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
控制不佳的II型糖尿病患者的空腹高血糖(fasting hyperglycemia)與葡萄糖生成速率的增加密切相關(guān)，反過來又可歸因于糖原異生速率的增加。多項(xiàng)研究已經(jīng)證明，升高的胰高血糖素水平部分是由II型糖尿病患者體內(nèi)增加的肝葡萄糖生成(hepatic glucose production)造成的。胰高血糖素為胰腺α細(xì)胞中含四個氨基酸的激素，其對胰島素作用具有重要的反向調(diào)節(jié)功能。禁食期間，胰高血糖素分泌增加以響應(yīng)循環(huán)中的低葡萄糖水平。增加的胰高血糖素分泌通過促進(jìn)肝糖原異生和糖原分解刺激了葡萄糖的生成。此外，胰高血糖素降低了肝臟中糖原的合成。臨床上，對具有顯著低血糖癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的患者施用胰高血糖素。相反，胰高血糖素通路的抑制可能為治療II型糖尿病提供方案。胰高血糖素的生物學(xué)效應(yīng)是通過其結(jié)合到細(xì)胞表面上的特定受體一胰高血糖素受體，并隨后激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而介導(dǎo)的。胰高血糖素受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR) 的B家族。它主要表達(dá)于肝臟和腎臟中，這反映了其在這些組織中作為葡萄糖排出和糖原異生調(diào)節(jié)劑的主要作用。肝臟中胰高血糖素受體的激活刺激了腺苷酸環(huán)化酶的活性和磷酸肌醇的周轉(zhuǎn)(turnover)，導(dǎo)致幾種關(guān)鍵的糖原異生酶的表達(dá)增加?？紤]到胰高血糖素在控制高血糖中的關(guān)鍵作用，抑制胰高血糖素激活途徑的方案可提供治療II型糖尿病的方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供作用于胰高血糖素受體的抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供重組載體、宿主細(xì)胞、分離的細(xì)胞系和用于生產(chǎn)該抗體的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明的再一個目的是提供含有所述抗體的藥物組合物。本發(fā)明的又一個目的是提供利用這些抗體治療II型糖尿病及相關(guān)疾病的方法。技術(shù)方案本發(fā)明的一個方面涉及能夠特異性結(jié)合胰高血糖素受體的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，包括(a)第一組⑶R，⑶Rl、⑶R2和⑶R3依次一起包含重鏈⑶R的氨基酸序列，⑶Rl、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；(b)第二組⑶R，⑶Rl、⑶R2和⑶R3依次一起包含輕鏈⑶R的氨基酸序列，⑶Rl、 CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No. 18、20、22、24、洸、沘和30中任一所示的氨基酸序列；或，(c) (a)中所述的第一組⑶R和(b)中所述的第二組⑶R的組合。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體包括重鏈或輕鏈，或兩者，其中所述重鏈包括選自下組的重鏈可變區(qū)HC1(SEQ ID No. 2)、HC2(SEQ ID No. 4)、HC3 (SEQ ID No. 6)、HC4 (SEQ ID No. 8)、HC5(SEQID No. 10)、HC6(SEQ ID No. 12)、HC7(SEQ ID No. 14)、HC8(SEQ IDNo. 16) 及其抗原結(jié)合片段；且所述輕鏈包括選自下組的輕鏈可變區(qū)LC1(SEQ ID No. 18)、LC2(SEQ ID No. 20)、LC3 (SEQ ID No. 22)、LC4 (SEQ ID No. 24)、LC5 (SEQ ID No. 26)、LC6 (SEQ ID No. 28), LC7 (SEQ ID No. 30)及其抗原結(jié)合片段。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體選自下組(a)包括如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 18中所示氨基酸序列的抗體(Abl)；(b)包括如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 20中所示氨基酸序列的抗體(Ab2)；(c)包括如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 22中所示氨基酸序列的抗體(Ab3)；(d)包括如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 24中所示氨基酸序列的抗體(Ab4)；(e)包括如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 26中所示氨基酸序列的抗體(Ab5)；(f)包括如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 26中所示氨基酸序列的抗體(Ab6)；(g)包括如SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 28中所示氨基酸序列的抗體(Ab7)；(h)包括如SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 30中所示氨基酸序列的抗體(Ab8)；(i)包括如SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 26中所示氨基酸序列的抗體(Ab9)；以及，(j)包括如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 22中所示氨基酸序列的抗體(AblO)。在另一個方面，本發(fā)明涉及競爭結(jié)合胰高血糖素受體的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物。在一個實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合劑以與參考抗體基本上相同的Kd結(jié)合到人胰高血糖素受體上，或者以與參考抗體基本上相同的IC50抑制受體的胰高血糖素刺激作用，或與參考抗體競爭結(jié)合受體。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，包括(a)第一組⑶R，⑶R1、⑶R2和⑶R3依次一起與重鏈⑶R的氨基酸序列具有至少 85% 的一致性，CDRU CDR2 和 CDR3 依次一起包含于如 SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14 和 16 中任一所示的氨基酸序列；(b)第二組⑶R，⑶R1、⑶R2和⑶R3依次一起與輕鏈⑶R的氨基酸序列具有至少 85% 的一致性，CDR1、CDR2 和 CDR3 依次一起包含于如 SEQ ID No. 18、20、22、24、26、28 和 30
中任一所示的氨基酸序列；或，(c) (a)中所述的第一組⑶R和(b)中所述的第二組⑶R的組合，其中所述抗體或抗原結(jié)合部位或衍生物與胰高血糖素競爭結(jié)合胰高血糖素受體。所述抗體可包括含有可變區(qū)的重鏈，該可變區(qū)含有的氨基酸序列與選自SEQ ID
5No. 2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列具有至少85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%和最優(yōu)選 99%的一致性。此外，所述抗體可包括含有可變區(qū)的輕鏈，該可變區(qū)含有的氨基酸序列與選自SEQ ID No. 18、20、22、對、26、觀或30的氨基酸序列具有至少85%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選 95%和最優(yōu)選99%的一致性。在另一個方面，本發(fā)明提供分離的抗體或抗原結(jié)合部位，包括選自下組的氨基酸序列(a)通過氨基酸的添加、缺失和/或非保守替換，與選自SEQ IDNo. 2、4、6、8、10、 12、14和16的⑶R3序列差異總共不超過3個氨基酸的重鏈⑶R3序列；(b)通過氨基酸的添加、缺失和/或非保守替換，與選自SEQ IDNo. 18、20、22、24、 26,28和30的⑶R3序列差異總共不超過3個氨基酸的輕鏈⑶R3序列；(c) (a)中所述的重鏈⑶R3序列和(b)中所述的輕鏈⑶R3序列的組合，其中所述抗體或抗原結(jié)合部位與胰高血糖素受體結(jié)合。本發(fā)明的另一個方面涉及含有抗體或其功能片段以及藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明的組合物包括重鏈和/或輕鏈，其可變域，或其抗原結(jié)合部位，或編碼所述抗體、抗體鏈或其可變域的核酸分子，以及與一種或多種藥用載體或融合伴侶形成的混合物。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括其它組分，如治療劑或診斷劑。本發(fā)明又一個方面涉及含有編碼所述抗體的輕鏈可變域、重鏈可變域或兩者的多核苷酸序列的分離的核酸。所述核酸可包括一種或多種如SEQ ID No. 1、3、5、7、9、11、13、 15、17、19、21、23、25、27和29所示的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個方面涉及重組表達(dá)載體，其含有參考序列的核酸。本發(fā)明的另一個方面涉及宿主細(xì)胞，其通過用所述載體轉(zhuǎn)化得到。本發(fā)明的另一個方面涉及分離細(xì)胞系，其生產(chǎn)所述抗體、或其重鏈或輕鏈或抗原結(jié)合部位。本發(fā)明的另一個方面涉及雜交瘤細(xì)胞，其生產(chǎn)所述抗體、或其重鏈或輕鏈或抗原結(jié)合部位。本發(fā)明的另一個方面涉及用于降低血糖、改善糖耐量或用于治療、預(yù)防或抑制患病個體中II型糖尿病、血脂異?；蛳嚓P(guān)疾病的方法，其包括向個體施用所述抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，或所述藥物組合物的步驟。所述胰高血糖素受體抗體可以單獨(dú)施用，或與其它抗體或其它藥物聯(lián)合施用。有益效果本發(fā)明提供基于干擾胰高血糖素受體激活的組合物和方法，包括但不限于通過結(jié)合胰高血糖素受體的胞外部分。本發(fā)明所述的拮抗劑提供用于靶向與糖尿病及相關(guān)疾病有關(guān)的生理狀況的重要治療劑和診斷劑。因此，本發(fā)明提供與調(diào)節(jié)胰高血糖素受體通路相關(guān)的方法、組合物、試劑盒及生產(chǎn)的制品。


圖1表明選定抗體與表達(dá)于細(xì)胞表面的胰高血糖素受體結(jié)合的能力。將不同量的抗體添加到表達(dá)全長人胰高血糖素受體的CHO細(xì)胞中。洗滌后，用HRP標(biāo)記的抗人抗體檢測仍保留于細(xì)胞上的抗體，隨后通過添加底物來顯示HRP活性。
圖2表明對于胰高血糖素刺激，作用于胰高血糖素受體的抗體抑制了 cAMP的產(chǎn)生。將表達(dá)全長人胰高血糖素受體的穩(wěn)定的細(xì)胞系與不同量的抗體孵育。15分鐘后，向細(xì)胞中添加IOOpM胰高血糖素，并使用cAMP HTRF試劑盒(CIS Bio)測定cAMP的水平。重復(fù)樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差如圖所示。圖3-圖5顯示了分離的抗胰高血糖素受體抗體的輕鏈和重鏈可變域的預(yù)測氨基酸序列。下劃線序列從左至右表示⑶R1、⑶R2和⑶R3。圖6顯示了以lmg/kg和7mg/kg注射選定抗體(Ab7)的高脂肪誘導(dǎo)肥胖小鼠的血糖水平。單次注射抗體或緩沖液對照后，在第0、1、2、3和10天測定血糖。數(shù)值為根據(jù)每組 9-10只小鼠計(jì)算的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7顯示了高脂肪誘導(dǎo)的肥胖小鼠的空腹血糖水平和基礎(chǔ)肝葡萄糖生成(HGP) 率。采用放射性同位素稀釋法測定基礎(chǔ)HGP(Choi C. S.等，Natl Acad Sci U-S-A, 2007，104 :16480-85)。與賦形劑注射組相比，以7mg/kg注射Ab7的小鼠空腹血糖和基礎(chǔ) HGP率顯著下降，而兩組的基礎(chǔ)葡萄糖清除率無差異。數(shù)據(jù)表示為每組10只小鼠的平均值 +/-SEM0
具體實(shí)施例方式本文中使用的術(shù)語“抗體”是指由一種或多種基本上由公認(rèn)的免疫球蛋白基因的全部或部分編碼的多肽組成的蛋白。公認(rèn)的免疫球蛋白基因，例如在人體內(nèi)，包括由κ、λ 和重鏈遺傳座位，其共同包含無數(shù)個可變區(qū)基因和恒定區(qū)基因。其中，“抗體”可以指“特定抗原結(jié)合劑”。本領(lǐng)域技術(shù)人員會易于知曉，所述抗體可用作治療劑或診斷劑，因此，也可將 “抗體”稱為“治療劑”或“診斷劑”。本文中使用的“分離的抗體”是指基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合胰高血糖素受體的分離抗體基本上不含特異性結(jié)合除了胰高血糖素受體以外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合胰高血糖素受體的分離抗體，對其它抗原如來自其它物種的胰高血糖素受體具有交叉反應(yīng)。此外，分離的抗體可以基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。此外，分離的抗體，例如分離的人類抗體，可為嵌合抗體，其中，例如，可變區(qū)、CDR域或不同人源的同種抗體被移植到該親本人類抗體上。術(shù)語用于胰高血糖素受體的“中和抗體”是指根據(jù)檢測，可抑制胰高血糖素受體的胰高血糖素依賴性刺激至少約10 120 %，優(yōu)選至少30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %或以上的抗體。優(yōu)選通過至少一種如本文中所述的和/或本領(lǐng)域已知的以細(xì)胞為基礎(chǔ)的合適檢測來評估胰高血糖素受體抗體抑制胰高血糖素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。一個實(shí)例為，使用試劑盒，如cAMP HTRF試劑盒(CisBio)來測定由于胰高血糖素刺激而產(chǎn)生的cAMP。本文中使用的術(shù)語“保守氨基酸替換”是指將氨基酸殘基替換成具有類似的或更佳的(為了預(yù)期目的)功能和/或化學(xué)特性的氨基酸殘基，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知曉的。保守氨基酸替換往往是氨基酸殘基被替換成帶有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基。帶有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已有定義。例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸為堿性側(cè)鏈，天門冬氨酸和谷氨酸為酸性側(cè)鏈，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸為不帶電荷的極性側(cè)鏈，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、
7苯丙氨酸、蛋氨酸為非極性側(cè)鏈，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸為芳香族側(cè)鏈。用通常相似理化性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行的替換使得該替換不會本質(zhì)上改變肽、多肽或蛋白的特性或活性。兩條氨基酸序列之間的一致性百分率是兩條序列共有的氨基酸位置數(shù)量的函數(shù) (即相同氨基酸位置數(shù)量除以位置總數(shù)乘以100)，考慮到空位數(shù)量以及每個空位的長度， 需引入它們用于兩條序列的最佳比對。本發(fā)明的抗體還包括那些Vh和/或&中的框架殘基被修飾以改善抗體的一種或多種屬性的抗體。通常，這種框架的修飾用于降低免疫原性或改善抗體的穩(wěn)定性。除了在框架區(qū)或⑶R區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾，對本發(fā)明的抗體的改造也可包括在F。區(qū)的修飾，通常是改變抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、F。受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。抗體片段或衍生劑是抗體的一部分，或是不同形式的含有抗原結(jié)合部位，及任選地可使抗原結(jié)合蛋白的抗原結(jié)合部位結(jié)合抗原的骨架或框架部位的抗體一部分。例如，可進(jìn)行框架或CDR中的變化，如氨基酸替換、缺失或添加，然而仍保持其抗原結(jié)合的能力?；蛘?，本發(fā)明的抗原結(jié)合部位可以進(jìn)行衍生或與另一個分子(例如其它肽、蛋白、 聚合物或化學(xué)物質(zhì))相連?？贵w的抗原結(jié)合部位可被修飾成單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段(帶有V^CpVh和Cm的單價(jià)片段)、F(ab, )2片段(由二硫橋連接的兩個Fab片段)、Fd(VH 和Chi域)、scFv (Vl和Vh通過接頭連接)、域抗體、雙特異性抗體、微型抗體、scab (含有Vh 和Vl以及Cl或Chi的抗體片段)、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、Ig3 抗體、IgG4抗體或抗體恒定域的任意衍生物和基于蛋白骨架的人工抗體，包括但不限于，纖維連接蛋白型、高親和性多聚體(avimers)或細(xì)胞色素B。發(fā)明詳述本發(fā)明提供作用于胰高血糖素受體的分離的重組體和/或合成的抗體，以及組合物和含有編碼至少一種抗胰高血糖素受體抗體的至少一種多核苷酸的核酸分子。本發(fā)明提供基于但不限于通過與胰高血糖素受體的胞外部分結(jié)合而干擾胰高血糖素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的組合物和方法。本發(fā)明所述的拮抗劑提供用于靶向與糖尿病及相關(guān)疾病有關(guān)的生理狀況的重要治療劑和診斷劑。因此，本發(fā)明提供與調(diào)節(jié)胰高血糖素受體通路相關(guān)的方法、組合物、試劑盒及生產(chǎn)的制品。在一個方面，本發(fā)明提供適合治療使用的且能夠不同程度破壞胰高血糖素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗胰高血糖素受體治療劑。例如，本發(fā)明提供作用于胰高血糖素受體的人類抗體及其衍生物和片段，其含有編碼能夠結(jié)合胰高血糖素受體的全部或部分多肽的多核苷酸序列，如編碼全部或部分抗胰高血糖素受體抗體、抗體片段或抗體衍生物的核酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體為抑制人胰高血糖素和胰高血糖素受體結(jié)合的人類抗體。例如，本發(fā)明的抗體以低于1 μ M，優(yōu)選低于ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選ΙΟηΜ，最優(yōu)選InM的 IC5tl值抑制胰高血糖素結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體為依賴胰高血糖素來抑制cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的胰高血糖素受體特異性抗體分子，其包括含有與公開的抗體相應(yīng)氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體分子通過胰高血糖素受體抑制胰高血糖素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，重鏈可變域可包括與選自SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14和16的重鏈可變域序列具有至少80%、85%、 90%、95%、97%或99% —致性的氨基酸序列。此外，輕鏈可變域可包括與選自SEQ ID No. 18、20、22、24、26、28 和 30 的輕鏈可變域序列具有至少 80 % ,85 % ,90 % ,95 % ,97 % ^； 99% —致性的氨基酸序列。具體的實(shí)施方案為包括分別與公開的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)至少85 %，優(yōu)選90 %，更優(yōu)選95 %，最優(yōu)選99 %同源的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的拮抗劑。
在另一個實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白包括選自由SEQ IDNos.中所示的重鏈和輕鏈構(gòu)成的組合中的輕鏈可變域和重鏈可變域的組合。在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體分子，其含有如 SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24J6、28 和 30所示的重鏈和/或輕鏈可變域序列的變體(variant)及其保守改造。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過由來自如 SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、沘和 30 所示的各輕鏈和重鏈序列的可變域任意組合形成的抗體，以及在任一個或多個CDR序列中發(fā)生一個或多個保守氨基酸替換的其等價(jià)物，具體的實(shí)施方案為抑制胰高血糖素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的胰高血糖素依賴性激活的抗體。
本發(fā)明還提供包括與另一種異源多肽或聚合物連接或融合的胰高血糖素受體拮抗劑的嵌合分子。例如，已知用于從目標(biāo)抗體中衍生出不同亞類或同種抗體的技術(shù)，即亞類轉(zhuǎn)換(subclass switching)。這些抗體包括人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結(jié)合的抗體片段，如F(ab, )2、Fab、Fv、Fab,、F。和Fd片段，且它們可被整合至單域抗體中，如單鏈抗體、大抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、細(xì)胞內(nèi)抗體(intrabodies)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、vNAR和雙scFv (bisscFv) (Hoilinger, P. and Hudson, P. J.，2005，Nat Biotech,23 :112636)。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體、片段和衍生物可與其它多肽或化學(xué)物質(zhì)融合。 融合伴侶可以為肽、蛋白或抗體衍生物，其具有與其它蛋白特異結(jié)合活性，以產(chǎn)生雙特異性或多特異性分子或改善分子的理化性質(zhì)。此外，可對抗體進(jìn)行以下修飾糖基化、聚乙二醇化、交聯(lián)或與其它蛋白或化學(xué)物質(zhì)結(jié)合?？贵w的氨基酸可被非天然氨基酸取代。
胰高血糖素受體抗體可攜帶或與毒素、放射性同位素、放射性核素、脂質(zhì)體、靶向基團(tuán)、生物傳感器、陽離子尾鏈(cationic tail)或酶結(jié)合。這類拮抗劑組合物構(gòu)成本發(fā)明的另一個方面。
在某些情況下，得到不干預(yù)配體(如胰高血糖素)與受體結(jié)合的胰高血糖素受體拮抗劑抗體可能是有利的。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供不結(jié)合胰高血糖素受體上胰高血糖素結(jié)合位點(diǎn)的抗體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不明顯地抑制胰高血糖素與胰高血糖素受體的結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不明顯地與胰高血糖素競爭結(jié)合胰高血糖素受體。
在另一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的胰高血糖素受體拮抗劑抗體在制備治療和/ 或預(yù)防性治療疾病如糖尿病的藥劑中的應(yīng)用。
在另一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的表達(dá)載體在制備治療和/或預(yù)防性治療疾病如糖尿病的藥劑中的應(yīng)用。
在另一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防性治療疾病如糖尿病的藥劑中的應(yīng)用。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供本發(fā)明生產(chǎn)的制品在制備治療和/或預(yù)防性治療疾病如糖尿病的藥劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部位及藥用載體的藥物組合物。在一個實(shí)施方案中，所述藥物組合物進(jìn)一步包括至少一種用于治療疾病的其它治療劑，在所述疾病中胰高血糖素受體激活是不利的。
本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合部位可被摻入到適于對個體施用的藥物組合物中。通常，所述藥物組合物包括本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部位及藥用載體。本文中使用的“藥用載體”包括生理相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。藥用載體的實(shí)例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、右旋糖(dextrose)、甘油、 乙醇等中的一種或多種，以及它們的組合。在許多情況下，組合物中優(yōu)選地包括等滲劑，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。藥用載體可進(jìn)一步包括少量的能夠提高保質(zhì)期或者抗體或抗原結(jié)合部位有效性的輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑，防腐劑或緩沖液。
本發(fā)明的組合物可以為各種形式。這些形式包括，例如，液體、半固體和固體劑型， 如液體溶液(例如，可注射的及可輸注的溶液(infusible solutions))、分散液或懸浮液、 片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于給藥和治療應(yīng)用的目標(biāo)模式。通常優(yōu)選的組合物為可注射或輸注的溶液，如類似于那些用其它抗體被動免疫人類的組合物。
盡管對于許多治療應(yīng)用而言，優(yōu)選的給藥途徑/模式為皮下注射、靜脈注射或輸注，但是本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合部位可通過本領(lǐng)域已知的各種方法施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，給藥途徑/模式可根據(jù)所要達(dá)到的結(jié)果而有所不同。
輔助活性化合物也可摻入到所述組合物中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部位與一種或多種用于治療疾病的其它治療劑共同配制和/或共同給藥，在所述疾病中胰高血糖素受體激活是不利的。例如，本發(fā)明的抗胰高血糖素受體抗體或抗原結(jié)合部位可與一種或多種能夠結(jié)合其它靶分子的其它抗體共同配制和/或共同給藥。此外，本發(fā)明的一種或多種抗體可與兩種或兩種以上的治療劑組合使用。這種組合療法可有利地利用低劑量施用的治療劑，從而避免了與各種單一療法相關(guān)的可能的毒性或并發(fā)癥。
本發(fā)明的藥物組合可包含“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部位。“治療有效量”是指有效且對于必要時期而言，能達(dá)到理想治療結(jié)果的劑量?？贵w或抗原結(jié)合部位的治療有效量可根據(jù)不同因素，如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個體體重，以及所述抗體或抗原結(jié)合部位引發(fā)個體所需響應(yīng)的能力而有所不同。治療有效量也是指抗體或抗原結(jié)合部位的治療有益效果大于任何毒性或不利影響的劑量。“預(yù)防有效量”是指有效且對于必要時期而言，能達(dá)到理想的預(yù)防結(jié)果的劑量。通常，由于預(yù)防劑量是應(yīng)用于疾病前或疾病早期階段的個體，因此預(yù)防有效量將少于治療有效量。
本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部位的示例性的、非限制性的治療或預(yù)防有效量的范圍為 0. 01-100mg/kg，更優(yōu)選0. l_30mg/kg。應(yīng)當(dāng)注意的是，劑量值可隨著待緩解的病癥類型和嚴(yán)重程度而有所不同。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，對于任何特定個體而言，特定劑量方案應(yīng)根據(jù)個人需要以及給藥和監(jiān)管組合物施用的人的專業(yè)判斷，隨著時間的推移來調(diào)整，本文中列出的劑量范圍僅為示例性的，不用來限制所要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。
以下，將參考下面的實(shí)施例來具體解釋本發(fā)明，提供的實(shí)施例只為更好地理解本發(fā)明，但不應(yīng)理解為以任何方式對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1 篩選結(jié)合胰高血糖素受體的抗體
產(chǎn)生表達(dá)C-末端融合有GFP的全長人胰高血糖素受體的HEK293和CHO細(xì)胞。通過FACS分選出穩(wěn)定的庫，并分選出高熒光細(xì)胞，從而富集高水平表達(dá)胰高血糖素受體的細(xì)胞。
為了產(chǎn)生編碼人胰高血糖素受體胞外第一域(1st extracellular domain)的蛋白，將組成人胰高血糖素受體胞外第一域的哺乳動物表達(dá)載體與人IgGl的F。部分在C-末端融合(NTD-F。)。將該構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，并收獲條件培養(yǎng)基。采用親和純化，使用蛋白A瓊脂糖珠(Pierce)通過親和純化對NTD-F。融合蛋白進(jìn)行純化。
使用NTD-F。和表達(dá)胰高血糖素受體的細(xì)胞對展示人類抗體scFv的噬菌體文庫進(jìn)行淘選(pan)。源于健康人體的人類cDNA制備得到，并使用pill融合展示于M13噬菌體上。為了進(jìn)行淘選(panning)，將純化的NTD-F。固定在G蛋白磁珠(Invitrogen)上， 第一輪用三乙胺洗脫結(jié)合的噬菌體。表達(dá)融合有GFP的胰高血糖素受體的HEK293細(xì)胞和 CHO細(xì)胞用于隨后的幾輪淘選。經(jīng)過3輪淘選，根據(jù)ELISA法中其結(jié)合NTD-F。的能力檢驗(yàn)單獨(dú)的噬菌體克隆。然后通過細(xì)胞ELISA法(cell based ELISA)檢測陽性噬菌體在表達(dá)融合了 GFP的胰高血糖素受體的CHO或HEK293細(xì)胞中的結(jié)合。
實(shí)施例2 抗體轉(zhuǎn)化和活性測試
對選定的噬菌體克隆進(jìn)行測序，并通過瞬時表達(dá)，將特定的克隆轉(zhuǎn)化至人類IgG2 中，從而產(chǎn)生完整的人類抗體。收獲條件培養(yǎng)基，使用蛋白A瓊脂糖珠(Pierce)純化抗體。 然后制備用于細(xì)胞ELISA法的不同量的抗體，以測定其與人胰高血糖素受體的結(jié)合能力。
然后使用cAMP HTRF試劑盒^isBio)測定純化的抗體在cAMP檢測中的中和活性。 在將胰高血糖素加入細(xì)胞之前，向表達(dá)胰高血糖素受體的細(xì)胞中加入不同量的抗體并孵育 15分鐘。根據(jù)cAMP的生成量測定胰高血糖素受體的刺激。根據(jù)IOOpM胰高血糖素刺激對 cAMP生成的抑制百分?jǐn)?shù)來測定抗體效價(jià)。
實(shí)施例3 高脂肪誘導(dǎo)的肥胖模型中抗體的體內(nèi)療效測試
為了測試抗體在體內(nèi)的療效，瞬時表達(dá)Ab7并進(jìn)行純化。經(jīng)過蛋白A純化后，對抗體進(jìn)行定量并通過cAMP檢測證實(shí)其活性。
對于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型，馴化C57BL/6雄性小鼠并飼喂高脂飲食(60%脂肪卡路里，研究飲食(Research Diet))6周。施用當(dāng)天，采集小鼠血液，進(jìn)行基線血糖測定， 隨后立即進(jìn)行體重測量。將將體重和血糖具有相似分布的小鼠分為3組(每組n = 9 10)。然后以7mg/kg和lmg/kg給小鼠單次腹膜內(nèi)注射(IP)賦形劑或抗體。單次注射后在第1、2、3和10天測定血糖。
實(shí)施例4 根據(jù)放射性同位素稀釋法檢驗(yàn)抗體效果的分子機(jī)制
為進(jìn)一步理解所述抗體的葡萄糖降低效果的機(jī)制，通過放射性同位素標(biāo)記的葡萄糖輸注來評估肝臟和外周胰島素的敏感性(Choi C. S.等，Natl Acad Sci U-S-A， 2007，104 :16480-85)。馴化C57BL/6雄性小鼠并飼喂高脂肪飲食(60%脂肪卡路里；研究飲食(Research Diet))6周。進(jìn)行研究前7天，將留置導(dǎo)管置于頸靜脈內(nèi)。然后在實(shí)驗(yàn)前 48h，給小鼠單次腹膜內(nèi)注射(IP)賦形劑或抗體7mg/kg。
空腹過夜后，靜脈輸注[3」H]葡萄糖(Perkin Elmer) 2小時，以評估基礎(chǔ)葡萄糖出現(xiàn)率(基礎(chǔ)肝葡萄糖生成，basal hepatic glucose production)。在基礎(chǔ)期結(jié)束時，采集血液樣本(20 μ 1)，測定空腹血糖濃度及[3- ]-葡萄糖活性。根據(jù)基礎(chǔ)期結(jié)束時[3- ]-葡萄糖輸注率(每分鐘分解量[dpm])與血糖具體活性(dpm/mg)的比值來確定基礎(chǔ)全身葡萄糖出現(xiàn)率。
序列表自由文本
SEQIDNo.ι表示3鏈可變區(qū)HCl的核苷酸序列；
SEQIDNo.2表示3鏈可變區(qū)HCl的氨基酸序列；
SEQIDNo.3表示3鏈可變區(qū)HC2的核苷酸序列；
SEQIDNo.4表示3鏈可變區(qū)HC2的氨基酸序列；
SEQIDNo.5表示重鏈可變區(qū)HC3的核苷酸序列；
SEQIDNo.6表示重鏈可變區(qū)HC3的氨基酸序列；
SEQIDNo.7表示3鏈可變區(qū)HC4的核苷酸序列；
SEQIDNo.8表示3鏈可變區(qū)HC4的氨基酸序列；
SEQIDNo.9表示重鏈可變區(qū)HC5的核苷酸序列；
SEQIDNo.10表示:惹鏈可變區(qū)HC5的氨基5脧序列
SEQIDNo.11表示:惹鏈可變區(qū)HC6的核苷5脧序列
SEQIDNo.12表示:惹鏈可變區(qū)HC6的氨基5脧序列
SEQIDNo.13表示:惹鏈可變區(qū)HC7的核苷5脧序列
SEQIDNo.14表示:惹鏈可變區(qū)HC7的氨基5脧序列
SEQIDNo.15表示:惹鏈可變區(qū)HC8的核苷5脧序列
SEQIDNo.16表示:惹鏈可變區(qū)HC8的氨基5脧序列
SEQIDNo.17表示輕鏈可變區(qū)LCl的核苷5脧序列
SEQIDNo.18表示輕鏈可變區(qū)LCl的氨基5脧序列
SEQIDNo.19表示輕鏈可變區(qū)LC2的核苷5脧序列
SEQIDNo.20表示輕鏈可變區(qū)LC2的氨基5脧序列
SEQIDNo.21表示輕鏈可變區(qū)LC3的核苷5脧序列
SEQIDNo.22表示輕鏈可變區(qū)LC3的氨基5脧序列
SEQIDNo.23表示輕鏈可變區(qū)LC4的核苷5脧序列
SEQIDNo.24表示輕鏈可變區(qū)LC4的氨基5脧序列
SEQIDNo.25表示輕鏈可變區(qū)LC5的核苷5脧序列
SEQIDNo.26表示輕鏈可變區(qū)LC5的氨基5脧序列
SEQIDNo.27表示輕鏈可變區(qū)LC6的核苷5脧序列
SEQIDNo.28表示輕鏈可變區(qū)LC6的氨基5脧序列
SEQIDNo.29表示輕鏈可變區(qū)LC7的核苷5脧序列
SEQIDNo.30表示輕鏈可變區(qū)LC7的氨基5脧序列。
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其包括(a)第一組⑶R，⑶R1、⑶R2和⑶R3依次一起包含重鏈⑶R的氨基酸序列，⑶R1、⑶R2 和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；(b)第二組⑶R，CDRl、⑶R2和⑶R3依次一起包含輕鏈⑶R的氨基酸序列，⑶R1、⑶R2 和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No. 18、20、22、對、26、觀和30中任一所示的氨基酸序列； 或，(c)(a)中所述的第一組⑶R和(b)中所述的第二組⑶R的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其包括重鏈或輕鏈，或兩者，其中所述重鏈包括具有如SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合片段；以及所述輕鏈包括具有如SEQ ID No. 18,20, 22,24,26,28和30中任一所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其選自下組(a)包括如SEQID No. 2和SEQ ID No. 18中所示氨基酸序列的抗體；(b)包括如SEQID No. 4和SEQ ID No. 20中所示氨基酸序列的抗體；(c)包括如SEQID No. 6和SEQ ID No. 22中所示氨基酸序列的抗體；(d)包括如SEQID No. 8和SEQ ID No. 24中所示氨基酸序列的抗體；(e)包括如SEQID No. 6和SEQ ID No. 26中所示氨基酸序列的抗體；(f)包括如SEQID No. 10和SEQ ID No. 26中所示氨基酸序列的抗體；(g)包括如SEQID No. 12和SEQ ID No. 28中所示氨基酸序列的抗體；(h)包括如SEQID No. 14和SEQ ID No. 30中所示氨基酸序列的抗體；(i)包括如SEQID No. 16和SEQ ID No. 26中所示氨基酸序列的抗體；以及，(j)包括如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 22中所示氨基酸序列的抗體。
4.一種分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其與包括如SEQ ID No.2、4、6、8、10、 12、14和16中任一所示的氨基酸序列和如SEQ ID No. 18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列組合的抗體競爭結(jié)合胰高血糖素受體。
5.一種分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其包括(a)第一組⑶R，⑶R1、⑶R2和⑶R3依次一起與重鏈⑶R的氨基酸序列具有至少85% 的一致性，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No. 2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；(b)第二組⑶R，⑶R1、⑶R2和⑶R3依次一起與輕鏈⑶R的氨基酸序列具有至少85% 的一致性，CDRU CDR2 和 CDR3 依次一起包含于如 SEQ ID No. 18、20、22、M、26、28 和 30 中任一所示的氨基酸序列；或，(c)(a)中所述的第一組⑶R和(b)中所述的第二組⑶R的組合，其中所述抗體或抗原結(jié)合部位或衍生物與胰高血糖素受體結(jié)合。
6.一種分離的抗體或抗原結(jié)合部位，其包括選自下組的氨基酸序列(a)通過氨基酸的添加、缺失和/或非保守替換，與選自SEQID No. 2、4、6、8、10、12、14 和16的⑶R3序列差異總共不超過3個氨基酸的重鏈⑶R3序列；(b)通過氨基酸的添加、缺失和/或非保守替換，與選自SEQID No. 18、20、22、對、26、 28和30的⑶R3序列差異總共不超過3個氨基酸的輕鏈⑶R3序列；(c) (a)中所述的重鏈CDR3序列和(b)中所述的輕鏈CDR3序列的組合， 其中所述抗體或抗原結(jié)合部位與胰高血糖素受體結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其為單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其中所述抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物選自下組人類抗體、人源化抗體、結(jié)合抗原的抗體片段、 單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(ab, )2片段、Fd、scFv、域抗體、雙特異性抗體、微型抗體、scab、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、Ig3抗體、IgG4 抗體、抗體恒定域的任意衍生物和基于蛋白骨架的人工抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，其中所述抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物與其它多肽融合或與其它化學(xué)物質(zhì)連接。
10.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物以及一種或多種藥用載體。
11.分離的核酸，其含有編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的抗體的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)或兩者的多核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的核酸，其包括一種或多種如SEQID No. 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、25、27 和 29 所示的核苷酸序列。
13.重組表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求11或12所述的核酸。
14.宿主細(xì)胞，其通過用權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化得到。
15.分離細(xì)胞系，其生產(chǎn)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述抗體、或其重鏈或輕鏈或抗原結(jié)合部位。
16.雜交瘤細(xì)胞，其生產(chǎn)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述抗體、或其重鏈或輕鏈或抗原結(jié)合部位。
17.用于降低血糖、改善糖耐量或用于治療、預(yù)防或抑制患病個體中II型糖尿病、血脂異?；蛳嚓P(guān)疾病的方法，其包括向個體施用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合部位或其衍生物，或者權(quán)利要求10所述的藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了免疫組合物，以及使用作用于胰高血糖素受體的抗體降低胰高血糖素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的方法。
文檔編號C07K16/46GK102482350SQ200980161348
公開日2012年5月30日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者徐成京, 李殷暻, 金臺成 申請人:株式會社新藥